IDENTIFIKASI PROTEIN SPESIFIK BIOFILM CANDIDA ALBICANS SEBAGAI TARGET PENENTUAN PROTEIN SPESIFIK ANTIGENIK

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014

IDENTIFIKASI PROTEIN SPESIFIK BIOFILM CANDIDA ALBICANS SEBAGAI TARGET PENENTUAN PROTEIN SPESIFIK ANTIGENIK IDENTIFICATION BIOFILM SPESIFIC PROTEIN OF CANDIDA ALBICANS AS A TARGET TO DETERMINE ANTIGENIK SPESIFIC PROTEIN

Mirwa Adiprahara Anggarani1), Afaf Baktir2), Sri Puji Astuti Wahyuningsih3) 1)

Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Surabaya Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga 3) Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga 2)

e-mail: [email protected] Candida albicans adalah flora normal dan berpotensi patogen yang dapat membentuk biofilm pada permukaan inang dan peralatan medis. Profil protein biofilm fungi belum banyak dijelaskan secara detail, namun demikian diketahui bahwa pembentukan biofilm memberikan peranan penting terhadap sifat patogen C. albicans. Dalam penilitian ini, digunakan teknik elektroforesis gel yaitu Sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) untuk mengidentifikasi protein spesifik biofilm C. albicans. Hasilnya, teridentifikasi protein spesifik biofilm C. albicans, meliputi protein dengan berat molekul 84,4; 69,5; 67,1; 62,5 kD. Profil protein spesifik biofilm ini dapat digunakan sebagai kandidat untuk mengidentifikasi protein antigenik spesific C. albicans. Kata kunci: Candida albicans, biofilm, SDS-PAGE, protein spesifik biofilm Abstract Candida albicans is a human commensal and opportunistic pathogen that participates in biofilm formation on host surface and also on medical devices. Protein profiles of fungal biofilm have not investigated in details, although such profile are believed to play critical roles in fungal biofilm formation that can be caused its pathogenic. We used Sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to identification biofilm specific protein of C. albicans. The result, we identify biofilm specific protein profile of C. albicans includes proteins with molecular weight 84,4; 69,5; 67,1; 62,5 kD. This biofilm specific protein profile is a candidate to identification antigenic biofilm specific protein of C. albicans. Keyword: Candida albicans, biofilm, SDS-PAGE, biofilm specific protein biofilm (Mitchell et al., 2005). Biofilm merupakan alat perlindungan bagi mikroba terhadap respon imun sel inang dan zat antimikroba. Virulensi dan resistensi sebagian besar mikroorganisme patogen, termasuk Candida, ditentukan oleh kemampuannya membentuk biofilm. Komunitas biofilm memiliki karakter yang spesifik dan sifat fenotip yang unik. Dengan demikian, biofilm adalah bentuk patogen dari

PENDAHULUAN Candida merupakan fungi dimorfik dan secara normal dapat berkolonisasi pada kulit dan membran mukosa pada individu sehat. Dengan demikian secara umum dapat ditemukan pada saluran pencernaan, mulut rahim dan vagina. Komunitas Candida dapat membentuk asosiasi koloni yang disebut B - 49

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Candida. Candida dapat pula berada dalam bentuk lain yang tidak patogen, yaitu bentuk bebas yang dinamakan bentuk planktonik (Naglik et al., 2003). Disamping faktor morfologi, patogenitas C. albicans juga berkaitan dengan metabolit yang dihasilkan. Metabolit tersebut diantaranya adalah asetaldehid (Mravec dan Epp, 2006), arabinosa dan asam-asam organik seperti asam tartrat (Clack, 2009). Metabolit C. albicans di dalam tubuh dapat memicu terjadinya mutasi DNA inang yang dapat menghasilkan protein misfolding dan atau secara langsung mendenaturasi protein inang. Kelainan struktur protein inang akan menyebabkan timbulnya kelainan fungsi metabolisme maupun struktur organ inang, hingga terjadi kelainan atau penurunan fungsi organ inang (Alvarado, 2008). Organ yang telah dilaporkan mengalami penurunan fungsi karena infeksi oleh C. albicans antara lain adalah hati, jantung, ginjal, paru-paru, pencernaan, dan otak (Lakkawar et al., 2003). Metabolit toksik tersebut menjadi penyebab timbulnya kerusakan jaringan atau organ hingga timbul penyakit tertentu. Penyakit yang disebabkan oleh infeksi C. albicans yang berkaitan dengan metabolit yang dihasilkan antara lain adalah parkinson (Mravec dan Epp, 2006), schizophrenia (Truss, 1981), autis atau Autistic Spectrum Disorder (Clack, 2009), dan alzheimer (Tanzi et al., 2010). Kandidiasis atau infeksi Candida terjadi sebagai hasil gangguan keseimbangan antara imunitas inang dan penyerangan patogen (Kuleta et al., 2009). Beberapa infeksi Candida menyebabkan masalah yang serius khususnya pada individu dengan mekanisme sistem imun yang lemah (Kuleta et al., 2009). Faktor yang mempengaruhi peningkatan populasi (over growth) C. albicans di saluran pencernaan adalah terapi imunosupresif, terapi antibiotik, infeksi HIV, diabetes, dan penuaan (Ribot et al., 2001). Dinding sel C. albicans memiliki struktur yang kuat dan liat. Struktur liat tersebut meningkat jauh lebih kuat pada bentuk biofilm yang disebabkan oleh keberadaan matrik ekstraseluler pada biofilm (Rashki, 2009). Chaffin dan Casanova (1991) melakukan penelitian untuk mengisolasi ekstrak protein dinding sel planktonik C.

albicans. Ekstrak protein dinding sel planktonik diperoleh melalui gabungan metode ekstraksi kimia dan reaksi enzimatik. Penelitian tersebut hanya mengisolasi ekstrak protein dinding sel planktonik C. albicans, sedangkan dalam penelitian ini akan dilakukan isolasi ekstrak protein matrik biofilm C. albicans menggunakan metode yang sama. Berdasarkan fakta yang telah diuraikan tentang patogenitas biofilm C. albicans yang dapat menimbulkan berbagai penyakit serius, maka perlu dilakukan pengembangan strategi deteksi biofilm C. albicans. Dengan demikian, pada penelitian ini akan diidentifikasi protein spesifik biofilm C. albicans melalui pendekatan proteomik. Target protein spesifik biofilm ini selanjutnya dapat dikembangkan untuk mengidentifikasi protein antigenik spesifik biofilm C. albicans yang dapat dijadikan sebagai kandidat terhadap biomarker kandidiasis. BAHAN DAN METODE Alat Beberapa alat yang digunakan antara lain: autoklaf (OSK 6508 Steam pressure apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Ohaus), pH meter (Metrohm 744), oven (Memmert, Jerman), lemari pendingin -20°C (Royal Chest Freezer BD195), pipet mikro (Eppendorf), waterbath (sansat tipe SYK382-M), spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu 1700 Pharma), piranti SDSPAGE (Biorad), penggoyang (Heidolph Polymax 1040), shaker incubator (Heidolph Unimax 1010), dan alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium. Bahan Bahan-bahan yang digunakan antara lain: media YPD (yeast extract, pepton, dextrosa), media Sabouraud Dextose Agar / SDA (dextrosa, pepton, agar), 50 mM PBS, 0,6M KCl, larutan 1% β-merkaptoetanol dalam (NH4)2CO3, Zymolyase, aseton, buffer SDS (Tris-HCl, gliserol, SDS, βmercaptoetanol), 10% SDS-gel poliakrilamid. Prosedur Penelitian. Kultivasi C. albicans B - 50

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Dibuat media padat Sabouraud dextrose agar (SDA) sebanyak 20 mL dengan perbandingan pepton : dextrosa : agar = 1 : 4 : 2. Selanjutnya ditempeli dengan 8 buah membran filter selulosa nitrat berdiameter 25 mm dan ukuran pori 0,2 µm yang telah disterilkan menggunakan radiasi UV selama 15 menit dan ditetesi dengan 50 µL suspensi pelet C. albicans hasil yang didapat dari sentrifugasi dan pencucian. Kemudian dibiarkan sampai cairan terserap ke dalam membran dan diletakkan secara terbalik. Setiap 24 jam membran filter selulosa nitrat dipindahkan ke media padat SDA yang baru. Berikutnya berulang hingga 48 jam dilakukan pemanenan biofilm. Untuk keperluan prosedur preparasi ekstrak protein biofilm C. albicans dilakukan resuspensi biofilm ke dalam 10 mL PBS 50 mM.

Pembiakan isolat C. albicans dalam media cair Media cair yang digunakan adalah media ekstrak ragi, pepton dan dextrosa (YPD). Dibuat media cair YPD dengan perbandingan yeast : peptone : agar = 1 : 2 : 2. Selanjutnya sebanyak isolat C. albicans dimasukkan ke dalam media cair YPD. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C dengan kecepatan pengocokan 155 rpm selama 1 hari. Pembuatan kultur C. albicans pada media padat Media padat yang digunakan adalah media ekstrak ragi, pepton dan dextrosa (YPD). Dibuat media cair YPD dengan perbandingan yeast : peptone : agar = 1 : 2 : 2. Dilakukan penumbuhan starin C. albicans pada media padat. Sedikit isolat C. albicans dari biakan cair digoreskan ke media padat dan disimpan di dalam inkubator pada suhu 37 ˚C selama 1 hari

Analisis biofilm C. albicans menggunakan SEM Biofilm C. albicans yang ditumbuhkan pada media biofilm selama 48 jam, diamati morfologi permukaannya menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM). Biofilm yang akan dianalisis dikeringkan semalam pada suhu 37 ˚C dan dilakukan dehidrasi melalui pencucian etanol bertingkat (70 % selama 10 menit, 95 % selama 10 menit dan 100 % selama 20 menit). Biofilm yang telah dikeringkan dilakukan proses coating menggunakan emas/palladium dan diamati morfologi permukaannya menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM).

Pembuatan inokulum C. albicans Media cair yang digunakan adalah media YPD. Dibuat media cair YPD dengan perbandingan yeast : peptone : agar = 1 : 2 : 2. Sedikit koloni tunggal C. albicans dari media padat disuspensikan ke dalam 20 mL media cair YPD. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ˚C dan aerasi dengan kecepatan pengocokan 155 rpm. Inokulum yang terbentuk diukur densitas optiknya (OD) menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ 600 nm. Pembuatan dan analisis biofilm C. albicans Pembuatan biofilm C. albicans Koloni tunggal C. albicans diinokulasi ke dalam 20 mL media cair YPD dan diinkubasi pada suhu suhu kamar dengan kecepatan pengocokan 160 rpm selama 1 hari sesuai dengan metode Hetrick et al. (2009). Selanjutnya biakan sel dipanen dengan cara sentrifugasi pada 10.000 rpm dan suhu 4 ˚C selama 15 menit. Pelet yang didapat dicuci dengan 0,1 M buffer fosfat salin (PBS) steril. Proses pencucian ini dilakukan dua kali. Selanjutnya endapan sel C. albicans disuspensi dengan PBS hingga mencapai OD 0,5 pada λ 600 nm menggunakan Spektrofotometer UV-VIS.

Preparasi ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans Preparasi ekstrak protein planktonik C. albicans Dilakukan sentrifugasi terhadap inokulum selama 15 menit pada suhu 22˚C dengan kecepatan 200 rpm. Pelet sel diresuspensi menggunakan 165 mL larutan kerja (1% β-merkaptoetanol dalam 1,89 gr/L (NH4)2CO3 pH 8,64) kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 22˚C dengan kecepatan 1500xg. Supernatan yang didapatkan di freeze dry dan hasilnya mengandung protein dinding sel C. albicans (ekstrak A). Sedangkan pelet sel dicuci dengan air dingin dan dilanjutkan B - 51

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 pencucian menggunakan 0,6M KCl. Kemudian diresuspensi ke dalam 100 mL 0,6 KCl yang mengandung 0,5 mg/mL zymolyase dan diinkubasi pada suhu 28˚C selama 2 jam dengan pengocokan lemah. Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3500 rpm dan dipisahkan antara supernatan dan pelet. Supernatan yang diperoleh disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian larutan yang jernih di freeze dry dan hasilnya mengandung protein dinding sel C. albicans (ekstrak B), sedangkan peletnya merupakan protoplas (PY). Untuk analisis selanjutnya ekstrak A digabung dengan ekstrak B.

0,1 mL larutan kalium persulfat 10 %, 0,01 mL larutan TEMED dan 3,4 mL H2O. Campuran komponen gel separating dimasukkan ke dalam sepasang pelat kaca dan ditunggu hingga gel terpolarisasi dan mengeras. Gel stacking dibuat dengan komposisi sebagai berikut: 0,67 mL larutan akrilamid-bisakrilamid, 1,25 mL larutan trisHCl 1M pH 6,8, 0,25 mL larutan SDS 10 %, 0,05 mL larutan kalium persulfat 10 %, 0,01 mL larutan TEMED dan 3,075 mL H2O. Campuran komponen gel stacking dimasukkan diatas gel separating. Selanjutnya sisir dipasang untuk membuat sumuran tempat memasukkan sampel protein. Setelah gel stacking terpolarisasi dan mengeras plat kaca yang telah berisi gel dilepas dari cetakannya selanjutnya dirangkaikan pada apparatus elektroforesis dan dituangi buffer separating. Selanjutnya sebanyak 10 µL masing sampel protein dicampur dengan 2 µL sampel buffer. Marker protein dibuat dari campuran 10 µL fermentas dicampur dengan 2 µL. Sampel protein dan marker protein dimasukkan dalam sumuran pada gel. Kemudian buffer elektroforesis dituang hingga memenuhi bak. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt, 200 mA selama ± 1 jam. Untuk menampilkan pita-pita protein hasil pemisahan dilakukan pewarnaan menggunakan Coomassie Briliant Blue.

Preparasi ekstrak protein biofilm C. albicans Biofilm dicuci dalam larutan PBS dan disentrifugasi, kemudian pelet diresuspensi menggunakan 165 mL larutan kerja (1% β-merkaptoetanol dalam 1,89 gr/L (NH4)2CO3 pH 8,64) kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 22˚C dengan kecepatan 1500xg. Supernatan yang didapatkan dilakukan freeze dry dan hasilnya mengandung protein biofilm C. albicans (ekstrak C). Sedangkan pelet sel dicuci dengan air dingin dan dilanjutkan pencucian menggunakan 0,6M KCl. Kemudian diresuspensi ke dalam 100 mL 0,6 KCl yang mengandung 0,5 mg/mL zymolyase dan diinkubasi pada suhu 28˚C selama 2 jam dengan pengocokan lemah. Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3500 rpm dan dipisahkan antara supernatan dan pelet. Supernatan yang diperoleh disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian larutan yang jernih di freeze dry dan hasilnya mengandung protein biofilm C. albicans (ekstrak D), sedangkan peletnya merupakan PB. Untuk analisis selanjutnya ekstrak C digabung dengan ekstrak D.

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Penentuan Protein Spesifik Biofilm C. albicans Penentuan protein spesifik biofilm C. albicans dilakukan dengan memisahkan protein hasil preparasi ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans berdasarkan berat molekulnya melalui metode SDS-PAGE. Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) Melalui SDS-PAGE, komponen protein dalam ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans akan terpisah berdasarkan berat molekulnya. Penggunaan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) berfungsi untuk mengikat gugus hidrofobik protein, yang menyebabkan pelepasan struktur lipat (folding) protein. Dengan demikian protein

Penentuan protein spesifik biofilm C. albicans SDS-PAGE Ekstrak protein dipisahkan melalui SDS-PAGE. Gel separating dibuat dengan komposisi sebagai berikut: 4 mL larutan akrilamid-bisakrilamid, 2,5 mL larutan trisHCl 2M pH 8,8, 0,05 mL larutan SDS 10 %, B - 52

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 akan tetap stabil di dalam larutan dalam bentuk konformasi linier. Oleh karena itu, ukuran kompleks SDS-protein proporsional dengan berat molekul protein. Dimana protein dengan berat molekul tinggi akan bergerak lebih lambat, sehingga terfraksinasi lebih dahulu dan protein dengan berat molekul rendah akan bergerak lebih cepat, sehingga terfraksinasi kemudian. Elektroforesis terhadap ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans dilakukan menggunakan gel diskontinyu yang terdiri dari gel penumpuk (stacking gel) dan gel pemisah (separating gel). Elektroforesis untuk memisahkan ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans pada penelitian ini dilakukan pada tegangan konstan 100V. Melalui SDS-PAGE ekstrak protein baik planktonik maupun biofilm akan terpisah menjadi pita-pita protein tergantung pada berat molekulnya. Standar berat molekul marker berada pada kisaran 4 kDa sampai dengan 250 kDa. Komposisi marker prestained meliputi: insulin, B chain (4 kDa), aprotinin (6 kDa), lisosim (16 kDa), myoglobin red (22 kDa), karbonat anhidrat (36 kDa), alkohol dehidrogenase (50 kDa), glutamat dehidrogenase (64 kDa), BSA (98 kDa), fosforilase (148 kDa), dan myosin (250 kDa). Tabel 5.1 memaparkan Rf dan berat molekul masing-masing komponen marker.

Tabel 1.

Data hasil perhitungan Rf dan berat molekul komponen marker (SeeBlue®Plus2 Prestained Standard)

Komponen marker Myosin Fosforilase BSA Glutamat dehidrogenase Alkohol dehidrogenase Karbonat anhidrat Myoglobin red Lisosim

Rf

0.015385 0.061538 0.123077

Berat Molekul (kDa) 250 148 98

0.215385

64

0.307692

50

0.661538 0.907692 1

36 22 16

Berdasarkan berat molekul dan jarak migrasi (Rf) komponen marker yang tampak sebagai pita-pita protein, dapat dibuat persamaan regresi hubungan antara berat molekul dan Rf, seperti pada Tabel 1. Persamaaan regresi berat molekul marker terhadap Rf adalah y = -75,22x + 87,97. Gambar 1 merupakan kurva standar hubungan antara berat molekul marker dan Rf.

Gambar 1. Kurva standar hubungan antara berat molekul dan Rf protein marker Berdasarkan persamaan regresi pada Gambar 1 ditentukan berat molekul protein dalam sampel, yang telah terfraksinasi berupa dengan Rf tertentu. Gambar 2 merupakan elektrogram hasil pemisahan ekstrak protein

ekstrasel planktonik (PEP), ekstrak protein matrik biofilm (PMB), protein intrasel biofilm (PIB), dan protein intrasel planktonik (PIP) C. albicans serta enzim zymolyase.

B - 53

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014

Gambar 2.

Elektroforegram protein planktonik dan biofilm C. albicans dengan metode SDSPAGE. Berturut-turut baris pertama hingga sembilan dari kiri ke kanan adalah: marker prestained, protein intrasel planktonik I dan II (PIP II dan PIP I), protein intrasel biofilm I dan II (PIB II dan PIB I), protein matrik biofilm (PMB), protein ekstrasel planktonik (PEP), dan enzim zymolyase.

Keberadaan protein dalam protoplas planktonik (PIP) maupun biofilm (PIB) menunjukkan bahwa protein tersebut merupakan protein intrasel, dengan asumsi prosedur preparasi ekstrak protein planktonik dan biofilm dapat melepas seluruh protein dinding sel dan matrik biofilm C. albicans. Dengan demikian pita-pita protein dari pemisahan sampel protoplas planktonik dan biofilm C. albicans yang diperoleh pada penelitian ini merupakan pita protein intrasel C. albicans. Namun apabila prosedur preparasi ekstrak protein planktonik dan biofilm kurang sempurna dalam melepas seluruh protein dinding sel dan matrik biofilm C. albicans, maka residu protoplas tersebut dimungkinkan masih mengandung komponen dinding sel dan matrik biofilm C. albicans. Hal ini disebabkan dinding sel C. albicans sangat kompak dan liat, terlebih lagi matrik biofilm C. albicans. Berdasarkan kekuatan dinding sel dan matrik ekstrasel biofilm tersebut sehingga dinding sel dan matrik ekstrasel biofilm sulit untuk dipecah guna mendapatkan protein dinding sel dan protein matrik biofilm C. albicans. PIB merupakan sampel protoplas biofilm yang mengandung protein intrasel

biofilm, sedangkan PIP merupakan protoplas planktonik yang mengandung protein intrasel planktonik. PMB merupakan sampel yang mengandung protein matrik biofilm. PEP merupakan sampel yang mengandung protein ekstrasel planktonik. Pada Gambar 2, PIB II dan PIP II merupakan sampel protoplas biofilm dan protoplas planktonik yang mengandung protein intrasel yang dianalisis melalui SDS-PAGE tanpa melalui proses pemisahan massa kental yang terdapat dalam sampel melalui sentrifugasi. Sehingga sampel yang dianalisis SDS-PAGE merupakan sampel yang pekat. Sedangkan PIB I dan PIP I merupakan sampel protoplas biofilm dan protoplas sel planktonik yang merupakan cairan bening, dari sampel yang sama dengan terlebih dahulu disentrifugasi untuk menghilangkan massa kental. Penggunaan 2 jenis sampel yaitu PIP I dan PIP II maupun PIB I dan PIB II bertujuan untuk mendapatkan keseluruhan (total) pita protein hasil pemisahan. Dimana salah satu sampel menggunakan cairan supernatan hasil sentrifugasi dan sampel yang lainnya merupakan sampel induk. PMB merupakan ekstrak protein matrik biofilm gabungan antara isolat hasil perlakuan biofilm B - 54

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 menggunakan β-merkaptoetanol dan isolat hasil perlakuan biofilm menggunakan zymolyase. PEP merupakan ekstrak protein ekstrasel planktonik gabungan antara isolat hasil perlakuan sel planktonik menggunakan β-merkaptoetanol dan isolat hasil perlakuan sel planktonik menggunakan zymolyase. Enzim zymolyase juga dielektroforesis sebagai kontrol untuk membedakan antara pita protein sampel pita protein komponen enzim. Dari hasil pemisahan sampel PIP, PIB, PEP, dan PMB, maka protein terpisah berdasarkan berat molekulnya yang tampak sebagai pita-pita protein. Sebagaimana pada Gambar 2, tampak adanya pengganggu dalam elektroforesis sampel PIP II yang lebih besar dibandingkan PIP I. Hal ini terlihat dimana gel hasil SDS-PAGE dengan pewarnaan Coomasie Briliant Blue tampak lebih pekat dibanding sampel yang lain. Sampel PIP II menunjukkan kekentalan yang sangat tinggi karena mengandung polimer glukan dan kitin. Polimer glukan dan kitin tersebut merupakan hasil degradasi dan pembentukan gel dari komponen dinding sel pada proses preparasi ekstrak protein ekstrasel planktonik. Pembentukan gel dari polimer glukan dan kitin yang terikut pada sampel protoplas planktonik, mengakibatkan kentalnya protoplas planktonik. Polimer Tabel 2.

glukan dan kitin sebagai pengganggu dalam proses elektroforesis dapat diselesaikan melalui sentrifugasi sehingga kandungan glukan dan kitin telah dipisahkan dan hasilnya adalah sampel PIP I. Melalui sentrifugasi, glukan dan kitin akan mengendap sebagai pelet. Adapun pada sampel PIB, keberadaan pengganggu yang berasal polimer glukan dan kitin tidak tampak. Hal ini disebabkan oleh proses degradasi matrik biofilm yang tidak sempurna, dikarenakan matrik biofilm lebih kuat dan liat dibandingkan dinding sel. Sehingga diperlukan perlakuan yang lebih kuat dibanding perlakuan terhadap dinding sel agar matrik biofilm dapat terurai lebih sempurna. Dari hasil SDS-PAGE tampak beberapa pita protein yang menunjukkan protein komponen masing-masing sampel PIP, PIB, PMB, PEP dan enzim zymolyase. Berdasarkan data Rf sampel yang dimasukkan ke dalam persamaan regresi berat molekul marker terhadap Rf yaitu y = 75,22x + 87,97, maka ditentukan estimasi berat molekul komponen protein dalam sampel PIP, PIB, PMB, dan PEB. Tabel 2 memaparkan komponen protein masingmasing sampel PIP, PIB, PMB, PEP dan enzim zymolyase.

Data hasil perhitungan Rf dan berat molekul (BM) pita elektrogram sampel PIP, PIB, PMB, PEP pada Gambar 2. Rf

PIP II

PIP I

PIB II

PIB I

PEM

PEP

Zymolyase

0.046

-

-

84,4 kDa

-

-

-

-

0.153

76,4 kDa

76,4 kDa

76,4 kDa

76,4 kDa

-

-

-

0.230

70,6 kDa

70,6 kDa

70,6 kDa

70,6 kDa

-

-

-

0.246

-

-

-

69,5 kDa

-

-

-

0.276

-

-

-

67,1 kDa

-

-

-

0.307

64,8 kDa

64,8 kDa

64,8 kDa

64,8 kDa

-

-

64,8 kDa

0.338

-

-

-

62,5 kDa

-

-

-

0.423

56,1 kDa

56,1 kDa

56,1 kDa

56,1 kDa

-

-

-

0.476

52,1 kDa

52,1 kDa

52,1 kDa

52,1 kDa

-

-

-

0.538

47,4 kDa

-

-

-

-

-

-

0.553

46,3 kDa

-

-

-

-

-

-

0.630

40,5 kDa

40,5 kDa

-

-

-

-

-

B - 55

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 0.707

34,7 kDa

34,7 kDa

-

-

-

-

-

0.923 18,5 kDa 18,5 kDa 18,5 kDa 18,5 kDa 18,5 kDa Berdasarkan data pada Tabel 2, tidak Pembahasan tampak pita protein hasil pemisahan ekstrak Preparasi Ekstrak Protein Planktonik dan protein ekstrasel planktonik (PEP) dan Biofilm C. Albicans ekstrak protein matrik biofilm (PMB). Hal ini mengindikasikan bahwa dalam sampel PEP Dinding sel C. albicans tersusun atas dan PMB tidak mengandung protein ekstrasel komplek protein (mannoprotein dan sejumlah planktonik dan protein matrik biofilm C. kecil protein lain) dengan polisakarida (βalbicans, atau pewarnaan menggunakan 1,3-glukan, β-1,6-glukan, kitin, mannan dan Coomassie Briliant Blue yang kurang peka. glycosyl phosphatidylinositol (GPI)) (Kuleta Batas deteksi pewarnaan menggunakan et al., 2009). Komponen penyusun dinding Coomasie Briliant Blue adalah 0,1 µg untuk sel ini membentuk asosiasi liat, berupa sebuah pita protein. lapisan bilayer yang diselimuti protein Dari Tabel 2, dapat diketahui pitaeksternal. Komponen utama protein eksternal pita protein sampel PIP dan PIB. adalah protein glycosyl phosphatidylinositol Keseluruhan pita protein sampel PIP meliputi (GPI). Glukan memiliki ikatan yang sangat pita yang menunjukkan berat molekul: 76,4; kuat dan tidak larut dalam air. Kekuatan 70,6; 64,8; 56,1; 52,1; 47,4; 46,3; 40,5; 34,7; struktur ini juga didukung oleh adanya 18,5 kDa. Sedangkan keseluruhan pita jembatan disulfida (Klis et al., 2009). protein sampel PIB meliputi pita yang Struktur liat pada sel planktonik C. menunjukkan berat molekul: 84,4; 76,4; 70,6; albicans meningkat jauh lebih kuat pada 69,5; 67,1; 64,8; 62,5; 56,1; 52,1; 18,5 kDa. bentuk biofilmnya. Hasil penelitian yang Pita protein 64,8 kDa dan 18,5 kDa terdapat dilakukan oleh Andes dan Nett (2006) pada sampel protoplas planktonik dan menyatakan bahwa kandungan β-1,3 glukan protoplas biofilm serta enzim zymolyase. pada bentuk biofilm lebih tinggi Dengan demikian dimungkinkan pita tersebut dibandingkan bentuk planktonik. adalah pita protein komponen enzim Berdasarkan analisis TEM ketebalan dinding zymolyase yang terikut pada sampel PIP dan sel bentuk biofilm dua kali lebih besar PIB. Hal ini terjadi karena sampel yang daripada bentuk planktonik. Ketebalan dipisahkan dengan SDS-PAGE merupakan dinding sel bentuk planktonik sekitar 120 nm, sampel hasil perlakuan menggunakan enzim sedangkan ketebalan dinding sel bentuk zymolyase. biofilm sekitar 260 nm. Bentuk planktonik Pita protein intrasel planktonik C. tersusun oleh sel khamir yang dilindungi oleh albicans meliputi: 76,4; 70,6; 56,1; 52,1; dinding sel, yang salah satu komponen 47,4; 46,3; 40,5; 34,7 kDa. Sedangkan dindingnya adalah β-1,3 glukan. Sedangkan keseluruhan pita protein intrasel biofilm sel C. albicans dalam bentuk biofilm C. albicans meliputi: 84,4; 76,4; 70,6; 69,5; terlindungi oleh dinding sel maupun matrik 67,1; 62,5; 56,1; 52,1 kDa. Diantara pita biofilm yang menyelimutinya. protein yang diperoleh terdapat protein Biofilm C. albicans tersusun atas spesifik planktonik dan protein spesifik berbagai morfologi sel C. albicans yang biofilm C. albicans yang dipaparkan dalam hidup secara bersama-sama sebagai Tabel 3. komunitas, yang tertata dalam struktur tiga Tabel 3. Komposisi protein spesifik dimensi. Komunitas ini, dibungkus oleh planktonik dan protein spesifik matrik ekstrasel yang tersusun atas biofilm C. albicans polisakarida, protein dan komponen lain yang dapat mengikatkan antar sel C. Protein spesifik 47,4 kDa, 46,3 kDa, albicans dan melekatkan agregat sel pada planktonik C. 40,5 kDa, 34,7 kDa permukaan padatan. Bentuk biofilm lebih albicans kuat, rapat dan liat dibandingkan dengan Protein spesifik 84,4 kDa, 69,5 kDa, bentuk planktonik, karena keberadaan matrik biofilm C. albicans 67,1 kDa, 62,5 kDa ekstraseluler pada bentuk biofilm (Rashki, 2009). B - 56

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Metode preparasi ekstrak planktonik C. albicans mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Chaffin dan Casanova (1991). Metode preparasi ini bertujuan untuk mengisolasi ekstrak protein ekstrasel planktonik C. albicans. Ekstrak protein planktonik C. albicans diperoleh melalui gabungan metode ekstraksi kimia dan reaksi enzimatik. Karena kekuatan dinding sel dan matrik biofilm C. albicans sebagaimana yang telah diuraikan, maka pada penelitian ini digunakan gabungan dua metode, yaitu ekstraksi kimia dan reaksi enzimatik untuk mendegradasi dinding sel dan matrik biofilm C. albicans. Pada ekstraksi kimia digunakan β-merkaptoetanol, sedangkan pada reaksi enzimatik digunakan enzim zymolyase untuk mendegradasi dinding sel dan matrik biofilm C. albicans untuk memperoleh ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans. β-merkaptoetanol merupakan denaturan reversibel yang diharapkan dapat mendenaturasi sebagian protein dinding sel dan matrik biofilm C. albicans, sehingga sebagian protein terlepas. β-merkaptoetanol juga memberi jalan bagi kinerja zymolyase sebagai pendegradasi struktur dinding sel dan matrik biofilm selanjutnya, sehingga kerja enzim ini lebih optimal. Dengan demikian degradasi dinding sel dan terutama matrik biofilm yang sangat liat, dapat berlangsung lebih baik untuk memperoleh ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans. Sehingga dalam hal ini, kinerja βmerkaptoetanol dan enzim zymolyase saling mendukung untuk pelepasan protein matrik maupun dinding sel. Setelah perlakuan degradasi menggunakan β-merkaptoetanol, tahap pencucian sangat penting, agar pelet sel bebas dari β-merkaptoetanol, sehingga zymolyase tidak terdenaturasi. Mukherjee et al. (2008) melakukan penelitian untuk mengidentifikasi protein dinding sel biofilm dan protein matrik biofilm C. albicans. Mula-mula dilakukan isolasi matrik biofilm C. albicans melalui lima tahapan yaitu sentrifugasi, perlakuan menggunakan EDTA, ultrasonikasi, kombinasi ultrasonikasi dengan metode vortex, dan metode vortex. Supernatan yang dihasilkan mengandung matrik biofilm C. albicans. Pada isolasi dinding sel biofilm, dinding sel diisolasi dari biofilm C.

albicans, selanjutnya protein yang terkandung di dalamnya diperlakukan menggunakan SDS untuk memisahkan protein yang larut dan tidak larut. Selanjutnya sel planktonik dan biofilm dihomogenkan dengan menggunakan glass beads, dan dilakukan sentrifugasi untuk untuk memisahkan material sitoplasma. Pelet yang dihasilkan diperlakukan menggunakan TrisCl, SDS, EDTA dan β-merkaptoetanol dan dilakukan sentrifugasi untuk memperoleh supernatan yang mengandung dinding sel biofilm C. albicans. Namun penelitian tersebut tidak mengidentifikasi protein matrik maupun dinding sel biofilm C. albicans yang bersifat antigenik. Selain itu, dalam asosiasi biofilm yang terbentuk tidak terdapat hifa, yang merupakan salah satu komponen penyusun biofilm yang berperan dalam proses invasi. Biofilm merupakan asosiasi sel C. albicans dalam berbagai morfologi yang diselimuti oleh matrik ekstrasel. Jadi, biofilm tersusun oleh sel-sel yang saling berikatan, dan kemudian sel-sel yang saling berikatan tersebut melekatkan pada suatu padatan pendukung. Protein matrik biofilm adalah kandungan protein di dalam matrik ekstrasel biofilm. Sedangkan protein dinding sel biofilm adalah protein penyusun dinding dari suatu sel C. albicans yang menjadi komponen asosiasi biofilm. Kesempurnaan ekstraksi protein penyusun dinding sel planktonik dan matrik biofilm tergantung pada keterampilan dalam perlakuan β-merkaptoetanol dan zymolyase. Pada ekstraksi protein biofilm C. albicans, dibutuhkan perlakuan yang berbeda. Pengocokan harus dilakukan lebih kuat karena matrik biofilm lebih kompak dibanding dinding sel. Menurut Nett et al. (2007) biofilm merupakan kumpulan sel yang terikat secara kuat pada suatu permukaan dan menjadi tertanam di dalam matrik dari polimer ekstraseluler yang dihasilkan selnya. Pada penelitian ini biofilm C. albicans ditumbuhkan pada padatan pendukung berupa membran filter selulosa nitrat diatas media padat pertumbuhan biofilm. Sumber nutrisi bagi pertumbuhan biofilm C. albicans diperoleh dari media pertumbuhan SDA yang dipisahkan dari suspensi pelet C. albicans oleh membran. Dengan demikian dalam penelitian ini, adanya padatan B - 57

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 pendukung berupa membran filter selulosa nitrat menjadi sarana dalam pembentukan biofilm. Disamping itu, pembentukan biofilm juga dipicu oleh suatu kondisi yang minim nutrisi. Dimana, di dalam suspensi pelet C. albicans yang terletak di atas membran tidak terdapat nutrisi. Untuk mendapatkan nutrisi, maka pelet sel planktonik C. albicans harus mengadakan perubahan bentuk agar dapat menembus membran. Kondisi yang demikian akan memicu terbentuknya hifa. Hal ini terjadi karena sel khamir akan mulai berkembang menjadi bentuk hifa yang dapat menembus membran dan memperoleh nutrisi dari media biofilm yang ada di bawah membran. Kondisi minimum terjadi karena suspensi khamir C. albicans yang diteteskan pada membran merupakan suspensi C. albicans dalam PBS. Dengan demikian sel khamir akan berkembang menjadi hifa, yaitu bentuk vegetatif yang mampu menembus membran guna mendapatkan nutrisi. Douglas dan Al-Fattani (2006), melakukan penelitian untuk mengetahui komposisi matrik biofilm dengan cara mengisolasi dan menganalisis materi matrik biofilm C. albicans. Dari penelitian tersebut diketahui bahwa komposisi matrik biofilm diantaranya adalah karbohidrat, glukosa, protein, heksosamin, fosfor, dan asam uronat. Mengacu pada metode penelitian yang dilakukan oleh Douglas dan Al-Fattani

(2006), biofilm C. albicans matang dengan pertumbuhan maksimal memerlukan waktu inkubasi 48 jam. Dari hasil penelitian ini, diperoleh hasil yang sama, dimana dalam waktu inkubasi 48 jam, pertumbuhan biofilm mencapai fase puncak. Setelah inkubasi selama 48 jam biofilm yang dihasilkan diamati bentuk pertumbuhannya menggunakan SEM. Dari hasil pengamatan menggunakan SEM dapat diketahui bahwa biofilm C. albicans hasil inkubasi selama 48 jam mengandung berbagai bentuk morfologi. Bentuk yang tampak pada penelitian ini (Gambar 3) adalah bentuk khamir (sel bebas), hifa, dan budding-yeast, yang dilingkupi matrik ekstrasel. Hal ini menunjukkan bahwa biofilm dapat tumbuh dengan baik pada padatan membran filter selulosa nitrat dengan lama waktu inkubasi 48 jam. Gambaran biofilm C. albicans yang dihasilkan dari penelitian ini dan dibandingkan dengan penelitian lain (Douglas, 2002) ditunjukkan dalam Gambar 3. Penelitian ini lebih ditekankan pada protein penyusun biofilm dan atau protein yang berperan dalam pembentukan biofilm. Hal ini dikarenakan biofilm merupakan faktor patogenitas utama C. albicans. Biofilm menjadi alat tipu daya bagi C. albicans untuk terhindar dari respon inang.

(a) (b) Gambar biofilm C. albicans melalui pengamatan menggunakan SEM. (a). Penampang melintang biofilm C. albicans. Sel khamir dan hifa tampak melekat pada material matrik (Douglas, 2002). (b). Penampang biofilm yang dihasilkan dari penelitian ini dilapisi membran plasma, dan cairan Dalam penelitian ini dilakukan supernatan yang mengandung komponendigesti enzimatik menggunakan enzim komponen dinding sel yang telah zymolyase yang menyebabkan terdegradasi. Menurut Gill et al. (2006) terdegradasinya dinding sel planktonik C. komponen dinding sel yang terlepas albicans sehingga terbentuk protoplas. Proses mengandung protein ekstraseluler dan degradasi ini akan memisahkan antara komponen dinding sel berupa komplek protoplas sebagai pelet sel yang hanya mannoprotein dan polisakarida (β-1,3Gambar 3.

B - 58

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 glukan, β-1,6-glukan, kitin, mannan dan glycosyl phosphatidylinositol (GPI)). Berdasarkan teori tersebut supernatan hasil preparasi ekstrak protein planktonik mengandung sejumlah protein ekstrasel dan komponen dinding sel yang telah terdegradasi. Sedangkan pelet sel berupa protoplas yang merupakan sel yang diselimuti oleh membran plasma, mengandung protein penyusun membran plasma dan sitoplasma. Membran plasma mengandung protein membran plasma serta ergosterol dan fosfolipid. Sedangkan sitoplasma mengandung protein intrasel.

dalam menentukan protein spesifik biofilm C. albicans, yang dapat dijadikan sebagai kandidat biomarker kandidiasis. DAFTAR PUSTAKA Alvarado, M. R. 2008. Principles of Protein Misfolding, vol. 84. Elsevier Scientific Publishing Company. Minnesota Chaffin, W. L. dan M. Cassanova. 1991. Cell wall glycoprotein of Candida albicans as released by different methods. Journal of General Microbiology, 137: 1045-1051 Clack, S. Candidiasis and Dysbiosis in children with Autistic Spectrum Disorders. 2009. IHP. New York Douglas, L. J. 2002. Medical importance of biofilms in Candida infections. Rev Iberoam Micol. Glasgow Kuleta, J. K., M. R. Kozik dan A. Kozik. 2009. Fungi patogenic to humans: molecular bases of virulence of Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigates, vol.56: 211-224. Acta Biochimica Polonica. Krakaw Lakkawar, A., S. Chattopadhyay, R. Somvanshi, dan A. Sikdar. 2003. Experimental Candidiasis in Rabbit Inoculated with a Fowl Isolat of Candida Albicans – a Clinical and Pathological Study. Slov Vet Res. India Mravec, B. dan L. M. Epp. 2006. Chronic polysistemic candidiasis as a possible contributor to onset of idiopathic Parkinson’s disease. Britisl Lek Listy. Slovakia Mitchell, A. P., M. L. Richard, C. L. Nabile, dan V. M. Bruno. 2005. Candida albicans Biofilm-Defective Mutants, vol. 4. American Society for Microbiology. New York Mukherjee, P. K., S. Mohamed, J. Chandra, D. Kuhn, S. Liu, R, Mitchell, D. Andes, dan M. A, Ghannoum. 2008. Proteomic and Pathway Mapping Analyses Reveal Phase-Dependent Over-Expression of Protein Associated with Carbohydrate Metabolic Pathway in Candida albicans Biofilm. The Open Proteomics Journal, 1: 5-26 Naglik, J. R., S. J. Challacombe, dan B. Hube. 2003. Candida albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Patogenesis, vol. 67. American Society for Microbiology. Berlin

Identifikasi Protein Antigenik Spesifik Biofilm C. albicans Ekstrak protein planktonik dan biofilm C. albicans mengandung sejumlah protein dengan berat molekul tertentu. Protein-protein sel planktonik dan biofilm C. albicans selanjutnya dipisahkan melalui SDS-PAGE. Untuk penelitian selanjutnya, hasil identifikasi protein spesifik biofilm C. albicans dapat dijadikan sebagai target dalam menentukan protein spesifik biofilm C. albicans, yang dapat dijadikan sebagai kandidat biomarker kandidiasis. Pada penelitian ini diperoleh pita protein sampel protoplas planktonik dan biofilm C. albicans yang mengandung protein intrasel planktonik dan biofilm C. albicans. Keseluruhan pita protein intrasel planktonik C. albicans meliputi: 76,4; 70,6; 56,1; 52,1; 47,4; 46,3; 40,3; 34,7 kDa. Sedangkan keseluruhan pita protein intrasel biofilm C. albicans meliputi: 84,5; 76,4; 70,6; 69,5; 67,1; 62,5; 56,1; 52,1 kDa. Diantara pita protein yang diperoleh terdapat protein spesifik planktonik dan protein spesifik biofilm C. albicans. Protein spesifik planktonik meliputi protein dengan berat molekul 47,4 kDa, 46,3 kDa, 40,3 kDa, 34,7 kDa. Protein spesifik biofilm meliputi protein dengan berat molekul 84,5 kDa, 69,5 kDa, 67,1 kDa, 62,5 kDa. KESIMPULAN Berdasarkan data penelitian dan analisisnya, dapat disimpulkan bahwa terdapat protein spesifik biofilm C. albicans, meliputi protein dengan berat molekul 84,4; 69,5; 67,1; 62,5 kD. Hasil identifikasi protein spesifik biofilm C. albicans dapat dijadikan sebagai target B - 59

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Rashki, A. 2009. Transcriptional analysis of the histone acetylation and deacetylation in Candida albicans. Thesis, University of Salamanca. Spanyol Ribot, J. P., G. Ramage, K. V. Walle, dan B. L. Wiskes. 2001. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev Iberoam Micol. Texas

B - 60