Identifikace genetických polymorfismů ve vztahu k výkonnosti a zdraví u dojeného skotu

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra speciální zootechniky

Identifikace genetických polymorfismů ve vztahu k výkonnosti a zdraví u dojeného skotu Disertační práce

Doktorand:

Ing. Mgr. Jana Bolečková

Školitel:

Prof. Ing. Ladislav Štolc, CSc.

Konzultant:

Ing. Jitka Matějíčková, PhD., Ing. Mojmír Vacek, CSc.

Praha 2011

Obsah 1.

Úvod ...................................................................................................................................1

2.

Literární přehled ..............................................................................................................2 2.1.

Český strakatý skot .....................................................................................................2

2.2.

Mléčná užitkovost.......................................................................................................2

2.2.1.

Složení kravského mléka ....................................................................................2

2.2.2.

Mastitida a počet somatických buněk.................................................................3

2.2.3.

Vlivy působící na mléčnou užitkovost ...............................................................4

2.3.

Využití molekulární genetiky ve šlechtění skotu........................................................5

2.4.

Vybrané polymorfismy...............................................................................................6

2.4.1.

PPARGC1A........................................................................................................6

2.4.2.

SPP1..................................................................................................................11

2.4.3.

Prolaktin............................................................................................................14

2.4.4.

CYP11B1..........................................................................................................19

2.5.

Metody genotypování ...............................................................................................22

2.5.1.

PCR...................................................................................................................22

2.5.2.

Restrikční štěpení..............................................................................................24

2.5.3.

Elektroforetické stanovení výsledků PCR a restrikční reakce..........................24

2.6.

Vazebná nerovnováha...............................................................................................25

3.

Hypotéza ..........................................................................................................................26

4.

Cíl .....................................................................................................................................26

5.

Materiál a metodika .......................................................................................................27 5.1.

Sledovaná populace ..................................................................................................27

5.2.

Genetická analýza souboru .......................................................................................27

5.2.1.

Izolace DNA .....................................................................................................27

5.2.2.

Stanovení jednotlivých polymorfismů..............................................................28

5.2.2.1.

PPARGC1A..............................................................................................28

5.2.2.2.

SPP1..........................................................................................................28

5.2.2.3.

bPRL.........................................................................................................29

5.2.2.4.

PRLE ........................................................................................................29

5.2.2.5.

CYP11B1..................................................................................................30

5.3.

Průběh elektroforézy a vyhodnocení ........................................................................30

5.4.

Statistická analýza ....................................................................................................31

6.

Výsledky a diskuse..........................................................................................................33 6.1.

Základní charakteristika sledovaného souboru.........................................................33

6.2.

Genotypová a alelová struktura populace.................................................................34

6.3.

Výsledky asociačních analýz....................................................................................35

6.3.1.

PPARGC1A......................................................................................................37

6.3.2.

SPP1..................................................................................................................38

6.3.3.

CYP11B1..........................................................................................................39

6.3.4.

bPRL.................................................................................................................40

6.3.5.

PRLE ................................................................................................................42

6.3.6.

bPRLE a vazebná nerovnováha ........................................................................45

7.

Souhrn a závěr ................................................................................................................47

8.

Seznam literatury

Seznam zkratek Příloha

Tímto bych chtěla poděkovat svému školiteli Prof. Ing. Ladislavu Štolcovi, CSc. a svým konzultantům Ing. Jitce Matějíčkové, PhD. a Ing. Mojmíru Vackovi, CSc. za pomoc při zpracování této práce. Děkji rovněž všem spolupracovníkům z oddělení Chovu skotu a oddělení Molekulární genetiky VÚŽV, v.v.i za jejich pomoc a podporu, jmenovitě Ing. Miloslavě Štípkové, Ing. Jaroslavě Šefrové, Michaele Krejčové a Ing. Daliborovi Řehákovi, PhD.

Práce byla vypracována v rámci projektů NAZV QH71275 a QH91270 a výzkumného záměru MZE0002701404 ve Výzkumném ústavu živočišné výroby, v.v.i. v Praze-Uhříněvsi.

Prohlašuji, že tuto práci na téma "Identifikace genetických polymorfismů ve vztahu k výkonnosti a zdraví u dojeného skotu" jsem vypracovala samostatně a s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou citovány v práci a uvedeny v seznamu literatury na konci práce.

V Praze dne 17.května 2011

...........................................

1. Úvod O produkčních vlastnostech a zdravotním stavu rozhoduje genetické pozadí jedince. Jelikož jsou tyto vlastnosti určující v souvislosti s rentabilitou, znalost jejich genetické podmíněnosti může vést k zefektivnění šlechtění i vlastního chovu skotu. Genetika patří k celosvětově se rozvíjejícímu odvětví. Chov skotu není výjimkou. Zde je dnes v popředí zájmu především genomická selekce. Genomika umožňuje získat velké množství dat, které je ovšem problém interpretovat. Základní výzkum a práce jen s několika vybranými geny naopak umožňuje zaměřit se pouze na malou část problematiky a hledat nové souvislosti. V současné době tak vznikají týmy, které se snaží o propojení výsledků z genomiky s celosvětovými výsledky ze základního výzkumu a tímto o spojení výhod obou těchto postupů. V chovu skotu budou takové znalosti důležité nejen pro selekci zvířat, ale i pro prevenci onemocnění a výrobu molekulárně orientovaných léčiv. Vzhledem k dlouhé tradici a množství po generace shromažďovaných dat se šlechtění skotu může stát základnou pro výzkum genomiky i u dalších organismů. Díky komplexním databázím pak mohou být znalosti z oblasti molekulární genetiky skotu uplatněny při pochopení molekulárně genetických drah např. i u člověka. Český strakatý skot je plemeno, které je propojeno s celosvětovou genetickou základnou strakatého skotu. Přesto si zachovalo určitou jedinečnost (genová rezerva). Je tedy vhodné zjistit, na kolik se genetické vzorce zjištěné u jiných plemen a populací uplatňují u tohoto plemene, neboť reanalýza těchto asociací u izolované skupiny skotu může být důležitá pro pochopení vlivu jednotlivých genů na mléčnou užitkovost.

1

2. Literární přehled 2.1. Český strakatý skot Český strakatý skot, plemeno kombinovaného užitkového typu, je původním plemenem skotu na území České republiky a je součástí celosvětové populace strakatých plemen shodného fylogenetického původu. Na celkových stavech skotu v České republice se toto plemeno podílí v současné době přibližně jednou polovinou (Svaz chovatelů českého strakatého skotu, 2010). Původní plemena skotu na našem území, jako české a chebské červinky, žlutky, skot hřbínecký, skot kravařský, byla již od druhé poloviny 19. století zušlechťována švýcarským strakatým skotem. Především na dovozu tohoto plemene se vytvářel základ chovu českého strakatého skotu. Byl křížen i s plemenem pincgavským a zilertallerským. V 50. letech bylo využíváno křížení s ayrshirským, švédským červenobílým a dánským červeným skotem především pro zvýšení dojivosti a od 70. let i skotem červeným holštýnským. Dále byli a stále jsou využívání býci fylogeneticky příbuzných plemen (Urban et al., 1997). Chovný cíl plemene je zaměřen na vysokou a hospodárnou produkci kvalitního mléka a masa. Cílovým požadavkem v dlouhodobější perspektivě je produkce 6 000 až 7 500 kg mléka za laktaci a s obsahem bílkovin nad 3,5 %. V masné užitkovosti je pak cílem průměrný denní přírůstek nad 1 300 g v intenzivním výkrmu býků a jatečná výtěžnost nad 58 % (Svaz chovatelů českého strakatého skotu, 2010). Dojivost krav českého strakatého skotu v kontrole užitkovosti za rok 2009 byla 6457 kg mléka, což bylo na 74 % úrovni oproti holštýnskému skotu, s obsahem tuku 4,02 % (259 kg) a bílkovin 3,43 % (221 kg) (Kvapilík et al., 2010).

2.2. Mléčná užitkovost Mléko obsahuje komponenty důležité pro přežití a vývoj narozených savců. Jsou to zdroje energie (tuky a karbohydráty), bílkoviny jako zdroje aminokyselin, vitamíny, minerály jako elektrolyty, a voda (Frandson et al., 2003).

2.2.1. Složení kravského mléka Zralé kravské mléko obsahuje asi 88% vody, 5 % laktózy, 3,3 % proteinů a 3.7% tuku (Sedmíková, 2006). Složení krmné dávky stejně jako fáze laktace ovlivňují složení mléka. Dieta s vysokým podílem sacharidů je spojená s vysokým procentem tuku v mléce. Krmná dávka

2

s vysokým podílem proteinů zvyšuje procento bílkovin i v mléce. Podíl mléčného cukru dietou příliš ovlivněn není. Procento tuku a bílkovin je vysoké na začátku laktace několik týdnů, poté na 3 až 4 měsíce klesá a vzrůstá zase s klesající celkovou produkcí mléka ke konci laktace. Lipidy jsou v mléce především ve formě triglyceridů. Ty se skládají z glycerolu a mastných kyselin. Mastné kyseliny jsou vychytávány z krve nebo jsou syntetizovány přímo v buňkách mléčné žlázy. U přežvýkavců jsou prekurzorem mastných kyselin mléčného tuku acetát a β-hydroxybutyrát. Acetát i β-hydroxybutyrát vznikají fermentačním metabolismem mikroorganismů v bachoru a přecházejí zde rovnou do krve. Glycerol vzniká především z glukózy procesem glykolýzy. Kaseiny jsou syntetizovány v buňkách mléčné žlázy s využitím aminokyselin z krve jako prekurzorů. Stejně tak α-laktoalbumin a β-laktoglobuliny. Sérum albumin a imonoglobuliny jsou produkovány játry a lymfocyty. Laktóza je disacharid skládající se z glukózy a galaktózy. Glukóza je syntetizována v játrech procesem glukoneogeneze z propionové kyseliny, jejímž zdrojem jsou fermentační procesy v bachoru. Z krve pak přechází glukóza do buněk mléčné žlázy, kde je část přeměněna na galaktózu a následně jsou tyto dva monosacharidy spojeny v laktózu (Frandson et al., 2003).

2.2.2. Mastitida a počet somatických buněk Počet somatických buněk v mléce je využívaným indikátorem detekce onemocnění mléčné žlázy, neboť zvýšený počet buněk (bílé krvinky a buňky epitelu) poukazuje na rozvoj zánětu v mléčné žláze (Blowey a Edmondson, 2010). Mastitida, infekční zánět mléčné žlázy, patří mezi základní zdravotní problémy, s kterými se potýká každý chovatel dojeného skotu. Choroba může postihnout všechny savce, ale zásadní význam má především problematická u dojeného skotu, neboť ovlivňuje kvalitu i kvantitu vyprodukovaného mléka a způsobuje tak chovatelům značné ztráty (Sordillo a Streicher, 2002). Původci jsou patogenní agens, především bakterie, jako je Streptococcus agalactiae, Mycoplasma spp., Staphylococcus aureus, Eschericha coli (Rainard a Poutrel, 1999; Barkema et al., 2009). V ochraně před patogeny se v mléčné žláze uplatňuje jak nespecifická, tak i specifická imunita (Sordillo a Streicher, 2002). Na rozvoji onemocnění má vliv nejen vnější prostředí, jako je management chovu (Sato et al., 2008), ale i genetické založení jedince (Rupp a Boichard, 2003). Díky genetickým studiím bylo nalezeno mnoho

3

QTL (quantitative trait loci), které mají vztah k rozvoji mastitidy (Ogorevc et al., 2009). V severských zemích má šlechtění na rezistenci k mastitidě již svou historii (Rupp a Boichard, 2003). Je jasné, že se k ní mohou vztahovat jak geny spojené s imunitou, tak i produkcí mléka, neboť byl prokázán antagonistický vztah mezi rezistencí k mastitidám a mléčnou užitkovostí (Rupp a Boichard, 2003). Pravděpodobně v důsledku intenzivní selekce na mléčnou užitkovost se prohlubuje metabolická zátěž organismu, a tím dochází u jedince ke snížené imunitě (Sordillo a Streicher, 2002).

2.2.3. Vlivy působící na mléčnou užitkovost Mléčná užitkovost vykazuje značnou variabilitu, neboť na ní má vliv mnoho faktorů, které lze podle Vaňka et al. (2002) rozdělit na: Vnější •

Výživa a krmení – výživa by měla být fázová, tak aby byla zajištěna optimální krmná dávka v průběhu laktace.

•

Technologie chovu - systém ustájení a dojení.

•

Úroveň odchovu jalovic

Vnitřní •

Plemenná příslušnost – jednak užitkový typ (plemena mléčná, kombinovaná a masná), ale i jednotlivá plemena se liší produkcí mléka.

•

Plemenná hodnota rodičů tj. genetické založení jedince – každý jedinec získá od svých rodičů unikátní kombinaci genů, mléčná užitkovost je podmíněna velkým počtem genů; koeficienty dědivosti (h2) jsou u množství mléka a mléčných složek 0,25-0,30; u obsahu mléčných složek (0,25-0,50); u náchylnosti k mastitidám 0,20 (Přibyl a Bouška, 2006).

•

Stáří dojnice – vyjadřuje se pořadím laktace, maximální produkci poskytuje dojnice na 3.-5. laktaci.

•

Zdravotní stav dojnice – negativně působí poruchy metabolismu a infekční choroby.

•

Stadium mezidobí – tj. říje, stádium březosti (v druhé polovině březosti dochází k postupnému poklesu produkce), doba stání na sucho, délka mezidobí.

•

Věk při prvním otelení – se zvyšujícím se věkem prvotelky se zvyšuje produkce mléka na I. laktaci (Vaněk et al., 2002)

4

2.3. Využití molekulární genetiky ve šlechtění skotu Skot má 60 chromosomů, z toho 58 autozómů a dva pohlavní chromosomy. Všechny jsou akrocentrické s výjimkou chromosomu X (Fries a Ruvinsky, 1999). Původní metody šlechtění využívaly fenotypové podobnosti příbuzných jedinců a odtud se usuzovalo na genotyp jedinců a tedy přenos vlastností jedince na jeho potomky (Přibyl, 1997; Jakubec, 1999; Jakubec, 2003). Dnešní znalosti molekulární a buněčné biologie nám pomáhají pochopit založení vlastností a znaků na úrovni molekul – DNA (deoxyribonukleová kyselina), RNA (ribonukleová kyselina), proteinů (Ibeagha-Awemu et.al., 2008). Užitkovost a funkční vlastnosti u skotu mohou být ovlivněny jedním genem. Tyto vlastnosti jsou pak mendelisticky děděné. Mezi takové patří například mutace v genu pro myostatin, která má za následek zdvojené osvalení (Gill et al., 2008). Většina užitkových a funkčních vlastností u dojeného skotu však patří mezi vlastnosti komplexní, ke kterým není možné vytvořit jednoduchý mendelistický model. Genetická predispozice, která je dána kaskádovitě působící řadou genů, se po ovlivnění prostředím projevuje určitou fenotypovou expresí. Polygenetické založení těchto vlastností spočívá v zapojení velkého množství metabolitů, tj. metabolických drah a jejich alternativních cest (Fries a Ruvinski, 1999). Genetické studie zabývající se polygenně ovlivněnými vlastnostmi využívají vazebné a asociační studie. Vazebné studie, tzv. vyhledávání QTL, využívají markerů v určitých oblastech DNA a jejich dědění z generace na generaci ve spojení s fenotypem kvantitativních vlastností. Tak se vyhledávají oblasti chromosomů, na kterých by se mohly vyskytovat geny, které tyto vlastnosti ovlivňují, u skotu je známý tzv. grand-daughter design nebo daughter design, které jsou založeny na tomto principu (Szyda et al., 2005; Holmberg a AnderssonEklund, 2006; Longeri et al., 2006; Buitenhuis et al., 2007). Asociační studie využívají kandidátních genů, tedy polymorfismů v těchto genech, a ty přímo vztahují k určité vlastnosti. Kandidátní geny jsou takové, které jsou zapojeny do metabolismu dané vlastnosti (Liefers et al., 2005; Morsci et al., 2006; Sherman et al., 2008). Pro vazebné studie je potřeba větší počet jedinců, proto je vhodnější na menších populacích provádět studie asociační, kde není třeba sledovat přenos markerů v generacích (Lund, 2008, pers.comm.; Matějíčková et al., 2008). Metody DNA technologie se v dnešní době neustále rozvíjejí a umožňují nám tak stále efektivnější prozkoumávání DNA. Již rutinně využívané metody PCR (polymerázová

5

řetězová reakce), např. RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů), umožňují stanovení většinou pouze jednoho polymorfismu v jedné reakci. Obdobně je tomu u dnes využívaných metod sekvenace. Trendem současnosti se tak stávají sekvenace nové generace, které se neustále zrychlují a zlevňují, a využívání mikročipů, které umožňují stanovení až desetitisíce polymorfismů najednou (Sellner et al., 2007; Smith a Rosa, 2007). Přestože tyto mikročipy dokáží odhalit nejen SNP (jednonukleotidové polymorfismy) odpovědné za vlastnosti určené jedním nebo několika geny, ale dokonce i genomové a chromosomální mutace (Arnold, 2010, pers.comm.), jejich potenciál je i v určení polymorfismů odpovědných za polygenetické vlastnosti. Vývoj zaznamenává nejen molekulárně-biologická technika a technologie, ale i další oblasti, které s rozvojem biologie úzce souvisí, jako jsou výkonnější počítače a dostupnost neustále aktualizovaných internetových databází. Do budoucna tak budou informace z mikročipů, využívané pro asociační metody, propojeny se znalostmi z ostatních oblastí molekulární biologie, pro pochopení komplexního vlivu polymorfismu na organismus (Hedegaard et al., 2009). Rozlišení funkčních mutací od polymorfimů, které jsou s funkčními polymorfismy pouze ve vazebné nerovnováze, také může zlepšit selekci do budoucna, neboť vazebná nerovnováha se mezi určitými alelovými variantami v populaci v průběhu doby vytrácí. Metody šlechtění skotu založené na znalosti genotypu jedinců se mohou uplatnit především u vlastností, které nelze získat během života jedince (kvalita jatečného trupu), nebo je jejich zjišťování časově náročné (mléčná užitkovost dcer). Takovéto metody by mohly např. zefektivnit předselekci býků-testantů (Fries a Ruvinsky, 1999).

2.4. Vybrané polymorfismy 2.4.1. PPARGC1A Lidský PPARGC1A (peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, coactivator 1, alpha; PGC1a) je dlouhý přibližně 67 kb (b - báze), kóduje 798 aminokyselin s celkovou molekulární váhou proteinu 91 kDa (Da – Dalton). Je z 94% shodný s myším orthologem. PPARGC1A protein obsahuje RNA-binding doménu a 2 SR domény (regiony bohaté na serinarginin). Tyto části interagují s C-terminální doménou RNA polymerázy-2. Dále se na něm vyskytují 3 oblasti pro fosforylaci proteinkinázou A (Esterbauer et al., 1999). Bovinní gen pro PPARGC1A o celkové délce 6261 bp se nachází na šestém bovinním chromosomu (BTA) v oblasti BTA6q17–q19. Je rozdělen na 13 exonů. Organizace intronů a exonů mezi lidským a bovinním genem je konzervována. Kódující sekvence je shodná z 94%

6

s lidskou a z 91,1% s myší a krysí kódující sekvencí. Vzniklý protein je pak ve skladbě aminokyselin shodný z 94,9%, 92,3% a 91,7% s lidskou, myší a krysí proteinovou strukturou (Weikard et al., 2005). Bovinní PPARGC1A gen je transkribován do mRNA (messenger RNA), která se skládá z 90 bp dlouhé 5´-UTR (untranslated region) sekvence, 2391 bp dlouhé sekvence kódující 797 aminokyselin, dále dvou konsensus sekvencí AATAAA tzv. polyadenylačních signálů (A-adenin, T-thymin) naznačujících 3´-UTR oblast ve vzdálenosti 1878, respektive 3779 bp od stop kodonu (Weikard et al., 2005). PPARGC1A je exprimován v tkáních s vysokou metabolickou aktivitou, jako je hnědá tuková tkáň, srdce, kosterní svalovina, ledviny, játra, mozek a pankreas (Esterbauer et al., 1999; Nedergaard et al., 2005). Tyto tkáně jsou bohaté na mitochondrie, které jsou díky vyššímu počtu schopny zvládnout zvýšený požadavek na energii (Bonen, 2009). PPARGC1A interaguje s řadou transkripčních faktorů, jako jsou NRF1, NRF2 (jaderné respirační faktory 1, 2) (Wu et al., 1999), PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) αβδ, estrogenem, ERR (estrogen-related receptor) alfa a gamma, glukokortikoidy (VenturaClapier et al., 2008). Hraje klíčovou roli v propojení jaderných receptorů a transkripčního programu adaptativní termogeneze. Zvyšuje transkripční aktivitu PPAR-gamma a thyroidních hormonů na promotor uncoupling proteinů (Puigserver et al., 1998). Je hlavním regulátorem transkripce uncoupling proteinů (UCP), které uvolňují protony z vnitřní mitochondriální membrány a ty se poté nemohou účastnit oxydativní ATP (adenosin trifosfát) syntézy. Známé jsou tři základní uncoupling proteiny - UCP1, UCP2 a UCP3. UCP1 se aktivuje v hnědé tukové tkáni a má termogenetickou funkci. Protony, které se díky jeho aktivitě nepodílejí na oxidativní fosforylaci, jsou využity na produkci tepelné energie (Nedergaard et al., 2005). Zvýšená exprese PPARGC1A byla zjištěna při vystavení organismu nižším teplotám (Oliveira et al., 2004) a v bílé tukové tkáni navozuje typické projevy pro hnědou tukovou tkáň, jako je zvýšená biogeneze mitochondrií a exprese UCP1 (Arany, 2008) UCP2 a UCP3 jsou sekvenčně blízké UCP1, s nímž je jejich aminokyselinová sekvence shodná z 58%. Vzájemně mají vysokou sekvenční podobnost a pravděpodobně vznikly nerovnoměrným crossing-overem, kterému napovídá i sousední umístění na chromosomu (Nedergaard et al., 2005). Přestože snižují membránový potenciál, jejich funkce pravděpodobně nebude termoregulační, ale protekční před nadměrným vznikem superoxidů, tzv. oxidativním stresem. Především polynenasycené mastné kyseliny z membránových fosfolipidů mohou být přeměněny pomocí superoxidů na 4-hydroxy-2-nonenaly (HNE), které pak interagují s UCP proteiny a umožňují jim přenášet protony. Tento samoregulující proces 7

při zvýšené funkci mitochondrií vede ke snížení membránového potenciálu a tím k potlačení vzniku superoxidů (Brand et al., 2004). PPARGC1A je základním regulátorem transkripce a replikace mitochondriální DNA (Wu et al., 1999). Podílí se na regulaci mitochondriální biogeneze v závislosti na podnětech z okolí (Wu et al., 1999; 2006). Je aktivován nedostatkem živin a kyslíku a je tak jedním z hlavních regulátorů mitochondriálních funkcí v závislosti na zvýšené fyzické zátěži (Arany et al., 2008), jednorázové (Terada a Tebata, 2004; Terada et al, 2005) i dlouhodobé (Akimoto et al. 2005; Taylor et al., 2005). Množství PPARGC1A je velmi snížené u jedinců s nižší pohybovou aktivitou a tedy nižší oxidativní kapacitou oproti jedincům se zvýšenou pohybovou aktivitou (Timmons et al, 2006; Wisløff et al., 2005). PPARGC1A je vysvětlujícím článkem v pochopení adaptace mitochondriální boigeneze a funkce v kosterní svalovině a v regulaci substrátového metabolismu v kosterní svalovině (Bonen, 2009). Je více exprimován ve svalech bohatých na svalový typ vláken I, které jsou více odolné při dlouhodobé zátěži. Pokud je ve svalových vláknech typu II navozena zvýšená exprese PPARGC1A, pak zde dochází nejen ke zvýšené oxidativní činnosti mitochondrií a zvýšené odolnosti k zátěži, ale také ke zvýšené expresi proteinů typických pro typ vláken I, jako je myoglobin a troponin I (Lin et al., 2002). Ve stavech, kdy dochází k atrofii svalů, jako je denervace, rakovina, diabetes a selhání ledvin, dochází k výraznému poklesu exprese PPARGC1A. Na druhou stranu navození zvýšené exprese PPARGC1A vede ke snížené indukci genů zapojených do atrofie a ke zpomalení redukce svaloviny (Sandri et al., 2006). Kromě toho se PPARGC1A ukázal jako důležitý indukční faktor angiogeneze (Arany et al., 2008), čímž napomáhá zvýšenému průtoku krve ve svalech a tím snadnějšímu přístupu živin a kyslíku k aktivním mitochondriím. PPARGC1A je také spojován se srdeční mrtvicí, kdy jeho snížená exprese vede ke zvýšenému riziku a naopak zvýšená exprese má nejen protektivní účinek, ale i možné terapeutické využití (Arany et al., 2006). Je považován za zásadní komponent cirkadiánního systému, kde propojuje vnitřní hodiny savců a jejich energetický metabolismus. Dle Liu et al. (2007) je PPARGC1A rytmicky exprimován v játrech a svalovině a stimuluje expresi hodinových genů. PPARGC1A se ukázal jako klíčový faktor energetického metabolismu (Lin et al., 2004) a energetické rovnováhy (Nisoli et al., 2003) a s tím související přežitelnosti (délky života jedince) (Rodgers et al., 2005). PPARGC1A reguluje metabolismus triglyceridů. Dieta s vysokým obsahem tuků popř. infuse lipidů do organismu snižují expresi PPARGC1A (Richardson et al., 2005; Sparks et al., 8

2005). Zvýšená exprese PPARGC1A vede ke snížené syntéze triglyceridů (Zhang et al., 2004) a dále ke zvýšení transportu mastných kyselin do buněk svaloviny (Benton et al., 2008) a stimuluje β-oxidaci mastných kyselin (Arany, 2008; Benton, et al., 2008). PPARGC1A reguluje glykolýzu v játrech (Rodgers et al., 2005) a zvyšuje transport glukózy do buněk (Benton et al, 2008). Je klíčovým modulátorem glukoneogeneze v játrech (Herzig et al., 2001; Yoon et al., 2001; Puigserver et al., 2003). Dle Li et al. (2007) insulin inhibuje PPARGC1A, a tak kontroluje lipidový katabolismus v játrech, když potlačuje glukoneogenezi a oxidaci mastných kyselin. Glukoneogeneze je silně stimulována během hladovění a je aktivována při diabetes mellitus. PPARGC1A je zvýšeně exprimován při inzulínové rezistenci a jeho zvýšená exprese navozuje aktivaci právě glukoneogenetických genů (Herzig et al., 2001). PPARGC1A je zvýšený nejen u pacientů diagnostikovaných na diabetes mellitus II, ale i u jejich potomků (Patti et al., 2003). Přestože dle některých autorů (Ling et al., 2004) je jeho úloha v inzulínové rezistenci, v reakci na změnu hladiny inzulínu v krvi a úloha v rozvoji diabetes mellitus nejasná, lze říci, že zvýšení PPARGC1A ve fyziologických hodnotách zlepšuje inzulínovou senzitivitu a stimuluje inzulínem stimulovaný glukózóvý transport (Bonen, 2009). Ovšem exprese PPARGC1A zvýšená nad fyziologickou hladinu vede ke zvýšení transportu mastných kyselin a jejich akumulaci, což následně navozuje inzulínovou rezistenci (Benton et al, 2008). Dále závisí na tom, v kterém orgánu je zvýšená popř. snížená exprese PPARGC1A navozena. Například absence PPARGC1A pouze v kosterní svalovině vede k dysfunkci β buněk pankreatu a snížené produkci inzulínu (Handschin et al., 2007). Obecně platí, že je-li exprese PPARGC1A navozena v hladině, která není ve fyziologickém rozsahu, dochází u těchto jedinců i k dalším patologickým projevům způsobeným nekontrolovanou proliferací mitochondrií a s ní spojenou ztrátou struktury sarkomér a dilatovanou kardyomiopatií (Lehman et al., 2000). U člověka, myši, psa, krysy, kuřete, dania pruhováného i u skotu byl lokalizován také gen PPARGC1B (Bionaz a Loor, 2008; Entrez Gene, 2010a). Bylo prokázáno, že tyto geny sdílejí řadu funkcí (Lai et al., 2008). PPARGC1A se také podílí na metabolismu mléčné žlázy jak u lidí, tak u myší a přežvýkavců (Weikard et al., 2005). Jeho zvýšená exprese byla korelována se zvýšeným obsahem tuku v mléce (Bionaz a Loor, 2008) a PPARGC1A je uvažován jako stimulující regulátor PPAR-gamma při tvorbě mléčného tuku. Gen pro bovinní PPARGC1A se nachází na 6. chromosomu v blízkosti markeru BM143, který měl v mnoha studiích prokazatelný vliv na obsah a procento tuku i proteinu v mléce, stejně jako na celkové množství mléka (Velmala et al., 1999; Khatkar et al., 2004). 9

Na chromosomu 6 bylo zatím nalezeno nejvíce QTL ve vztahu k mléčné užitkovosti. Ve středu tohoto chromosomu několik studií prokázalo QTL ve vztahu k množství mléka a proteinu v mléce, stejně jako k procentu proteinu a tuku v mléce (Khatkar et al., 2004). V rámci studie Weikarda et al. (2005) bylo nalezeno několik polymorfních míst na bovinním genu pro PPARGC1A. Jedná se o SNP (jedno nukleotidový polymorfismus) na 8. exonu na pozici c.1209T>C (C – cytosin), který nezpůsobí změnu aminokyseliny na pozici 403 proteinu. Další SNP polymorfismus je na pozici c.1847C>T v 9. exonu a vede k záměně leucinu za prolin v aminokyselině 616 (p.Pro616Leu). Dále byly nalezeny dva polymorfismy T/C. Jeden v intronu 1 (c.49–9T>C) a druhý v intronu 9 (c.1892+19T>C). V 3´-UTR oblasti byly nalezeny tři SNP polymorfismy: substituce A/C (c.3359A>C), záměna G/C (c.4223G>C) (G – guanin) a C/T (c.5314C>T). Dále se v této oblasti nachází mikrosatelitní motiv (c.2660– 2709) [(GT)2GC(GT)9+n(GC)5+mGTGCCT(GT)5]. Na 5´-upstream oblasti se nacházejí 3 polymorfismy. Jsou to delece c.-298_-301delCTTT a c.-644_-645delAA a substituce na pozici c.-920G>A. Jedno polymorfní místo bylo také nalezeno v koncové oblasti BAC (bakteriální arteficiální chromosom) BBI_750J07162. Jednalo se o G/A záměnu v pozici 250. Při asociační analýze u německého holštýnského skotu byla nalezena asociace polymorfismů c.3359A>C a c.1892+19T>C s množstvím tuku v mléce (Weikard et al., 2005). Tranzice G/A (c.1181G>A) vedoucí k aminokyselinové záměně (Ser364Asn) a transverse A/T (c.1299A>T) byly u masného skotu v Argentině asociovány s vlastnostmi masné užitkovosti jako je konečná živá váha, výška podkožního tuku, množství ledvinového tuku, zastoupení intramuskulárního tuku a barva masa. Žádná z těchto vlastností nebyla signifikantně asociována s těmito polymorfismy (Soria et al., 2009). Polymorfismy c.1790+514G>A a c.1892+19C>T byly v rámci studie na holandské holštýnsko-fríské populaci skotu hodnoceny ve vztahu k množství vyprodukovaného mléka, včetně obsahu proteinu a tuku a podílu jednotlivých mastných kyselin. Oba polymorfismy PPARGC1A ukázaly signifikantní asociaci s množstvím tuku v mléce (Schennink et al., 2009). Dle Schenninka et al. (2009) by PPARGC1A mohl regulovat desaturaci mastných kyselin přes PPARG, který je regulátorem SCD1 (Stearoyl-CoA desaturáza), která se podílí na desaturaci saturovaných mastných kyselin na cis9-nenasycené mastné kyseliny. Asociační analýza na polském holštýnsko-fríském skotu byla provedena u polymorfismů c.1847C>T (C 0,90 a T 0,10), c.1892+19T>C (C 0,73 a T 0,27) a c.3359A>C (A 0,64 a C 0,36). Druhý polymorfismus měl vliv na obsah proteinu v mléce a na podíl nepřeběhlých jalovic, třetí pak na věk při první inseminaci (Komisarek a Dorynek, 2009).

10

Vliv PPARGC1A na reprodukci by zde mohl být vysvětlen jeho vztahem k estrogenům a estrogenovým receptorům. U

polského

jersey

byly

zkoumány

dva

polymorfismy

genu

PPARGC1A

s následujícími výsledky zastoupení alel T – 0,63 (c.1892+19T>C), A – 0,88 (c.3359A>C) a nejvíce zastoupeným sdruženým genotypem TC/AA – 0,558. Mezi jednotlivými genotypy a znaky mléčné produkce nebyly zjištěny signifikantní asociace narozdíl od sdružených genotypů. Genotyp CC/AC produkoval signifikantně méně mléka a více proteinu (Kowalewska-Luczak et al., 2010). U dvou populací holštýnsko-fríského skotu v USA byly zkoumány dva polymorfismy ve vztahu k mléčné užitkovosti. Prvním byl SNP C/T v pozici c.1892+19T>C PPARGC1A, jehož genotypové frekvence nebyly v Hardy-Weinbergově rovnováze. Deficience TT homozygotů byla vysvětlena pravděpodobnou semiletalitou tohoto genotypu. Druhým polymorfismem byl SNP A/C v pozici c.3359A>C se zastoupením genotypů AA, AC a CC 16,3, 50,6 a 33,1% u jedné populace a 12,3, 43,0 a 44,7% u druhé populace. Tento polymorfismus měl prokazatelný vliv na množství mléka, obsah proteinu v mléce a PSB (počet somatických buněk) (Khatib et al., 2007). SNP c.1892+19T>C neměl vliv na vlastnosti masné užitkovosti u studií provedených Whitem et al. (2007) na křížencích masných plemen v USA.

2.4.2. SPP1 Alternativní názvy a označení – osteopontin (OPN); secreted phosphoprotein 1 (SPP1); osteopontin-K; bone sialoprotein; bone sialoprotein 1; urinery stone protein; early T lymphocyte activation 1 (ETA1) (Entrez Gene, 2010b; Omim, 2010b).

Uprostřed 6. bovinního chromosomu leží také gen pro SPP1, a to ve vzdálenosti přibližně 6 Mb, tedy asi 12 cM (centiMorgan) od genu PPARGC1A (Khatib et al., 2007). Mutace uvnitř genu pro SPP1 pravděpodobně vysvětlují podstatnou část QTL působících v tomto regionu na mléčnou užitkovost (Schnabel et al., 2005). Lidský genom má jednu kopii genu SPP1 (Young et al., 1990) složeného ze 7 exonů, kdy 6 z nich obsahuje kódující sekvenci (Crosby et al., 1995). Mezi savčími druhy existuje v tomto genu vysoká homologita, a to i v jeho organizaci, i když u bovinního genu chybí oproti lidskému dvě krátké sekvence (Sodek et al., 2000). Myší SPP1 mRNA obsahuje dva translační počátky a produkuje tak dva různě dlouhé proteiny 70 a 75 kDa (Shinohara et al., 2008). U člověka je to rozdíl 14 AMK (aminokyselin) 11

(Young et al., 1990). Kratší forma se nachází především v cytoplasmě a je označována jako SPP1-i (intracelulární), delší forma je označována jako sekreční (SPP1-s). SPP1 protein obsahuje několik konzervovaných vazebných motivů, které interagují s integriny (především RGD (arginin-glycin-asparagová kyselina) sekvence), thrombinem, vápníkem, heparinem atd. (Kazanecki et al., 2007). Osteopontin je základní fosforylační glykoprotein produkovaný osteoblasty a osteoklasty v kostní tkáni a je exprimován i v dalších tkáních, jako je dentin (Crosby et al., 1995), intersticiální fibroblasty a kardiomyocyty (Singh et al., 1995; Graf et al., 1997), mozková tkáň (Chabas et al., 2001), ledviny (Kohri et al., 1992; 1993), varlata (Erikson et al., 2007), děloha (Johnson et al., 1999; Kimmins et al., 2004), mléčná žláza (Nemir et al., 2000), hladká svalovina a imunitní orgány. Je vylučován do mnoha tekutin lidského těla např. moči, žluči, mléka (Sørensen et al., 2003), potu a semene (Kazanecki et al., 2007). SPP1 u člověka je exprimován jako 34 kDa nascentní protein, který je dále upravován (Sodek et al., 2000). Post-translační úpravy proteinu SPP1 zahrnují O-glykosylaci, sulfataci a fosforylaci serinu/threoninu, která je vysoce variabilní v různých tkáních a podstatná pro funkci SPP1 v organismu (Kazanecki et al., 2007). Na fosforylaci se podílí hlavně kasein kináza golgiho aparátu (Lasa et al., 1997) a kasein kináza II (Christensen et al., 2005). Díky těmto úpravám se může pohybovat jeho výsledná hmotnost od 25 do 75 kDa (Haylock a Nilsson, 2006). SPP1 v mléce je více fosforylovaný než ten v kostech (Kazanecki et al., 2007). Například u SPP1 v mléce skotu bylo nalezeno 28 fosforylačních míst (Sørensen et al., 1995), v kostech potkanů to bylo pouze jedenáct (Neame a Butler, 1996). Fosforylovaný a nefosforylovaný SPP1 se ukazují mít různou funkci. Zatímco fosforylovaný je ve vazbě s buňkami, nefosforylovaný je solubilní (Sodek et al., 2000). Nefosforylovaný také váže vápenaté ionty a zabraňuje tak srážení kalciových solí a vytváření krystalů, zatímco fosforylovaný tuto funkci nemá. Fosforylace je také důležitá pro resorpci kostí osteoklasty (Razzouk et al., 2002) a jejich adhezi (Ek-Rylander a Andersson, 2010). Zatímco fosforylovaná forma se podílí na tvorbě ledvinových kamenů, nefosforylovaná jejich tvorbě zabraňuje (Hunter et al., 2009; Langdon et al., 2009). Funkčně se SPP1 podílí na adhezi a migraci buněk, na formování extracelulární matrix (Kazanecki et al., 2007), na vaskularizaci a formování, remodelaci a resorbci kostní tkáně, na mineralizaci tkání (Cao a Liu, 2006), ale i na inhibici patologické kalcifikace (Saad et al., 2008), kdy se ukázal např. jako inhibitor kalcifikace artérií (Speer et al., 2002). Je spojován s tvorbou ledvinových (Kohri et al., 1992; 1993) a žlučových kamenů (Ichikawa et al, 2009). Je důležitým faktorem rozvoje osteoporózy u žen v postmenopauze (Yoshitake et al., 1999). Je 12

zapojen to kolagenové fibrilogeneze, a tak má vliv na remodelaci tkání in vivo, např. remodelaci srdečních komor (Graf et al., 1997) a reorganizaci matrix po zranění (Liaw et al., 1998). Dále se podílí na aktivaci buněk imunitního systému, inhibici apoptózy (Kazanecki et al., 2007) a na hojení ran (Sodek et al., 2000). Jeho exprese je zvýšená v mnoha patologických procesech (rakovina, záněty) (Kim et al., 2002) a při infekci a zranění (Kazanecki et al., 2007). Jedním z jeho názvů je ETA-1 (early T lymphocyte activation 1), právě díky podílu na imunitní reakci. Osteopontin je ligandem CD44 (Weber et al., 1996) a je klíčovým cytokininem v imunitní odpovědi typu 1 díky regulaci exprese IL-10 (IL-interleukin) a IL-12 produkovaných makrofágy. Expresi IL-10 potlačuje a expresi IL-2 naopak stimuluje (Ashkar et al., 2000), stejně jako v případě INF-γ (interferon gamma) (Chabas et al., 2001). Je důležitý pro stimulaci Th1 (Th - pomocné T lymfocyty) a Tc1 (cytotoxické T lymfocyty 1) (Shinohara et al., 2005) a jeho exprese je spojena i s TLR9 (toll like receptor 9) (Shinohara et al., 2006) a interferony (Shinohara et al., 2008). Úloha SPP1 se ukazuje i v autoimunitních onemocněních, jako je roztroušená skleróza, přes regulaci Th1 buněk (Chabas et al., 2001). Hraje úlohu v rozvoji revmatické artritidy (Yamamoto et al., 2003). Má pozitivní vliv při zánětlivých onemocněních jater, kdy je produkován NKT buňkami (natural killer T lymfocyty) a vede k jejich aktivaci a také infiltraci a aktivaci neutrofilů (Diao et al., 2004). Bývá spojován i s rozvojem rakovinového bujení (Weber et al., 2010). Je ve zvýšené míře exprimován při obezitě a jeho exprese koreluje s množstvím tělního tuku (Gómez-Ambrozi et al., 2007). SPP1 tak může hrát spojující roli mezi obezitou a inzulínovou rezistencí díky rozvoji zánětu a akumulaci makrofágů v tukové tkáni (Nomiyama et al., 2007). SPP1 se ukázal i jako důležitý faktor pro oplodnění a vývoj zárodku (Gonçalves et al., 2008) Mimo jiné se podílí na změnách spermií při kontaktu s tekutinami vejcovodu, na interakci spermie-vajíčko (Souza et al., 2008) a na prevenci polyspermie (Erikson et al., 2007). Jeho funkce inhibice krystalizace vápníku je mimo jiné zásadní pro zachování motility a fertility spermií (Luedtke et al., 2002). Vyskytuje se na rozhraní zárodku a matky, kde hraje úlohu v implementaci (Erikson et al, 2009). Byl prokázán jeho vliv na rozvoj mléčné žlázy (Nemir et al., 2000), kde je SPP1 vysoce exprimován (Sørensen a Petersen, 1993). V mléce pravděpodobně interaguje s laktoferinem a moduluje jeho antimikrobiální a imunostimulační aktivitu (Yamniuk et al.,

13

2009). Byl prokázán jeho vliv i na obsah komponent mléka, včetně β-kaseinu (Nemir et al., 2000). U holštýnského skotu v Austrálii byla provedena expresní studie genu SPP1 v mléčné žláze in vivo a v buňkách mléčné žlázy in vitro. Byl prokázán vliv tohoto genu nejen na vývoj mléčné žlázy, a to na remodelaci mléčné tkáně během involuce, ale i na expresi mléčného proteinu (Sheehy et al., 2009). Při studii na holštýnském skotu v USA byla zkoumána exprese SPP1 při infekci Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), která je příčinou vzniku Johnesovy choroby. SPP1 se ukázal jako klíčový regulátor proti infekci MAP (Karcher et al., 2008). Na holštýnském skotu v Kanadě byla provedena studie vlivu mutací v genu pro SPP1 na projev mastitidy na základě PSB. S plemennou hodnotou pro PSB byly asociovány polymorfismy SNP SPP1c.-1301G>A, SPP1c.-1251C>T, SPP1c.-430G>A a SPP1c.*40A>C. Polymorfismus SPP1c.-1301G>A měl také efekt na plemennou hodnotou pro množství mléka a procento tuku i bílkovin (Alain et al., 2009). V populaci skotu v USA byl polymorfismus na pozici 3907 ve studii Schnabela et al. (2005) asociován s množstvím mléka u holštýnského skotu a ve studii Whita et al. (2007) u masného skotu (masná plemena a jejich kříženci) s hmotností v roce věku, s živou hmotností při porážce, průměrným přírůstkem po odstavu a hmotností jatečného těla za tepla. Polymorfismus C/T na pozici g.8514C>T v intronu 4 byl u holštýnského skotu v USA asociován v jedné studii s procentem tuku a bílkovin v mléce (Leonard et al., 2005) a v druhé s procentem tuku a bílkovin a množstvím tuku v mléce (Khatib et al., 2007). U polského holštýnsko-fríského skotu měl tento polymorfismus prokazatelný vliv na růst býčků ve 3, 6, a 12 měsících a u jaloviček v 6 a 12 měsících věku s tím, že alela T byla spojována s vyšší hmotností (Pareek et al., 2008). Polymorfismus A/G v intronu 5 a polymorfismus T/G v exonu 7 byly asociovány s procentem bílkovin a tuku u holštýnského skotu v Izraeli a USA (Cohen-Zinder et al., 2005). Asociace polymorfismu 9T/10T u buvola v Indii (Bubalus bubalis) nebyla k vlastnostem mléčné užitkovosti prokázána (Tantia et al., 2008).

2.4.3. Prolaktin Na 23. bovinním chromosomu leží gen pro prolaktin (PRL), a to v blízkosti markeru MGTG7, který má prokazatelný vliv na počet somatických buněk (Heyen et al., 1999; Rupp a Boichard, 2003). Prolaktin hraje důležitou roli ve vývoji mléčné žlázy a v produkci mléka a 14

mutace v tomto genu by mohly mít vliv na mléčnou užitkovost. Prolaktin je také na základě svých funkcí znám jako luteotropní hormon nebo laktogenetický hormon. Lidský PRL se skládá z 5 + 1 exonů a 4 intronů o celkové délce téměř 10 kb (Bachelot a Binart, 2007). Bovinní a krysí prolaktinový gen jsou homologní ze 79 % (Camper et al, 1984). Dle Cao et al. (2002) je nejvíce SNP na down stream kódující oblasti a 3'-UTR oblasti genu, zatímco 5' oblast je vysoce konzervována. V 5' sousední oblasti se nachází enhancer (Wolf et al., 1990). Exprese PRL je řízena dvěma promotory, proximální promotor asi ~5kb upstream od počátku transkripce se uplatňuje v hypofýze, zatímco druhý zahrnuje oblast ~3kb upstream od exonu 1a, asi 6 kb upstream od adenohypofyzárního promotoru, a je spojován s extrahypofyzární expresí (Gellersen et al., 1994). Přestože oba exprimují jinak dlouhou mRNA, produkují shodný protein. Oba jsou řízeny různými kontrolními mechanismy. Exprese v hypofýze je pozitivně regulována Pit-1 (pituitary-specific positive transcription factor 1) a negativně dopaminem, narozdíl od extrahypofyzární genové exprese, která je obecně na těchto dvou transkripčních faktorech nezávislá, i když jsou známé některé výjimky (např. u některých nádorových buněk) (Goffin et al., 2002). Zatímco hypofyzární PRL funguje skrz klasickou endokrinní cestu, nehypofyzární přes autokrinní nebo parakrinní (Bole-Feysot et al., 1998). PRL se váže na specifický PRL receptor (PRLR) skládající se ze dvou shodných podjednotek, který aktivuje několik signálních drah (Goffin et al., 2002). PRL vytváří protein dlouhý 197-199 AMK (po odštěpení 28 AMK dlouhého signálního peptidu) u téměř všech živočichů s výjimkou ryb a váhou ~23 kDa u člověka (Bole-Feysot et al., 1998). Lidský a bovinní prolaktin jsou si blízké a mají shodný počet 199 AMK (Miller, 1981). Je známo mnoho posttranslačních úprav, např. fosforylace, které mohou ovlivňovat jeho funkci (Goffin et al., 2002; Schenck et al. 2003). U bovinního prolaktinu byla nalezena tři fosforylovaná místa a fosforylace v těchto místech ovlivňuje konformaci proteinu (Kim a Brooks, 1993) Prolaktin vykazuje vysokou homologitu (aminokyselinovou i funkční) s GH (růstový hormon) a PL (placentarní laktogen), somatolaktinem a choriovým somatomammotropinem (Miller et al., 1980; Cooke et al., 1981; Bole-Feysot et al., 1998). Pravděpodobně vznikly nestejnoměrným crossing-overem z jednoho genu a jsou členy jedné tzv. PRL/GH/PL rodiny proteinů. Kromě adenohypofýzy je exprimován i v jiných částech mozku, deciduu, myometriu, slzných žlázách, brzlíku, slezině, lymfocytech a lymfoidních buňkách kostní dřeni, savčích epitheliálních buňkách, nádorech, fibroblastech kůže, potních žlázách (Bole-Feysot et al., 1998), endotelu žil (Corbacho et al., 2000), prostatě (Nevalainen et al., 1997), žlutém tělísku 15

(Shibaya et al., 2006). Byl nalezen v mnoha tělních tekutinách, např. v cerebrospinální tekutině, amniocentické tekutině, slzách, mléce, folikulární tekutině a potu (Bole-Feysot et al., 1998). I když původně byl tento hormon známý především jako hypofyzární hormon ovlivňující vývoj mléčné žlázy a laktaci, dnes už je známo jeho zapojení do mnoha dalších funkcí v organismu (Goffin et al., 2002). Dle Bole-Feysota et al. (1998) je známo více jak 300 funkcí prolaktinu, které dále rozděluje do několika skupin: 1) Vodní a elektrolytová rovnováha – PRLR je nejen v ledvinách, ale i dalších orgánech uplatňujících se v elektrolytické rovnováze. PRL redukuje vylučování NA+ a K+ ledvinami (Richardson, 1973) a stimuluje zvýšenou absorpci vody a solí ve střevech (Bole-Feysot et al., 1998) a podílí se na redukci amniové vody (Josimovich et al., 1977). 2) Růst a vývin – v celkovém růstu těla má částečný vliv na celkovou hmotnost (Silverin, 1980). Uplatňuje se při metamorfóze obojživelníků (Platt et al., 1986). Má angiogenetický efekt (Ge et al., 2007), i když pro-tumorová a anti-tumorová aktivita je závislá na jeho isoformě (Struman et al., 1999). Dále má vliv na proliferaci mnoha buněk, jako jsou buňky kůže (Girolomoni et al., 1993), hepatocyty, buňky střevní sliznice, β-buňky pankreatu, buňky hypofýzy, astrocyty, buňky imunitního systému atd. (Bole-Feysot et al., 1998). 3) Endokrinologie a metabolismus – má výrazný vliv na lipidový metabolismus, kdy stimuluje syntézu fosfolipidů a aktivitu lipoprotein lipázy (Ling et al., 2003). Ovlivňuje metabolismus karbohydrátů. Má přímý efekt na aktivaci funkce pankreatu a sekreci inzulínu, snižuje glukózový práh pro sekreci inzulínu a zvyšuje glukokinázu a glukózový transporter-2 (Bole-Feysot et al., 1998). V graviditě stimuluje přes serotonin proliferaci buněk pankreatu a zabraňuje mateřské hyperglykémii (Kim et al., 2010). 4) Mozek a chování – stimuluje genezi, migraci a diferenciaci neuronů v mozku dospělých jedinců (Bachelot a Binart, 2007). Hraje úlohu především v neurogenezi olfaktoriálního centra předního mozku, díky tomu ovlivňuje nejen páření, ale především rodičovské chování (po porodu ovlivňuje mateřské chování) (Frandson et al., 2003; Shingo et al., 2003; Riou et al., 2010). Dále ovlivňuje psychosomatické reakce zahrnující pseudograviditu (Yang et al., 2009), snížení libida (Dissanayake et al., 2009), spánek (Macrea et al., 2010) a další. 5) Reprodukce a) Krmení potomků – stimuluje rozvoj mléčné žlázy během gravidity i laktaci po porodu (Frandson et al., 2003). Ovlivňuje syntézu složek mléka včetně mléčných 16

proteinů, laktózy a lipidů (Bole-Feysot et al., 1998). Jeho zvýšená hladina je u většiny živočichů těsně před porodem. Po porodu ovlivňuje sekreci mléka v alveolách (Frandson et al., 2003). Je primárním induktorem transkripce a zároveň stabilizátorem mRNA u všech genů mléčných bílkovin (Houdebine, 1999). PRL stimuluje produkci serotoninu a serotonin vede k supresi exprese βkaseinu a způsobuje smrštění alveolů (Matsuda et al., 2004). Hladina PRL je závislá na délce dne a to pravděpodobně u skotu ovlivňuje množství vyprodukovaného mléka (Auchtung et al., 2005). Ovlivňuje i růst epitelu stěn volete pro produkci holubího mléka (Kledzik et al., 1975). Dokonce u ryb stimuluje produkci hlenu specializovanými buňkami pokožky, který je určený pro krmení potomstva (Bole-Feysot et al., 1998). b) Funkce vaječníků – jako faktor regulující formaci a destrukci žlutého tělíska je PRL hlavním z regulátorů modulace fyziologických stádií estru, gravidity a laktace. Má přímý vliv na vyzrávání oocytů, organizaci embrya a během gravidity zabraňuje nastoupení dalšího cyklu (Frandson et al., 2003). Je důležitým faktorem formace a aktivity žlutého tělíska, zabraňuje jeho apoptóze (Grosdemouge et al., 2003), stimuluje v něm produkci progesteronu a v granulózních buňkách inhibuje syntézu estrogenů (Bole-Feysot et al., 1998). c) Funkce dělohy – zvyšuje zde počet progesteronových receptorů, stimuluje funkci progesteronu, indukuje ztrátu děložní tekutiny a snižuje progesteronový metabolismus, zvyšuje počet estrogenových receptorů a stimuluje sekreční aktivitu endometria a stimuluje prostaglandiny a fosfolipázu A2 (shrnuto v Bole-Feysot et al., 1998). d) Funkce varlat – stimuluje jejich funkci, zvyšuje počet receptorů luteinizačního hormonu, zvyšuje produkci androgenů, v Sertoliho buňkách zvyšuje počet receptorů folikulostimulačního hormonu. Má vliv na maturaci spermií, zvyšuje jejich energetický metabolismus, ovlivňuje jejich mobilitu a kapacitaci (Mori et al., 1988; Bole-Feysot et al., 1998). Ovlivňuje adrenální steroidogenezi (Glasow et al., 1996). e) Přídatné samčí funkce - u samců ovlivňuje vývoj přídatných pohlavních orgánů (Frandson et al., 2003). 6) Funkce imunoreakční a protekční – je zapojen do proliferace, diferenciace apoptózy mnoha imunitních buněk. Zvyšuje růst sleziny a brzlíku, aktivuje imunostimulační aktivitu submandibulárních žláz a zvyšuje produkci thymulinu. Zvyšuje hormonální a 17

buněčnou imunitu, zvyšuje formaci protilátek (včetně imunoglobulínů IgG a IgM), indukuje buněčnou proliferaci, zvyšuje počet receptorů pro IL-2, inhibuje apoptózu lymfocytů, zvyšuje pravděpodobnost zamítnutí štěpů. Stimuluje DNA syntézu natural killer buněk. Aktivuje makrofágy a produkci superoxidů k zabíjení cizích patogenetických organismů (Bole-Feysot et al., 1998). 7) Funkce spojené s patologickými jevy – s PRL byla asociována hyperprolaktinemie (Hodson et al., 2010), pseudogravidita (Yang et al., 2009) i různé formy nádorů (Jacobson et al., 2010) a autoimunitní onemocnění, jako je lupus a revmatická artritida (Jara et al., 2009).

Známým polymorfismem v bovinním genu pro prolaktin je polymorfismus v pozici g.8398G>A, v kodonu 103. AMK (Sasavage et al., 1982), který byl již sledován u mnoha plemen skotu (Mitra et al., 1995; Chung et al., 1998; Chrenek et al., 1998; Udina et al., 2001; Citek et al., 2001, Chrenek et al., 2003; Brym et al., 2005; Dybus et al., 2005; Khatami et al., 2005; Alipanah et al., 2007; Zatoń-Dobrowolska et al., 2007; Oztabak et al., 2008; WojdakMaksymiec et al., 2008; Mehmannavaz et al., 2009; Lazebnaia et al., 2010; Lü et al., 2010; Sharifi et al., 2010; Tabar et al., 2010). Tento polymorfismus měl vliv na znaky mléčné produkce u plemene jersey (Dybus et al., 2005), obsah tuku v mléce (negativní asociace genotyp AA) u německého holštýnského a yaroslavlského skotu (Khatami et al., 2005). U plemene brown swiss importovaného na Slovensko asociační analýza neprokázala žádný vliv tohoto genotypu na mléčnou produkci (Chrenek et al., 2003). U černostrakatého a červenostrakatého skotu v Rusku byl tento polymorfismus asociován s množstvím mléka a procentem tuku v mléce (Alipanah et al., 2007). U holštýnsko-fríského skotu (červená varianta) v Polsku a čevenostrakatého polského skotu byla nalezena asociace PSB s prolaktinovým genotypem, kdy nejvyšší PSB bylo zjištěno u AA homozygotních krav a nejnižší u GG homozygotních krav (Wojdak-Maksymiec et al., 2008). V další studii v Posku byl genotyp AG spojen s vyšší produkcí mléka a genotyp GG s nejvyšším obsahem tuku u černostrakatého skotu. U jerseyského skotu byl genotyp AA spojován s nejvyšší produkcí tuku (Brym et al., 2005). Alela G měla signifikantně negativní vliv na množství vyprodukovaného mléka a proteinu u iránského holštýnského skotu (Mehmannavaz et al., 2009). Dále byl u skotu nalezen polymorfismus c.-1043A>G v enhanecerové oblasti tohoto genu. U genotypu AA byla prokázána vyšší exprese PRL než u GG, což je dáno různou afinitou tohoto polymorfního místa k transkripčním faktorům (Brym et al., 2007). Studie na stejný polymorfismus byla provedena i u holštýnského skotu v Číně, kde jedinci s genotypem 18

GG vykazovali vyšší produkci mléka a naproti tomu jedinci s genotypem AA vyšší obsah tuku v mléce (Lü et al., 2010). U čínského holštýna byly analyzovány tři SNP polymorfismy v promotorové oblasti a jeden v intronu 1a: A/C (-767), G/T (-485), C/A (-247) a C/T (427). Jeden z těchto SNP v promotoru byl signifikantně asociován s množstvím mléka, proteinu a tuku a obsahem proteinu (He et al., 2006). Dále byla u tohoto plemene provedena studie na SNP v promotoru -402A
2.4.4. CYP11B1 Alternativní názvy - cytochrome P450, subfamily XI B, polypeptide 1; steroid 11-betahydroxylase; P450C11 (Omim, 2010a); CYP11B; P450(11beta) (Boon et al., 1998b).

Gen CYP11B1 leží v centromerické oblasti 14. bovinního chromosomu (Wibowo et al., 2008). Lidský gen obsahuje 9 exonů o 6,5 kb a kóduje protein o sekvenci 503 aminokyselin (Mornet et al., 1989). U skotu má protein molekulární váhu 48,5/49,5 kDa (Ogishima et al., 1989). U člověka je také znám v blízkosti ležící CYP11B2, který je s ním shodný z 93%. U krysy jsou známy čtyři geny CYP11B1-4 (Mukai et al., 1993). Kromě bovinního CYP11B1 se v bovinním genomu vyskytují i nefunkční pseudogeny (Kirita et al., 1990). Produkty lidského CYP11Bl a B2 jsou v aminokyselinové sekvenci shodné ze 75% s bovinním CYP11B1 (Mornet et al., 1989). Bovinní CYP11B1 má tři enzymatické aktivity: 11β-hydroxylaci (11deoxykortizolu na kortizol a 11-deoxykortikosteronu na kortikosteron) (Ohta et al., 1991), 18hydroxylaci

(kortikosteronu

na

18-hydroxykortikosteron)

a

18-oxidaci

(18-

hydroxykortikosteronu na aldosteron) (Wada et al., 1985; Yanagibashi et al., 1986). Všechny tři funkce se uplatňují při produkci aldosteronu (Boon et al., 1998a), první při produkci kortizolu. Funkci syntézy aldosteronu má u člověka, potkana a myši CYP11B2, u skotu, prasete a ovce tuto funkci zaujímá pouze CYP11B1 (Boon et al.,1998a; Waterman a Bischof, 19

1997). Zatímco exprese CYP11B1 je u člověka jen v zona fasciculata (Müller, 1998) a reticularis (Payne a Hales, 2004), u skotu je vylučována v celém adrenálním kortex (Boon et al., 1998a) a v zona fasciculata dochází pouze k inhibici aldosteronové syntézy (Müller, 1998). Syntéza kortizolu tak probíhá v zóně fasciculatě a je kontrolována kortikotropinem a syntéza aldosteronu je v zóně glomerulose a je pod kontrolou renin-angiotenzin systému (Mornet et al., 1989). Exprese CYP11B1 je ovlivňována také regulačním proteinem PREB (prolactin regulatory element-binding protein), jež je znám především jako transkripční faktor pro prolaktin (Imachi et al., 2008). Aldosteron se podílí na udržení vnitřní homeostázy – na reabsorbci iontů a vody v ledvinách a tím na retenci vody a výši krevního tlaku. Kortizol je hormon s cirkadiální sekrecí, který je znám především jako protizánětlivý hormon ovlivňující CNS (centrální nervová soustava) a reakci na stres, je důležitým hormonem lipolýzy a lipogeneze, glukoneogeneze, glykogeneze a podílí se na metabolismu bílkovin. Kortizol má silný protizánětlivý a imunosupresivní účinek. Ovlivňuje leukocyty a blokuje funkce imunitních buněk, potlačuje cytokiny a další mediátory imunitního systému doprovázející zánět (např. PAF (faktor aktivující destičky), oxid dusnatý, prostanoidy). Indukuje rezistenci k cytokinům a inhibuje expresi adhezivních molekul a jejich receptorů na povrchu imunitních buněk. Imunomodulatorní funkce spočívá v přiklonění imunitního systému z buněčné k humorální imunitě. Stimuluje cytokiny indukující humorální imunitu a Th-1 lymfocyty (IL-10, IL-4, IL-13) a potlačuje cytokiny podporující buněčnou imunitu a Th-2 lymfocyty (TNF-α, INF-γ, IL-2, IL-12) (Bose et al., 2009; Kyrou et al., 2006). Ovlivňuje katabolický metabolismus. Zvyšuje hladinu glukózy v krvi tím, že inhibuje funkci inzulínu, ovlivňuje glukózový transport, v játrech podporuje glukoneolýzu, glukoneogenezi. Ve svalech, kostech a kůži snižuje absorbci aminokyselin a zvyšuje proteolýzu, v tukové tkáni indukuje lipolýzu (Nussey a Whitehead, 2001). Je antagonistou anabolických funkcí růstového hormonu, thyroidních hormonů a pohlavních steroidů. Inhibuje GnRH (gonadotropin uvoňující hormon) a steroidogenezi, GH, IGF-1 (insulin-like growth factor 1) a jiné růstové faktory a tím ovlivňuje růst. Snižuje produkci TSH (thyroidy stimulující hormon) a tím inhibuje produkci thyroidů (Kyrou et al., 2006). Ovlivňuje rozložení tuku v těle, energetickou rovnováhu a příjem potravy, a to pravděpodobně přes leptin, inzulin, ghrelin a NPY (neuropeptid Y) (Kyrou et al., 2006; Bose et al., 2009). Spolu s inzulínem reguluje vliv prolaktinu na mléčné bílkoviny (Houdebine., 1999).

20

Inhibuje proliferaci fibroblastů a formaci kolagenu. Snižuje funkci osteoblastů a formaci kostí, zvyšuje množství a aktivitu osteoklastů a retenci vápníku. Ovlivňuje reaktivitu neuronů a může zapříčinit i jejich destrukci. Má vliv na dozrávání CNS, sítnice, kůže, gastrointestinálního traktu a plic u plodu (Nussey a Whitehead, 2001). V ledvinách má funkci podobnou aldosteronu, kdy zvyšuje glomerulární filtraci a způsobuje retenci solí a vody, čímž ovlivňuje krevní tlak (Nussey a Whitehead, 2001; Bose et al., 2009). Ačkoliv je nezbytný pro přežití při krátkodobém stresu, jeho delší působení vede k obezitě, inzulínové rezistenci (jeho zvýšená aktivita se může podílet i na vzniku diabetu), kardiovaskulárním chorobám a metabolickému syndromu. Jeho antireproduktivní funkce je reverzibilní (Nussey a Whitehead, 2001; Kyrou et al., 2006). Mutace v genu CYP11B1 mohou ovlivňovat produkci kortizolu (Bhangoo et al., 2006). Genetické varianty CYP11 mají také efekt na funkce androgenů, které dále ovlivňují proliferaci buněk mléčné žlázy (Brettes a Mathelin, 2008). U skotu se CYP11B1 nachází na pozici na BTA14q12 (Kaupe et al., 2004) v blízkosti markeru ILSTS039 (Wibowo et al., 2008). Tento marker byl také asociován s parametry mléčné užitkovosti, jak s celkovou produkcí mléka, tak i jeho složkami (Looft et al., 2001; Kuhn et al., 2004; Wibowo et al., 2008). QTL nalezené v této oblasti, které byly přisuzovány a nebyly dostatečně vysvětleny DGAT1 (diacylglycerol O-acyltransferáza 1), bude pravděpodobně ovlivňovat právě gen CYP11B1 (Kaupe et al., 2007; Mai et al., 2010) Kaupe et al. (2007) vyhodnocoval vliv polymorfismu v 1. intronu bovinního genu pro CYP11B1, který vede k záměně valinu za alanin v 30. aminokyselině (p.Val30Ala). Studie byla provedena na německém holštýnském skotu a německém simentálském skotu. Alela Val byla asociována s PSB, vykazovala i pozitivní asociaci se snadností telení (paternální efekt), zvyšovala obsah tuku v mléce, ale díky asociaci s nižší produkcí mléka nebyla celková produkce tuku ovlivněna. Stejně tomu bylo i u obsahu bílkovin. Na genu CYP11B1 v mléčné žláze skotu bylo nalezeno miRNA (mikro RNA) cílové místo, které pravděpodobně bude mít souvislost s expresí tohoto genu (Ogorevc et al., 2009).

21

2.5. Metody genotypování 2.5.1. PCR Je metoda, která umožňuje rychlé zmnožení požadovaného úseku DNA. Požadovaný úsek DNA je vymezen dvěma primery. Primery jsou jednořetězcové molekuly DNA a jsou komplementární ke krajním sekvencím amplifikované sekvence. Každý primer je komplementární k protilehlému řetězci DNA. Produktem PCR jsou tak úseky DNA určité délky, které je možné stanovit elektroforeticky. Podstatou této metody je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců DNA při použití termostabilních polymeráz (polymerázy z termofilních organismů), které nedegradují ani při teplotě denaturace DNA. Při PCR se střídají tři kroky, které se od sebe liší teplotami. Při různých teplotách pak probíhají různé děje. Prvním krokem je denaturace dvouřetězcových molekul DNA, která probíhá při 94°C. Druhým krokem je krok připojení primerů k odděleným řetězcům DNA, optimální teplota je dána délkou primerů, zastoupením GC párů a pohybuje se mezi 50 a 60°C. Ve třetím kroku dochází k vlastní syntéze nových řetězců DNA. Tento děj probíhá nejčastěji při teplotě 72°C, při využití Taq polymerázy. V reakční směsi je obsažena templátová DNA, DNA dependentní DNA polymeráza (Taq polymeráza), primer 1 a 2, prekurzory syntézy DNA (dNTP - deoxynukleotid trifosfát), aktivátor katalizované reakce (Mg2+), a pufr odpovídajícího pH. Průběh PCR reakce je znázorněn na Obr.1.

22

Obr.1: Průběh PCR reakce. oblast DNA k amplifikaci Templátová DNA

Denaturace při 94°C

Ochlazení na 50-60°C

Primery

Navázání primerů

DNA syntéza 72°C

Produkty 1. cyklu PCR reakce

Denaturace

DNA syntéza

Akumulace požadovaných produktů exponenciálně

PCR reakce: V prvním cyklu dochází k vytvoření delších produktů, které v dalších reakcích slouží jako templáty pro produkci kratších produktů. V následujícím cyklu denaturace-anealingu-syntézy jsou produkovány čtyři produkty. Dva identické jako v prvním cyklu a dva nové, krátké, odpovídající požadovanému PCR produktu. Od třetího cyklu dále narůstá exponenciálně počet krátkých produktů, tj. těch, které požadujeme (Brown, 2002).

23

2.5.2. Restrikční štěpení Metoda PCR-RFLP je alternativní verzí PCR. Po proběhnutí PCR reakce je PCR produkt naštěpen restriktázou, která štěpí PCR produkt ve specifickém místě. Dojde-li k záměně nukleotidů v sekvenci restrikčního místa, je toto restrikční místo zrušeno, neboť restriktáza toto místo nerozpozná a tedy ho neštěpí. V následné elektroforéze je tak možné rozlišit jednotlivé genotypy, viz. Obr.2.

Obr.2: Schéma využití PCR-RFLP

Alela 1

Alela 2 Amplifikace

Štěpení PCR produktu restrikčním enzymem R

Separace alel na elektroforéze

Alely

Polymorfismus restrikčního místa umožňuje jednoduché určení genotypů pži využití PCR. Alela 1 obsahuje restrikční místo pro restriktázu R. Alela 2 má toto restrikční místo zrušeno. Nejdříve je část genu v okolí restrikčního místa zmnožena pomocí PCR reakce (1). Poté je PCR produkt naštěpen (2). Pomocí elektroforézy je výsledek štěpení vyhodnocen. Neštěpení homozygoti jsou ve výsledku elektroforéza jeden proužek, homozygoti štěpení mají dva proužky a heterozygoti proužky tři (Strachan a Read, 1999).

2.5.3. Elektroforetické stanovení výsledků PCR a restrikční reakce Elektroforéza umožňuje rozdělit DNA fragmenty podle jejich velikosti. Fragmenty DNA se pohybují v elektrickém poli ke kladně nabité elektrodě – anodě. Rychlost pohybu je pak nepřímo úměrná jejich velikosti. Separované molekuly je možné zviditelnit pomocí ethidium bromidu, který interkaluje mezi sousední páry bází DNA. Při ozáření UV světlem ethidium bromid červeně floreskuje a separovaná DNA je viditelná jako proužky v gelu.

24

2.6. Vazebná nerovnováha Klasická definice nerovnováhy (LD - linkage disequilibrium) je nenáhodná asociace mezi alelami dvou lokusů (Hayes, 2008). Vzdálenost 1 Mb odpovídá přibližně 1 cM (Hayes, 2008), což odpovídá 1% pravděpodobnosti, že dojde mezi jednotlivými markery ke crossing-overu. Tato hodnota je ovšem reálně ovlivněna pravděpodobností crossing-overu na daném místě, jako je např. fyzická pozice markerů na chromosomu. Známá jsou i tzv. horká místa crossing-overu. Existuje-li mezi dvěma lokusy vazebná nerovnováha, pak lze pro zjištění genotypů v obou markerech analyzovat pouze jeden. Vazebné nerovnováhy mezi markerem a funkčním polymorfismem využívají vazebné i asociační studie. Pokud máme k dispozici dva lokusy A a B s alelami A1 , A2 a B1, B2, pak lze LD mezi nimi počítat pomocí parametru D: D = freq(A1_B1)*freq(A2_B2)-freq(A1_B2)*freq(A2_B1) kde freq(A1_B1) je frekvence A1_B1 haplotypu v populaci atd. (Hayes, 2008). D je velmi závislé na frekvencích jednotlivých alel. Hodnoty se pohybují od -0,25 do 0,25 (Maurer, 2008). Dalším výpočtem je r2 (Hill a Robertson, 1968), které je méně závislé na alelové frekvenci (Hayes, 2008): r2=D2/(freqA1*freqA2*freqB1*freqB2) kde freqA1 je frekvence alely A1 v populaci atd. Hodnoty r2 se pohybují od 0 pro markery bez vazebné nerovnováhy až po hodnotu 1 s úplnou vazebnou nerovnováhou. Když r2=1 nazývá se tento stav perfektní LD a dochází k němu, pokud mezi markery nedochází ke crossing-overu a mají shodnou alelovou frekvenci (Istrail, 2008). Dalším způsobem měření LD je D’ (Lewontin, 1964) stanovované: D'= |D|/Dmax Dmax= min[freq(A1)*freq(B2)-1*freq(A2)*freq(B1)] jestliže D>0, jinak = min[freq(A1)*freq(B1)+1*freq(A2)*freq(B2)] jestliže D<0. Více než D’ je preferováno r2, neboť D´ bývá ovlivněno malým počtem vzorků nebo nízkou alelovou frekvencí. D’=1 se nazývá kompletní LD a dochází k němu, pokud mezi SNP nedochází ke crossing-overu. Hodnoty D’ se pohybují od -1 do 1 s tím, že blíží-li se hodnota 0, pak mezi markery není vazba. Pokud se vyskytuje některá z alel v nízké míře, může se hodnota D´ blížit 1 a r2 je blízké nule (Hayes, 2008; Istrail, 2008). V takovém případě je vhodnější brát v úvahu r2 (Thortnon, 2009).

25

3. Hypotéza Na základě zjištěných skutečností z literatury byly stanoveny následné hypotézy práce. Polymorfismy v genech PPARGC1A, SPP1, prolaktinu (PRL) a CYP11B1 byly asociovány s užitkovými vlastnostmi v několika populacích skotu. Je předpoklad, že: 1)

tyto polymorfismy budou i u českého strakatého skotu vykazovat obdobné zastoupení alel a genotypů, jako v jiných populacích skotu

2)

tyto

polymorfismy

pravděpodobně

ovlivňují

užitkové

vlastnosti i u českého strakatého skotu 3)

stanovované

polymorfismy

v

rámci

prolaktinového

genu

budou vykazovat vzájemnou vazebnou nerovnováhu a budou sdruženě ovlivňovat shodné užitkové vlastnosti.

4. Cíl Cílem práce bylo: 1) Zjistit genotypové složení populace českého strakatého skotu ve vybraných polymorfismech,

tj.

u

polymorfismů

c.1892+19C>T

v

PPARGC1A,

g.8514C>T v SPP1, p.Val30Ala v CYP11B1, a u dvou polymorfismů v rámci prolaktinového genu g.8398G>A a c.–1043A>G. 2) Zjistit vliv těchto polymorfismů na ukazatele mléčné užitkovosti a plemenné hodnoty pro znaky mléčné užitkovosti a počet somatických buněk u českého strakatého skotu. 3) Stanovit vazebnou nerovnováhu mezi polymorfismy v prolaktinovém genu a jejich vzájemné působení na vlastnosti mléčné užitkovosti a plemenné hodnoty pro mléčnou užitkovost a počet somatických buněk u českého strakatého skotu.

26

5. Materiál a metodika 5.1. Sledovaná populace Ve studii bylo vyhodnoceno 505 plemenic, u nichž byly stanoveny polymorfismy v genech SPP1, PRL a CYP11B1, a 500 plemenic, u nichž byl stanoven polymorfismus v genu PPARGC1A. Genetická analýza probíhala na vzorcích DNA (izolované z krve plemenic) uložených v genové bance ve Výzkumném ústavu živočišné výroby, v.v.i. v Praze-Uhříněvsi. Plemenice pocházely ze 4 stád, po 64 otcích, měly ukončenou alespoň jednu laktaci v letech 2001-2010 a v rodokmenu měly podíl nejméně 50 % českého strakatého skotu. Plemenná příslušnost, údaje o mléčné užitkovosti a odhadech plemenných hodnot byly získány z databáze celoživotních užitkovostí krav Českomoravské společnosti chovatelů a.s. v prosinci 2010. Údaje o mléčné užitkovosti byly hodnoceny za normovanou laktaci. Odhady plemenných hodnot (PH) byly stanovené s bází v roce 2000. Údaje o relativní plemenné hodnotě pro PSB byly známé pouze u 153 zvířat a jednalo se o údaj stanovený dle metodiky Plemdat, s.r.o. (2008). 5.2. Genetická analýza souboru Přístroje, programy a chemikálie použité při zpracování vzorků a genotypování jsou uvedeny a podrobněji popsány v Příloze.

5.2.1. Izolace DNA DNA byla izolována ze 75 µl EDTA periferní krve pomocí izolačního přístroje ABI PrismTM 6100 Nucleic Acid PrepStation od Applied Biosystems a izolačního kitu Genomic DNA Purification Tray II, určeného k použití s tímto přístrojem od stejné firmy. Proteaza využívaná v tomto kitu je proteináza K a slouží k rozbití nežádoucích příměsí proteinového charakteru. DNA je zachycena na membráně ze skelných vláken a pomocí pufrů je zbavena proteinů a jiných kontaminujících látek, které by mohly následně inhibovat PCR reakci. Následně je DNA pomocí vhodného pufru uvolněna z membrány do roztoku. Výsledná koncentrace DNA byla 40-50 ng/µl.

27

5.2.2. Stanovení jednotlivých polymorfismů 5.2.2.1. PPARGC1A Pro genotypování byla použita upravená metoda PCR-RFLP dle Khatib et al. (2007). Byl použit primer 1: 5´- CAT AGC CGG CGC CCC AGG TAA GAT GCA CGT TGG C -3´ a reverse primer 2: 5´- CTG GTA CTC CTC GTA GCT GTC -3´ (Generi Biotech) pro amplifikaci 192 bp dlouhého fragmentu, který nese polymorfní místo c.1892+19C>T rozeznávané restriktázou HaeIII. PCR probíhala v 15 µl reakčního objemu obsahujícího 0,5 U Taq polymerázy (Top-Bio), 1,5 µl 10X Pufru (Top-Bio), 0,1 mM každého dNTP (PCR dNTP mix, Top-Bio), 1,2 µl Redload (Top-Bio), 3 pmol každého primeru, 80-100 ng DNA a ddH2O do 15 µl. PCR reakce proběhla při počáteční denaturaci 5 min. při 95 °C, následovala 32-krát se opakující denaturace (45 s, 94 °C), hybridizace (45 s, 64 °C) a extenze (45 s, 72 °C), poté konečná extenze (7 min, 72 °C), konečné zchlazení a uchování při 10 °C. PCR produkt byl následně přes noc štěpen 5 U restriktázy HaeIII (Fermentas) při 37°C a vyhodnocen spolu s produkty štěpení elektroforeticky na 2,5% agarózovém gelu. Restiktáza HaeIII štěpí restrikční místo o sekvenci GG/CC. Jestliže je cytosin v restrikčním místě zaměněn thyminem, je restrikční místo zrušeno, nedochází v daném místě ke štěpení a na elektroforéze je původní fragment. Je-li restrikční místo zachováno, pak při štěpení vznikají dva fragmenty 33 a 159 bp dlouhé.

5.2.2.2. SPP1 Ve sledovaném případě bylo využito jednonukleotidového g.8514C>T polymorfismu v intronu 4, který je rozeznáván restriktázou BsrI. Restiktáza BsrI štěpí restrikční místo o sekvenci 5'...ACTGvGNˇ...3'. Po PCR vzniká 290 bp dlouhý fragment. Jestliže je restrikční místo zrušeno a nedochází v daném místě ke štěpení, na elektroforéze je původní fragment. Je-li restrikční místo zachováno, pak při štěpení vznikají dva fragmenty 200 a 90 bp dlouhé. Pro genotypování byla použita upravená metoda PCR-RFLP dle Leonard et al. (2005). Byl použit primer 1: 5´- GCA AAT CAG AAG TGT GAT AGA C -3´ a primer 2: 5´- CCA AGC CAA ACG TAT GAG TT -3´ (Generi Biotech). PCR reakční směs obsahovala 0,6 U Taq polymerázy (Top-Bio), 2,5 µl 10X Pufru (Top-Bio), 0,25 mM každého dNTP (PCR dNTP mix, Top-Bio), 1,2 µl Redload (Top-Bio), 8 pmol každého primeru, 80-100 ng DNA a doplnění ddH2O do 25 µl. PCR reakce proběhla při počáteční denaturaci 5 min. při 95 °C, následovala celkově 32-krát se opakující denaturace (45 s, 94 °C), hybridizace (30 s,

28

touchdown 63-50 °C (-1°C/cykl)) a extenze (45 s, 72 °C), konečná extenze (7 min, 72 °C), konečné zchlazení a uchování při 10 °C. PCR produkt byl následně přes noc štěpen při 37°C 2,5 U restriktázy BsrI (New England Biolabs) a vyhodnocen spolu s produkty štěpení elektroforeticky na 1,5 % agarózovém gelu.

5.2.2.3. bPRL Ve sledovaném případě bylo využito polymorfismu v pozici g.8398G>A, který je rozeznáván restriktázou RsaI. Restiktáza RsaI štěpí restrikční místo o sekvenci GT/AC. Po PCR vzniká 154 bp dlouhý fragment. Je-li restrikční místo zachováno, pak při štěpení vznikají dva fragmenty 82 a 74 bp dlouhé. Pro genotypování byla použita upravená metoda PCR-RFLP dle Chrenka et al. (1998). Byl použit primer 1: 5´- CGA GTC CTT ATG AGC TTG ATT CTT -3´ a primer 2: 5´- GCC TTC CAG AAG TCG TTT GTT TTC-3‘ (Generi Biotech). PCR reakční směs obsahovala 1 U Taq polymerázy (Top-Bio), 2 µl 10X Pufru (Top-Bio), 0,1 mM každého dNTP (PCR dNTP mix, Top-Bio), 1 µl Redload (Top-Bio), 10 pmol každého primeru, 80-100 ng DNA (Generi Biotech) a ddH2O do 20 µl. PCR reakce proběhla při počáteční denaturaci 3 min. při 94 °C, následovala celkově 35-krát se opakující denaturace (45 s, 94 °C), hybridizace (1 min, 65 °C) a extenze (1 min, 72 °C), konečná extenze (4 min, 72 °C), konečné zchlazení a uchování při 10 °C. PCR produkt byl následně přes noc štěpen při 37°C 2,5 U restriktázy RsaI (Fermentas) a vyhodnocen spolu s produkty štěpení elektroforeticky na 2,5% agarózovém gelu.

5.2.2.4. PRLE Ve

sledovaném

případě

bylo

využito

jednonukleotidového

polymorfismu

v restrikčním místě c.–1043A>G, které je rozeznáváno restriktázou Hsp92II. Restiktáza Hsp92II štěpí restrikční místo o sekvenci CATG/. Po PCR vzniká 311 bp dlouhý fragment. Po restrikčním štěpení produkuje homozygot AA fragmenty dlouhé 111, 102, 88 a 11 bp; genotyp AG fragmenty 213, 111, 102, 88 a 11 bp dlouhé a genotyp GG fragmenty 213, 88 a 10 bp dlouhé. Pro genotypování byla použita upravená metoda PCR-RFLP dle Brym et al. (2007). Byl použit primer 1: 5´- TTT TCT TAA TGC AGC TCA CTT GTC -3´ a primer 2: 5´- TCT AGA CAG TCA TGT TCA CTT TCC TT-3‘ (Generi Biotech). PCR reakční směs obsahovala 1,5 U Taq polymerázy (Top-Bio), 1,5 µl 10X Pufru (Top-Bio), 0,05 mM každého dNTP (PCR dNTP mix, Top-Bio), 1,2 µl Redload (Top-Bio), 20 pmol každého primeru, 80-100 ng DNA a ddH2O doplněná do celkového objemu 24 µl. PCR reakce proběhla při počáteční denaturaci 3 29

min. při 94 °C, následovaly cyklus 35-krát se opakující denaturace (30 s, 94 °C), hybridizace (30 s, 60 °C) a extenze (30 s, 72 °C), konečná extenze (5 min, 72 °C), konečné zchlazení a uchování při 10 °C. Restrikční reakce probíhala v termostatu při 37°C přes noc s 5 U restriktázy Hsp92II (Promega). Po ukončení reakce bylo provedeno elektroforetické vyhodnocení restrikční reakce na 3,5% agarózovém gelu.

5.2.2.5. CYP11B1 Ve

sledovaném

případě

bylo

využito

jednonukleotidového

polymorfismu

v restrikčním místě p.Val30Ala, které je rozeznáváno restriktázou PstI. Restiktáza PstI štěpí restrikční místo o sekvenci CTGCA/G. Po PCR vzniká 568 bp dlouhý fragment. Po restrikčním štěpení produkuje neštěpená varianta (valin) fragmenty o délce 442/103/23 bp a štěpená varianta (alanin) fragmenty 371/103/71/23 bp. Pro genotypování byla použita upravená metoda PCR-RFLP dle Kaupe et al. (2007). Byl použit primer 1: 5´- ATA CTG GAG GGG GAG GAG G -3´a primer 2: 5´- GGA CAG AAC GTG AGG GTG TT -3´ (Generi Biotech). PCR reakční směs obsahovala 0,5 U Taq polymerázy (Top-Bio), 1,5 µl 10X Pufru (Top-Bio), 0,15 mM každého dNTP (PCR dNTP mix, Top-Bio), 1,2 µl Redload (Top-Bio), 2 pmol každého primeru, 80-100 ng DNA a ddH2O do 20 µl. PCR reakce proběhla při počáteční denaturaci 15 min. při 95 °C, následovala celkově 40-krát se opakující denaturace (30 s, 94 °C), hybridizace (30 s, touchdown 72-62 °C (-1°C/cykl) a extenze (45 s, 72 °C), konečná extenze (10 min, 72 °C), konečné zchlazení a uchování při 10 °C. PCR produkt byl následně přes noc štěpen při 37°C 10,5 U restriktázy PstI (Fermentas) a vyhodnocen spolu s produkty štěpení elektroforeticky na 2 % agarózovém gelu.

5.3. Průběh elektroforézy a vyhodnocení Elektroforéza probíhala v 1 x TBE (popis přípravy v Příloze) agarózovém gelu s obsahem ethidium bromidu (Top-Bio) 30 min při stejnosměrném napětí o velikosti 5 V/cm. Pro porovnání délek fragmentů byl využit žebříček Gene Ruler 50bp (Fermentas). Vyhodnocení probíhalo pomocí transluminátoru (Transluminátor TM-20, Alpha Innotech Corporation) a v programu Alpha DigiDoc 1000 (Alpha Innotech Corporation).

30

5.4. Statistická analýza Hardy-Weinbergova rovnováha U dat byla stanovena relativní četnost zastoupení jednotlivých alel a genotypů a Hardy-Weinbergova rovnováha testována pomocí Pearsonova χ2-testu.

Vazebná nerovnováha Zastoupení haplotypů v populaci a LD u polymorfismů v rámci genu PRL jsou stanoveny pomocí programu EMLD (Huang, 2003), který při výpočtu frekvence jednotlivých haplotypů využívá metodu algoritmu očekávané maximalizace bez využití příbuznosti zvířat. Asociační analýza V pozici závisle proměnných byla analyzována mléčná užitkovost (ML), množství tuku (TK) a bílkovin (BK) v mléce, procenta tuku (TP) a bílkovin (BP) v mléce, plemenné hodnoty pro dojivost (PHML), procento tuku (PHTP) a bílkovin (PHBP) v mléce, produkci tuku (PHTK) a bílkovin (PHBK) v kg a relativní plemennou hodnotu pro somatické buňky (RPHSB). Analýzy byly provedeny smíšeným lineárním modelem metodou REML (metoda restringované maximální věrohodnosti) procedurou MIXED v SAS 9.2 (SAS Institute Inc., 2008) dle následující modelové rovnice: yijklmno = µ + cijklmno + SROijk + Bl + Nm + Gn + βxijklmno + eijklmno yijklmno -asociovaná vlastnost

µ - střední hodnota cijklmno - náhodný efekt zvířete ostatní efekty jsou pevné tj. SROijk - kombinovaný efekt stádo, rok, období první laktace Bl - efekt podílu českého strakatého plemene v rodokmenu (50-75%; 75-99%; 100%) Nm - efekt pořadí laktace (1. laktace; 2. laktace; 3. a další laktace) Gn - efekt genotypu alternativně PPARGC1A (CC, CT, nebo TT), SPP1 (CC, CT, nebo TT), CYP11B1 (Ala/Ala, Ala/Val, Val/Val), bPRL (AA, AG, nebo GG), PRLE (AA, AG, nebo GG), dále byla provedena asociace s kombinací genotypů v rámci obou polymorfismů v prolaktinovém genu označená jako bPRLE, kde první genotyp je bPRL a druhý genotyp je PRLE (AA/AA, AA/AG, AA/GG, AG/AA, AG/AG, AG/GG, GG/AA, GG/AG, nebo GG/GG) β – regresní koeficient

31

xijklmno - délka laktace (ve dnech) eijklmno – náhodná chyba. Byly odhadnuty průměry nejmenších čtverců (LSM) a rozdíly mezi genotypy byly testovány Tukeyho testem. Pro výpočet plemenných hodnot byl z modelové rovnice vypuštěn náhodný efekt zvířete/plemenice. U asociační analýzy RPHSB byla z výpočtu vyloučena skupina jedinců s genotypem AA u polymorfismu bPRL a skupina AA/AA u bPRLE v důsledku nízkého zastoupení v populaci.

32

6. Výsledky a diskuse 6.1. Základní charakteristika sledovaného souboru. Plemenice byly rozděleny do skupin podle podílu českého strakatého plemene. V první skupině bylo 147 čistokrevných zvířat, v druhé skupině 250 krav s 76-99% krve českého strakatého plemene a ve třetí 108 krav s 50-75 % podílu českého strakatého plemene. Počet zvířat v jednotlivých chovech byl 40, 91, 316 a 58. Základní statistiky parametrů užitkovosti ve sledovaném souboru jsou uvedeny v Tab.1. Tab.1: Základní charakteristika souboru n

Průměr

s

Median Modus

Počet dnů laktace

1299

290,6

30,6

305,0

305,0

Dojivost (kg)

1299

7620

1675

7649

8058

Tuk (%)

1299

3,98

0,37

3,97

3,81

Tuk (kg)

1299

301,9

67,7

303,0

301,0

Bílkoviny (%)

1299

3,47

0,19

3,47

3,51

Bílkoviny (kg)

1299

263,3

55,9

267,0

275,0

PHML

505

156,6

424,1

145,0

0,0

PHBK

505

4,62

13,10

3,90

0,00

PHTK

505

5,65

17,60

4,50

0,00

PHBP

505

-0,02

0,10

-0,01

0,02

PHTP

505

-0,02

0,17

-0,03

-0,07

RPHSB

153

97,35

11,78

97,00

92,00

33

6.2. Genotypová a alelová struktura populace Výsledky frekvence alel a genotypů zjištěné ve sledovaném souboru jsou uvedeny v Tab.2.

Tab.2: Zastoupení jednotlivých genotypů a alel zkoumaných genů. SNP

Genotypová frekvence CC 0,64 PPARGC1A CT 0,33 TT 0,03 CC 0,04 CT SPP1 0,28 TT 0,68 Ala/Ala 0,05 Ala/Val CYP11B1 0,40 Val/Val 0,55 AA 0,01 AG bPRL 0,22 GG 0,77 AA 0,65 AG PRLE 0,32 GG 0,02 GG/AA 0,475 GG/AG 0,275 GG/GG bPRLE1,2 0,024 AG/AA 0,168 AG/AG 0,050 AA/AA 0,008 1 2

Alelová frekvence C 0,80 T 0,20 C T

0,18 0,82

Ala Val

0,25 0,75

A G

0,12 0,88

A G

0,81 0,19

První v pořadí je uveden genotyp bPRL druhý v pořadí je genotyp PRLE. Genotypy AA/AG, AA/GG a AG/GG se v uvedené populaci nevyskytovaly.

Hardy-Weinbergova rovnováha Tab.3: Výsledky výpočtu Hardy-Weinbergovy rovnováhy. Polymorfismus χ2 PPARGC1A 1,03 SPP1

0,71

PRLE

2,61

bPRL

1,56

CYP11B1

1,82

Má-li platit Hardy-Weinbergova rovnováha, nesmí hodnota χ2 překročit hranici 3,84 (P < 0,05). Distribuce všech genotypů tedy byla v Hardy-Weinbergově rovnováze (P < 0,05) viz Tab.3. 34

6.3. Výsledky asociačních analýz Výsledky asociační analýzy polymorfismů PPARGC1A, SPP1, CYP11B1, bPRL a PRLE genotypového efektu s vlastnostmi mléčné užitkovosti jsou uvedeny v Tab.4 a s plemennými hodnotami pro mléčnou užitkovost a PSB v Tab.5. Asociace mezi genotypy v bPRLE a vlastnostmi mléčné produkce a plemennými hodnotami jsou v Tab.6.

Tab.4: Efekt PPARGC1A, SPP1, bPRL, PRLE a CYP11B1 polymorfismů na vlastnosti mléčné užitkovosti u krav českého strakatého plemene CC (n=805)

CT (n=430)

TT (n=49)

PPARGC1A ML TP TK BP BK

7624,08 3,94 297,40a 3,45 261,31

SPP1 ML TP TK BP BK

CC (n=46) 7396,71 ± 275,49 3,98 ± 0,08 294,12 ± 11,32 3,47 ± 0,04 255,25 ± 9,09

CT (n=362) 7591,00 ± 117,30 3,93 ± 0,03 295,54 ± 4,82 3,46 ± 0,02 261,43 ± 3,87

TT (n=891) 7674,46 ± 96,47 3,95 ± 0,03 300,84 ± 3,97 3,44 ± 0,01 262,59 ± 3,18

CYP11B1 ML TP TK BP BK

Ala/Ala (n=70) 7876,44 ± 235,87 3,93 ± 0,07 308,47 ± 9,72 3,48 ± 0,03 273,52 ± 7,78

Ala/Val (n=521) 7672,98 ± 102,70 3,91 ± 0,03 298,44 ± 4,23 3,44 ± 0,01 262,73 ± 3,38

Val/Val (n=708) 7572,08 ± 96,87 3,97 ± 0,03 298,22 ± 3,99 3,46 ± 0,01 259,96 ± 3,19

bPRL ML TP TK BP BK

AA (n=12) 6798,64 ± 504,59 3,96 ± 0,15 267,91 ± 20,87 3,48 ± 0,07 233,55 ± 16,74

AG (n=270) 7444,30 ± 128,22 3,97 ± 0,04 293,30 ± 5,29 3,47 ± 0,02 256,32 ± 4,23

GG (n=1012) 7681,49 ± 87,97 3,94 ± 0,03 300,39 ± 3,63 3,45 ± 0,01 263,29 ± 2,90

± ± ± ± ±

94,31 0,03 3,86 0,01 3,11

7593,72 3,95 298,60b 3,45 261,07

± ± ± ± ±

106,68 0,03 4,37 0,02 3,52

8102,79 4,07 326,76a,b 3,43 275,98

± ± ± ± ±

279,81 0,08 11,47 0,04 9,26

Signif.

*

*

*

AA (n=842) AG (n=418) GG (n=39) PRLE a a ML 7533,79 ± 90,23 7819,98 ± 111,55 8057,24 ± 301,79 ** TP 3,93 ± 0,03 3,97 ± 0,03 4,04 ± 0,09 TK 294,09A,b ± 3,69 308,10A ± 4,56 324,13b ± 12,36 *** BP 3,45 ± 0,01 3,45 ± 0,02 3,49 ± 0,04 BK 258,28A ± 2,96 268,50A ± 3,67 280,17 ± 9,97 ** *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001 Hodnoty jsou uváděny jako průměry nejmenších čtverců (±SE). Signifikantní rozdíly mezi odhady jsou označeny stejnými písmeny v indexu P < 0,05 (malá písmena) a P < 0,01 (velká písmena).

35

Tab.5: Efekt PPARGC1A, SPP1, bPRL, PRLE a CYP11B1 polymorfismů na plemenné hodnoty pro mléčnou užitkovost a PSB u krav českého strakatého plemene PPARGC1A PHML PHBP PHTP PHBK PHTK

CC (n=346) 210,54 ± -0,01 ± -0,01 ± 6,81 ± 8,65 ± n=90

35,05 0,01 0,02 1,12 1,54

CT (n=188) 176,29 ± 0,01 ± 0 ± 6,61 ± 8,19 ± n=56

39,72 0,01 0,02 1,27 1,75

TT (n=16) 330,36 ± 0 ± 0,05 ± 11,34 ± 17,54 ± n=7

RPHSB

98,75 ± 1,89

95,12 ± 1,88

94,45 ± 5,16

SPP1 PHML PHBP PHTP PHBK PHTK

CC (n=21) 213,49 ± 99,41 0 ± 0,03 -0,01 ± 0,04 7,71 ± 3,17 9,13 ± 4,38 n=3 97,81 ± 7,66

CT (n=154) 208,42 ± 43,74 0,01 ± 0,01 0 ± 0,02 7,8 ± 1,4 8,98 ± 1,93 n=31 95,58 ± 2,86

TT (n=380) 195,9 ± 35,74 -0,01 ± 0,01 0 ± 0,02 6,3 ± 1,14 8,55 ± 1,57 n=119 97,19 ± 1,66

RPHSB CYP11B1

Ala/Ala (n=30) a

PHML PHBP PHTP

381,06 ± 86,79 0 ± 0,02 -0,02 ± 0,04

PHBK

13,40a ± 2,77

PHTK

a

RPHSB

16,19 ± 3,83 n=6 92,3 ± 6,07

bPRL PHML

AA (n=4) -80,73 ± 196,68

PHBP PHTP PHBK PHTK

0,02 0,09 -1,41 1,09

± ± ± ±

0,05 0,09 6,31 8,7

RPHSB PRLE PHML PHBP PHTP PHBK

AA (n=356) A

163,20 ± 33,58 -0,01 ± 0,01 -0,01 ± 0,01 5,53

A

± 1,07

Signif.

104,57 0,03 0,05 3,35 4,6

Ala/Val (n=220)

Val/Val (n=305)

229,56 ± 38 -0,01 ± 0,01 -0,01 ± 0,02

168,14a ± 35,57 0 ± 0,01 0 ± 0,02

*

5,91a ± 1,14

*

7,58 ± 1,21 9,8 ± 1,68 n=68 95,48 ± 1,99

± 1,57 n=79 97,98 ± 1,75

AG (n=124) 148,55 ± 47,45

GG (n=427) 215,83 ± 32,77

0,02a ± 0,02 ± 6,24 ± 7,88 ± n=34 93,08 ±

0,01 0,02 1,52 2,10 2,68

AG (n=186) A

280,98 ± 41,1 -0,01 ± 0,01 0,01 ± 0,02 9,62

A

± 1,31

7,44

a

-0,01a ± 0,01 -0,01 ± 0,01 7,07 ± 1,05 8,99 ± 1,45 n=118 97,61 ± 1,53

*

*

GG (n=13) 344,92 ± 116,73 0,03 ± 0,03 0,10 ± 0,05 13,94 ± 3,72

** * ***

6,40A,B ± 1,46 13,53A ± 1,78 21,46B ± 5,06 *** n=95 n=54 n=4 RPHSB 95,86 ± 1,61 99,22 ± 2,17 95,61 ± 6,43 * P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001 Hodnoty jsou uváděny jako průměry nejmenších čtverců (±SE). Signifikantní rozdíly mezi odhady jsou označeny stejnými písmeny v indexu P < 0,05 (malá písmena) a P < 0,01 (velká písmena). PHTK

36

6.3.1. PPARGC1A Ve studii byl sledován polymorfismus c.1892+19C>T v genu pro bovinní PPARGC1A s frekvencí alel C 0,8 a T 0,2 a genotypů CC 0,64, CT 0,33 a TT 0,03. Obdobné výsledky dosáhly studie jak u dojeného, tak i masného skotu. Polymorfismus byl již zkoumán u holštýnsko-fríského skotu v Německu s frekvencemi genotypů CC, CT a TT 0,68, 0,3 a 0,01 a frekvencemi alel C 0,84 a T 0,16 (Weikard et al., 2005), v USA s frekvencemi genotypů CC, CT a TT 0,33, 0,65 a 0,02 a frekvencí alel C 0,66 a T 0,34 (Khatib et al, 2007), v Nizozemí s frekvencí alel C 0,75 a T 0,25 (Schennink et al., 2009), v Polsku s frekvencemi alel C 0,73 a T 0,27 (Komisarek a Dorynek, 2009). Dále byl polymorfismus sledován u dvou populací kříženců masných plemen v USA s frekvencemi genotypů CC, CT, TT 0,71, 0,28, 0,02 a 0,68, 0,30, 0,02 tj. s frekvencí alel C 0,85 a T 0,15 resp. C 0,83 a T 0,17 (White et al., 2007). Výjimku tvoří plemeno jersey, které má vyšší podíl alely T. V Polsku byla provedena analýza u tohoto plemene s frekvencí alel C 0,37 a T 0,63 (Kowalewska-Luczak et al., 2010). PPARGC1A má důležitou úlohu v ochraně buněk před metabolickým stresem přes regulaci UCP proteinů (Puigserver et al., 1998). Tak umožňuje tkáním vyvinout vyšší metabolickou aktivitu. Z toho lze dedukovat, že by mohl podporovat i vyšší výkonnost buněk mléčné žlázy. V našem souboru byl polymorfismus signifikantně asociován pouze s TK (P<0,05). Výsledky korespondují se známou fyziologií tohoto genu, který ovlivňuje nejen metabolismus mléčné žlázy (Weikard et al., 2005), ale patří i mezi významné regulátory metabolismu lipidů (Bionaz a Loor, 2008). Byly zjištěné statisticky významné rozdíly genotypu TT k ostatním genotypům (Graf 1). Výsledky jsou v souladu s předchozími studiemi, kdy tento polymorfismus byl asociován s množstvím tuku v mléce u holštýnského skotu v Německu (Weikard et al., 2005) a Holandsku (Schennink et al., 2009). V jiných studiích měl vliv i na množství mléčného proteinu, např. u holštýnského skotu v Polsku (Komisarek a Dorynek, 2009) a u polského Jersey byl asociován s množstvím mléka a proteinu pouze ve spojení s polymorfismem c.3359A>C v PPARGC1A (Kowalewska-Luczak et al., 2010). Dříve byl asociován také s podílem nepřeběhlých jalovic (Komisarek a Dorynek, 2009), což by mohlo být vysvětleno vztahem PPARGC1A k estrogenům a estrogenovým receptorům (Ventura-Clapier et al., 2008).

37

Graf 1: Procento tuku a bílkovin (%) a množství mléka (kg) u jednotlivých genotypů polymorfismu PPARGC1A

PPARGC1A 4,2

8200 8100

4 8000 7900

%

7800 3,6

TP kg

3,8

7700 3,4

BP ML

7600 7500

3,2 7400 3

7300 CC

CT

TT

6.3.2. SPP1 V této studii byl zkoumán polymorfismus g.8514C>T ve 4. intronu bovinního genu pro SPP1 se zastoupením jednotlivých genotypů CC 0,04, CT 0,28, TT 0,68 a alel C 0,18 a T 0,82. Obdobných výsledků bylo dosaženo u jižního a západního anatolianského červeného skotu v Turecku se zastoupením alel C - 0.26; 0,16 a T - 0.74; 0,84, a genotypů TT - 0.55; 0.68, CT - 0.38; 0.32 a CC - 0.07; 0.00. Podíl alely C s předpokládaným vlivem na mléčnou produkci je nižší než u jiných mléčných plemen (Oztabak et al., 2008). Např. u holštýnského skotu v USA u plemeníků bylo zastoupení genotypů CC, CT a TT 0,25, 0,50 a 0,25, u jejich synů 0,23, 0,54 a 0,23 a u plemenic byla frekvence výskytu alely C 0,49 a alely T 0,51 (Leonard et al., 2005). Khatib et al. (2007) uvádějí u stejného plemene zastoupení CC, CT a TT genotypů 0,23, 0,51 a 0,26 a alel C 0,48 a T 0,52. U polského holštýnsko-fríského skotu byl výskyt genotypů CC 0,25, CT 0,50 a TT 0,25 (Pareek et al., 2008). Je tedy možné, že tento polymorfismus bude mít úlohu v rozdílu užitkovostí mezi jednotlivými plemeny. SPP1 ovlivňuje rozvoj mléčné žlázy a složení mléka (Nemir et al., 2000), především mléčné proteiny (Sheehy et al., 2009). V předchozích studiích byla alela C pozitivně asociována se zvýšeným obsahem mléčných složek (bílkovin i tuku) (Leonard et al., 2005; Khatib et al., 2007). V naší populaci nebyl tento polymorfismus asociován s žádnou ze sledovaných vlastností, i když můžeme sledovat nesignifikantní pozitivní vliv alely C na

38

obsah bílkovin (Tab.4, Graf 2). Vzhledem k uplatnění genu při regulaci imunitní reakce by se dalo usuzovat na jeho možné uplatnění v rezistenci proti mastitidám. Avšak naše výsledky ani studie Leonarda et al. (2005) a Khatiba et al. (2007) neprokázaly vliv tohoto polymorfismu na PSB.

Graf 2: Procento tuku a bílkovin (%) a množství mléka (kg) u jednotlivých genotypů polymorfismu SPP1

SPP1 4,1

7700

4

7650

3,9

7600

3,8

7550 7500

3,6 7450

3,5

TP kg

%

3,7

BP ML

7400

3,4 3,3

7350

3,2

7300

3,1

7250 CC

CT

TT

6.3.3. CYP11B1 U polymorfismu p.Val30Ala v genu CYP11B1 bylo zjištěno zastoupení genotypů Ala/Ala 0,05, Ala/Val 0,40 a Val/Val 0,55 a zastoupení jednotlivých alel Ala 0,25 a Val 0,75, což je blízké výsledkům německé studie provedené Kaupem et al. (2007), kde byl výskyt alely Val 0,78 u německého holštýnského skotu a 0,73 u německého simentálského skotu. V předchozí studii (Kaupe et al., 2007) alela Val vykazovala pozitivní efekt na procenta tuku a bílkovin a na druhou stranu alela Ala pozitivně ovlivňovala celkové množství mléka, a tím i celkové množství tuku a bílkovin. Obdobné výsledky jsme zjistili i v naší studii, kdy byl tento polymorfismus signifikantně asociován s PHML (P<0,05), PHBK (P<0,05) a PHTK (P<0,05) s pozitivním efektem alely Ala na tyto vlastnosti. Tento trend lze pozorovat i u ML (Graf 3). Kaupe et al. (2007) prokázal pozitivní vliv alely Val na PSB. Také naše výsledky vykazují obdobný, avšak nesignifikantní trend (Tab.5).

39

Graf 3: Procento tuku a bílkovin (%) a množství mléka (kg) u jednotlivých genotypů polymorfismu CYP11B1

4,1

7900

4

7850

3,9

7800

3,8

7750

3,7

7700

3,6

7650

3,5

7600

3,4

7550

3,3

7500

3,2

7450

3,1

TP kg

%

CYP11B1

BP ML

7400 Ala/Ala

Ala/Val

Val/Val

6.3.4. bPRL Jedním z polymorfismů v genu pro prolaktin byl polymorfismus RsaI polymorfického místa se zastoupením polymorfismů AA 0,01, AG 0,22 a GG 0,77 a zastoupením jednotlivých alel A 0,12 a G 0,88. Zjištění je blízké zastoupení alel zkoumaných již dříve u tohoto plemene a plemen fylogeneticky příbuzných. Výrazně nižší zastoupení alely G bylo zjištěno v dřívějších studiích především u plemene jersey. Při porovnávání alelové frekvence tohoto polymorfismu u středoevropských plemen skotu měla plemena frekvenci alely G 0,83 - český strakatý skot, 0,90 - černostrakatý skot, 0,81 - německý černostrakatý skot, 0,56 - česká červinka, 0,87 - polský červený a 0,86 německý červený skot. Zastoupením alel se od ostatních plemen signifikantně lišila česká červinka (Citek et al., 2001). U slovenského strakatého, pinzgavského a slovenského holštýnského skotu byl výskyt alely G 0,87, 0,68 a 0,95 (Chrenek et al., 1998). Zastoupení alely G u brown swiss importovaného na Slovensko bylo 0,61 (Chrenek et al., 2003). Homozygoti AA byli detekováni u německého holštýna a yaroslavlského skotu s frekvencí 0,16 a 0,13 (Khatami et al., 2005). V Polsku bylo u černostrakatého skotu zastoupení genotypů 0,0042 – AA, 0,2851 - AG, 0,7107 - GG a jednotlivých alel 0,1467 – A a 0,8533 - G ve studii Dybuse et al. (2005) a alely A 0,113 a alely G 0,1467 ve studii Bryma et al. (2005). U jerseyského skotu v Polsku bylo zastoupení genotypů a alel v jedné studii 0,4757

40

- AA, 0,4324 - AG, 0,0919 - GG a 0,6919 – A a 0,3081 - G (Dybus et al., 2005) a v druhé studii frekvence alely A 0,706 a alely G 0,294 (Brym et al., 2005). U stejného polymorfismu u íránského holštýnského skotu bylo zjištěno zastoupení alely A 0,069 a alely G 0,931 (Mehmannavaz et al., 2009). U čínského holštýnského skotu bylo zastoupení genotypů AA 0,019, AG 0,176 a GG 0,805 a zastoupení jednotlivých alel: G 0,893, A 0,107 (Lü et al., 2010). U černostrakatého a červenostrakatého skotu v Rusku byly alelové frekvence 0,71, 0,79 pro alelu G a 0,29, 0,21 pro alelu A. Mezi plemeny nebyl signifikantní rozdíl v zastoupení alel (Alipanah et al., 2007). U ruského černostrakatého skotu se vyskytovala nízká hetorozygotnost tohoto polymorfismu (9,4%) (Khatami et al., 2005). U ruského ayrshirského skotu a gorbatovského červeného skotu měla alela G výskyt 0,859 a 0,914 (Udina et al., 2001). U yakutianského skotu v Rusku byla heterozygotnost tohoto místa 0,36 (Lazebnaia et al., 2010). U jižního a západního anatolianského červeného skotu v Turecku byl výskyt alely G 0,56 a 0,74, s genotypy AA (0,15;0,125), AG (0,575;0,275) a GG (0,275;0,6) (Oztabak et al., 2008). U najdiského skotu v Íránu bylo zastoupení jednotlivých genotypů 0,2857-GG, 0,5714-AG, 0,1429-AA a frekvence alel A 0,429 a G 0,571 (Sharifi et al., 2010). Populace buvolů v provincii Khuzestan v Íránu byla monomorfická pro GG genotyp (Tabar et al., 2010). U sahiwalského skotu byl výskyt alely G 0,49, u egyptského buvola byl daný polymorfismus monomorfický, u murrah buvola byl výskyt alely G 0,93 a u nili-ravi buvola 0,84 (Mitra et al., 1995). U korejského skotu byl tento polymorfismus zvlášť zkoumán pro krávy a zvlášť pro býky. Žádný signifikantní rozdíl mezi zastoupením alel mezi pohlavími nebyl zjištěn. U krav byl výskyt alely G 0,678 a u býků 0,767 (Chung et al., 1998). Výsledky asociačních analýz k parametrům tohoto polymorfismu k mléčné užitkovosti nejsou považovány za jednotné (Schennink et al., 2009). Pozitivní vliv GG genotypu na procento tuku byl zjištěn Brymem et al. (2005) a Khatamim at al. (2005) a na obsah bílkovin Dybusem (2002). Ve studii Alipanaha et al. (2007) byl genotyp AA pozitivně asociován s procentem tuku a bílkovin v mléce u ruského černotrakatého, ale negativně u ruského červenostrakatého skotu. Alela A již také byla pozitivně asociována s množstvím mléka a bílkovin (Mehmannavaz et al., 2009). Na druhou stranu některé studie nebyly úspěšné v asociačních analýzách pro mléčnou užitkovost s tímto polymorfismem (Chrenek et al., 2003; Schennink et al., 2009). V naší populaci byl tento polymorfismus signifikantně asociován s ML (P<0,05), BK (P<0,05) a PHBP (P<0,05) (Tab.4, Tab.5). Genotypy s alelou G vykazovaly pozitivní vliv na 41

množství mléka (Graf 4), což pozitivně ovlivnilo i celkové množství bílkovin. S RPHSB nebyl tento polymorfismus v naší populaci asociován, ačkoliv už se v jedné předchozí studii podařilo tuto asociaci prokázat (Wojdak-Maksymiec et al., 2008).

Graf 4: Procento tuku a bílkovin (%) a množství mléka (kg) u jednotlivých genotypů polymorfismu bPRL

bPRL 4,1

7800

4

7600

3,9

7400

3,7

7200

3,6

7000

3,5

6800

TP kg

%

3,8

BP ML

3,4 6600

3,3

6400

3,2 3,1

6200 AA

AG

GG

6.3.5. PRLE Zkoumaný polymorfismus A/G v enhanecerové oblasti v pozici c.–1043 měl zastoupení genotypů AA 0,64, AG 0,34 a GG 0,02 a alel A 0,81 a G 0,19. V předchozích studiích u holštýnsko-fríského skotu byl zjištěn poněkud vyšší podíl alely G. V polské studii to bylo zastoupení alely G 0,26 se zastoupením jednotlivých genotypů AA, AG, GG – 0,53, 0,43, 0,04 (Brym et al., 2007). Ve studii na holštýnském skotu v Číně bylo zastoupení alely G 0,251 a zastoupení genotypů AA 0,58, AG 0,34, GG 0,08 (Lü et al., 2010). Polymorfismus byl signifikantně asociován s ML (P<0,01), BK (P<0,01), TK (P<0,001) a plemennými hodnotami PHML (P<0,01), PHTP (P<0,05), PHBK (P<0,001), PHTK (P<0,001). Genotyp AA vykazoval nižší hodnoty v množství vyprodukovaného mléka (Graf 5) i množství tuku a bílkovin oproti ostatním genotypům, což je v souladu s výsledky Lü et al. (2010).

42

Graf 5: Procento tuku a bílkovin (%) a množství mléka (kg) u jednotlivých genotypů polymorfismu PRLE

PRLE 4,1

8100

4

8000

3,9

7900

3,8

7800 7700

3,6 7600

3,5

7500

3,4 3,3

7400

3,2

7300

3,1

7200 AA

AG

GG

43

TP kg

%

3,7

BP ML

Tab.6: Efekt bPRLE na vlastnosti mléčné užitkovosti, plemenné hodnoty pro mléčnou užitkovost a PSB u krav českého strakatého plemene AA/AA (n=12)

AG/AA (n=202)

ML TP

6791,9 ± 501,01 3,97 ± 0,14

a

7331,66 ± 138,8 3,98 ± 0,04

7896,76 ± 221,59 3,98 ± 0,06

7616,82 ± 96,63 3,92 ± 0,03

TK BP

267,94 ± 20,61 3,48 ± 0,07

289,12a ± 5,69 3,47 ± 0,02

312,11 ± 9,1 3,46 ± 0,03

BK

233,48 ± 16,58 n=4

253,01a ± 4,57 n=93

PHML

-76,89 ± 195,22

115,08a ± 51,09 A

AG/AG (n=68)

GG/AA (n=628)

GG/GG (n=39)

a

7791,36 ± 116,6 3,97 ± 0,03

8047,65 ± 300,69 4,05 ± 0,09

**

296,31 ± 3,96 3,44 ± 0,01

306,98a ± 4,78 3,45 ± 0,02

324,03 ± 12,37 3,5 ± 0,04

**

270,73 ± 7,31 n=31

260,56 ± 3,18 n=269

267,70a ± 3,84 n=155

279,95 ± 9,95 n=13

**

296,42 ± 83,59

183,52 ± 36,19

274,47a ± 42,94

341,07 ± 116,78

* * * **

A

PHBP PHTP PHBK

0,03 ± 0,05 0,09 ± 0,09 -1,13 ± 6,23

0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,02 5,57 ± 1,63

0,00 ± 0,02 0,03 ± 0,04 10,1 ± 2,67

-0,02 ± 0,01 -0,03 ± 0,02 5,62 ± 1,16

0,00 ± 0,01 0,01 ± 0,02 9,5 ± 1,37

0,04 ± 0,03 0,11 ± 0,05 13,94 ± 3,73

PHTK

1,55 ± 8,49

6,52a ± 2,22 n=23

15,29 ± 3,64 n=11

6,47B,c ± 1,57 n=71

13,21B ± 1,87 n=43

21,54a,c ± 5,08 n=4

88,75a,b ± 2,89

103,52a ± 4,17

98,42b ± 1,76

97,75 ± 2,22

96,50 ± 6,15

RPHSB * P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001

Signif,

GG/AG (n=350)

Genotypy AA/AG. AA/GG a AG/GG se v naší populaci nevyskytovaly. Hodnoty jsou uváděny jako průměry nejmenších čtverců (±SE). Signifikantní rozdíly mezi odhady jsou označeny stejnými písmeny v indexu P < 0,05 (malá písmena) a P < 0,01 (velká písmena).

*** *

6.3.6. bPRLE a vazebná nerovnováha V asociační analýze byly použity sdružené genotypy z polymorfismů v rámci prolaktinového genu bPRLE. Zastoupení jedinců v populaci majících určitý genotyp v bPRLE jsou uvedeny v Tab.1. Jedinci s genotypy GG/GG, GG/AG, a AG/GG se v této populaci nevyskytovali.

Tab.7: Pravděpodobnost výskytu jednotlivých haplotypů genu PRL. AA

AG

GA

GG

0,12

3,04*10-6

0,69

0,19

První v pořadí je uvedená alela polymorfismu bPRL, druhou je alela PRLE.

Pravděpodobnosti (frekvence) jednotlivých haplotypů v této populaci byly dány programem EMLD. Nejvyšší pravděpodobnost výskytu ve zkoumané populaci má haplotyp GA, naopak pravděpodobnost výskytu haplotypu AG je velice nízká (viz. Tab.7).

Tab.8: Parametry LD. D

D'

r2

-0,0217

0,9999

0,0302

Vazebná nerovnováha nebyla v předchozích studiích nikdy stanovována. Výsledky výpočtu parametrů LD mezi polymorfismy v rámci genu PRL (bPRL a PRLE) jsou uvedeny v Tab.8. Dle Thortnona (2009), pokud se vyskytuje některá z alel v nízké míře, může se hodnota D´ blížit 1 a r2 je blízké nule, v takovém případě je vhodnější brát v úvahu r2. Proto z výsledků výpočtu LD nelze prokázat LD mezi lokusy genu PRL sledovaných v této studii. K rozdílům v D’ a r2 v naší studii mohlo dojít ze dvou důvodů. Zaprvé D’ je ovlivněno nízkým zastoupením minoritních alel v populaci a zadruhé r2 je ovlivněno různou frekvencí vázaných alel. Nízké r2 v našich výsledcích znamená, že jeden polymorfismus vysvětluje pouze v malém množství (asi 3%) variabilitu druhého polymorfismu. Kdyby r2 bylo vysoké, nebylo by nutné v dalších analýzách genotypovat oba SNP, takto však bude nutné pro další výzkum používat oba polymorfismy, neboť oba,

45

jak je patrno i z výsledků asociační analýzy, ovlivňují přímo či nepřímo produkční vlastnosti. Sdružený genotyp bPRLE byl asociován s ML (P<0,01), TK (P<0,01) a BK (P<0,05) a plemennými hodnotami PHML (P<0,05), PHBK (P<0,01), PHBP (P<0,05), PHTK (P<0,001), PHTP (P<0,05) (Tab.6, Graf 6). Mezi jednotlivými skupinami genotypů byly rozdíly ovlivněné oběma samostatnými genotypy (bPRL a PRLE). Jednotlivé genotypy ovlivňovaly asociované vlastnosti směrem jako v samostatných analýzách pro bPRL a PRLE (Tab.4, Tab.5) bPRLE byl asociován také s RPHSB (P<0,05). Ačkoliv by se dalo předpokládat, že jedinci s vysokou produkcí budou vykazovat nízkou RPHSB, to se v tomto případě nepotvrdilo (Tab.6). Jedinci s genotypem AG/AG měli oproti jedincům AG/AA a GG/AA nejen vyšší produkci mléka (nesignifikantní rozdíly mezi těmito skupinami), ale i vyšší RPHSB (signifikantní rozdíly mezi skupinami). Vliv prolaktinu na počet somatických buněk a tím na prevenci proti mastitidě můžeme tedy spojovat spíše s jeho imunostimulační a protekční aktivitou (viz kapitola 2.4.3). Důvodem proč nebyla u jednotlivých polymorfismů bPRL a PRLE asociace s RPHSB prokazatelná, může být vliv druhého polymorfismu na variabilitu skupiny s genotypem prvního polymorfismu a obráceně, popř. určitý druh interakce. To podporuje závěr, že oba polymorfismy jsou důležité markery nejen vzhledem k možné rezistenci k mastitidám. Graf 6: Procento tuku a bílkovin (%) a množství mléka (kg) u genotypů bPRLE

4,1

8200

4

8000

3,9

7800

3,8

7600

3,7

7400

3,6

7200

3,5

7000

3,4

6800

3,3

6600

3,2

6400

3,1

6200 AA/AA

AG/AA

AG/AG

GG/AA

46

GG/AG

GG/GG

TP kg

%

bPRLE

BP ML

7. Souhrn a závěr Byla provedena genetická analýza pomocí metody PCR-RFLP u 505 krav českého strakatého plemene, a sice polymorfismu c.1892+19C>T v intronu 9 bovinního proliferátorem aktivovaného receptoru gamma koaktivátoru 1 alfa (PPARGC1A), dále g.8514C>T polymorfismu ve čtvrtém intronu bovinního sekretovaného fosfoproteinu (SPP1), p.Val30Ala polymorfismu v prvním intronu bovinního cytochromu P450, subfamily XI B, polypeptidu 1 (CYP11B1), a dvou polymorfismů vrámci prolaktinového genu (PRL) – prvním byl g.8398G>A ve čtvrtém exonu tohoto genu a druhým byl polymorfismus c.–1043A>G v enhanceru tohoto genu. Z výsledků genetické analýzy bylo stanoveno zastoupení alel a genotypů v populaci a byla vypočtena Hardy-Weinbergova rovnováha pomocí Pearsonova χ2-testu. Byla provedena asociační analýza mezi těmito polymorfismy a znaky mléčné užitkovosti u českého strakatého skotu, tj. dojivostí (ML), produkcí bílkovin (BK) a tuku (TK) v kg, procentickým obsahem bílkovin (BP) a tuku (TP) v mléce, plemennou hodnotou pro množství mléka (PHML), množství bílkovin (PHBK) a tuku (PHTK), obsah bílkovin (PHBP) a tuku (PHTP) v mléce a relativní plemennou hodnotou pro počet somatických buněk (RPHSB) u krav českého strakatého plemene. Zároveň byla provedena analýza vazebné nerovnováhy mezi polymorfismy v rámci prolaktinového genu a pomocí asociační analýzy bylo stanoveno jejich současné působení na zkoumané vlastnosti.

Prvním dílčím cílem této práce bylo zjistit variabilitu vybraných polymorfismů v populaci českého strakatého plemene. Pro genotypování bylo využito DNA izolované z periferní krve. Všechny polymorfismy byly stanoveny pomocí metody PCR-RFLP. Celkově bylo genotypováno 505 krav českého strakatého plemene. Výsledky genotypování můžeme zhodnotit následovně: •

Sledovaný soubor českého strakatého skotu vykazoval variabilitu ve všech vyšetřovaných polymorfních místech.

•

Genotypy všech studovaných polymorfismů byly v Hardy-Weinbergově rovnováze.

•

Zastoupení genotypů i alel je blízké výsledkům studií u jiných plemen.

Dalším dílčím cílem bylo zhodnotit asociace mezi genotypy a alelami vyšetřovaných polymorfismů a ukazateli mléčné užitkovosti tj. množstvím mléka, procentem tuku a bílkovin v mléce, a množstvím vyprodukovaného tuku a bílkovin, stejně jako s plemennými hodnotami

47

pro všechny tyto vlastnosti a relativními plemennou hodnotou pro počet somatických buněk. Statistická analýza byla provedena smíšeným lineárním modelem u každého polymorfismu: •

Byla prokázána asociace polymorfismu c.1892+19C>T genu PPARGC1A s TK (P<0,05).

•

Nebyla prokázána žádná asociace vyšetřovaných vlastností s polymorfismem g.8514C>T v SPP1 genu.

•

Byla prokázána asociace polymorfismu p.Val30Ala v genu CYP11B1 s PHML (P<0,05), PHBK (P<0,05) a PHTK (P<0,05).

•

Byla prokázána asociace polymorfismu g.8398G>A v PRL s ML (P<0,05), BP (P<0,05) a PHBP (P<0,05).

•

Byla prokázána asociace polymorfismu c.-1043A>G v PRL s ML (P<0,01), TK (P<0,01), BK (P<0,01), PHML (P<0,01), PHTP (P<0,05), PHBK (P<0,001), PHTK (P<0,001).

Dílčím cílem bylo zjistit vazebnou nerovnováhu v rámci genů v prolaktinovém genu a zjištění současného působení těchto polymorfismů na sledované vlastnosti. Pro výpočet frekvence jednotlivých haplotypů byla využita metoda algoritmu očekávané maximalizace. Jako parametry vazebné nerovnováhy byly následně stanoveny r2, D, D’. Vazebná nerovnováha mezi těmito dvěma polymorfismy nebyla v předchozích studiích nikdy stanovována. Statistická analýza byla provedena smíšeným lineárním modelem pro odhad efektu daného genotypu. Výsledky tohoto dílčího cíle byly: •

Na základě parametrů vazebné nerovnováhy se nepodařila prokázat vazebná nerovnováha mezi polymorfismy v rámci prolaktinového genu.

•

Genotypy v rámci prolaktinového genu současně signifikantně ovlivňovali ML (P<0,01), TK (P<0,01), BK (P<0,01), PHML (P<0,05), PHBP (P<0,05), PHTP (P<0,05), PHBK (P<0,01), PHTK (P<0,001) a RPHSB (P<0,05).

•

Rozdíly mezi skupinami sdružených genotypů byly ovlivněny oběma polymorfismy.

Všechny zkoumané polymorfismy vykazují ve sledovaném souboru českého strakatého skotu variabilitu. Zastoupení genotypů všech polymorfismů je v HardyWeinbergově rovnováze. Zastoupení alel a genotypů je blízké výsledkům u dojeného i masného skotu v jiných studiích. Zkoumané polymorfismy v genech PPARGC1A, CYP11B1 a PRL jsou významnými markery pro vlastnosti mléčné užitkovosti u českého strakatého 48

skotu. Mezi polymorfismy v PRL genu nebyla prokázána vazebná nerovnováha a tyto polymorfismy ovlivňují mléčnou užitkovost každý zvlášť. Oba polymorfismy se tedy přímo nebo nepřímo podílejí na variabilitě u vlastností mléčné užitkovosti u českého strakatého skotu, a to na sobě nezávisle, lze tedy doporučit využití obou polymorfismů v dalších studiích

Výsledky analyzovaných polymorfismů podporují jejich využití při dalších studiích u českého strakatého skotu. Výsledky studie lze dále v budoucnosti využít při šlechtění a selekci českého strakatého skotu, neboť byl prokázán vliv vybraných polymorfismů na mléčnou užitkovost. Možnost uplatnění dosažených výsledků je velmi aktuální vzhledem k připravovanému uvedení genomické selekce u českého strakatého skotu a vzhledem k vývoji této problematiky ve světě.

49

8. Seznam literatury Akimoto, T., Pohnert, S.C., Li, P., Zhang, M., Gumbs, C., Rosenberg, P.B., Williams, R.S., Yan Z. 2005. Exercise Stimulates Pgc-1_ Transcription in Skeletal Muscle through Activation of the p38 MAPK Pathway. The Journal of Biological Chemistry. 280 (20). 19587–19593. Alain, K., Karrow, N.A., Thibault, C., St-Pierre, J., Lessard, M., Bissonnette, N. 2009. Osteopontin: an early innate immune marker of Escherichia coli mastitis harbors genetic polymorphisms with possible links with resistance to mastitis [online]. BMC Genomics. 10. 444. Dostupné z . Alipanah, M., Kalashnikova, L.A., Rodionov, G.V. 2007. Polymorphism Prolactin loci in Russian cattle. Journal of Animal and Veterinary Advances. 6(6). 813-815. Arany, Z. 2008. PGC-1 coactivators and skeletal muscle adaptations in health and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 18(5). 426-34. Arany, Z., Novikov, M., Chin, S., Ma, Y., Rosenzweig, A., Spiegelman, B. M. 2006. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1-alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103(26). 10086-10091. Arany, Z., Foo, S.-Y., Ma, Y., Ruas, J. L., Bommi-Reddy, A., Girnun, G., Cooper, M., Laznik, D., Chinsomboon, J., Rangwala, S. M., Baek, K. H., Rosenzweig, A., Spiegelman, B. M. 2008. HIF-independent regulation of VEGF and angiogenesis by the transcriptional coactivator PGC-1-alpha. Nature. 451(7181). 1008-1012. Arnold, H.-P. 12th May 2010. pers.comm. Ashkar, S., Weber, G.F., Panoutsakopoulou, V., Sanchirico, M.E., Jansson, M., Zawaideh, S., Rittling, S.R., Denhardt, D.T., Glimcher, M.J., Cantor, H. 2000. Eta-1 (osteopontin): an early component of type-1 (cell-mediated) immunity. Science. 287(5454). 860-4.

Auchtung, T.L., Rius, A.G., Kendall, P.E., McFadden, T.B., Dahl, G.E. 2005. Effects of photoperiod during the dry period on prolactin, prolactin receptor, and milk production of dairy cows. Journal of Dairy Science. 88(1).121-7. Bachelot, A., Binart, N. 2007. Reproductive role of prolactin. Reproduction. 133(2). 361-9. Barkema, H.W., Green, M.J., Bradley, A.J., Zadoks, R.N. 2009. Invited review: The role of contagious disease in udder health. Journal of Dairy Science. 92(10). 4717-29. Benton, C.R., Wright, D.C., Bonen, A. 2008. PGC-1alpha-mediated regulation of gene expression and metabolism: implications for nutrition and exercise prescriptions. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 33(5). 843-62. Bhangoo, A., Wilson, R., New, M.I., Ten, S. 2006. Donor splice mutation in the 11betahydroxylase (CypllB1) gene resulting in sex reversal: a case report and review of the literature. Journal of Pediatric Endocrinology & Metabolism. 19(10). 1267-82. Bionaz, M., Loor, J.J. 2008. Gene networks driving bovine milk fat synthesis during the lactation cycle [online]. BMC Genomics. 9. 366. Dostupné z . Blowey R, Edmondson P. Mastitis control in dairy herds. 2nd ed. Wallingford, Oxfordshire, UK. Cambridge. MA: CABI. 266 p. ISBN: 9781845935504. Dostupné také z . Bole-Feysot, C., Goffin, V., Edery, M., Binart, N., Kelly, P.A. 1998 Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocrine Reviews. 19(3). 225-68. Bonen, A. 2009. PGC-1alpha-induced improvements in skeletal muscle metabolism and insulin sensitivity. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 34(3). 307-14. Boon, W.C., Coghlan, J.P., McDougall, J.G. 1998b. Late steps of aldosterone biosynthesis: Sheep are not rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 25. S21-S27.

Boon, W.C., McDougall, J.G., Coghlan, J.P. 1998a. Hypothesis: aldosterone is synthesized by an alternative pathway during severe sodium depletion. 'A new wine in an old bottle'. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 25(5). 369-78. Bose, M., Oliván, B., Laferrère, B. 2009. Stress and obesity: the role of the hypothalamicpituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 16(5). 340-6. Brand, M.D., Affourtit, C., Esteves, T.C., Green, K., Lambert, A.J., Miwa, S., Pakay, J.L., Parker, N. 2004. Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins. Free Radical Biology & Medicine. 37(6). 75567. Brettes, J.P., Mathelin, C. 2008. Dual effects of androgens on mammary gland. Bull Cancer. 95(5). 495-502. Brown, T.A. 2002. Genomes. 2nd ed. Garland Science. New York and London. Dostupné také z . Brym, P., Kamiñski, S., Wójcik, E. 2005. Nucleotide sequence polymorphism within exon 4 of the bovine prolactin gene and its associations with milk performance traits. Journal of Applied Genetics. 46(2). 179-185. Brym, P., Malewski, T., Starzyński, R., Flisikowski, K., Wójcik, E., Ruść, A., Zwierzchowski, L., Kamiński, S. 2007. Effect of new SNP within bovine prolactin gene enhancer region on expression in the pituitary gland. Biochemical Genetics. 45(9-10). 743-54. Buitenhuis, A.J., Lund M.S., Thomasen, J.R., Thomsen, B., Hunnicke Nielsen V., Bendixen, C., Guldbrandtsen, B. 2007. Detection of Quantitative Trait Loci Affecting Lameness and Leg Conformation Traits in Danish Holstein Cattle. Journal of Dairy Science. 90(1). 472–481. Camper, S.A., Luck, D.N., Yao, Y., Woychik, R.P., Goodwin, R.G., Lyons, R.H. Jr, Rottman, F.M. 1984. Characterization of the bovine prolactin gene. DNA. 3(3). 237-49.

Cao, W., Liu, Y.-J. 2006. Opn: key regulator of pDC interferon production. Nature Immunology. 7(5). 441-3. Cao, X., Wang, Q., Yan, J.B., Yang, F.K., Huang, S.Z., Zeng, Y.T. 2002. Molecular cloning and analysis of bovine prolactin full-long genomic as well as cDNA sequences. Yi Chuan Xue Bao. 29(9). 768-73. Chabas, D., Baranzini, S.E., Mitchell, D., Bernard, C.C., Rittling, S.R., Denhardt, D.T., Sobel, R.A., Lock, C., Karpuj, M., Pedotti, R., Heller, R., Oksenberg, J.R., Steinman, L. 2001. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease. Science. 294(5547). 1731-5. Chrenek, P., Huba, J., Vasicek, D., Peskovicova, D., Bulla, J. 2003. The relation between genetic polymorphism markers and milk yield in brown swiss cattle imported to Slovakia. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 16(10). 1397-1401. Chrenek, P., Vasicek, D, Bauerova, M,, Bulla, J. 1998. Simultaneous analysis of bovine growth hormone and prolactin alleles by multiplex PCR and RFLP. Czech Journal of Animal Science. 43(2). 53-55. Christensen, B., Nielsen, M.S., Haselmann, K.F., Petersen, T.E., Sørensen, E.S. 2005. Posttranslationally modified residues of native human osteopontin are located in clusters: identification of 36 phosphorylation and five O-glycosylation sites and their biological implications. Biochemical Journal. 390(Pt 1). 285-92. Chung, E.R., Kim, W.T., Lee, C.S. 1998. DNA polymorphisms of kappa-casein, betalactoglobulin,

growth

hormone

and

prolactin

genes

in

Korean

cattle

Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 11(4). 422-427. Citek, J., Rehout, V., Neubauerova, V. 2001. Allele frequency at PRL (prolactin) and LGB (lactoglobulin beta) genes in Red cattle breeds from Central Europe and in other breeds. Czech Journal of Animal Science. 46(10). 433-438. Cohen-Zinder, M., Seroussi, E., Larkin, D.M., Loor, J.J., Everts-van der Wind, A., Lee, J.H., Drackley, J.K., Band, M.R., Hernandez, A.G., Shani, M., Lewin, H.A., Weller, J.I., Ron, M. 2005. Identification of a missense mutation in the bovine ABCG2

gene with a major effect on the QTL on chromosome 6 affecting milk yield and composition in Holstein cattle. Genome Research. 15(7). 936-44. Cooke, N.E., Coit, D., Shine, J., Baxter, J.D., Martial, J.A. 1981. Human prolactin. cDNA structural analysis and evolutionary comparisons. Journal of Biological Chemistry. 256(8). 4007-16. Corbacho, A.M., Macotela, Y., Nava, G., Torner, L., Dueñas, Z., Noris, G., Morales, M.A., Martínez De La Escalera, G., Clapp, C. 2000. Human umbilical vein endothelial cells express multiple prolactin isoforms. Journal of Endocrinology. 166(1). 53-62. Crosby, A.H., Edwards, S.J., Murray, J.C., Dixon, M.J. 1995. Genomic organization of the human osteopontin gene: exclusion of the locus from a causative role in the pathogenesis of dentinogenesis imperfecta type II. Genomics. 27(1). 155-60. Diao, H., Kon, S., Iwabuchi, K., Kimura, C., Morimoto, J., Ito, D., Segawa, T., Maeda, M., Hamuro, J., Nakayama, T., Taniguchi, M., Yagita, H., Van Kaer, L., Onóe, K., Denhardt, D., Rittling, S., Uede, T. 2004. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases. Immunity. 21(4). 539-50. Dissanayake, D., Wijesinghe, P.S., Ratnasooriya, W.D., Wimalasena, S. 2009. Effects of zinc supplementation on sexual behavior of male rats. Journal of Human Reproductive Sciences. 2(2). 57-61. Dybus, A. 2002. Associations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) gene polymorphisms with milk production traits in Polish Black-and-White cattle. Animal Science Papers and Reports. 20(4). 203–12. Dybus, A., Grzesiak, W., Kamieniecki, H., Szatkowska, I., Sobek, Z., Blaszczyk, P., Czerniawska-Piatkowska, E., Zych, S., Muszyńska, M. 2005. Association of genetic variants of bovine prolactin with milk production traits of Black-andWhite and Jersey cattle. Archiv für Tierzucht-Archives of Animal Breeding. 48(2). 149-156.

Ek-Rylander, B., Andersson, G. 2010. Osteoclast migration on phosphorylated osteopontin is regulated by endogenous tartrate-resistant acid phosphatase. Experimental Cell Research. 316(3). 443-51. Entrez Gene (a), PPARGC1B peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 beta [ Homo sapiens ] [online]. [cit. 2010-9-30]. Dostupné z . Entrez Gene (b), SPP1 secreted phosphoprotein 1 [ Bos taurus ] [online]. [cit. 2010-9-21]. Dostupné z . Erikson, D.W., Burghardt, R.C., Bayless, K.J., Johnson, G.A. 2009. Secreted phosphoprotein 1 (SPP1, osteopontin) binds to integrin alpha v beta 6 on porcine trophectoderm cells and integrin alpha v beta 3 on uterine luminal epithelial cells, and promotes trophectoderm cell adhesion and migration. Biology of Reproduction. 81(5). 81425. Erikson, D.W., Way, A.L., Chapman, D.A., Killian, G.J. 2007. Detection of osteopontin on Holstein bull spermatozoa, in cauda epididymal fluid and testis homogenates, and its potential role in bovine fertilization. Reproduction. 133(5). 909-17. Esterbauer, H., Oberkofler, H., Krempler, F., Patsch, W. 1999. Human peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 (PPARGC1) gene: cDNA sequence, genomic organization, chromosomal localization, and tissue expression. Genomics. 62(1). 98-102. Frandson, R.D., Lee Wilke W., Dee Fails A. 2003. Anatomy and physiology of farm animals. 6th edition. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. p. 481. ISBN: 9780781733588. Dostupné také z . Fries, R., Ruvinsky, A. (eds.) 1999. The Genetics of cattle. CABI Publishing. Walligford. p. 710. ISBN: 0851992587. Ge, G., Fernández, C.A., Moses, M.A., Greenspan, D.S. 2007. Bone morphogenetic protein 1 processes prolactin to a 17-kDa antiangiogenic factor. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 104(24). 10010-5.

Gellersen, B., Kempf, R., Telgmann, R., DiMattia, G.E. 1994. Nonpituitary human prolactin gene transcription is independent of Pit-1 and differentially controlled in lymphocytes and in endometrial stroma. Molecular Endocrinology, 8(3), 356-73. Gill, J.L., Bishop, S.C., McCorquodale, C., Williams, J.L., Wiener, P. 2008. Associations between the 11-bp deletion in the myostatin gene and carcass quality in Angussired cattle. Animal Genetics. 40(1). 97-100. Girolomoni, G., Phillips, J.T., Bergstresser, P.R. 1993. Prolactin stimulates proliferation of cultured human keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 101(3). 2759. Glasow, A., Breidert, M., Haidan, A., Anderegg, U., Kelly, P.A., Bornstein, S.R. 1996. Functional aspects of the effect of prolactin (PRL) on adrenal steroidogenesis and distribution of the PRL receptor in the human adrenal gland. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 81(8). 3103-11. Goffin, V., Binart, N., Touraine, P., Kelly, P.A. 2002. Prolactin: the new biology of an old hormone. Annual Review of Physiology. 64. 47-67. Gómez-Ambrosi, J., Catalán, V., Ramírez, B., Rodríguez, A., Colina, I., Silva, C., Rotellar, F., Mugueta, C., Gil, M.J., Cienfuegos, J.A., Salvador, J., Frühbeck, G. 2007. Plasma osteopontin levels and expression in adipose tissue are increased in obesity. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 92(9). 3719-27. Gonçalves, R.F., Chapman, D.A., Bertolla, R.P., Eder, I., Killian, G.J. 2008. Pre-treatment of cattle semen or oocytes with purified milk osteopontin affects in vitro fertilization and embryo development. Animal Reproduction Science. 108(3-4). 375-83. Graf, K., Do, Y.S., Ashizawa, N., Meehan, W.P., Giachelli, C.M., Marboe, C.C., Fleck, E., Hsueh, W.A. 1997. Myocardial osteopontin expression is associated with left ventricular hypertrophy. Circulation. 96(9). 3063-71. Grosdemouge, I., Bachelot, A., Lucas, A., Baran, N., Kelly, P.A., Binart, N. 2003. Effects of deletion of the prolactin receptor on ovarian gene expression. Reproductive Biology and Endocrinology. 1. 12.

Handschin, C., Choi, C.S., Chin, S., Kim, S., Kawamori, D., Kurpad, A.J., Neubauer, N., Hu, J., Mootha, V.K., Kim, Y.B., Kulkarni, R.N., Shulman, G.I., Spiegelman, B.M. 2007. Abnormal glucose homeostasis in skeletal muscle-specific PGC-1alpha knockout mice reveals skeletal muscle-pancreatic beta cell crosstalk. Journal of Clinical Investigation. 117(11). 3463-74. Hayes, B. 2008. Course Notes 'QTL Mapping, MAS, and Genomic Selection'[online]. QTL Mapping, MAS, and Genomic Selection Course. 10th-14th March 2008. [cit. 201010-15]. Dostupné z . Haylock, D.N., Nilsson, S.K. 2006. Osteopontin: a bridge between bone and blood. British Journal of Haematology. 134(5). 467-74. He, F., Sun, D.X., Yu, Y., Wang, Y., Zhang, Y. 2006. Association between SNPs within prolactin gene and

milk performance traits in Holstein dairy cattle.

Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 19(10). 1384-1389. Hedegaard, J., Arce, C., Bicciato, S., Bonnet, A., Buitenhuis, B., Collado-Romero, M., Conley, L.N., Sancristobal, M., Ferrari, F., Garrido, J.J., Groenen, M.A., Hornshøj, H., Hulsegge, I., Jiang, L., Jiménez-Marín, A., Kommadath, A., Lagarrigue, S., Leunissen, J.A., Liaubet, L., Neerincx, P.B., Nie, H., van der Poel, J., Prickett, D., Ramirez-Boo, M., Rebel, J.M., Robert-Granié, C., Skarman, A., Smits, M.A., Sørensen, P., Tosser-Klopp, G., Watson, M. 2009. Methods for interpreting lists of affected genes obtained in a DNA microarray experiment [online]. BMC Proceedings. 3. Suppl 4:S5. Dostupné z . Herzig, S., Long, F., Jhala, U. S., Hedrick, S., Quinn, R., Bauer, A., Rudolph, D., Schutz, G., Yoon, C., Puigserver, P., Spiegelman, B., Montminy, M. 2001. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature. 413(6852). 179183. Heyen, D.W., Weller, J.I., Ron, M., Band, M., Beever, J.E., Feldmesser, E., Da, Y., Wiggans, G.R.,VanRaden, P.M., Lewin, H.A. 1999. A genome scan for QTL influencing

milk production and health traits in dairy cattle. Physiological Genomics. 1(3). 165-75. Hill, W.G., Robertson A. 1968. Linkage disequilibrium in finite populations. Theoretical and Applieed Genetetics. 38(6). 226–231. Hodson, D.J., Townsend, J., Tortonese, D.J. 2010. Biology of reproduction. Characterization of the Effects of Prolactin in Gonadotroph Target Cells [online]. V tisku. Elektronicky

publikováno

18th

August

2010.

Dostupné

z


www.biolreprod.org/content/early/2010/08/16/biolreprod.110.084947.long>. Holmberg, M., Andersson-Eklund, L. 2006. Quantitative Trait Loci Affecting Fertility and Calving Traits in Swedish Dairy Cattle. Journal of Dairy Science. 89. 3664–3671. Houdebine, L.-M.1999. The regulation of milk protein synthesis. In Martinet, J., Houdebine, L.-M., Head, H.H. (eds.). Biology of Lactation. INRA Editions. Paris. p. 401-428. ISBN: 978-2-7380-0861-9. Dostupné také z . Huang Q., EMLD [Program] [online]. 23rd September 2003. [cit. 2009-20-5]. Dostupné z . Hunter, G.K., Grohe, B., Jeffrey, S., O'Young, J., Sørensen, E.S., Goldberg, H.A. 2009. Role of phosphate groups in inhibition of calcium oxalate crystal growth by osteopontin. Cells Tissues Organs. 189(1-4). 44-50. Ibeagha-Awemu, E.M., Kgwatalala, P., Ibeagha, A.E., Zhao. X. 2008. A critical analysis of disease-associated DNA polymorphisms in the genes of cattle, goat, sheep, and pig. Mammalian Genome. 19(4). 226-245. Ichikawa, H., Imano, M., Takeyama, Y., Shiozaki, H., Ohyanagi, H. 2009. Involvement of osteopontin as a core protein in cholesterol gallstone formation. Journal of HepatoBiliary-Pancreatic Surgery. 16(2). 197-203. Imachi, H., Murao, K., Cao, W.M., Muraoka, T., Nishiuchi, T., Dobashi, H., Hosomi, N., Iwama, H., Ishida, T. 2008. The prolactin regulatory element-binding regulates of the

11beta-hydroxylase

gene.

Communications. 376(3). 531-5.

Biochemical

and

Biophysical

Research

Istrail, S. Introduction to Linkage Disequilibrium CSCI2950-L: Algorithmic Foundations of Computational Biology [online]. 12th May 2008. [cit. 2010-10-30] Dostupné z . Jacobson, E.M., Hugo, E.R., Tuttle, T.R., Papoian, R., Ben-Jonathan, N. 2010. Unexploited therapies in breast and prostate cancer: blockade of the prolactin receptor. Trends in Endocrinology and Metabolism. 21(11). 691-8. Jakubec, V. Říha, J., Golda, J., Majzlík, I. 1999. Odhad plemenné hodnoty hospodářských zvířat. Grafotyp. Rapotín. 178 s. Jakubec, V., Říha, J., Majzlík, I., Bjelka, M. 2003. Teorie a praxe selekce hospodářských zvířat. Grafotyp. Rapotín. 154 s. ISBN: 80-903143-2-5. Jara, L.J., Medina, G., Saavedra, M.A., Vera-Lastra, O., Navarro, C. Prolactin and Autoimmunity [online]. Clin Rev Allergy Immunol. V tisku. Elektronicky publikováno 13th November 2009. Dostupné z . Johnson, G.A., Burghardt, R.C., Spencer, T.E., Newton, G.R., Ott, T.L., Bazer, F.W. 1999. Ovine osteopontin: II. Osteopontin and alpha(v)beta(3) integrin expression in the uterus and conceptus during the periimplantation period. Biology of Reproduction. 61(4). 892-9. Josimovich, J.B., Merisko, K., Boccella, L. 1977. Amniotic prolactin control over amniotic and fetal extracellular fluid water and electrolytes in the rhesus monkey. Endocrinology. 100(2). 564-70. Karcher, E.L., Bayles, D.O., Bannantine, J.P., Beitz, D.C., Stabel, J.R. 2008. Osteopontin: a novel cytokine involved in the regulation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection in periparturient dairy cattle. Journal of Dairy Science. 91(8). 3079-91. Kaupe, B., Brandt, H., Prinzenberg, E.-M., Erhardt, G. 2007. Joint analysis of the influence of CYP11B1 and DGAT1 genetic variation on milk production, somatic cell score,

conformation, reproduction, and productive lifespan in German Holstein cattle. Journal of Animal Science. 85. 11-21. Kaupe, B., Kollers, S., Fries, R., Erhardt, G. 2004. Mapping of CYP11B and a putative CYHR1 paralogous gene to bovine chromosome 14 by FISH. Animal Genetics. 35(6). 478-9. Kazanecki, C.C., Uzwiak, D.J., Denhardt, D.T. 2007. Control of osteopontin signaling and function by post-translational phosphorylation and protein folding. Journal of Cellular Biochemistry. 102(4). 912-24. Khatami SR, Lazebny OE, Maksimenko VF, Sulimova G.E. 2005. Association of DNA polymorphisms of the growth hormone and prolactin genes with milk productivity in Yaroslavl and Black-and-White cattle. Russian Journal of Genetics. 41(2). 167173. Khatib, H., Zaitoun, I., Wiebelhaus-Finger, J., Chang, Y.M., Rosa, G.J. 2007. The association of bovine PPARGC1A and OPN genes with milk composition in two independent Holstein cattle populations. Journal of Dairy Science. 90(6). 2966-70. Khatkar, M.S., Thomson, P.C., Tammen, I., Raadsma, H.W. 2004. Quantitative trait loci mapping in dairy cattle: review and meta-analysis. Genetics Selection Evolution. 36(2). 163-90. Kim, B.G., Brooks, C.L. 1993. Isolation and characterization of phosphorylated bovine prolactin. Biochemical Journal. 296 (Pt 1). 41-7. Kim, J.H., Skates, S.J., Uede, T., Wong, K.K., Schorge, J.O., Feltmate, C.M., Berkowitz, R.S., Cramer, D.W., Mok, S.C. 2002. Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. JAMA. 287(13). 1671-9. Kim, H., Toyofuku, Y., Lynn, F.C., Chak, E., Uchida, T., Mizukami, H., Fujitani, Y., Kawamori, R., Miyatsuka, T., Kosaka, Y., Yang, K., Honig, G., van der Hart, M., Kishimoto, N., Wang, J., Yagihashi, S., Tecott, L.H., Watada, H., German, M.S. 2010. Serotonin regulates pancreatic beta cell mass during pregnancy. Nature Medicine. 16(7). 804-8.

Kimmins, S., Lim, H.C., MacLaren, L.A. 2004. Immunohistochemical localization of integrin alpha V beta 3 and osteopontin suggests that they do not interact during embryo implantation in ruminants. Reproductive Biology and Endocrinology. 2. 19. Kirita, S., Hashimoto, T., Kitajima, M., Honda, S., Morohashi, K., Omura, T. 1990 Structural analysis of multiple bovine P-450(11 beta) genes and their promoter activities. Journal of Biochemistry. 108(6). 1030-41. Kledzik, G., Marshall, S., Gelato, M., Campbell, G., Meites, J. 1975. Prolactin binding activity on the crop sacs of juvenile, mature, parent and prolactin-injected pigeons. Endocrine Research Communications. 2(4-5). 345-55. Kohri, K., Nomura, S., Kitamura, Y., Nagata, T., Yoshioka, K., Iguchi, M., Yamate, T., Umekawa, T., Suzuki, Y., Sinohara, H., Kurita, T. 1993. Structure and expression of the mRNA encoding urinary stone protein (osteopontin). Journal of Biological Chemistry. 268(20). 15180-4. Kohri, K., Suzuki, Y., Yoshida, K., Yamamoto, K., Amasaki, N., Yamate, T., Umekawa, T., Iguchi, M., Sinohara, H., Kurita, T. 1992. Molecular cloning and sequencing of cDNA encoding urinary stone protein, which is identical to osteopontin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 184(2). 859-64. Komisarek, J., Dorynek, Z. 2009. Effect of ABCG2, PPARGC1A, OLR1 and SCD1 gene polymorphism on estimated breeding values for functional and production traits in Polish Holstein-Friesian bulls. Journal of Applied Genetics. 50(2). 125-32. Kowalewska-Luczak, I., Kulig. H., Kmiec, M. 2010. Associations between the bovine PPARGC1A gene and milk production traits. Czech Journal of Animal Science. 55(5). 195-199. Kuhn, C., Thaller, G., Winter, A., Bininda-Emonds, O.R., Kaupe, B., Erhardt, G., Bennewitz, J., Schwerin, M., Fries, R. 2004. Evidence for multiple alleles at the DGAT1 locus better explains a quantitativetrait locus with major effect on milk fat content in cattle. Genetics. 167(4). 1873-81.

Kvapilík, J., Růžička, Z., Bucek., P. 2010. Ročenka-Chov skotu v České republice Hlavní výsledky a ukazatele za rok 2009. ČMSCH. Praha. 96 s. ISBN: 978-80-904131-46. Kyrou, I., Chrousos, G.P., Tsigos, C. 2006. Stress, visceral obesity, and metabolic complications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1083. 77-110. Lai, L., Leone, T.C., Zechner, C., Schaeffer, P.J., Kelly, S.M., Flanagan, D.P., Medeiros, D.M., Kovacs, A., Kelly, D.P. 2008. Transcriptional coactivators PGC-1alpha and PGC-lbeta control overlapping programs required for perinatal maturation of the heart. Genes & Development. 22(14). 1948-61. Langdon, A., Wignall, G.R., Rogers, K., Sørensen, E.S., Denstedt, J., Grohe, B., Goldberg, H.A., Hunter G.K. 2009. Kinetics of calcium oxalate crystal growth in the presence of osteopontin isoforms: an analysis by scanning confocal interference microcopy. Calcified Tissue International. 84(3). 240-8. Lasa, M., Chang, P.L., Prince, C.W., Pinna, L.A. 1997. Phosphorylation of osteopontin by Golgi apparatus

casein kinase.

Biochemical and Biophysical Research

Communications. 240(3). 602-5. Lazebnaia, I.V., Lazebnyĭ, O.E., Sulimova, G.E. 2010. Study of genetic variation in Yakutian cattle (Bos taurus L.) using the prolactin bPRL, growth hormone bGH, and transcription factor bPit-1 genes. Genetika. 46(3). 425-8. Lehman, J.J., Barger, P.M., Kovacs, A., Saffitz, J.E., Medeiros, D.M., Kelly, D.P. 2000. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 promotes cardiac mitochondrial biogenesis. Journal of Clinical Investigation. 106(7). 847-56. Leonard, S., Khatib, H., Schutzkus, V., Chang, Y. M., Maltecca, C. 2005. Effects of the Osteopontin Gene Variants on Milk Production Traits in Dairy Cattle. Journal of Dairy Science. 88(11). 4083–4086. Lewontin, R.C. (1964). The interaction of selection and linkage. I. General considerations; heterotic models. Genetics. 49(1). 49–67.

Li, X., Monks, B., Ge, Q., Birnbaum, M.J. 2007. Akt/PKB regulates hepatic metabolism by directly inhibiting PGC-1alpha transcription coactivator. Nature. 447(7147). 10126. Liaw, L., Birk, D.E., Ballas, C.B., Whitsitt, J.S., Davidson, J.M., Hogan, B.L. 1998. Altered wound healing in mice lacking a functional osteopontin gene (spp1). Journal of Clinical Investigation. 101(7). 1468-78. Liefers, S.C., Veerkamp, R.F., te Pas, M.F.W., Delavaud, C., Chilliard, Y., Platje, M., van der Lende, T. 2005. Leptin promoter mutations affect leptin levels and performance traits in dairy cows. Animal Genetics. 36(2). 111–118. Lin, J., Wu, P.-H., Tarr, P. T., Lindenberg, K. S., St-Pierre, J., Zhang, C., Mootha, V. K., Jager, S., Vianna, C. R., Reznick, R. M., Cui, L., Manieri, M., Donovan, M.X., Wu, Z., Cooper, M.P., Fan, M.C., Rohas, L.M., Zavacki, A.M., Cinti, S., Shulman, G.I., Lowell, B.B., Krainc, D., Spiegelman, B.M. 2004. Defects in adaptive energy metabolism with CNS-linked hyperactivity in PGC-1-alpha null mice. Cell. 119(1). 121-135 Lin, J., Wu, H., Tarr, P.T., Zhang, C.Y., Wu, Z., Boss, O., Michael, L.F., Puigserver, P., Isotani, E., Olson, E.N., Lowell, B.B., Bassel-Duby, R., Spiegelman, B.M. 2002. Transcriptional co-activator PGC-1 alpha drives the formation of slow-twitch muscle fibres. Nature. 418(6899). 797-801. Ling, C., Poulsen, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Almgren, P., Wojtaszewski, J., BeckNielsen, H., Groop, L., Vaag, A. 2004. Multiple environmental and genetic factors influence skeletal muscle PGC-1-alpha and PGC-1-beta gene expression in twins. Journal of Clinical Investigation. 114(10). 1518-1526. Ling, C., Svensson, L., Odén, B., Weijdegård, B., Edén, B., Edén, S., Billig, H. 2003. Identification of functional prolactin (PRL) receptor gene expression: PRL inhibits lipoprotein lipase activity in human white adipose tissue. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88(4). 1804-8.

Liu, C., Li, S., Liu, T., Borjigin, J., Lin, J. D. 2007. Transcriptional coactivator PGC-1-alpha integrates the mammalian clock and energy metabolism. Nature. 447(7143). 477481. Longeri, M., Polli, M., Strillacci, M. G., Samore, A. B., Zanotti, M. 2006. Short Communication: Quantitative Trait Loci Affecting the Somatic Cell Score on Chromosomes 4 and 26 in Italian Holstein Cattle. Journal of Dairy Science. 89(8). 3175–3177. Looft, C., Reinsch, N., Karall-Albrecht, C., Paul, S., Brink, M., Thomsen, H., Brockmann, G., Kuhn, C., Schwerin, M., Kalm, E. 2001. A mammary gland EST showing linkage disequilibrium to a milk production QTL on bovine Chromosome 14. Mammalian Genome. 12(8). 646-50. Lü, A., Hu, X., Chen, H., Jiang, J., Zhang, C., Xu, H., Gao, X. 2010. Single nucleotide polymorphisms in bovine PRL gene and their associations with milk production traits in Chinese Holsteins. Molecular Biology Reports. 37(1). 547-51. Luedtke, C.C., McKee, M.D., Cyr, D.G., Gregory, M., Kaartinen, M.T., Mui, J., Hermo, L. 2002. Osteopontin expression and regulation in the testis, efferent ducts, and epididymis of rats during postnatal development through to adulthood. Biology of Reproduction. 66(5). 1437-48. Lund, M.S. 19th November 2008. pers.comm. Macrea, M.M., Martin, T.J., Zagrean, L. 2010. Infertility and obstructive sleep apnea: the effect of continuous positive airway pressure therapy on serum prolactin levels. Sleep and Breathing. 14(3). 253-7. Mai, M.D., Sahana, G., Christiansen, F.B., Guldbrandtsen, B. 2010. A genome-wide association study for milk production traits in Danish Jersey cattle using a 50K single nucleotide polymorphism chip. Journal of Animal Science. 88(11). 3522-8. . Matějíčková, J., Štípková, M., Jandurová, O.M., Němcová, E., Bouška, J. 2008. Mapování lokusů se vztahem k parametrům mléčné užitkovosti. Náš chov. 12. 31-33.

Matsuda, M., Imaoka, T., Vomachka, A.J., Gudelsky, G.A., Hou, Z., Mistry, M., Bailey, J.P., Nieport, K.M., Walther, D.J., Bader, M., Horseman, N.D. 2004. Serotonin regulates mammary gland development via an autocrine-paracrine loop. Developmental Cell. 6(2). 193-203. Maurer, H.P. Measures of Linkage Disequilibrium [online]. 19th June 2008. [cit. 2010-10-30]. Dostupné

z


47EF-950D-2E46C18DCE67/66940/HansPeterMaurer.pdf>. Mehmannavaz, Y., Amirinia, C., Bonyadi, M., Torshizi, R.V. 2009. Effects of bovine prolactin gene polymorphism within exon 4 on milk related traits and genetic trends in Iranian Holstein bulls. African Journal of Biotechnology. 8(19). 47974801. Miller, W.L., Coit, D., Baxter, J.D., Martial, J.A. 1981. Cloning of bovine prolactin cDNA and evolutionary implications of its sequence. DNA. 1(1). 37-50. Miller, W.L., Thirion, J.P., Martial, J.A. 1980. Cloning of DNA complementary to bovine prolactin mRNA. Endocrinology. 107(3). 851-3. Mitra, A., Schlee, P., Balakrishnan, C.R., Pirchner, F. 1995. Polymorphisms at growthhormone and prolactin loci in Indian cattle and buffalo. Journal of Animal Breeding and Genetics-Zeitschrift für Tierzuchtung und Zuchtungbiologie. 112(1). 71-74. Mori, C., Hashimoto, H., Hoshino, K., Fukuda, A., Noda, Y., Mori, T. 1988. Influences of prolactin upon spermatogenesis and spermatozoa during in vitro fertilization in mice. Journal of In Vitro Fertilization and Embryo Transfer. 5(2). 61-6. Mornet, E., Dupont, J., Vitek, A., White, P.C. 1989. Characterization of two genes encoding human steroid 11 beta-hydroxylase (P-450(11) beta). Journal of Biological Chemistry. 264(35). 20961-7. Morsci, N.S., Schnabel, R.D., Taylor, J.F. 2006. Association analysis of adiponectin and somatostatin polymorphisms on BTA1 with growth and carcass traits in Angus cattle. Animal Genetics. 37(6). 554–562.

Mukai, K., Imai, M., Shimada, H., Ishimura, Y. 1993. Isolation and characterization of rat CYP11B genes involved in late steps of mineralo- and glucocorticoid syntheses. Journal of Biological Chemistry. 268(12). 9130-7. Müller, J. 1998. Regulation of aldosterone biosynthesis: the end of the road? Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 25. S79-85. Neame, P.J., Butler, W.T. 1996. Posttranslational modification in rat bone osteopontin. Connective Tissue Research. 35(1-4). 145-50. Nedergaard, J., Ricquier, D., Kozak, L.P. 2005. Uncoupling proteins: current status and therapeutic prospects. EMBO Reports. 6(10). 917-21. Nemir, M., Bhattacharyya, D., Li, X., Singh, K., Mukherjee, A.B., Mukherjee, B.B. 2000. Targeted inhibition of osteopontin expression in the mammary gland causes abnormal morphogenesis and lactation deficiency. Journal of Biological Chemistry. 275(2). 969-76. Nevalainen, M.T., Valve, E.M., Ingleton, P.M., Nurmi, M., Martikainen, P.M., Harkonen, P.L. 1997. Prolactin and prolactin receptors are expressed and functioning in human prostate. Journal of Clinical Investigation. 99(4). 618-27. Nisoli, E., Clementi, E., Paolucci, C., Cozzi, V., Tonello, C., Sciorati, C., Bracale, R., Valerio, A., Francolini, M., Moncada, S., Carruba, M.O. 2003. Mitochondrial Biogenesis in Mammals: The Role of Endogenous Nitric Oxide. Science. 299(5608). 896-899 Nomiyama, T., Perez-Tilve, D., Ogawa, D., Gizard, F., Zhao, Y., Heywood, E.B., Jones K.L., Kawamori, R., Cassis, L.A., Tschöp, M.H., Bruemmer, D. 2007. Osteopontin mediates obesity-induced adipose tissue macrophage infiltration and insulin resistance in mice. Journal of Clinical Investigation. 117(10). 2877-88. Nussey, S.S., Whitehead, S.A. 2001. Endocrinology: An Integrated Approach. BIOS Scientific Publishers. Oxford. p.358. ISBN: 1-85996-252-1. Dostupné také z . Oliveira R.L.G.S., Ueno M., de Souza C.T., Pereira-da-Silva M., Gasparetti A.L., Bezzera R.M.N., Alberici L.C., Vercesi A.E., Saad M.J.A., L.A. Cold-induced. 2004. PGC-

1_ expression modulates muscle glucose uptake through an insulin receptor/Aktindependent, AMPK-dependent pathway. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 287. E686–E695. Ogishima, T., Mitani, F., Ishimura, Y. 1989. Isolation of two distinct cytochromes P-45011 beta with aldosterone synthase activity from bovine adrenocortical mitochondria. Journal of Biochemistry. 105(4). 497-9. Ogorevc, J., Kunej, T., Razpet, A., Dovc, P. 2009. Database of cattle candidate genes and genetic markers for milk production and mastitis. Animal Genetics. 40(6). 832851. Ohta, M., Fujii, S., Miura, R., Nonaka, Y., Okamoto, M. 1991. Bovine adrenal cytochrome P450(11 beta)-mediated conversion of 11-deoxycortisol to 18- and 19-hydroxy derivatives; structural analysis by 1H-NMR. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 39(6). 911-20. Omim (a), CYTOCHROME P450, SUBFAMILY XIB, POLYPEPTIDE 1; CYP11B1. [online]. [cit. 2010-10-18]. Dostupné z . Omim (b), SECRETED PHOSPHOPROTEIN 1; SPP1. [online]. [cit. 2010-8-17]. Dostupné z . Oztabak, K., Un, C., Tesfaye, D., Akis, I., Mengi, A. 2008. Genetic polymorphisms of osteopontin (OPN), prolactin (PRL) and pituitary-specific transcript factor-1 (PIT1) in South Anatolian and East Anatolian Red cattle. Acta Agriculturae Scandinavica Section A-Animal Science. 58(2). 109-112. Pareek, C.S., Czarnik, U., Pierzchala, M., Zwierzchowski, L. 2008. An association between the C > T single nucleotide polymorphism within intron IV of osteopontin encoding gene (SPP1) and body weight of growing Polish Holstein-Friesian cattle. Animal Science Papers and Reports. 26(4). 251-257. Patti, M.E., Butte, A.J., Crunkhorn, S., Cusi, K., Berria, R., Kashyap, S., Miyazaki, Y., Kohane, I., Costello, M., Saccone, R., Landaker, E.J., Goldfine, A.B., Mun, E.,

DeFronzo, R., Finlayson, J., Kahn, C.R., Mandarino, L.J. 2003. Coordinated reduction of genes of oxidative metabolism in humans with insulin resistance and diabetes: Potential role of PGC1 and NRF1. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 100(14). 8466-71. Payne, A.H., Hales, D.B. 2004. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Reviews. 25(6). 947-70. Platt, J.E., Brown, G.B., Erwin, S.A., McKinley, K.T. 1986. Antagonistic effects of prolactin and oxytocin on tail fin regression and acid phosphatase activity in metamorphosing Ambystoma tigrinum. General and Comparative Endocrinology. 61(3). 376-82. Plemdat, s.r.o. 2008. Popis modelu pro odhady PH na množství somatických buněk. 27th March 2008. [cit. 2011-2-5]. Dostupné z . Přibyl, J. 1997. Šlechtění skotu a jeho vliv na jednotlivé chovy. Institut výchovy a vdělávání Ministerstva zemědělství ČR v Praze. Praha. 36 s. ISBN: 80-7105-155-1. Přibyl, J., Bouška, J. 2006. Základy genetiky a šlechtění. In Bouška, J., Doležal, O., Jílek, F., Kudrna, V., Kvapilík, J., Přibyl, J., Rajmon, R., Sedmíková, M., Skřivanová, V., Šlosárková, S., Tylorová, Y., Vacek, M., Žižlavský, J. Chov dojeného skotu. Profi Press. Praha. s. 47-70. ISBN: 80-86726-16-9. Puigserver, P., Rhee, J., Donovan, J., Walkey, C.J., Yoon, J.C., Oriente, F., Kitamura, Y., Altomonte, J., Dong, H., Accili, D., Spiegelman, B.M. 2003. Insulin-regulated hepatic gluconeogenesis through FOXO1-PGC-1alpha interaction. Nature. 423(6939). 550-5. Puigserver, P., Wu, Z., Park, C.W., Graves, R., Wright, M., Spiegelman, B.M. 1998. A coldinducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell. 92(6). 829-39. Rainard, P., Poutrel, B. 1999. Immune protection of the mammary gland. In Martinet, J., Houdebine, L.-M., Head, H.H. (eds.). Biology of Lactation. INRA Editions. Paris.

p.481-502. ISBN: 978-2-7380-0861-9. Dostupné také z . Razzouk, S., Brunn, J.C., Qin, C., Tye, C.E., Goldberg, H.A., Butler, W.T. 2002. Osteopontin posttranslational modifications, possibly phosphorylation, are required for in vitro bone resorption but not osteoclast adhesion. Bone. 30(1). 40-7. Richardson, B.P. 1973. Evidence for a physiological role of prolactin in osmoregulation in the rat after its inhibition by 2-bromo--ergokryptine. British Journal of Pharmacology. 47(3). 623P-624P. Richardson, D.K., Kashyap, S., Bajaj, M., Cusi, K., Mandarino, S.J., Finlayson, J., DeFronzo, R.A., Jenkinson, C.P., Mandarino, L.J. 2005. Lipid infusion decreases the expression of nuclear encoded mitochondrial genes and increases the expression of extracellular matrix genes in human skeletal muscle. Journal of Biological Chemistry. 280(11). 10290-7. Riou, S., Chastel, O., Lacroix, A., Hamer, K.C. 2010. Stress and parental care: Prolactin responses to acute stress throughout the breeding cycle in a long-lived bird. General and Comparative Endocrinology. 168(1). 8-13. Rodgers, J.T., Lerin, C., Haas, W., Gygi, S.P., Spiegelman, B.M., Puigserver, P. 2005. Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1-alpha and SIRT1. Nature. 434(7029). 113-118. Rupp, R., Boichard, D. 2003. Genetics of resistance to mastitis in dairy cattle. Veterinary Research. 34(5). 671-88. Saad, F.A., Salih, E., Glimcher, M.J. 2008. Identification of osteopontin phosphorylation sites involved in bone remodeling and inhibition of pathological calcification. Journal of Cellular Biochemistry. 103(3). 852-6. Sandri, M., Lin, J., Handschin, C., Yang, W., Arany, Z.P., Lecker, S.H., Goldberg, A.L., Spiegelman, B.M. 2006. PGC-1-alpha protects skeletal muscle from atrophy by suppressing FoxO3 action and atrophy-specific gene transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103(44). 16260-16265.

SAS Institute Inc. 2008. SAS/STAT® 9.2 User’s Guide. Cary, NC: SAS Institute Inc. Sasavage, N.L., Nilson, J.H., Horowitz, S., Rottman, F.M. 1982. Nucleotide sequence of bovine prolactin messenger RNA. Evidence for sequence polymorphism. The Journal of Biological Chemistry. 257(2). 678-81. Sato, K., Bartlett, P.C., Alban, L., Agger, J.F., Houe, H. 2008. Managerial and environmental determinants of clinical mastitis in Danish dairy herds. Acta Veterinaria Scandinavica. 50. 4. Schenck, E.J., Canfield, J.M., Brooks, C.L. 2003. Functional relationship of serine 90 phosphorylation and the surrounding putative salt bridge in bovine prolactin. Molecular and Cellular Endocrinology. 204(1-2). 117-25. Schennink, A., Bovenhuis, H., Léon-Kloosterziel, K.M., van Arendonk, J.A., Visker, M.H. 2009. Effect of polymorphisms in the FASN, OLR1, PPARGC1A, PRL and STAT5A genes on bovine milk-fat composition. Animal Genetics. 40(6). 909-916. Schnabel, R.D., Kim, J.J., Ashwell, M.S., Sonstegard, T.S., Van Tassell, C.P., Connor, E.E., Taylor, J.F. 2005. Fine-mapping milk production quantitative trait loci on BTA6: analysis of the bovine osteopontin gene. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102(19). 6896-901. Sedmíková, M. 2006. Biologické základy mléčné a masné užitkovosti. In Bouška, J., Doležal, O., Jílek, F., Kudrna, V., Kvapilík, J., Přibyl, J., Rajmon, R., Sedmíková, M., Skřivanová, V., Šlosárková, S., Tylorová, Y., Vacek, M., Žižlavský, J. Chov dojeného skotu. Profi Press. Praha. s. 47-70. ISBN: 80-86726-16-9. Sellner, E.M., Kim, J.W., McClure, M.C., Taylor, K.H., Schnabel, R.D., Taylor, J.F. 2007. BOARD-INVITED REVIEW: Applications of genomic information in livestock. Journal of Animal Science. 85. 3148-3158. Sharifi, S., Roshanfekr, H., Khatami, S.R., Mirza, K.H. 2010. Prolactin Genotyping of Najdi Cattle Breed Using PCR-RFLP. Journal of Animal and Veterinary Advances. 9(2). 281-283.

Sheehy, P.A., Riley, L.G., Raadsma, H.W., Williamson, P., Wynn, P.C. 2009. A functional genomics approach to evaluate candidate genes located in a QTL interval for milk production traits on BTA6. Animal Genetics. 40(4). 492-8. Sherman, E.L., Nkrumah J.D., Murdoch B.M., Li C., Wang Z., Fu A., Moore S.S. 2008. Polymorphisms and haplotypes in the bovine neuropeptide Y, growth hormone and receptor, ghrelin, insulin-like growth factor 2, and uncoupling proteins 2 and 3 genes and their associations with measures of growth, performance, feed efficiency, carcass merit in beef cattle. Journal of Animal Science. 86(1). 1-16. Shibaya, M., Murakami, S., Tatsukawa, Y., Skarzynski, D.J., Acosta, T.J., Okuda, K. 2006. Bovine Corpus Luteum Is an Extrapituitary Site of Prolactin Production. Molecular Reproduction and Development. 73(4). 512-9. Shingo, T., Gregg, C., Enwere, E., Fujikawa, H., Hassam, R., Geary, C., Cross, J.C., Weiss, S. 2003. Pregnancy-stimulated neurogenesis in the adult female forebrain mediated by prolactin. Science. 299(5603). 117-20. Shinohara, M.L., Jansson, M., Hwang, E.S., Werneck, M.B., Glimcher, L.H., Cantor, H. 2005. T-bet-dependent expression of osteopontin contributes to T cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102(47). 17101-6. Shinohara, M.L., Kim, H.J., Kim, J.H., Garcia, V.A., Cantor, H. 2008. Alternative translation of osteopontin generates intracellular and secreted isoforms that mediate distinct biological activities in dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105(20). 7235-9. Shinohara, M.L., Lu, L., Bu, J., Werneck, M.B., Kobayashi, K.S., Glimcher, L.H., Cantor, H. 2006. Osteopontin expression is essential for interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 7(5). 498-506. Silverin, B. 1980. Effects of prolactin on the gonad and body weight of the male pied flycatcher during the breeding period. Endokrinologie. 76(1). 45-50. Singh, K., Balligand, J.L., Fischer, T.A., Smith, T.W., Kelly, R.A. 1995. Glucocorticoids increase osteopontin expression in cardiac myocytes and microvascular endothelial

cells. Role in regulation of inducible nitric oxide synthase. Journal of Biological Chemistry. 270(47). 28471-8. Smith, G.W., Rosa, G.J.M. 2007. Interpretation of microarray data: Trudging out of the abyss towards elucidation of biological significance. Journal of Animal Science. 85(13 Suppl). E20-E23. Sodek, J., Ganss, B., McKee, M.D. 2000. Osteopontin. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine. 11(3). 279-303. Sordillo, L.M., Streicher, K.L. 2002. Mammary gland immunity and mastitis susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7(2). 135-46. Sørensen, E.S., Højrup, P., Petersen, T.E. 1995. Posttranslational modifications of bovine osteopontin: identification of twenty-eight phosphorylation and three Oglycosylation sites. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 4(10). 2040-9. Sørensen, S., Justesen, S.J., Johnsen, A.H. 2003. Purification and characterization of osteopontin from human milk. Protein Expression and Purification. 30(2). 238-45. Sørensen, E.S., Petersen, T.E. 1993. Purification and characterization of three proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine milk. Journal of Dairy Science. 60(2). 189-97. Soria, L.A., Corva, P.M., Branda Sica A., Villarreal, E.L., Melucci, L.M., Mezzadra, C.A., Papaleo Mazzucco, J., Fernández Macedo, G., Silvestro, C., Schor, A., Miquel, M.C. 2009. Association of a novel polymorphism in the bovine PPARGC1A gene with growth, slaughter and meat quality traits in Brangus steers. Molecular and Cellular Probes. 23(6). 304-8. Souza, C.E., Moura, A.A., Monaco, E., Killian, G.J. 2008. Binding patterns of bovine seminal plasma proteins A1/A2, 30 kDa and osteopontin on ejaculated sperm before and after incubation with isthmic and ampullary oviductal fluid. Animal Reproduction Science. 105(1-2). 72-89.

Sparks, L.M., Xie, H., Koza, R.A., Mynatt, R., Hulver, M.W., Bray, G.A., Smith, S.R. 2005. A high-fat diet coordinately downregulates genes required for mitochondrial oxidative phosphorylation in skeletal muscle. Diabetes. 54(7). 1926-33. Speer, M.Y., McKee, M.D., Guldberg, R.E., Liaw, L., Yang, H.Y., Tung, E., Karsenty, G., Giachelli, C.M. 2002. Inactivation of the osteopontin gene enhances vascular calcification of matrix Gla protein-deficient mice: evidence for osteopontin as an inducible inhibitor of vascular calcification in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 196(8). 1047-55. Strachan, T., Read, A.P. (eds.) 1999. Human Molecular Genetics 2. PCR, DNA sequencing and in vitro mutagenesis. 2nd ed. Garland Science. New York. p.576. ISBN:185996-202-5. Dostupné také z http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7580/. Struman, I., Bentzien, F., Lee, H., Mainfroid, V., D'Angelo, G., Goffin, V., Weiner, R.I., Martial, J.A. 1999. Opposing actions of intact and N-terminal fragments of the human prolactin/growth hormone family members on angiogenesis: an efficient mechanism for the regulation of angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96(4). 1246-51. Svaz chovatelů českého strakatého skotu. Plemeno. [online]. [cit. 2010-10-15]. Dostupné z . Szyda, J., Liu, Z., Reinhardt, F., Reents, R. 2005. Estimation of Quantitative Trait Loci Parameters for Milk Production Traits in German Holstein Dairy Cattle Population. Journal of Dairy Science. 88(1). 356–367. Tabar, Y.S., Fayazi, J., Roshanfekr, H., Mirzadeh, K., Sadr, A.S. 2010. Investigation of Prolactin Polymorphism in Buffalo Population of Khuzestan-Iran by PCRRFLP. Journal of Animal and Veterinary Advances. 9(2). 284-286. Tantia, M.S., Mishra, B., Bharani Kumar S.T., Mishra B.P., Kataria R.S., Mukesh M., Vijh R.K. 2008. Characterization of Osteopontin gene of Bubalus bubalis. Animal. 2(7). 987-990.

Taylor, E.B., Lamb, J.D., Hurst, R.W., Chesser, D.G., Ellingson, W.J., Greenwood, L.J., Porter, B.B., Herway S.T., Winder W.W. 2005. Endurance training increases skeletal muscle LKB1 and PGC-1alpha protein abundance: effects of time and intensity.

American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism.

289(6). E960–E968. Terada, S., Kawanaka, K., Goto, M., Shimokawa, T., Tabata, I. 2005. Effects of high-intensity intermittent swimming on PGC-1alpha protein expression in rat skeletal muscle. Acta Physiologica Scandinavica. 184(1). 59-65. Terada, S., Tabata, I. 2004. Effects of acute bouts of running and swimming exercise on PGC1alpha protein expression in rat epitrochlearis and soleus muscle. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 286(2). E208-16 Thortnon, T. 2009. Linkage Disequilibrium [online]. 3rd september 2009 [cit. 2010-10-25]. Dostupné z . Timmons, J.A., Norrbom, J., Schéele, C., Thonberg, H., Wahlestedt, C., Tesch, P. 2006. Expression profiling following local muscle inactivity in humans provides new perspective on diabetes-related genes. Genomics. 87(1). 165-72. Udina, I.G., Turkova, S.O., Kostiuchenko, M.V., Lebedeva, L.A., Sulimova, G.E. 2001. Polymorphism of cattle prolactin gene: microsatellites, PSR-RFLP. Genetika. 37(4). 511-6. Urban, F., Šereda, L., Váchal, J., Vetýška J. 1997. Rozvoj chovu a mléčné užitkovosti plemen skotu v České republice. In Urban, F. (ed.) Chov dojeného skotu : [reprodukce, odchov, management, technologie, výživa]. Apros. Praha. s. 56-64, ISBN: 80901100-7-X. Vaněk, D., Štolc, L., Bouška, J., Doležal, O., Ježková, A., Nová, V., Stádník, L., Toušová, R. 2002. Chov skotu a ovcí (Přednášky pro Bc). Česká zemědělská univerzita, Agronomická fakulta. Praha. 199 s. ISBN: 80-86642-11-9.

Velmala, R.J., Vilkki, H.J., Elo, K.T., De Koning, D.J., Maki-Tanila, A.V. 1999. A search for quantitative trait loci for milk production traits on chromosome 6 in Finnish Ayrshire cattle. Animal Genetics. 30(2). 136–143. Ventura-Clapier R., Garnier A., Veksler V. 2008. Transcriptional control of mitochondrial biogenesis: the central role of PGC-1a. Cardiovascular Research. 79(2). 208–217. Wada, A., Ohnishi, T., Nonaka, Y., Okamoto, M., Yamano, T. 1985. Synthesis of aldosterone by a reconstituted system of cytochrome P-45011 beta from bovine adrenocortical mitochondria. Journal of Biochemistry. 98(1). 245-56. Waterman, M.R., Bischof, L.J. 1997. Cytochromes P450 12: diversity of ACTH (cAMP)dependent transcription of bovine steroid hydroxylase genes. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11(6). 419-27. Weber, G.F., Ashkar, S., Glimcher, M.J., Cantor, H. 1996. Receptor-ligand interaction between CD44 and osteopontin (Eta-1). Science. 271(5248). 509-12. Weber, G.F., Lett, G.S., Haubein, N.C. 2010. Osteopontin is a marker for cancer aggressiveness and patient survival. British Journal of Cancer. 103(6). 861-9. Weikard, R., Kühn, C., Goldammer, T., Freyer, G., Schwerin, M. 2005. The bovine PPARGC1A gene: molecular characterization and association of an SNP with variation of milk fat synthesis. Physiological Genomics. 21(1). 1-13. White, S.N., Casas, E., Allan, M.F., Keele, J.W., Snelling, W.M., Wheeler, T.L., Shackelford, S.D., Koohmaraie, M., Smith, T.P.L. 2007. Evaluation in beef cattle of six deoxyribonucleic acid markers developed for dairy traits reveals an osteopontin polymorphism associated with postweaning growth. Journal of Animal Science. 85(1). 1-10. Wibowo, T.A., Gaskins, C.T., Newberry, R.C., Thorgaard, G.H., Michal, J.J., Jiang, Z. 2008. Genome assembly anchored QTL map of bovine chromosome 14. International Journal of Biological Sciences. 4(6). 406-14.

Wisløff, U., Najjar, S.M., Ellingsen, O., Haram, P.M., Swoap, S., Al-Share, Q., Fernström, M., Rezaei, K., Lee, S.J., Koch, L.G., Britton, S.L. 2005. Cardiovascular risk factors emerge after artificial selection for low aerobic capacity. Science. 307(5708). 418-20. Wojdak-Maksymiec, K., Kmic, M., Strzalaka, J. 2008. Prolactin Gene Polymorphism and Somatic Cell Count in Dairy Cattle. Journal of Animal and Veterinary Advances. 7(1). 35-40. Wolf, J.B., David, V.A., Deutch, A.H. 1990. Identification of a distal regulatory element in the 5' flanking region of the bovine prolactin gene. Nucleic Acids Research. 18(16). 4905-12. Wu, Z., Huang, X., Feng, Y., Handschin, C., Feng, Y., Gullicksen, P.S., Bare, O., Labow, M., Spiegelman, B., Stevenson, S.C. 2006. Transducer of regulated CREB-binding proteins (TORCs) induce PGC-1-alpha transcription and mitochondrial biogenesis in muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103(39). 14379-14384. Wu, Z., Puigserver, P., Andersson, U., Zhang, C., Adelmant, G., Mootha, V., Troy, A., Cinti, S., Lowell, B., Scarpulla, R.C., Spiegelman, B.M. 1999. Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Cell. 98(1). 115-24. Yamamoto, N., Sakai, F., Kon, S., Morimoto, J., Kimura, C., Yamazaki, H., Okazaki, I., Seki, N., Fujii, T., Uede, T. 2003. .Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Investigation. 112(2). 181-8. Yamniuk, A.P., Burling, H., Vogel, H.J. 2009. Thermodynamic characterization of the interactions between the immunoregulatory proteins osteopontin and lactoferrin. Molecular Immunology. 46(11-12). 2395-402. Yanagibashi, K., Haniu, M., Shively, J.E., Shen, W.H., Hall, P. 1986. The synthesis of aldosterone by the adrenal cortex. Two zones (fasciculata and glomerulosa)

possess one enzyme for 11 beta-, 18-hydroxylation, and aldehyde synthesis. Journal of Biological Chemistry. 261(8). 3556-62. Yang, J.J., Larsen, C.M., Grattan, D.R., Erskine, M.S. 2009. Mating-induced neuroendocrine responses

during

pseudopregnancy

in

the

female

mouse.

Journal

of

Neuroendocrinology. 21(1). 30-9. Yoshitake, H., Rittling, S.R., Denhardt, D.T., Noda, M. 1999..Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96(14). 8156-60. Yoon, J.C., Puigserver, P., Chen, G., Donovan, J., Wu, Z., Rhee, J., Adelmant, G., Stafford, J., Kahn, C R., Granner, D.K., Newgard, C.B., Spiegelman, B.M. 2001. Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC-1. Nature. 413(6852). 131-138. Young, M.F., Kerr, J.M., Termine, J.D., Wewer, U.M., Wang, M.G., McBride, O.W., Fisher, L.W. 1990. cDNA cloning, mRNA distribution and heterogeneity, chromosomal location, and RFLP analysis of human osteopontin (OPN). Genomics. 7(4). 491502. Zatoń-Dobrowolska M, Čitek J, Filistowicz A, Řehout V., Szulc T. 2007. Genetic distance between the Polish Red, Czech Red and German Red cattle estimated based on selected loci of protein coding genes and DNA microsatellite sequences. Animal Science Papers and Reports. 25(1). 45-54. Zhang, Y., Castellani, L.W., Sinal, C.J., Gonzalez, F.J., Edwards, P.A. 2004. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1-alpha (PGC-1-alpha) regulates triglyceride metabolism by activation of the nuclear receptor FXR. Genes & Development. 18(2). 157-169.

Seznam zkratek A - adenin Ala - alanin AMK - aminokyselina AMPK - adenosin-monofosát-aktivovaná kinasa b – báze BAC - bakteriální arteficiální chromosom BK – produkce mléčných bílkovin v kg BP – produkce mléčných bílkovin v % BTA – bovinní chromosom C – citosin CaMKs - Ca2+-kalmodulin-dependentní kinasa CaN – calcineurin CDK - cyclin-dependentní kinása cM – centiMorgan CNS - centrální nervová soustava CYP11B1 - cytochrome P450, subfamily XI B, polypeptide 1; steroid 11-beta-hydroxyláza Da – Dalton DGAT1 – diacylglycerol O-acyltransferáza 1 DNA - deoxyribonukleová kyselina dNTP - deoxynukleotid trifosfát ERR - estrogen-related receptor ETA1 - early T lymphocyte activation 1 G - guanin GH - růstový hormon GnRH - gonadotropin uvoňující hormon HNE - 4-hydroxy-2-nonenaly IGF-1 - insulin-like growth factor 1 IgG – imunoglobulín G IgM – imunoglobulín M IL – interleukin INF-γ - interferon gamma LD - linkage disequilibrium, vazebná nerovnováha

LSM – least square means, průměry nejmenších čtverců MAP - Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis miRNA - mikro RNA ML – produkce mléka v kg za laktaci mRNA- messenger RNA NKT - natural killer T lymfocyty NPY - neuropeptid Y NOS/cGMP - syntetáza oxidu dusnatého NRF - jaderný respirační faktor OPN - osteopontin PAF - faktor aktivující destičky PCR - polymerázová řetězová reakce PGC1a – viz PPARGC1A PH – plemenná hodnota PHBK – plemenná hodnota pro produkci bílkovin v kg PHBP - plemenná hodnota pro produkci bílkovin v % PHTK - plemenná hodnota pro produkci tuku v kg PHTP - plemenná hodnota pro produkci tuku v % Pit-1 - pituitary-specific positive transcription factor 1 PL - placentarní laktogen PPAR - peroxisome proliferator-activated receptor PPARGC1A - peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, coactivator 1, alpha PPARGC1B - peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, coactivator 1, beta PREB - prolactin regulatory element-binding protein PRL - prolaktin PRLR - prolaktinový receptor PSB - počet somatických buněk p38MAPK - p38 mitogen-aktivovaná protein kináza P450C11 a P450(11beta) – viz CYP11B1 QTL - quantitative trait loci REML - restricted (residual, reduced) maximum likelihood; metoda restringované maximální věrohodnosti RFLP -polymorfismus délky restrikčních fragmentů RGD - arginin-glycin-asparagová kyselina

RNA - ribonukleová kyselina RPHSB – relativní plemenná hodnota pro počet somatických buněk SIRT - sirtuin SNP - jednonukleotidový polymorfismus SPP1 - secreted phosphoprotein 1 SR domény - regiony bohaté na serin-arginin T - thymin Tc1 - cytotoxické T lymfocyty 1 Th - pomocné T lymfocyty TH - thyroidní hormony TK – produkce tuku v kg za laktaci TLR9 - toll like receptor 9 TP – produkce tuku v % TSH - thyroidy stimulující hormon UCP - uncoupling protein UTR - untranslated region Val - valin β/cAMP - β-adrenergická stimulace

Příloha Použité přístroje ABI PrismTM 6100 Nucleic Acid PrepStation, Applied Biosystems Biometra T-Gradient, Biometra QB-96, QB96 Server Gradient Thermal Cycler (Thermocycler), Quanta Biotech Ltd. CO2 Incubator, model MCO-17A, SANYO Elektroforéza PS608, Apelex Elektroforéza PS 250-2, Sigma Transluminátor TM-20, Alpha Innotech Corporation Fotoaparát DC290, Kodak

Použité programy Alpha Ease FC (Alpha DigiDoc 1000), Alpha Innotech Corporation

Použité chemikálie Genomic DNA Purification Tray II, Applied Biosystems BloodPrepTM PK Digestion Buffer, 200 ml BloodPrepTM DNA Purification Solution, 1000 ml BloodPrepTM DNA Wash Solution, 1000 ml BloodPrepTM DNA Elution Solution 1, 200 ml BloodPrepTM DNA Elution Solution 2, 200 ml Skadování při laboratorní teplotě Proteinase K Solution, 20 mg/ml Skladování při +4°C.

PCR reakční kit, Top-Bio 500 µl Taq DNA polymeráza 1.1, 500u, 1u/µl; 1,5 ml 10X PCR Blue Buffer; Uchováváme při -20°C;

PCR dNTP mix, Top-Bio 100µl, 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP,10 mM dTTP.

dNTP jsou zředěny na koncentraci 1 mM zředěním ddH2O. Tato směs byla použita pro přípravu PCR směsi. Uchováváme při -20°C.

PCR vkládací pufr Red load, Top-Bio, 1,5ml Uchováváme při -20°C.

Destilovaná H2O Skladováno při -20°C.

Mineral oil, BioReagent 500 ml Pokud PCR rakce probíhala v 96-ti jamkovém platíčku, pak byla PCR mix v krajních jamkách překryta 10 µl tohoto oleje jako ochrana před vysycháním. Skladování při +4°C.

Primery, Generi Biotech PPARGCA Primer 1 5´- CAT AGC CGG CGC CCC AGG TAA GAT GCA CGT TGG C -3´ Primer 2 5´- CTG GTA CTC CTC GTA GCT GTC -5´ OPN Primer 1 5´- GCA AAT CAG AAG TGT GAT AGA C -3´ Primer 2 5´- CCA AGC CAA ACG TAT GAG TT -5´ PRLE Primer 1 5´- TTT TCT TAA TGC AGC TCA CTT GTC -3´ Primer 2 5´- TCT AGA CAG TCA TGT TCA CTT TCC TT-5´ bPRL Primer 1 5´- CGA GTC CTT ATG AGC TTG ATT CTT -3´ Primer 2 5´- GCC TTC CAG AAG TCG TTT GTT TTC-5´ CYP11B1 Primer 1 5´- ATA CTG GAG GGG GAG GAG G -3´ Primer 2 5´- GGA CAG AAC GTG AGG GTG TT -5´

Koncentrát dodaný výrobcem zředíme dle návodu (uvedené množství ddH2O dle návodu výrobce) na koncentraci 0,1mM. Dále pro použití ředíme na 0,01mM roztok. Takto zředěné využíváme v přípravě PCR směsi. Uchováváme při -20°C.

BsuRI (HaeIII), Fermentas 300 µl BsuRI, 3000u, 10u/µl 1 ml 10X Buffer R Uchováváme při -20°C.

BsrI, New England Biolabs 200 µl BsrI, 1000 u, 5u/µl 1,5 ml 10X NEBuffer 3 Uchováváme při -20°C.

PstI, Fermentas 300 µl Pst I, 3000u, 10u/µl 1ml 10X Buffer 0 Uchováváme při -20°C.

RsaI, Fermentas 500 µl RsaI, 5000 u, 10 u/µl 1ml 10X Buffer Tango™ with BSA Uchováváme při -20°C.

Hsp92II, Promega 100 µl Hsp92II, 1000u, 10u/µl 1ml Buffer K 10X Buffer 150µl Bovine Serum Albumin, Acetylovaný, 10mg/µl Uchováváme při -20°C. Žebříček Gene RulerTM, 50bp DNA Ladder, Fermentas 100 µl, konc. 0,5 ug DNA/µl 1ml 6X DNA Loading Dye

Příprava: 0,1 µl DNA Ladder smísíme s 0,1 µl 6X DNA Loading Dye a doplníme ddH2O na 3 µl. Skladování při -20°C. PCR ethidium bromidTB, Top-Bio 1 ml, 10 mg/ml Skladování při +4°C. AgaroseTB, Top-Bio 100g Skladování při pokojové teplotě.

Tris base, Sigma-Aldrich Skadování při laboratorní teplotě.

Kyselina boritá, Sigma-Aldrich Skadování při laboratorní teplotě.

0,5 M EDTA pH=8, Sigma-Aldrich Skadování při laboratorní teplotě.

Příprava 1 x TBE pufru (Tris-borátového pufru) (5000 ml roztoku): K 1000 ml destilované vody přidáme 54 g TrisBase, 27,5 g kyseliny borité a 20 ml EDTA. Rozmícháme na magnetické míchačce. Poté doplníme do 5000 ml destilovanou vodou. Skladování při +4°C.