POTENSI EKSTRAK PROTEIN Candida albicans SEBAGAI BIORESEPTOR PADA IMUNOSENSOR UNTUK DIAGNOSA KANDIDIASIS Masfufatun1, Akhmad Sudibya2, Nur Kumala I1 1 Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya 2 Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya 1 Email :
[email protected];
[email protected] 2 Email :
[email protected]
Abstrak Selama ini diagnosa kandidiasis masih terbatas pada kultur darah standar. Metode konvensioanal dengan kultur mikrobiologi ini kurang sensitif, beberapa pasien kandidiasis mempunyai kultur darah negatif dan memerlukan waktu yang lama. Hal ini mendorong beberapa peneliti mencari metode alternatif diagnosa lainnya. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan potensi ekstrak protein Candida albicans sebagai bioreseptor pada imunosensor untuk mendeteksi Candida albicans dan biofilmnya dalam darah pasien kandidiasis. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif dengan tahapan sebagai berikut: (1) isolasi enzim dari cairan pencernaan bekicot; (2) ekstraksi protein Candida albicans melalui metode enzimatis dan mekanik dan (3) analisis ekstrak protein sebagai bioreseptor melalui immunodot assay. Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim bekicot memiliki kadar protein 1,35 mg/ml dan aktifitas spesifik 1,96 Unit/mg. Enzim ini mampu menghidrolisis dinding sel C. albicans dan dengan bantuan sonikasi menghasilkan ekstrak protein ekstrasel planktonik (PEP) dan biofilm (PEB), ekstrak protein intrasel plantonik (PIP) dan biofilm (PIB), dengan kadar protein masing-masing 1,44; 1,29; 1,29 dan 1,21 mg/ml. Ekstrak protein PIB bersifat antigenik terhadap antibody anti-Candida (kontrol positif) dengan memberikan spot berwarna merah pada immunodot assay. Immunodot assay dapat membedakan serum kontrol negatif (orang sehat) dan kontrol positif dengan menggunakan antigen 1 ng/nl dan 50 nl serum. Kata Kunci : Candida albicans, kandidiasis , biofilm, pemeriksaan immunodot
THE POTENCY OF Candida albicans PROTEIN EXTRACT AS BIORESEPTOR ON IMMUNOCENCOR TO DIAGNOSE CANDIDIASIS Abstract So far, diagnosing on candidiasis has still been limited in standard blood culture. The traditional method of this microbiology culture is less sensitive, many patients with
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
26
candidasis infection have negative blood culture, and need a long time. This case encourage many researchers to use another alternative methode to diagnose. The purpose of this research is to examine the potency of Candida albicans protein extract as bioreseptor on immunocencor to detect Candida albicans and its biofilm in the blood of candidiasis patients. The research method which is used is descriptive with the following steps : (1) isolating enzim from the liquid of digestive gland of snail (Achatina fulica); (2) extraction of protein candida albicans through enzimatis and mechanic methods and (3) Analyzing the protein extract as bioreseptor through immunodot assay. The research result shows that the snail enzyme has the protein content 1.35 mg/ml and the specific activity 1.96 unit/mg. This snail enzyme can hydrolyze the cell wall of Candidia albicans and, with the help oh sonication, produce extract of planktonic extracel protein (PEP) and biofilm (PEB), extract of planktonic intracell protein (PIP), and biofilm (PIB), with each protein content 1.44; 1.29; 1.29 and 1.21 mg/ml. The characeristic of biofilm intracell protein (PIB) is antigenic on antibody anti-candida (positive control) with giving red spot on immunodot assay. Immunodot assay can distinguish negative control serum (health man) and positive Candidiasis control by using antigen 1 ng/nl and 50nl serum. Keywords: Candida albicans, candidiasis, biofilm, immunodot assay PENDAHULUAN Candida spp dikenal sebagai fungi
epidermal dan mukosa, misal pada rongga
dimorfik yang secara normal ada pada
mulut,
saluran pencernaan, saluran pernafasan
urinary bladder, dan vagina. Di Amerika
bagian atas dan
75% wanita pada masa reproduksi pernah
mamalia1.
mukosa genital pada
Populasi Candida spp yang
meningkat
(over
growth)
dapat
pharynx,
mengalami Antara
oesophagus,
vulvavaginistis
40-50%
dari
intestin,
candidiasis.
angka
tersebut
menimbulkan masalah. Beberapa spesies
mengalami infeksi berulang dan 5-8% nya
Candida yang dikenal banyak menimbulkan
terkena infeksi candida kronis 2, sedangkan
penyakit baik pada manusia maupun hewan
kandidemia merupakan kondisi diseminasi
adalah Candida
albicans. Penyakit yang
dari infeksi oleh Candida. Kandidemia
timbul akibat infeksi C. albicans dikenal
biasanya diderita oleh penderita HIV, atau
dengan istilah kandidiasis.
setelah menjalani perawatan medis yang
Kandidiasis menjadi
kandidiasis
(kandidiasis)
dan
(kandidemia).
diklasifikasikan
menjadi pasien rumah sakit, terutama yang
superfisial
menjalani transplantasi organ. Di London,
kandidiasis
Kandidiasis
sistemik
40,5%
terkena
infeksi
jamur
pasca
superfisial
transplantasi hati dan 90% dari angka
adalah infeksi Candida pada permukaan
tersebut disebabkan oleh infeksi Candida
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
27
spp dan 66% oleh Candida albicans 3. Di
dapat menyebabkan invasi, menembus sel
Jerman
epitel pada dinding usus. Pada penderita
angka
kematian
akibat
necrosectomy diikuti oleh infeksi jamur
dengan
termasuk Candida mencapai 62% 4.
(immunocompetent) sel C. albicans akan
Infeksi
yang
normal
dihadang oleh antibodi sehingga tidak dapat
masalah
menyebar ke dalam darah. Antibodi adalah
therapeutical di beberapa tahun terakhir.
molekul protein yang dihasilkan oleh sel
Deteksi terhadap kandidiasis sangat sulit
plasma sebagai akibat interaksi antara
dilakukan.
limfosit B yang peka antigen. Antibodi
telah
disebabkan
imun
oleh
kandidiasis
yang
sistem
menambah
Diagnosis laboratorium dan
pengobatan terhadap penyakit ini belum memberikan hasil yang memuaskan
5
memiliki
kemampuan berikatan secara
.
khusus dengan antigen serta mempercepat
Selama ini diagnosa kandidiasis masih
penghancuran dan eliminasi sel asing.
terbatas pada kultur darah standar. Metode
Antibodi
tradisional kultur mikrobiologi ini kurang
berbagai
sensitif, banyak pasien dengan infeksi
walaupun hanya memiliki sedikit perbedaan
Candida menunjukkan hasil kultur darah
dalam konfigurasi structural 6.
yang negatif dan membutuhkan waktu
dapat
membedakan
determinan
antigen
antara (epitop),
Na dan Song (1999) melaporkan
beberapa hari (1-3). Hal ini mendorong para
bahwa
peneliti
metode
aspartyl proteinase) terhadap C. albicans
seperti
mampu dideteksi menggunakan metode
deteksi
ELISA ( Enzyme-Linked Immunoabsorbent
untuk
alternatif
menghasilkan
dalam
diagnosis
mendiagnosis,
serologi
melalui
antigen/antibodi.
Assay).
Di dalam tubuh, sebagai respon terhadap
adanya
protein
antigenik
respon antibodi Sap
Metode
ELISA
(secreted
ini
memiliki
sensitivitas dan spesifitas masing-masing 70% dan 76% 7. Selain antibodi, diagnosis
C. albicans, maka sistem imun tubuh akan
invasi
memproduksi
dilakukan melalui deteksi antigen. Oliveri
pertahanan C.
albicans.
antibodi
sebagai
terhadap
bentuk
keberadaan
Keberadaan
(2008)
Candida
melakukan
albicans
juga
penelitian
bisa
dengan
biofilm
menggunakan Platelia Candida ELISA
C. albicans tersebut di dalam saluran
untuk mendiagnosis invasi kandidiasis pada
pencernaan
inang
memicu
pasien bayi prematur. Deteksi antigen
terbentuknya
antibodi
spesifik
Mannan Candida (CM) telah menunjukkan
akan yang
terhadap biofilm tersebut. Bentuk biofilm Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
28
sensitivitas dan spesifitas lebih tinggi, yakni 8
masing-masing 94,4% dan 94,2% . Salah
satu
format
di Institute of Tropical Disease (ITD) Universitas Airlangga. Pada tahun 2010,
pemeriksaan
Dewi mengaplikasikan imunosensor untuk
deteksi antigen/antibodi yang baru adalah
mendeteksi
dengan
gondii dengan metode GICA menggunakan
imunokromatografi,
yang
IgG
terhadap
Toxoplasma
merupakan sebuah biosensor 9. Biosensor
ekstrak ESA sebagai bioreseptor
yang menggunakan antigen atau antibodi
Indonesia
sebagai
pengembangan
bioreseptor
dikenal
dengan
10
imunosensor . Gold Assay
untuk Immunochromatograaphic
(GICA)
ada
uji
identifikasi
.
Di
penelitian
imunokromatografi C.
albicans
dan
biofilmnya. Metode uji yang ada selama ini
teknik
kurang memuaskan karena pelaksanaannya
yang
sulit, karena membutuhkan peralatan yang
nitroselulosa
mahal, analis yang berpengalaman dan
sebagai pembawa dan koloid emas berlabel
biayanya juga mahal. Oleh karena itu pada
antigen/antibodi sebagai tracer. Teknologi
penelitian ini perlu dilakukan uji potensi
ini
keuntungan
ekstrak protein sebagai bioreseptor pada
dibandingkan dengan Immunoassay yang
imunosensor melalui immunodot assay
lain, yaitu prosedur yang sederhana, hasil
sebagai
cepat, harga murah, tidak membutuhkan
diaplikasikan dalam imunosensor dengan
teknisi dengan kemampuan khusus atau
metode
peralatan mahal dan dapat digunakan untuk
Immunochromatographic Assay).
imunokromatografi menggunakan
merupakan
belum
12
baru
membran
mempunyai
banyak
mendeteksi antigen atau antibodi. Metode
uji
pendahuluan
sebelum
GICA
(Gold
Tujuan penelitian adalah menguji
ini telah banyak digunakan untuk diagnosis
kemampuan
beberapa penyakit dan mendeteksi molekul
fulica) dalam melisis dinding sel Candida
bioaktif, hormon, dan haptens 11.
albicans untuk menghasilkan estrak protein
Di indonesia telah dikembangkan
baik
enzim
ektrasel
bekicot
maupun
intrasel
membuktikan
berbagai macam antigen atau antibodi,
Candida albicans sebagai bioreseptor pada
diantaranya
antibodi
imunosensor untuk mendeteksi Candida
Helicobacter pylory di unit Biomedika
albicans dalam darah pasien kandidiasis.
identifikasi
ekstrak
dan
tes imunokromatografi untuk identifikasi
untuk
potensi
(Achatina
protein
Rumah Sakit Umum Daerah Mataram, Identifikasi Plasmodium falciparium vivax Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
29
BAHAN DAN METODA
nitrat yang berdiameter 25 mm dengan
Bahan Penelitian
ukuran pori 0,22 µm dengan media spider.
Bahan
yang
akan
digunakan
dalam
Membran
selulosa
yang
sudah
penelitian ini diantaranya adalah bacto agar
disterilkan diletakkan diatas media biofilm
(Difco), dektrosa (Difco), pepton (Oxoid),
dengan
yeast
(Merk),
Selanjutnya 50 µl inokulum C. albicans
Na2HPO4.7H2O
dengan Optical Density (OD) 0,5 pada λ
extract
NaHCO3
(Merck),
(Merck),
NaCl
menggunakan
pinset
steril.
(Merck),
NaH2PO4
(Merck),
spiritus,
469 nm diteteskan pada membran filter
aquades,
L-Manitol
(sigma),
glukosa,
selulosa
reagen Lowry, reagen DNS.
nitrat
yang diletakkan diatas
permukaan media spider dalam cawan petri dan diinkubasi pada 370C selama 1 jam.
Pembuatan Pellet sel Candida albicans
Cawan
petri
selanjutnya
dibalik
Pembuatan pellet sel planktonik Candida
inkubasi dilanjutkan selama 24 jam.
dan
Biofilm yang terbentuk dipisahkan
albicans Setelah dikocok (shaker) 24 jam, 100
dari membran untuk diresuspensi dengan
ml inokulum C. albicans dalam media cair
larutan PBS steril. Suspensi disentrifus pada
YPD (Yeast Peptone Dextrose) disentrifus
kecepatan 1000 rpm selama 15 menit.
pada 10.000 rpm dan suhu kamar selama 15
Residu hasil sentrifus ini disebut pelet
menit. Pellet yang diperoleh dicuci dengan
biofilm
0,1 M buffer fosfat salin (PBS) steril.
selanjutnya disimpan dalam kulkas untuk
Proses pencucian ini dilakukan dua kali.
penelitian selanjutnya.
sel
Candida
albicans
yang
Endapan sel C. albicans yang diperoleh disebut sebagai pellet sel planktonik.
Isolasi Enzim dari bekicot (Achatina fulica)
Pembuatan pellet biofilm Candida
Panen enzim dari Achatina fulica
albicans
Bekicot,
Achatina
fulica
yang
telah
Pembuatan biofilm dilakukan sesuai
dikarantina selama lebih dari 3 hari, maka
dengan metode Samaranayake, et al (2005)
akan siap untuk dipanen. Pengambilan
dan Merrit, et al (2005) yang telah
cairan digestive gland dilakukan dengan
dimodifikasi
13
. Biofilm
C. albicans
cara aseptis. Achatina fulica dipotong
ditumbuhkan pada membran filter selulosa
bagian sutura, dan cairan yang didapat ditampung dalam beaker glass yang telah
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
30
direndam dengan es dengan suhu 2 – 5 ºC.
yaitu larutan A, B, C dan D terlebih dahulu.
Cairan yang didapat kemudian disentrifus
Selanjutnya mencampurkan 0,5 ml sampel
dengan kecepatan 4000 rpm selama 5-10
enzim dan 2,5 ml larutan C. Pencampuran
menit dengan suhu 2 – 5 ºC. Setelah
kedua larutan tersebut divortex selama 5-10
disentrifus didapat endapan dan supernatan
menit. Selanjutnya ditambah dengan 0,25
terpisah. Supernatan tersebut merupakan
ml larutan D, setelah itu diinkubasi selama
ekstrak kasar enzim yang telah terpisah dari
20 menit, kemudian diukur absorbansinya
kotoran dan selanjutnya di uji aktivitas
14.
pada
panjang
gelombang
750nm.
Absorbansi yang diperoleh diplotkan pada Penentuan aktivitas enzim Achatina fulica
persamaan regresi liner yang diperoleh dari
Aktivitas enzim β-1,3-glukanase ditentukan
kurva standar larutan standar protein BSA.
dengan cara mengukur banyaknya gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis
Ekstraksi Protein planktonik dan biofilm
substrat laminarin (SIGMA). Sebanyak 750
C. albicans secara enzimatis dan mekanik
μl substrat laminarin 1% ditambah dengan 75 μl enzim sampel (3%) kemudian
Ekstraksi protein plantonik C. albicans
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit.
Ekstraksi
Hasil inkubasi ditambah 450 μl pereaksi
menggunakan
DNS (3,5-dinitrosalisilic acid) kemudian
dimodifikasi
dimasukkan dalam penangas air mendidih
inokulum C. albicans diresuspensi dengan
dan dipanaskan selama 15 menit. Setelah
KCl 0,6M dan disentrifuge pada kecepatan
itu segera didinginkan dalam air es selama
1000 rpm selama 15 menit. Pelet yang
20 menit. Aktivitas enzim diukur dengan
dihasilkan
spektrofotometer pada panjang gelombang
posfat pH 7 dan ditambah dengan enzim
550
diperoleh
Achatina fulica. Campuran diagitasi pelan
diplotkan pada persamaan regresi linier dari
pada suhu 28oC selama beberapa jam.
kurva standar larutan glukosa.
Selanjutnya campuran disentrifuge dingin
nm.
Absorbansi
yang
protein
dilakukan
metode
15
dengan
Casanova,
yang
. Pelet sel hasil sentrifugasi
diresuspensi
dengan
buffer
pada kecepatan 2600 rpm selama 10 menit. Penentuan kadar protein Pengukuran kadar protein dari enzim bekicot dilakukan dengan menggunakan metode Lowry, dengan membuat 4 larutan
Supernatan yang diperoleh disentrifuge ulang pada kecepatan 20000 rpm selama 30 menit.
Supernatan
merupakan
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
ekstrak
yang protein
dihasilkan ekstrasel 31
Planktonik
(PEP)
dan
diuji
kadar
diresuspensi
dengan
buffer
posfat,
proteinnya.
Pelet hasil sentrifus I dan II
selanjutnya disonikasi selama 10 menit (10
digabung
diresuspensi dengan buffer
x
60 detik) pada suhu dingin. Suspensi
posfat, selanjutnya disonikasi selama 10
hasil sonikasi disentrifuge selama 30 menit
menit (10 x 60 detik) pada sauhu dingin.
dengan kecepatan 17.500 rpm. Supernatan
Suspensi hasil sonikasi disentrifus selama
yang dihasilkan disebut ekstrak protein
30 menit dengan kecepatan 17.500 rpm.
intrasel Biofilm (PIB) dan selanjutnya diuji
Supernatan yang dihasilkan disebut ekstrak
kadar proteinnya. Baik PEB maupun PIB
protein
dan
dipekatkan melalui liofilisasi dengan freeze
selanjutnya diuji kadar proteinnya. Baik
dryer dan disimpan pada suhu -20oC untuk
PEP
uji selanjutnya sehingga dapat digunakan
intrasel
plantonik
(PIP)
maupun PIP dipekatkan melalui
liofilisasi dengan freeze dryer dan disimpan
sebagai bioreseptor pada immunodot assay.
pada suhu -20oC untuk diuji sebagai Persiapan/Preparasi Sampel Serum
bioreseptor pada immunodot assay.
Darah Pasien yang Terinfeksi C.albicans Ekstrasi protein Biofilm C. albicans
Pasien yang menderita kandidiasis (pasien
Pelet sel hasil sentrifugasi suspensi biofilm
Diabetes Militus, atau ODHA) diambil
C. albicans diresuspensi dengan 10 ml KCl
sampel darahnya. Darah yang diperoleh
0,6M
dialirkan ke lereng media miring SDA
dingin
dan
disentrifuse
pada
kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.
secara
Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan
dalam
buffer posfat pH 7 dan ditambah dengan
melapisi permukaan SDA dibiarkan sampai
enzim Achatina fulica. Campuran diagitasi
tumbuh jamur dan selanjutnya dikultur.
pelan pada suhu 28 oC selama beberapa jam.
Sedangkan
Selanjutnya campuran disentrifus dingin
disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm,
pada kecepatan 2600 rpm selama 10 menit.
pada suhu 4oC selama 15 menit untuk
Supernatan yang diperoleh disentrifus ulang
mendapatkan serum dan disimpan pada
pada kecepatan 20000 rpm selama 30
suhu -20 oC untuk dilakukan penelitian lebih
menit.
lanjut sebagai antibodi anticandida pada
Supernatan
merupakan
ekstrak
yang protein
dihasilkan ekstrasel
aseptis dan sisanya ditampung tabung
dispstik
Vacutiner.
darah
Immunodot.
dalam
negatif digunakan darah
Pelet hasil sentrifuse I dan II digabung
(normal)
yang
vacutiner
Sebagai
Biofilm (PEB) dan diuji kadar proteinnya.
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
Darah
kontrol
orang sehat
32
Immunodot Assay
kamar selama 30 menit. Setelah dicuci 3 x
Optimasi penempelan antigen
menggunakan buffer Tris-Cl, ujung dipstick
Larutan antigen diencerkan menggunakan
dimasukkan ke dalam sumuran yang berisi
buffer carbonat pH 9,6 sehingga diperoleh
200 ul larutan koloid emas yang diikat
serial kadar protein 1,0; 1,5; 2,0 2,5; dan
Protein A dan diinkubasi selama 15 menit
3,0 ng/ul. Sebanyak 3 ul antigen diteteskan
pada suhu kamar. Dipstick kemudian dicuci
pada
3 kali dan diamati adanya spot berwarna
permukaan
menggunakan
plastik
akan
merah. Hasil dikatakan positif bila timbul
membentuk spot tidak berwarna. Setelah
spot warna merah penuh. Hasil dikatakan
dikering anginkan, antigen difiksasi dengan
negatif bila tidak terbentuk spot berwarna
merendamnya dalam methanol selama 5
merah
menit dan dikeringkan kembali. Stabilisasi
membentuk lingkaran.
bagian
antigen
mikropipet
polystirene
ditutup
yang
dengan
atau
spot
yang
tidak
utuh
cara
mencelup ke dalam larutan 10% sukrosa,
Teknik Pengumpulan dan Analisis Data
dikeringkan anginkan, kemudian disimpan
Pengumpulan data dalam penelitian ini
o
pada 2 C hingga digunakan.
dilakukan dengan menggunakan metode observasi/pengamatan spot yang terbentuk
Optimasi volume serum
selama dilakukan eksperimen laboratorik
Optimalisasi volume serum menggunakan
melalui uji distick imunodot. Pengolahan
serum kontrol positif sebanyak 2 sampel
data hasil pengamatan dilakukan secara deskriptif dan disajikan dalam bentuk tabel.
Uji
anti-candida
dengan
distick
imunodot
HASIL
Sebanyak 50 ul serum dimasukkan ke
Isolasi Enzim bekicot, Achatina fulica
dalam sumuran mikroplate flat-bottomed
Dari 15 ekor bekicot diperoleh cairan
yang telah terisi 150 ul Tris-HCl pH 7,2.
bening kebiruan sebanyak 60 ml (Gambar
Kemudian dimasukkan ujung dipstick ke
1). Ekstrak enzim ini memiliki kadar
dalam sumuran dan diinkubasi pada suhu
protein sebesar 1,35 mg/ml.
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
33
Gambar 1. Cairan disgestive gland bekicot Hasil
uji
aktivitas
glukanase
dihitung sebagai glukosa permenit permili
menunjukkan bahwa ekstrak enzim bekicot
pada kondisi percobaan.
pada penelitian ini memiliki aktivitas
Ekstraksi protein C. albicans secara
sebesar 2,649 unit/ml dan aktivitas spesifik
enzimatis dan mekanik
sebesar 1,958 unit/mg. Unit aktivitas enzim
Kadar protein PEP (protein ekstrasel
diartikan Definisi 1U (unit) aktivitas adalah
planktonik), PEB (protein ekstrak Biofilm),
jumlah enzim β-1,3-glukanase dalam 1 ml
PIB (protein Intraseluler biofilm), PIP
ekstraks
β-1,3-glukanase
yang
membebaskan 1μmol gula pereduksi yang
(Protein Intraseluler Planktonik) ditentukan dengan menggunakan metode Lowry.
Gambar 2. Kadar protein hasil lisis matrik biofilm dan dinding sel C. albicans
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
34
Immunodot Assay Tabel 1. Hasil optimasi konsentrasi antigen Jumlah Ag ditempel ng/uL 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5
Sampel kontrol C+ (100 uL) C+ C+ C+ C+ C+
Spot warna merah
Hasil
Ada Ada Ada Ada Tidak ada
+ + + + -
Tabel 2. Hasil Optimasi Volume Serum No serum P5
D1
Blanko (0,8% NaCl)
Volume/Pengenceran Serum Kontrol positif 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200
Bentuk Spot
Hasil
Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Ada, tidak utuh
+ + + + + + + + -
Tabel 3. Hasil Uji Anti-Candida dengan distick imunodot No. sampel Kode Spot warna Hasil Keterangan merah
klinis
1
P1
Ada
Pos(+)
ODHA
2
P2
Ada
Pos(+)
ODHA
3
P3
Ada
Pos(+)
ODHA
4
H1
Ada tapi tidak
Neg(-)
Sehat
utuh 5
H2
Tidak ada
Neg (-)
Sehat
6
H3
Tidak ada
Neg(-)
Sehat
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer 2 Edisi Oktober 2014, hal. 26-39
35
HASIL PEMBAHASAN
sekitar 20 jam dibandingkan dengan enzim
Isolasi Enzim bekicot, Achatina fulica
zymolease, yang hanya berlangsung 2 jam
Menurut Weel, 1961 Enzim siput mengandung enzim β-1,3-glukanase, ββ-1,4-glukanhidrolase,
1,4-glukanase,
enzim kitinase, xilase, selulase, lichenase,
15
. Hal ini disebabkan enzim zymoliase
memiliki
aktivitas
jauh
lebih
tinggi
dibandingkan ekstrak enzim Achatina fulica.
inulase, hemiselulase, amilase, maltase,
Penelitian ini mengasilkan empat
dan sukrase. Berhubung komponen utama
jenis ekstrak protein yaitu ekstrak protein
dinding sel Candida albicans adalah
PEP (protein ekstrasel planktonik), PEB
glukan maka pada ekstrak enzim Achatina
(protein ekstrasel biofilm), PIP (protrein
fulica ini diuji aktivitas glukanase dengan
ekstrasel planktonik), dan PIB (protein
menggunakan substrat laminarin (1,3--
ekstrasel biofilm). Ekstrak protein PEP
glukan).
β-1,3-
dan PEB memiliki kadar protein lebih
glukanase diukur dari kadar gula reduksi
tinggi dari pada PIP maupun PIB. Hal ini
hasil reaksi antara enzim dengan substrat.
disebabkan
Gula pereduksi berhubungan erat dengan
enzim Achatina fulica ikut larut bercampur
aktivitas enzim, semakin tinggi aktivitas
dengan ekstrak protein ekstrasel.
Uji
aktivitas
enzim
pada
proses
sentrifugasi,
enzim maka semakin tinggi pula gula pereduksi yang dihasilkan. Gula reduksi merupakan golongan gula (karbohidrat) yang
memiliki
mereduksi
kemampuan
dikarenakan
adanya
Immunodot Assay Pada uji anti-Candida
dipstick
untuk
imunodot dilakukan optimasi pemilihan
gugus
dan konsentrasi antigen dari ekstrak protein yang diperoleh dari penelitian ini.
aldehid atau keto bebas.
Pada optimasi penempelan antigen pada Ekstraksi protein C. albicans secara
kertas polistyrena
menunjukkan bahwa
enzimatis dan mekanik
ekstrak protein PIP, PEP maupun PEB albicans
memberikan spot warna coklat kekuningan
diperoleh melalui lisis matrik biofilm dan
pada kertas polistyrena sedangkan ekstrak
dinding
protrein PIB tidak memberikan spot.
Ekstrak
sel
protein
C.
C.
albicans
dengan
menggunakan enzim Achatina fulica dan
Munculnya
disempurnakan
sonikasi.
dikhawatirkan dapat menganggu warna
Proses lisis enzimatis dengan enzim
spot yang ditimbulkan oleh signal reagent
Achatina fulica berlangsung lebih lama
pada uji imunodot assay. Oleh karena itu
dengan
cara
spot
warna
coklat
ekstak protein yang dipilih sebagai antigen Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer2 Edisi Oktober 2014, hal 26-39
36
pada uji anti-Candida dipstick imunodot
serum pasien
adalah ekstrak protein PIB dan selanjutnya
dengan protein A sehingga memberikan
dilakukan optimasi konsentrasi antigen.
signal berupa spot merah. Spot merah yang
Berdasarkan
hasil
optimasi
membentuk kompleks
muncul menunjukkan bahwa serum pasien
konsentrasi antigen, ekstrak protein PIB
terinfeksi
memberikan respon berupa spot
merah
protein PIB bisa diaplikasikan sebagai
terhadap serum pasien kandidiasis yang
bioreseptor pada imunosensor GICA (Gold
positif kultur sampai pada konsentrasi 1,0
Imunocromatography
g/l. Pada konsentrasi terkecil 0,5g/l
penelitian selanjutnya. Keakuratan dan
tidak
dengan
sensitivitas uji dipstick imunodot ini belum
yang
dilakukan pada penelitian ini, sehingga
dipakai dalam penelitian ini adalah 1,0
perlu juga dilakukan penelitian lanjutan
g/l dengan volume serum 50ul atau
dengan membandingkannya pada metode
pengenceran ¼.
serologi lain seperti ELISA.
memberikan
demikian
respon,
konsentrasi
Uji
antigen
pendahuluan
Candida
albicans.
Ekstrak
Assay)
pada
diagnosa
kandidiasis dengan menggunakan dipstick
KESIMPULAN
imunodot telah berhasil dilakukan dengan
Berdasarkan penelitian yang telah
menggunakan
dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa
beberapa
serum
pasien
ODHA (Orang dengan HIV-Aids) dan
1. Ekstrak enzim bekicot, Achatina
orang sehat. Pada penelitian ini, antigen
fulica
direndam bersama serum pasien dalam
melisis matriks biofilm maupun
sebuah sumuran
dinding sel Candida albicans
dengan tujuan terjadi
memiliki
potensi
untuk
ikatan antigen-antibodi yang selanjutnya
2. Ekstrak protein intrasel biofilm
direaksikan dengan signal reagent (protein
(PIB) memiliki potensi sebagai
A yang dilabel dengan koloid emas).
bioreseptor pada imunosensor
Protein A menyerupai antibodi sekunder
3. Pemeriksaan anti-Candida dengan
dengan mengikat Fc antibodi primer
uji dipstick immunedot dilakukan
sehingga
pada konsentrasi antigen 1,0g/L
immunodot
pada
uji
assay
diagnosa ini
tidak
dengan perlu
dengan volume serum 50 L
menggunakan antibodi sekunder. Protein A berikatan dengan IgG yang berasal mamalia.
Antigen berikatan dengan
antibodi anti-Candida yang terdapat dalam
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer2 Edisi Oktober 2014, hal 26-39
37
SARAN Berdasarkan hasil penelitian ini maka disarankan : 1. Mengaplikasikan ekstrak protein PIB sebagai
bioreseptor
pada
GICA
(Gold
imunosensor
Immunocromatography Assay) pada penelitian selanjutnya. 2. Menguji keakuratan dan sensitivitas uji
dipstick
imunodot
membandingkannya dengan metode serologi lain seperti ELISA. 3. Mengidentifikasi
profil
protein
antigenik spesifik biofilm Candida albicans sebagai
sehingga bisa dijadikan kandidat
biomarker
kandidiasis
UCAPAN TERIMAKASIH Kami ucapkan terimaksih yang sebesarbesarnya kepada Dijen DIKTI yang telah memberikan dana pada hibah penelitian
3. Verma, A., J.J. Wade, P. Cheeseman, B. Samaroo, M. Rela, N.D. Heaton, G. Mielivergani, and A. Dhawan. Risk factor for fungal infectionin pediatric liver transplant resipient. Pediatr transplant. 2005. 9(2) : 220-225. 4. Ellepola, A.N. and C.J. Morrison. Laboratory diagnosis of invasive candidiasis. J Microbiol. 2005. 43 : 65-84. 5. Baratawidjaja, K.G. Imunologi Dasar. Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2014. Edisi 11. 6. Na, B.K. and C.Y. Song. Use of monoclonal antibody in diagnosis of candidiasis caused by Candida albicans; detection of circulating aspartyl proteinase antigen. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. 6 : 924929 . 7. Oliver, S. L. Trovato, P. Betta, M.G. Romeo, G. Nicoletti. Experience with the platelia candida ELISA for the diagnosisof invasive candidiosis in neonatal patiens. Clin. Microbiol. Infect. 2008. 14 : 391-393.
DAFTAR PUSTAKA
8. Sacher dan Pherson. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Edisi 11. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. 2004.
1. Brown, M.R., C.A. Thomson, and F.M. Mohamed. Systemic candidiasis in an apparently immunocompetent dog. J Vet Diagn Invest. 2005. 17(3) : 272-276.
9. Parkison, G. and B. Pejcic. Using Biosensors to detect emerging infectious diseases. Nanochemistry Research Institute, Perth, Western Australia. 2005.
pemula ini
2. Wilson, C. Recurrent vulvovaginitis candidiasis; an overview of traditional and alternative therapies. Adv Nurse Pract. 2005. 13(5) : 24-29.
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer2 Edisi Oktober 2014, hal 26-39
38
10. Peng, D.P., S.S. Hu, Y. Hua, Y.C. Xiao, Z.L. Li, X.L. Wang and D.R. Bi. Comparation of new goldimmunichromatigraphic assay for the detection of antibodies agains avian influenza virus with hemagglutination inhibition and agar gel immunodiffusion assays. Veter Immunol Immunop. 2007. 17 : 17-25.
12. Samaranayake, LP, W.K. Leung, and L. Jin. Oral mucosal fungal infections. Periodontol 2000. 2009. 49 : L39-59.
11. Dewi, L.S.K. Imunosensor untuk Mendeteksi Imunoglobin G terhadap Toxoplasma gondii dengan Metode GICA menggunakan Ekstrak ESA sebagai Bioreseptor. Tesis.departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Unair. 2010.
14. Casanova, M. and W. Lajean Chaffin, Cell wall glycoproteins of Candida albicans as released by different methods. Journal of general Microbiology. 1990. 137 : 1045-1051.
13. Kholifah, Ayu. Pemurnian Parsial, Uji Aktivitas dan Stabilitas Enzim Kitinase dan -glukanase. Skripsi. Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Unair. 2013.
15. Wheel, B.P. Van. The Comparative Physiologi of Digestion in Molluscs, AM. Zoologis, Department of Zoology and Entomology, University of Hawaii, USA. 1961.
Reviewer Dr. Dorta Simamora, dra., M.Si
Jurnal “Ilmiah Kedokteran” Volume 3 Nomer2 Edisi Oktober 2014, hal 26-39
39
