I. Voorwoord Nadat ik als gegradueerde in de industriële wetenschappen en technologie optie chemie, optie milieuzorg in 1998 ben afgestudeerd, ben ik in 2 verschillende labo’s terecht gekomen. Het werd al gauw duidelijk dat je als laborant weinig doorgroeikansen hebt in een groot R&D – labo van een multinational. Daarnaast kriebelde de microbe van het lesgeven. Sinds 1 september 1999 ben ik werkzaam als leraar wetenschappen in het Vrij Technisch Instituut te Kortrijk. Door wat verschuivingen heb ik een plaatsje gevonden als leraar chemie in de derde graad van het TSO. Ondanks mijn diploma wens ik mij daar graag verder in te ontplooien en was een masterdiploma noodzakelijk. Als werkstudent koos ik voor de opleiding van master in de industriële wetenschappen en techniek, optie industriële chemie.
In het kader van deze studies werd mij de masterproef “Optimaliseren en valideren van een methode voor vitamine B12 – bepaling m.b.v. GF-AAS.” opgelegd. Onderzoek en instrumentele analysen zijn mijn favoriete onderdelen in de chemische wereld, vandaar dat ik heel opgetogen was met het onderwerp.
Deze studie zou ik niet tot een goed einde kunnen hebben gebracht zonder de steun, het vertrouwen en de hulp van mijn vrouw, Kathalyne Corriette. Ik wil haar dan nog eens via deze weg heel duidelijk bedanken voor haar begrip. Eigenlijk past het ook wel om mijn dochter Emma hierin te vernoemen want wanneer je ’s avonds thuis komt en een hunkerend, lachend gezicht naar je toe ziet kruipen, vergeet je even alle stress en ongemakken.
Uiteraard heb ik de ondersteuning en begeleiding van mijn mentor, dhr. Joël Hogie, en zijn talrijke collega’s, heel erg geapprecieerd. Ook de hulp van mevr. Ann Vergote vind ik niet vanzelfsprekend en wil haar dan ook daarvoor bedanken. Mevr. Isabel De Schrijver en dhr. Yannick Verheust hebben mij dikwijls terug op een goed spoor gebracht, ook daarvoor bedankt.
Ten slotte wil ik eveneens de directie, de collega’s en mijn afdelingsverantwoordelijke, dhr. Frank Eggermont, van het VTI bedanken voor hun vertrouwen en steun in deze keuze.
I
II. Inhoud I. Voorwoord.................................................................................................................. I II. Inhoud ..................................................................................................................... II III. Gebruikte symbolen en afkortingen .......................................................................... VI IV. Lijst van tabellen, figuren en formules..................................................................... VIII Inleiding ........................................................................................................................ 1 1. Probleemstelling ......................................................................................................... 2 2. Algemeenheden ......................................................................................................... 3 2.1 Vitamine B12 [6][19][23] ....................................................................................... 3 2.1.1 Molecule ........................................................................................................ 3 2.1.1.1 Structuur van vitamine B12. ...................................................................... 3 2.1.1.2 Corronoïden ............................................................................................. 5 2.1.1.3 De verschillende cobalaminen .................................................................... 5 2.1.2 Biochemische werking ..................................................................................... 7 2.1.3 Huidige analysetechnieken [6] ......................................................................... 9 2.1.3.1 Voorbehandeling ...................................................................................... 9 2.1.3.2 Microbiologische tests ............................................................................... 9 2.1.3.3 De competitieve eiwitbinding ................................................................... 11 2.1.3.4 Chromatografie [6] [24] .......................................................................... 11 2.1.3.5 Spectroscopisch [3][9][10][22] ................................................................ 11 2.1.3.6 Andere methodes ................................................................................... 11 2.2 Grafietoven Atoom Absorptie Spectrofotometrie [4][18][21] ................................... 12 2.2.1 Principe........................................................................................................ 12 2.2.1.1 Algemeen .............................................................................................. 12 2.2.1.2 Licht als elektromagnetische golf ............................................................. 12 2.2.1.3 Absorbantie ........................................................................................... 13 2.2.1.4 Wet van Lambert – Beer ......................................................................... 13 2.2.1.5 Beperkingen van de wet .......................................................................... 14 2.2.2 Toestel ........................................................................................................ 14 2.2.2.1 De autosampler ...................................................................................... 15 2.2.2.2 De lichtbron ........................................................................................... 15 2.2.2.3 Optiek ................................................................................................... 16 2.2.2.4 Grafietoven ............................................................................................ 16 2.2.2.5 Temperatuurprogramma ......................................................................... 17 2.2.2.6 Detectiesysteem ..................................................................................... 17 2.2.2.7 Software ................................................................................................ 18 2.2.3 Interferenties ............................................................................................... 18 2.2.3.1 Achtergrond ........................................................................................... 18 2.2.3.2 Chemische interferentie .......................................................................... 19 2.2.3.3 Fysische interferentie .............................................................................. 19
II
2.2.4 Correctiesystemen ........................................................................................ 19 2.2.4.1 Double beam-correctiesystem .................................................................. 19 2.2.4.2 Deuteriumcorrectie ................................................................................. 19 2.2.4.3 Smith – Hiefte ........................................................................................ 20 2.2.4.4 Matrix-modificatie ................................................................................... 20 2.2.4.5 Sample Blank ......................................................................................... 20 2.2.5 Voor- en nadelen van GF-AAS ........................................................................ 20 2.2.5.1 Voordelen .............................................................................................. 20 2.2.5.2 Nadelen ................................................................................................. 21 2.3 Complexatie van metaalionen [23] ........................................................................ 21 2.3.1 Principe........................................................................................................ 21 2.3.2 Complexanten .............................................................................................. 22 2.3.3 Factoren die de complexatie beïnvloeden ........................................................ 23 2.3.3.1 Temperatuur .......................................................................................... 23 2.3.3.2 Zuurtegraad ........................................................................................... 23 2.3.3.3 Aanwezige ionen .................................................................................... 23 3. De methode: principe ............................................................................................... 24 3.1 Algemeen principe............................................................................................... 24 3.2 Omrekening van vitamine B12-gehalte in yoghurt .................................................. 24 3.3 Destructie ........................................................................................................... 25 3.4 Opconcentratie ................................................................................................... 26 3.5 Meting................................................................................................................ 26 4. Onderzoek en bevindingen ........................................................................................ 27 4.1 Destructie ........................................................................................................... 27 4.1.1 Probleem ..................................................................................................... 27 4.1.2 Proefopzet.................................................................................................... 27 4.1.2.1 Drogen .................................................................................................. 27 4.1.2.2 Droge destructie met bunsenbrander ....................................................... 27 4.1.2.3 Moffeltemperatuur .................................................................................. 27 4.1.3 Resultaten .................................................................................................... 28 4.1.3.1 Drogen .................................................................................................. 28 4.1.3.2 Droge destructie met bunsenbrander ....................................................... 28 4.1.3.3 Moffeltemperatuur .................................................................................. 28 4.1.4 Discussie ...................................................................................................... 29 4.1.4.1 Drogen .................................................................................................. 29 4.1.4.2 Droge destructie met bunsenbrander ....................................................... 29 4.1.4.3 Moffeltemperatuur .................................................................................. 29 4.1.5 Besluit ......................................................................................................... 29 4.2 Buffer................................................................................................................. 29 4.2.1 Probleem ..................................................................................................... 29 4.2.2 Proefopzet.................................................................................................... 30 4.2.3 Resultaten .................................................................................................... 30 4.2.3.1 Carbonaatbuffer ..................................................................................... 30 4.2.3.2 Ammoniakbuffer ..................................................................................... 30 4.2.3.3 Fosfaatbuffer ......................................................................................... 30 4.2.3.4 Boraxbuffer ............................................................................................ 31 4.2.3.5 Meetwaarden ......................................................................................... 31
III
4.2.4 Discussie ...................................................................................................... 31 4.2.4.1 Carbonaatbuffer ..................................................................................... 31 4.2.4.2 Ammoniakbuffer ..................................................................................... 32 4.2.4.3 Fosfaatbuffer ......................................................................................... 32 4.2.4.4 Boraxbuffer ............................................................................................ 32 4.2.5 Besluit ......................................................................................................... 33 4.3 Complexant ........................................................................................................ 33 4.3.1 Probleem ..................................................................................................... 33 4.3.2 Proefopzet.................................................................................................... 33 4.3.3 Resultaten .................................................................................................... 34 4.3.4 Discussie ...................................................................................................... 34 4.3.5 Besluit ......................................................................................................... 34 4.4 Temperatuurscontrole ......................................................................................... 35 4.4.1 Probleem ..................................................................................................... 35 4.4.2 Proefopzet.................................................................................................... 35 4.4.3 Resultaten .................................................................................................... 35 4.4.3.1 Waterig kobaltmengsel............................................................................ 35 4.4.3.2 Apolair kobaltmengsel ............................................................................. 36 4.4.3.3 Grafiek .................................................................................................. 37 4.4.4 Discussie ...................................................................................................... 37 4.4.5 Besluit ......................................................................................................... 38 4.5 Opconcentratie ................................................................................................... 38 4.5.1 Probleem ..................................................................................................... 38 4.5.2 Proefopzet.................................................................................................... 38 4.5.2.1 Opconcentratie door volumeverandering................................................... 38 4.5.2.2 Preconcentratie in oven........................................................................... 39 4.5.3 Resultaten .................................................................................................... 39 4.5.3.1 Opconcentratie door volumeverandering................................................... 39 4.5.3.2 Preconcentratie in oven........................................................................... 42 4.5.4 Discussie ...................................................................................................... 46 4.5.4.1 Opconcentratie door volumeverandering................................................... 46 4.5.4.2 Preconcentratie in grafietoven ................................................................. 47 4.5.5 Besluit ......................................................................................................... 48 4.6 Matrixmodifier..................................................................................................... 48 4.6.1 Probleem ..................................................................................................... 48 4.6.2 Proefopzet.................................................................................................... 48 4.6.3 Resultaten .................................................................................................... 49 4.6.4 Discussie ...................................................................................................... 49 4.6.5 Besluit ......................................................................................................... 49 4.7 Blanco ................................................................................................................ 49 4.7.1 Probleem ..................................................................................................... 49 4.7.2 Proefopzet.................................................................................................... 50 4.7.3 Resultaten .................................................................................................... 50 4.7.4 Discussie ...................................................................................................... 51 4.7.5 Besluit ......................................................................................................... 51 4.8 Standaard ijklijn .................................................................................................. 51 4.8.1 Probleem ..................................................................................................... 51 4.8.2 Proefopzet.................................................................................................... 52 4.8.3 Resultaten .................................................................................................... 52 4.8.4 Discussie ...................................................................................................... 54 4.8.5 Besluit ......................................................................................................... 54
IV
4.9 Andere opmerkingen ........................................................................................... 55 4.9.1 Geheugeneffect door oventje [18] .................................................................. 55 4.9.2 Oppervlaktespanning van MIBK [14]............................................................... 55 4.9.3 Ontstaan van vlammen en stofwolken ............................................................ 55 4.9.4 Verlaging van signaal .................................................................................... 56 4.9.4.1 Adsorptie aan cuvet ................................................................................ 56 4.9.4.2 Andere redenen...................................................................................... 57 4.10 Mogelijk vervolgonderzoek ................................................................................. 57 4.10.1 Blanco ........................................................................................................ 57 4.10.2 Preconcentratie in oven ............................................................................... 57 4.10.3 Matched standaarden .................................................................................. 57 4.10.4 Methoden om absorbanties hoger te krijgen .................................................. 57 4.10.5 Inwendige standaarden ............................................................................... 58 4.10.6 Matrixmodificatie bij destructie en temperatuursoptimalisatie .......................... 58 4.10.7 Preconcentratie op microkolom [2] ............................................................... 58 4.10.8 Andere complexanten [15] ........................................................................... 58 5. De uiteindelijke methode ........................................................................................... 59 5.1 Recept ............................................................................................................... 59 5.1.1 Oplossingen ................................................................................................. 59 5.1.2 Werkwijze monsters ...................................................................................... 59 5.1.3 Werkwijze ijklijn vanuit masterstandaard ........................................................ 60 5.2 Fouten ............................................................................................................... 61 6. Validatie .................................................................................................................. 62 6.1 Twee keer preconcentreren.................................................................................. 62 6.1.1 Metingen ...................................................................................................... 62 6.1.2 Gemiddelde, recovery, standaardafwijking ...................................................... 63 6.1.3 Detectielimiet ............................................................................................... 64 6.2 Drie keer preconcentreren ................................................................................... 64 6.2.1 Metingen ...................................................................................................... 64 6.2.2 Gemiddelde, recovery, standaardafwijking ...................................................... 65 6.2.3 Detectielimiet ............................................................................................... 66 7. Besluit ..................................................................................................................... 67 Bijlagen .........................................................................................................................X Literatuurlijst .............................................................................................................. XII
V
III. Gebruikte symbolen en afkortingen Symbool/Afkorting
Betekenis
λ
Golflengte (m)
ε
Molaire absorptiecoëffiënt (l/mol.cm)
∆H
Enthalpieverandering
µl
Microliter
µm
Micrometer
A
Absorbantie
AAS
Atoom Absorptie Spectrometrie
abs.
Absorbantie
ADO-CBL
Adenosyl-Cobalamine
APDC
Ammonium 1 – Pyrrolidinedithiocarbamaat
Aq-CBL
Aqua-Cobalamine
b
Weglengte (cm)
B12
vitamine B12
Bidest.
Bigedestilleerd water
c
Lichtsnelheid = 299 792 458 m/s
CBL
Cobalaminen
CN-CBL
Cyano-cobalamine
CPB
Competitive protein bond
DDC
Natriumdiethyldithiocarbamaat trihydraat
DNA
Desoxyribonucleïnezuur
E
Energiehoeveelheid tussen elektrische niveaus van een atoom (J)
FDA
Food and Drug Administration
GF
Grafiet oven
h
Constante van Planck = 6,6260693.10-34 Js
HKL
Holle kathodelamp
HPLC
Hoge druk vloeistofchromatografie
Hz
Hertz
I
I0
Lichtintensiteit van het uittredende licht (aantal fotonen/s) Lichtintensiteit van het invallende licht (aantal fotonen/s)
VI
J
Joule
Ka
Zuurconstante
l
Liter
m
Meter
M (Co)
Molaire massa van cobalt
M (vit b12)
Molaire massa van vitamine B12
mA
Milliampère
ME-CBL
Methyl-cobalamine
mg
Milligram
MIBK
Methyl - isobutylketon
MM
Matrixmodifier
NITRO-CBL
Nitro-cobalamine
nm
Nanometer
OH-CBL
Hydroxy-cobalamine
opl.
Oplossing
pH
Zuurtegraad
pKa
- logaritme Ka
ppb
Parts per billion
ppm
Parts per million
RNA
Ribonucleïnezuur
sd
Standaarddeviatie
T
Transmissie
UV
Ultraviolet
ν
Lichtfrequentie (Hz)
V
Volt
VIS
Zichtbaar licht
VII
IV. Lijst van tabellen, figuren en formules. TABELLEN Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel Tabel
1: Lijst met liganden ............................................................................................................. 5 2: Resultaten droge destructie met bunsenbrander ...............................................................28 3: Buffers ...........................................................................................................................31 4: Complexanten .................................................................................................................34 5: Waterige kobaltoplossing, verassingstemperatuur .............................................................35 6: Waterige kobaltoplossing, atomisatietemperatuur..............................................................36 7: Apolaire kobaltoplossing, verassingstemperatuur ...............................................................36 8: Apolaire kobaltoplossing, atomisatietemperatuur ...............................................................36 9: Preconcentratie bij de extractie ........................................................................................38 10: Opconcentratie door volumeverandering bij 550 °C .........................................................39 11: Opconcentratie door volumeverandering bij 750 °C .........................................................40 12: Opconcentratie door volumeverandering bij 900 °C .........................................................41 13: Meervoudige injectie ......................................................................................................42 14: Standaarddeviaties bij verschillende injecties ..................................................................44 15: Verandering van detectielimiet .......................................................................................45 16: Matrixmodificatie ...........................................................................................................49 17: Blanco's ........................................................................................................................50 18: IJklijnen automatisch of zelfgemaakt ..............................................................................52 19: IJklijnen gemoffeld of gedroogd .....................................................................................53 20: Temperatuurprogramma ................................................................................................60 21: Meetresultaten validatie 2 keer preconcentreren..............................................................62 22: Validatie 2 keer preconcentreren ....................................................................................63 21: Meetresultaten validatie 3 keer preconcentreren..............................................................64 22: Validatie 3 keer preconcentreren ....................................................................................65
FIGUREN Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur Figuur
1: Structuur vitamine B12 .................................................................................................... 3 2: Structuur en opbouw van cobalaminen ............................................................................. 4 3: Solaar M series AAS - toestel ..........................................................................................14 4: Holle kathodelamp .........................................................................................................15 5: Bouw van een holle kathodelamp ....................................................................................15 6: Gecoate grafietoven .......................................................................................................17 7: De fotomultiplier ............................................................................................................18 8: Deuterium correctie .......................................................................................................19 9: APDC ............................................................................................................................22 10: DDC ............................................................................................................................22 11: Etiket volle yoghurt ......................................................................................................24 12: Etiket magere yoghurt ..................................................................................................24 13: Complexanten ..............................................................................................................34 14: Verassings- en atomisatietemperaturen .........................................................................37 15: Preconcentratie ............................................................................................................43 16: Recovery ifv het aantal injecties ....................................................................................43 17: Foutmarge bij verschillende injecties van 20 µl...............................................................45 18: Achtergrondsignaal.......................................................................................................46 19: IJklijnen automatisch of zelfgemaakt .............................................................................53 20: IJklijnen gemoffeld of gedroogd ....................................................................................53 21: Signaal bij een vlam .....................................................................................................55
VIII
FORMULES & VERGELIJKININGEN (I)
E=h.v
....................................................................................................12
(II)
λ=v.c
....................................................................................................12
(III)
T = I/I0
………………………………….….....………………………………………………………13
(IV)
A = - log10 T ………………………………….…….....……………………………………………………13
(V)
A=ε.c.b
(VI)
NH4PDC NH4+ + PDC-
………………..…………..….………………………………………….22
(VII)
NaDDC Na+ + DDC-
……………..…………………………………………………………….22
………………………………….…………..…………………………………………………13
(VIII) Co2+ + x PDC- [Co(PDC-)x](2-x)
....................................................................23
Co2+ + x DDC- [Co(DDC-)x](2-x)
....................................................................23
(IX)
n
∑ (x i =1
i
− x) 2
(X)
s=
(XI)
betrouwbaarheidsinterval = tn . s/√(n)
n −1
………………………………………………………………………………………44
IX
……………………………………………………….63
Inleiding Vitamine
B12,
de
laatst
ontdekte
vitamine,
is
net
als
andere
vitamines,
een
levensnoodzakelijke stof. Anders dan vaak wordt gedacht komt B12 niet voor in plantaardig voedsel. Veganisten zullen deze vitamine dus apart tot zich moeten nemen. Kennis over het bestaan en de werking van B12 is er pas sinds 1948. Vóór die tijd werd leverextract gebruikt bij ziekten die het gevolg waren van B12-gebrek, zonder dat men wist waarom dit hielp. Leverextract als bron van B12 is inmiddels verleden tijd. De vitamine wordt nu gemaakt met behulp van speciaal voor dit doel geselecteerde bacteriën. Vitamine B12 producerende bacteriën komen voor in het darmstelsel van de meeste dieren. Helaas bevinden die zich meestal in de dikke darm, achter het deel van de dunne darm waar het vitamine kan worden opgenomen. Enkel herkauwers kunnen hun eigen B12 produceren. Melkproducten zijn dus een belangrijke bron van vitamine B12 voor de mens. De bepaling van het B12 – gehalte in fermentatieproducten is dus essentieel in de zuivelindustrie.
Dit werk heeft als doelstelling onderzoek te leveren naar een snelle methode om vitamine B12 in yoghurt te bepalen met de middelen die voorhanden zijn in het labo van de Provinciale Industriële Hogeschool. Door destructie van de molecule komt het gebonden kobalt vrij en wordt het gedetecteerd d.m.v. grafietoven atoomabsorptiespectrometrie.
1
1. Probleemstelling Bij de bepaling van vitamine B12 in yoghurt zijn verschillende technieken mogelijk. Elk van deze technieken heeft zo zijn voor- en nadelen [19].
Zoals zal blijken zijn lang niet alle cobalamiden (zoals bvb. vitamine B12) biologisch actief. Bepaalde methoden kunnen zich toespitsen op de actieve, andere methoden bepalen dan eerder alle cobalamide.
Bij de niet-selectieve microbiologische bepaling met Lactobacillus leichmannii, momenteel het meest toegepast, moet er rekening worden gehouden met een incubatietijd van 16 tot 24h. Bij het gebruik van het ééncellig organisme Ochromonas malhamensis detecteert men enkel de biologische actieve cobalaminen. Hier dient wel rekening te worden gehouden met een incubatietijd tot 7 dagen. Een ander probleem is het gestandaardiseerd vervaardigen van entculturen. Dit moet meestal vergezeld worden van een parallelproef met een gekende hoeveelheid B12 [20].
HPLC lijkt dan eerder de oplossing om zowel snelle als specifieke resultaten op te leveren. Maar bij de toepassing met een yoghurtmatrix moet men rekening houden met de lage kwantiteit aan vitamine B12 (2,5 ppb) en eventueel storende matrixeffecten. Uit onderzoek blijkt dat de aantoonbaarheidsgrens van cyanocobalamide, gebruik makend van HPLC, bij 2,5 ppm ligt op basis van een methode ontwikkeld in het PIH door een thesisstudent [6]. Andere professionele onderzoekers kunnen een detectielimiet van 20 ppb behalen [24].
Daar vitamine B12 de enige vitamine is dat over het minerale element kobalt (Co) beschikt, is een analyse met een AAS-toestel misschien een oplossing. Bij de voorgestelde methode is er na destructie van de yoghurt, een concentratie van slechts 0,1 ppb Co aanwezig in de waterige oplossing. Vandaar het gebruik van de elektrothermische behandeling in een grafietoven. Deze methode wordt vnl. gebruikt voor sporenanalyses. Toch moet men rekening houden dat de detectielimiet van het toestel in dezelfde grootteorde ligt. Een opconcentratie naar een apolaire fase lijkt logisch om o.a. matrixeffecten te minimaliseren.
2
Bij het opconcentreren zal men de vrijgedestrueerde Co complexeren tot een geheel dat de apolaire fase verkiest. Daarnaast is ook het toestel in staat om een opconcentratie in het oventje te realiseren. Een nadeel is wel dat ook deze techniek niet selectief is en dus naast het eventuele vrije kobalt, ook het totale gehalte aan biologisch actieve en niet-actieve cobalaminen meet.
2. Algemeenheden 2.1 Vitamine B12 [6][19][23]
2.1.1 Molecule
2.1.1.1 Structuur van vitamine B12. Het B12-molecuul bestaat uit 5 verschillende onderdelen. Een kern, een nucleotide (dat wat aan de kern gebonden is), een suiker, een riboside en een uitwisselbare restgroep R (een ligand). De kern bestaat uit een plat vlak
waarin
vier
(gereduceerde
en
gesubstitueerde) pyrrol-ringen, samen een macro-ring vormen. Deze macro-ring wordt 'corrin' genoemd (core = kern). Alle verbindingen met deze macrocyclische ring worden corronoïden genoemd.
Figuur 1: Structuur vitamine B12
Bij vitamine B12 bevindt zich in het centrum van de 'corrin' (tot grote verbazing van de ontdekkers) een metaal: kobalt. Dit maakt B12 tot de enige vitamine die een mineraal element in zich draagt. B12 is overigens de enige verbinding waarin kobalt door het lichaam wordt gebruikt.
3
Van het kobaltatoom zijn vier van de in totaal zes bindingsplaatsen verbonden met de 'corrin'. Twee bindingsplaatsen zijn dus nog vrij. Wil een corronoïde het biologisch actieve B12 zijn, dan moet loodrecht op het platte vlak, aan de onderkant, een nucleotide, genaamd 5,6-dimethylbenzimidazole, aan het kobalt gebonden zijn. Dit nucleotide, dat aan één kant is gebonden aan het centrale kobaltatoom, is aan de andere kant via een suiker, fosfaat en een ribosidedeel (aminopropanol) aan de 'corrin' gebonden. Alleen deze corronoïden zijn de zogenaamde cobalaminen en zijn onmisbaar voor mensen en andere gewervelde dieren. Aan de bovenkant van het platte vlak is een restgroep R aan het kobalt gebonden. Deze restgroep is gehecht aan de zesde en laatst overgebleven bindingsplaats van het kobaltatoom en deze bepaald met welk cobalamine we te maken hebben (zie tabel 1). Vitamine B12 is gedefinieerd als die groep van kobalthoudende corronoïden die biologisch actief zijn bij mensen (dit zijn de cobalaminen).
Figuur 2: Structuur en opbouw van cobalaminen
4
2.1.1.2 Corronoïden Is er een ander nucleotide dan 5,6-dimethylbenzimidazole aan het kobalt gebonden, of is het B12-molecuul incompleet, dan spreekt men doorgaans van analoge vormen van B12. De desbetreffende moleculen lijken op B12, maar hebben niet de werking van B12. De verscheidenheid aan analoge vormen van B12 is groot. In de natuur komen er een 20-tal voor en via biosynthese kunnen er nog eens een 50-tal worden geproduceerd. Verschillende analoge vormen van B12 werken in het lichaam als antagonisten (tegenwerkers) van B12. Dat tegenwerken kan op drie manieren gebeuren: het verhinderen van de opname van B12 (bijvoorbeeld door alle intrinsieke factor-moleculen te bezetten), het verhinderen van de omzetting van B12 in co-enzymen, en het tegenwerken van de biochemische werking van de co-enzymatische vormen van B12. De analoge vormen van B12 kunnen (soms) biologisch actief zijn in niet-gewervelde dieren, bijvoorbeeld in bacteriën. Door sommige auteurs worden de corronoïden wel gezien als primitieve enzymen die nog stammen uit de tijd dat de atmosfeer geen zuurstof bevatte. Zij stellen dat gedurende de evolutie van het leven de corronoïden een steeds minder belangrijke rol zijn gaan spelen. Dit zou kunnen verklaren waarom veel anaerobe micro-organismen, die in het donker leven, nog vele enzymsystemen kennen die afhankelijk zijn van B12-analogen, dat de vaatplanten helemaal onafhankelijk lijken te zijn geworden van corronoïden en dat de hogere dieren nog maar drie B12-afhankelijke reacties kennen.
2.1.1.3 De verschillende cobalaminen Er bestaan verschillende voor de mens biologisch werkzame vormen van B12. Het soort cobalamine wordt bepaald door de restgroep R (het ligand). Tabel 1: Lijst met liganden
Ligand
Vorm van vitamine B12
Afkorting
H2O
Aqua-cobalamine
Aq-CBL
CN
Cyano-cobalamine
CN-CBL
ONO-
Nitro-cobalamine
NITRO-CBL
OH-
Hydroxy-cobalamine
OH-CBL
CH3
Methyl-cobalamine
ME-CBL
5'-deoxyadenosyl
Adenosyl-cobalamine
ADO-CBL
5
Van bovenstaande vormen zijn alleen ME-CBL en ADO-CBL rechtstreeks biologisch actief. Het lichaam is echter in staat de overige cobalaminen om te zetten in ME-CBL en ADO-CBL. ME-CBL en ADO-CBL zijn de zogenaamde 'co-enzymatische' vormen van B12. Verwarrend in dit verband is dat adenosylcobalamine ook wel 'co-enzym B12' wordt genoemd, terwijl het slechts één van de twee co-enzymen is. De twee co-enzymen zijn zeer instabiel en vallen onder invloed van licht binnen enkele seconden uit elkaar, en veranderen dan in aquacobalamine. Proefnemingen met de co-enzymen van B12 moeten dan ook worden verricht in een donkere kamer . Cyano-cobalamine komt van nature nauwelijks voor in het lichaam, behalve na het roken van sigaretten. Het cyanide uit de rook bindt zich bij voorkeur aan het B12-molecuul en verdrijft daarbij de andere liganden. Het lichaam kan cyano-cobalamine echter niet goed vasthouden en het wordt door de nieren via de urine vrij snel uitgescheiden. Dat verklaart waarom roken tot uitputting van de B12-voorraad kan leiden! De binding aan cyanide is zeer sterk en daarom is cyano-cobalamine chemisch zeer stabiel en is cyano-cobalamine ook de vorm van B12 die bij voorkeur gebruikt wordt in pillen. In droge vorm (in de lucht) blijft cyanocobalamine zelfs bij 100 graden Celsius enige uren stabiel. Onder invloed van ultraviolette straling of sterk zichtbaar licht valt cyano-cobalamine slechts langzaam uiteen, waarbij de cyanidegroep afgesplitst wordt en het molecuul veranderd wordt in hydroxy-cobalamine. Na zeer langdurige blootstelling aan zichtbaar licht en/of ultraviolet licht verandert cyanocobalamine onomkeerbaar in een inactieve stof. Hydroxy-cobalamine is redelijk stabiel en wordt bij voorkeur gebruikt in injecties. Het wordt beter vastgehouden door het lichaam dan cyano-cobalamine. Ook hydroxy-cobalamine moet niet al te veel aan licht worden blootgesteld. Aqua-cobalamine en nitro-cobalamine komen in het lichaam niet voor. Bij de bepaling van vitamine B12 met de hier onderzochte methode wordt steeds de verzameling van alle cobalaminen en het vrij kobalt bedoeld, daar de methode het totale Cogehalte meet.
6
2.1.2 Biochemische werking Van alle enzymen die in bacteriën voorkomen is bekend dat er slechts tien functioneren in het bijzijn van vitamine B12. Slechts twee van deze B12-afhankelijke enzymen zijn ook in mensen gevonden. Om actief te zijn hebben deze twee enzymen de twee co-enzymatische vormen van vitamine B12 nodig. In totaal worden er in het lichaam door B12 drie belangrijke reacties onderhouden, twee door adenosyl-cobalamine (ADO-CBL) en één door methylcobalamine (ME-CBL). ADO-CBL is een co-factor voor het enzym dat in de lichaamscellen de volgende twee reacties mogelijk maakt: Reactie 1: de methylmalonyl CoA mutase. Hierbij wordt L-methylmalonyl CoA omgezet in succinyl CoA (barnsteenzuur). Reactie 2: de synthese van (alfa)leucine uit beta-leucine. De reacties spelen een belangrijke rol in de opbouw- en afbraakprocessen van koolhydraten en vetten. Het achterwege blijven van de reacties is een mogelijke verklaring voor beschadigingen aan het zenuwstelsel en daarmee van de neurologische aandoeningen die kunnen optreden bij een B12-gebrek. De beschadigingen komen het meest duidelijk tot uiting in een aantasting van de vetscheden rond de zenuwbanen (de myelinescheden) en van de zenuwceluitlopers (de axonen). Wanneer deze degenereren, ontstaat een verstoring van de prikkelgeleiding. Door het niet plaatsvinden van reactie nummer 1 raken mogelijk ook de hoeveelheden propionyl-CoA en methylmalonyl-CoA in de lever verhoogd. Hierdoor zou meer propionyl-CoA gebruikt worden voor de aanmaak van vetzuren met een oneven ketenlengte dat leidt tot een afwijkende vetzuursamenstelling van de myelinescheden en van ander zenuwweefsel. Het degeneratieproces van de myelinescheden heet demyelinisatie.
7
ME-CBL is een co-factor voor het enzym dat reactie nummer 3 mogelijk maakt: Reactie 3: de omzetting van homocysteïne in methionine, de zogenaamde N5methyltetrahydrofoliumzuurhomocysteïnemethyltransferase. Wanneer deze reactie niet plaats vindt kan foliumzuur niet functioneren. Dat heeft weer tot gevolg dat de aanmaak van stoffen, die essentieel zijn voor de opbouw van DNA (en RNA), geblokkeerd raakt. Een gebrek aan foliumzuur heeft dezelfde gevolgen. Dit alles leidt er toe dat de cellen zich niet (goed) meer kunnen delen. Dit komt het eerst tot uiting in de cellen die zich snel delen: het beenmerg (bloedcellen), en de cellen in de slijmvliezen (darmwand, maagwand, tong, slokdarm, enzovoort). Ook raakt bij kinderen de groei geremd. Het uitblijven van de reactie heeft bovendien op twee manieren gevolgen voor het zenuwstelsel: •
De verstoorde aanmaak van DNA heeft ernstige gevolgen voor de zich snel delende cellen in de hersenen van in de groei zijnde baby's en kleine kinderen.
•
Er ontstaat een gebrek aan S-adenosylmethionine. Deze stof is nodig voor de aanmaak van de normale eiwitten en vetten (lipiden), die weer nodig zijn voor de opbouw van de myelinescheden.
Het kan niet worden uitgesloten dat vitamine B12 naast boven genoemde enzymreacties, ook bij andere reacties een rol speelt. De werking van vitamine B12 is nauw verweven met die van foliumzuur, maar de twee vitamines zijn niet uitwisselbaar. Het toedienen van grote hoeveelheden foliumzuur kan weliswaar tot gevolg hebben dat zowel de B12 als de foliumzuurafhankelijke reacties weer op gang komen, maar dit is slechts van tijdelijke aard. Wanneer na het toedienen van foliumzuur een door B12-gebrek veroorzaakte bloedarmoede tijdelijk verdwijnt, wordt soms de voorbarige conclusie getrokken dat er sprake was van een tekort aan foliumzuur. Foliumzuur is bij een B12-gebrek slechts een lapmiddel, dat bovendien gevaarlijk kan zijn. De neurologische schade als gevolg van B12-gebrek kan door het toedienen van foliumzuur snel verergeren, met onherstelbare zenuwbeschadigingen als gevolg.
8
2.1.3 Huidige analysetechnieken [6]
2.1.3.1 Voorbehandeling Om de cobalamineconcentratie (in bijvoorbeeld voedsel) te kunnen bepalen is het op de eerste plaats nodig de vitamine los te maken van de eiwitten waaraan deze vaak is gebonden. Hiervoor wordt onder andere zoutzuur, zwavelzuur of natronloog gebruikt. Verder wordt er met plantaardige enzymen gewerkt (bijvoorbeeld papaïne). Na dit losmaken wordt van organische oplosmiddelen gebruik gemaakt (bijvoorbeeld phenol of benzyl-alcohol) om de vitamine uit te spoelen. Daarna volgt de extractie van de B12 uit het oplosmiddel. Hierbij wordt gebruik gemaakt van ether of van ionenwisselaars. Omdat corronoïden allen goed oplosbaar zijn in water is het mogelijk ze vervolgens met water uit te spoelen. Door de bewerkingen kan een deel van de B12 verloren gaat, wat foutieve meetresultaten tot gevolg heeft. Bij de aanwezigheid van slechts een klein beetje cyanide gaan bovendien vele cobalaminen over in de meer stabiele cyanidevorm. Omdat dit nog steeds een cobalamine is, is dat alleen een nadeel als je de concentraties van de afzonderlijke cobalaminen wilt bepalen.
Corronoïden die afkomstig zijn van micro-organismen, bevatten naast cobalaminen ook allerlei non-cobalamine-corronoïden en/of incomplete corronoïden. Om niet (alleen) het totaal aan corronoïden te meten maar (ook) dat van de verschillende fracties, is het in bepaalde gevallen nodig die fracties eerst van elkaar te scheiden. Het scheiden van corronoïden afkomstig van mensen en andere gewervelde dieren is vaak niet nodig, omdat je
van
deze
corronoïden
al
weet
dat
het
voornamelijk
cobalaminen
zijn.
Papierchromatografie, ionophorese, kolomchromatografie en adsorptietechnieken zijn de meest toegepaste scheidingstechnieken.
2.1.3.2 Microbiologische tests Op papieren schijfjes worden de te meten corronoïden aangebracht. Vervolgens wordt het schijfje overgoten met vloeibare agar-agar waaraan geselecteerde micro-organismen zijn toegevoegd. De mate waarin de micro-organismen tot ontwikkeling komen kan worden gemeten met fotometrische opnameapparatuur en dit kan worden vergeleken met standaardproeven. De hoeveelheid corronoïden kan nu worden berekend. De groei is namelijk afhankelijk van de hoeveelheid aan aanwezige corronoïden. Dezelfde techniek
kan
ook
gebruikt
worden op
de papieren strippen waarmee
papierchromatografie of ionophorese is gedaan. Door het gebruik van een mengsel van verschillende soorten micro-organismen die ieder op zich, specifiek zijn voor slechts één
9
bepaald deel van de corronoïden, kunnen de fracties op de strippen zichtbaar worden gemaakt. Deze techniek heet bio-autografie. Het combineren van deze twee technieken, de papierchromatografie en de microbiologische test, is de enige methode waarmee individuele cobalaminen uit bijvoorbeeld bloedplasma of voedsel van elkaar zijn te onderscheiden en waarbij de afzonderlijke hoeveelheden exact zijn te meten. Een van de eerste microbiologische tests werd gedaan met Lactobacillus lactus dorner. Deze bleek later weinig specifiek te zijn. Van de vele geteste soorten zijn er vier soorten die het meest worden toegepast. Twee bacteriën : Lactobacillus leichmannii en Escherichia coli, en twee protozoa: Ochromonas malhamensis en Euglena gracilis.
De warenwet in de Verenigde Staten (de FDA) schrijft voor dat bij het vaststellen van het vitamine B12-gehalte in voedselgebruik moet worden gebruik gemaakt van Lactobacillus
leichmannii. Deze bacterie groeit echter ook op een aantal non-cobalamine-corronoïden, waardoor veel misverstanden over B12-gehalten zijn ontstaan. De meetresultaten zijn vaak geïnterpreteerd alsof het bij metingen met Lactobacillus leichmannii zou gaan om het totaal aan voor mensen werkzame B12. In werkelijkheid kan echter veel minder of zelfs helemaal geen B12 aanwezig zijn. Sommige fabrikanten verschuilen zich achter de wettelijke status van Lactobacillus leichmannii wanneer het B12-gehalte in bepaalde producten wordt aangevochten.
Ochromonas malhamensis is het meest specifiek voor cobalaminen. Deze heeft een B12huishouding die het meest lijkt op die van mensen (en andere gewervelde dieren) en groeit uitsluitend op cobalaminen. Testen met Ochromonas malhamensis (en Euglena gracilis) hebben een veel langere incubatietijd dan Lactobacillus leichmannii nodig. De incubatietijd van Lactobacillus leichmannii is 16 tot 24 uur, terwijl die van Ochromonas malhamensis 3 tot 7 dagen is.
Een nadeel van de microbiologische methode is dat het gestandaardiseerd vervaardigen van de entcultuur van het testorganisme nog steeds niet goed mogelijk is. Daardoor moet om nauwkeurig te kunnen werken bij iedere proef een parallelproef draaien met een standaard hoeveelheid B12. Om dezelfde reden is het ook moeilijk om een standaardcurve te reproduceren.
10
2.1.3.3 De competitieve eiwitbinding Deze methode wordt voornamelijk gebruikt voor de bepaling van B12 in bloed. De CPB-test (competitive proteïn bonding test) is eenvoudig en snel in het gebruik. Er kunnen zeer lage concentraties B12 mee worden gemeten en het monster dat minimaal nodig is om een meting te kunnen verrichten kan zeer klein zijn (200 microliter). De gevoeligheid benadert de microbiologische test en wordt niet negatief beïnvloed door antibiotica. De werking is als volgt: een mengsel van de te meten hoeveelheid corronoïden en een bekende hoeveelheid radioactief gemerkt B12 (waarvan het kobaltatoom in de 'corrin' een radioactieve isotoop van kobalt is) wordt vermengd met een beperkte hoeveelheid eiwit dat de eigenschap heeft B12 aan zich te binden. De beide soorten B12-moleculen raken gebonden aan het eiwit en deze gebonden moleculen kunnen aan het mengsel worden onttrokken. Vervolgens wordt van deze gebonden moleculen de verhouding radioactief en niet-radioactieve B12 bepaald door het meten van de hoeveelheid radioactiviteit. Uit de verhouding tussen radioactief en niet-radioactief gebonden B12 is de oorspronkelijke hoeveelheid B12 in het monster te berekenen en ook kan deze hoeveelheid worden afgelezen van een standaardcurve. Omdat deze test niet wordt toegepast op metingen in yoghurt gaan we hier niet verder op in.
2.1.3.4 Chromatografie [6] [24] Zowel met gas- als vloeistofchromatografie kan men selectief cobalaminen gaan bepalen. Er gebeurt zowel een scheiding als een analytische bepaling. Aangezien de molecuulmassa van de verschillende cobalaminen weinig verschillen is het scheiden ook niet evident. Deze technieken halen dikwijls ook niet de gewenste aantoonbaarheid.
2.1.3.5 Spectroscopisch [3][9][10][22] Daar corronoïden de enige biochemische verbindingen zijn die het minerale kobalt bevatten, kan men ook na destructie van de molecule het gehalte aan vrij kobalt spectrofotometrisch bepalen. Ook hier is al heel wat onderzoek gedaan naar bepaling met behulp van vlam AAS, ICP en GF-AAS. Maar weinig onderzoek is gebeurd bij metingen in de yoghurtmatrix.
2.1.3.6 Andere methodes Daarnaast zijn er nog een aantal, minder gekende en minder toegepaste, methoden: enzymatische tests [20], dure neutron-activeringstests en chemische reacties met kwikchloride.
11
2.2 Grafietoven Atoom Absorptie Spectrofotometrie [4][18][21] 2.2.1 Principe
2.2.1.1 Algemeen Grafietoven atoom absorptie spectrofotometrie is een analysemethode om concentraties aan elementen in een mengsel te bepalen. Het kent voornamelijk toepassingen bij het bepalen van metalen in waterige oplossingen en vaste stoffen. Een mengsel wordt via de autosampler geïnjecteerd in een grafietoven.
Via een
temperatuursprogrammatie wordt dat oventje elektrisch opgewarmd. Het mengsel verdampt, verast en atomiseert bij de verschillende stappen van het programma. De vrije atomen gaan het specifieke licht dat door een overeenkomstige holle kathodelamp werd uitgezonden, absorberen. De maat voor de absorbantie is volgens de wet van Lambert-Beer in lineair verband met de concentratie.
2.2.1.2 Licht als elektromagnetische golf Wanneer aan elektronen van een atoom energie wordt toegevoegd kunnen die overgaan naar een hoger gelegen elektrisch energieniveau. De mogelijke niveau’s zijn typisch voor een bepaald element. Wanneer die excitatie-energie uit de bestraling met licht (fotonen) wordt gehaald, bewees Planck dat er een verband is tussen de golflengte van het geabsorbeerde licht en die energiehoeveelheid. Specifieke excitaties komen dus overeen met specifieke golflengtes. E=h.ν
Met
(I)
E = energiehoeveelheid tussen elektrische niveaus (J) h = constante van Planck = (6,626 069 3 ± 0,000 001 1) × 10-34 Js ν = frequentie van het licht (s-1 = Hz)
λ=ν.c
Met
(II)
λ = golflengte (m) ν = frequentie van het licht (s-1 = Hz) c = lichtsnelheid in het huidige medium = 299.792.458 m/s
12
2.2.1.3 Absorbantie Lichtintensiteit wordt bepaald door het aantal invallende fotonen per seconden. Wanneer licht door een medium straalt worden een aantal van die fotonen ‘verbruikt’ voor de excitatie van elektronen. Daardoor daalt de lichtintensiteit. De verhouding van de uittredende lichtintensiteit t.o.v. de intredende lichtintensiteit wordt de transmissie genoemd.
T = I/I0
Met
(III)
T = transmissie I = lichtintensiteit van het uittredende licht (aantal fotonen/s) I0 = lichtintensiteit van het invallende licht (aantal fotonen/s)
Daar het absorberen van licht ifv de concentratie aan te meten product logaritmisch gebeurt, is het begrip absorbantie in het leven geroepen.
A = - log10 T
Met
(IV)
A = absorbantie T = transmissie
2.2.1.4 Wet van Lambert – Beer In 1729 toonde Pierre Bouguer aan dat de fractie aan geabsorbeerd licht een recht evenredig verband toont met de dikte van de laag en de intensiteit van het invallende licht. Dit werd in 1760 door Johann Heinrich Lambert geciteerd is zijn werk ‘Photometria’. In 1852 vulde August Beer die bevinding aan met de ontdekking dat de evenredigheidsconstante afhankelijk was van de concentratie.
De samengestelde wet ziet er dan als volgt uit: A=ε.c.b
Met
(V)
A = absorbantie ε = molaire absorptiecoëfficiënt (l/mol.cm) c = concentratie (mol/l) b = weglengte (cm)
13
Deze wet is pas geldig onder een aantal belangrijke voorwaarden: - Het invallende licht dient monochromatisch te zijn. - Het volume aan te meten mengsel dient homogeen verdeeld te zijn.
2.2.1.5 Beperkingen van de wet Om monochromatisch licht te verkrijgen is er ten eerste een selectieve lichtbron nodig en is de aanwezigheid van monochromatoren noodzakelijk. Ook dan nog hebben dergelijke lijnen een bepaalde breedte. Deze zijn te wijten aan de Dopplerverbreding, de Lorentzverbreding en in mindere mate aan de natuurlijke verbreding.
- Dopplerverbreding Atomen in een mengsel zijn in beweging. Er moet dus rekening gehouden worden met een spreiding op de golflengte. Dit wijst erop dat er steeds bij eenzelfde en constante temperatuur moet gemeten worden. - Lorentzverbreding Geëxciteerde atomen kunnen botsen, waardoor vroegtijdige terugval kan ontstaan. Dit kan deels verholpen worden door in een lage concentratie te werken. - Natuurlijke verbreding Dit is het gevolg van de onzekerheid die er bestaat op de levenduur van de geëxciteerde toestand. Het onzekerheidsprincipe van Heisenberg toont aan dat er dan ook onzekerheid bestaat op de grootte van de geabsorbeerde energie. Daardoor is de spectraallijn niet strikt monochromatisch maar bestaat ze uit een smalle band rond de meest waarschijnlijke centrale golflengte.
2.2.2 Toestel Bij de proeven werd gebruik gemaakt van het Solaar M – toestel van Thermo Elemental.
Figuur 3: Solaar M series AAS - toestel
14
De belangrijkste onderdelen zijn:
2.2.2.1 De autosampler In een volautomatisch rad kunnen plastieken cuvetjes geplaatst worden en kan de geautomatiseerde injectiearm van 1 tot 70 µl capillair opzuigen. Het spoelbakje en de arm worden gewassen met zuiver solvent, hier methylisobutylketon (MIBK). In onze metingen is een standaardinjectie 20 of 40 µl.
2.2.2.2 De lichtbron
Figuur 4: Holle kathodelamp
Figuur 5: Bouw van een holle kathodelamp
We maken gebruik van een holle kathodelamp. Deze betrouwbare lampen kunnen tot 5000 uren, zonder gebreken, meegaan. De kathode bestaat uit kobalt, waarbij monochromatisch licht met de specifieke golflengtes wordt uitgestraald. Beide elektrodes zitten in een glazen geheel waar aan het uiteinde ook een sillica venster kan zitten, afhankelijk van de golflengtes van het vrijkomende licht. Sillica is meestal gebruikt voor golflengtes in het UV – gebied onder de 300 nm; glas wordt verkozen voor het gebied van het zichtbare licht. De kathode heeft de vorm van een holle cilinder met een interne diameter van ca. 2 mm. De lamp is gevuld met argon, neon of helium bij een druk van 4 tot 10 Torr. Het glas is op hoge temperatuur gasvrij gemaakt om onzuiverheden te vermijden. De keuze van vulgas is bepaald door het gebruikte kathode-element. De emissielijn van het gas mag niet overlappen met de resonantielijn van het gebruikte metaal. Door het potentiaalverschil tussen anode en kathode (300 à 400 V) ioniseert het aanwezige edelgas en stelt elektronen vrij. De positieve gasionen worden versneld aangetrokken naar de kathode en bij botsing komen kobaltatomen vrij, die onder toevoeging van botsingsenergie, in gasvorm aanwezig zijn. De ronddwalende vrije elektronen of positieve gasionen exciteren de elektronen van de gasvormige kobaltatomen. Bij de terugval van deze geëxciteerde elektronen wordt licht met de overeenkomstige energiehoeveelheden en dus
15
golflengtes uitgestraald. Uit het specifieke spectrum wordt gekozen om de lijn bij 240,7 nm te selecteren. De lampen krijgen een stroom van 2 tot 15 mA afhankelijk van het element en de bouw. Meestal heeft het verlagen van de maximale stroom tot 75% het voordeel dat de gevoeligheid stijgt. Bij 100% is de meting wel preciezer.
2.2.2.3 Optiek Met enkele lenzen en spiegels wordt het licht door het geatomiseerde monster door het grafietoventje gestuurd en opgevangen op een detector. Monochromatoren worden gebruikt om die specifieke resonantielijn van het geabsorbeerde licht te selecteren. Bij het selecteren van de golflengte wordt gebruik gemaakt van een Echellerooster. Dit reflectierooster bevat tot 6000 groeven die onder een bepaalde hoek gekerfd staan. Door het licht te laten invallen onder een specifieke invalshoek kan men het reflectielicht tot op een bandbreedte van 0,01 nm precies instellen. Bij single beam systemen wordt één lichtstraal rechtstreeks door het monster gestuurd. Bij double beam wordt er ook een lichtstraal gemeten die niet door het monster loopt. Deze dient om eventuele fluctuaties van intensiteit, afkomstig van de lamp, te neutraliseren. In andere systemen wordt de deuteriumlamp gebruikt in de tweede straal (zie 2.2.4.2 Deuteriumcorrectie). In stockdale optics wordt zowel een met referentiestraal als met deuteriumcorrectie rekening gehouden, hierdoor gaat de lichtintensiteit ten volle gebruikt worden.
2.2.2.4 Grafietoven De grafietoven wordt geplaatst tussen twee grafieten klemmen die gemonteerd zijn op een metalen blok voorzien van elektrische aansluitingen. Op die manier kan er doorheen de grafietoven een elektrische stroom worden gestuurd. Deze elektrische stroom zorgt ervoor dat de grafietoven in een periode van enkele seconden thermisch kan verhitten tot ongeveer 3000°C. Door de ruimte in en rond de oven te spoelen met argon (0,2 l/min) beschermt men de grafietoven tegen opbranden met zuurstof uit de atmosfeer. De metalen blokken zijn voorzien van een intern watergekoeld koelsysteem. Niet alle elementen worden gemeten in dezelfde grafietovens. De gevoeligheid van een meting op een welbepaald element is afhankelijk van welk type grafietoven er gebruikt wordt. Voor de meting op kobalt maken we gebruik van een gecoate grafietoven. Grafieten oventjes worden gecoat met de Hot Wall-methode. De oven wordt in een atmosfeer van koolwaterstoffen gebracht bij temperaturen tot 2500°C. Zo wordt een laagje pyrolytisch grafiet gevormd van circa 30 tot 50 µm. Door dergelijke coating daalt de permeabiliteit voor gassen en wordt een
16
oventje beter resistent tegen chemische aanvallen van organische matrices. Het verlies van gassen daalt tot 33%, waardoor er meer product in de oven blijft en de analytische gevoeligheid stijgt. Het voorkomt ook grotendeels geheugeneffect en het is beter bestand tegen oxidatie.
Figuur 6: Gecoate grafietoven
2.2.2.5 Temperatuurprogramma Zowel de tijd, de temperatuur als de snelheid van temperatuurwijziging kan worden ingegeven bij de verschillende stappen: drogen, verassen, atomiseren en reinigen. In de droogfase wordt het solvent verdampt. Daar MIBK een kookpunt van 116 °C heeft, wordt gekozen om deze steeds bij 120 °C in te stellen. Bij de verassing worden alle organische componenten ontbonden. Bij de atomisatie worden de assen in atomaire toestand gebracht. Deze twee factoren worden uitvoerig onderzocht. En bij het reinigen wordt het oventje tot het maximum opgewarmd en worden alle resten met een hogere argonstroom verdreven. Hier wordt gekozen om te reinigen bij 2600 °C en wordt het gasdebiet opgetrokken.
2.2.2.6 Detectiesysteem De functie van het detectiesysteem is de intensiteit van het licht meten. Meestal gebruikt men een fotomultiplier. De detector moet de range van 190 tot 860 nm kunnen overlappen, wat soms problemen meebrengt voor de gevoeligheid. De gevoeligheid wordt bepaald door de fotogevoelige laag die de kathode bevat. Voor golflengtes in de buurt van de kobaltresonantielijn wordt gebruik gemaakt van cesiumantimoon-kathodes, die een bereik hebben van ca. 200 tot 500 nm. Wanneer licht invalt op een fotogevoelige kathode worden elektroden losgeslagen die versneld naar de anode bewegen en dusdanig een stroom creëren. Door een opeenvolging van dergelijke fotocellen waarbij het potentiaalverschil telkens voldoende groot is, wordt het signaal steeds sterker. Zo kan men tot 106 keer versterken. De versterking mag echter niet te groot worden, want de ruis wordt ook versterkt.
17
Figuur 7: De fotomultiplier
2.2.2.7 Software De bijhorende software maakt van het verkregen signaal een grafische voorstelling en bepaalt zowel de hoogte als de oppervlakte onder de pieken. Het systeem maakt het mogelijk om heel wat aspecten van de methode te variëren. Zo kan o.a. gekozen worden voor verschillende calibratiemethoden en ijklijnen, kan er rekening worden gehouden met correctiesystemen en kan er bepaald worden na welke fasen temperatuurcontrole moet gebeuren. Na de atomisatiefase wordt de gasstroom stilgelegd en wordt de eigenlijke meting uitgevoerd. Het is eveneens mogelijk om in een methode na de droog- of verassingsfase een reconcentratie aan monster in het oventje zelf te voorzien.
2.2.3 Interferenties
2.2.3.1 Achtergrond Wanneer andere stoffen licht absorberen bij de specifieke golflengte spreekt men van spectrale- of achtergrondinterferentie. Dit kan het gevolg zijn van de HKL, de monochromator of het optische systeem. Dit kan verholpen worden door het gebruik van blanco metingen. Daarnaast kunnen ook andere atomen of moleculen (deels) dat licht absorberen. We spreken van matrixeffecten. In 2.2.4 worden hiervoor oplossingen voorzien.
18
2.2.3.2 Chemische interferentie Bepaalde moleculen kunnen slechts gedeeltelijk geatomiseerd worden. Dit komt voornamelijk voor bij anionen, vandaar dat dit in onze analyse van minder belang is. We werken daarenboven bij een zodanig hoge tempratuur (ca. 2200 °C) dat quasi alle elementen zo optimaal mogelijk atomiseren.
2.2.3.3 Fysische interferentie Door allerlei fysische factoren (oppervlaktespanning, viscositeit) kan de atomisatie verhinderd worden. Het is de bedoeling om alle oplossingen (standaarden en monsters) in eenzelfde solvent te extraheren, zodoende ook die interferenties te neutraliseren.
2.2.4 Correctiesystemen De M-series van de AAS-toestellen van Thermo Elemental zijn gekend voor hun correctiesystemen. Meestal bevat een toestel zowel een wel double beam-correctie als een deuteriumcorrectie.
2.2.4.1 Double beam-correctiesystem Naast het uittredende licht wordt tijdens de meting eveneens het invallende licht gemeten, zodat eventuele fluctuaties in intensiteit afkomstig van de lichtbron geneutraliseerd kunnen worden.
2.2.4.2 Deuteriumcorrectie Een deuteriumbooglamp straalt licht uit die het volledige UV-VIS - spectrum bevat. Het meet dan ook de absorbanties die te wijten zijn aan alle elementen. Met deze lamp wordt dus de absorbanties te wijten aan de matrix bepaald. Zo kan men dan het totale signaal verminderen met het achtergrondsignaal van de matrix.
Figuur 8: Deuterium correctie
19
2.2.4.3 Smith – Hiefte Net zoals bij Zeemancorrectie gaat men bij deze correctiemethode het spectrale outputprofiel veranderen. Hier verandert men het outputprofiel door te werken met twee lampstromen. Bij lage lampstroom, ongeveer 5 mA, krijgt men de gewone emissielijn van de lamp. Bij een hoge lampstroom van ongeveer 20 mA verkrijgt men ten gevolge van lijnverbreding en zelfabsorptie een dubbele piek met de maxima aan weerszijden van de te bestuderen golflengte. Bij een lage lampstroom meet men de totale absorbantie, terwijl men bij een hoge lampstroom de achtergrondabsorbantie meet.
2.2.4.4 Matrix-modificatie Chemische interferentie van de matrix kan worden gereduceerd door het gebruik van een matrix modifier. Hierbij maakt men gebruik van reagentia die het thermische gedrag van de matrix wijzigen. Door middel van matrixmodificatie kan je de matrix sneller laten verdampen en andere elementen stabiliseren. Natriumchloride bijvoorbeeld heeft een heel hoog kookpunt (1465 °C). Door toevoeging van ammoniumnitraat wordt ammoniumchloride gevormd. Dit laatste heeft een kookpunt van 340 °C en ook natriumnitraat heeft een lager kookpunt (308 °C).
2.2.4.5 Sample Blank In heel wat testen wordt gekozen om een sample blank, een blanco monster, te gebruiken om de effecten van de matrix te neutraliseren. Daar wij niet over kobaltvrije yoghurt beschikken kunnen wij hier geen gebruik van maken. Het lijkt trouwens onlogisch omdat enkel gecomplexeerd kobalt in de apolaire fase overgaat. Daar bij een blanco geen kobalt aanwezig is, zou onze blanco uit puur MIBK bestaan.
2.2.5 Voor- en nadelen van GF-AAS
2.2.5.1 Voordelen - De meting met GF-AAS gebeurt relatief snel. Eén enkelvoudige meting duurt ongeveer 75 seconden. - De analysetechniek heeft een heel lage detectielimiet. GF-AAS kan concentraties tot op 0,1 ppb betrouwbaar bepalen. - De analyse gebeurt op kleine monsterhoeveelheden (typisch 20 µl). - Door de regelbare verblijftijden en –temperaturen kan een optimale behandeling gebeuren.
20
2.2.5.2 Nadelen - De grafieten oventjes zijn poreus en kunnen dus gassen opnemen. Er dient dus steeds goed te worden gereinigd. Bij de plotse overgang van een grote concentratie naar een kleine of omgekeerd kunnen storingen optreden. Herhaaldelijk meten en werken met kleine concentratieverschillen is aangeraden. Door het gebruik van gecoate oventjes wordt dit negatieve gevolg zoveel mogelijk beperkt. - De kwaliteit neemt af i.f.v. de gebruiksduur. Zeker bij de toepassingen met zware organische matrices. Het is dan ook aangeraden om de te gebruiken ijklijn net voor, tijdens of na de monstermetingen te doen. - Temperatuursgradiënten. Niet overal in het oventje is de temperatuur even hoog. Vandaar dat onderzoek naar ideale verassings- en atomisatietemperaturen aangeraden is. - Naarmate men met de techniek lagere concentraties analyseert, daalt de precisie.
2.3 Complexatie van metaalionen [23] Metaalionen verkiezen waterige oplossingen boven apolaire solventen. Om dergelijke ionen in apolaire fase te kunnen brengen – nodig voor de opconcentratie – moeten deze metaalionen gecomplexeerd worden tot een geheel die de apolaire fase verkiest.
2.3.1 Principe Een complex is een reversibele coördinatieve binding tussen een positief metaalion en een geheel aantal liganden. Deze liganden beschikken steeds over een vrij elektronenpaar, maar het kunnen zowel negatieve ionen als neutrale moleculen zijn. Meestal komen deze liganden per 2,4 of 6 voor. Liganden kunnen mono- of polydentaat zijn. Dwz dat ze respectievelijk één of meerdere keren met het metaalion binden. Grotere liganden kunnen zelfs aan verschillende metaalionen binden. Deze nieuwe moleculen verkrijgen dan ook een andere geometrie waardoor ze bv. gemakkelijk kunnen neerslaan, een andere kleur vertonen of hun polariteit wijzigen. Elk van deze wijzigingen kent zijn toepassingen in verschillende takken van de chemie. De liganden nodig om een complex te vormen worden geleverd door complexanten.
21
2.3.2 Complexanten De gebruikte complexanten in dit werk zijn ammonium 1-pyrolidinedithiocarbamaat (APDC) en natrium diethyldithiocarbamaat (DDC).
Figuur 9: APDC
Figuur 10: DDC
Eigenlijk zijn dit twee zouten die in waterig midden dissociëren tot respectievelijk het ammonium- / natriumion en de organische negatieve groep. Die laatste treden op als liganden bij de complexering met kobalt.
Vereenvoudigde voorstelling:
Dissociaties: NH4PDC NH4+ + PDC-
(VI)
NaDDC Na+ + DDC-
(VII)
Uit onderzoek is gebleken dat de ligging van bovenstaand dissociatie-evenwicht sterk afhankelijk is van omgevingsfactoren. Ook het complexeringsevenwicht met kobalt is erg milieu-afhankelijk. Complexering: Co2+ + x PDC- [Co(PDC-)x](2-x)
(VIII)
Co2+ + x DDC- [Co(DDC-)x](2-x)
(IX)
22
2.3.3 Factoren die de complexatie beïnvloeden
2.3.3.1 Temperatuur Ieder evenwicht is onderhevig aan een enthalpieverandering weergegeven als een onderdeel van de Gibbs vergelijking. Een belangrijk onderdeel is de temperatuurverandering. Uit onderzoek is gebleken dat de ligging van het dissociatie-evenwicht van APDC (VI) een negatieve ∆H kent. Wat zoveel wil zeggen dat het evenwicht naar rechts verschoven wordt door het afkoelen van het systeem. De dissociatie van DDC wordt gestimuleerd door tempertuurstijging. Het effect van de verandering van temperatuur is duidelijk groter bij VI dan bij VII. Ook bij de complexaties blijkt de inbreng van deze factor miniem. Over het algemeen is de temperatuurwijziging verwaarloosbaar t.o.v. de invloeden van pH en aanwezige ionen.
2.3.3.2 Zuurtegraad Het complexeren van metalen met APDC en DDC gebeurt het best in alkalische omstandigheden. Over het algemeen wordt in lectuur [10][18] voor APDC een gebied van pH 7 tot 10 voorgesteld. Voor dit gebied gaat – uit ondervinding – APDC een witte vlok vormen en neerslaan. Die neerslag kan men terug in oplossing krijgen door de pH te laten stijgen. Door pH-stijging a.d.h.v. hydroxiden wordt het evenwicht in de gunstige zin verschoven.
2.3.3.3 Aanwezige ionen Daar het hier over chemische activiteiten gaat, is de invloed van de vele ionen enerzijds in de matrix en anderzijds in de buffer niet te verwaarlozen. De keuze van buffer en keuze van complexant zijn van elkaar afhankelijk. De keuze van een ammoniumbuffer en de dusdanige aanwezigheid van ammoniumionen, belemmeren de dissociatie van APDC.
23
3. De methode: principe 3.1 Algemeen principe Vanuit onderzoek, geleverd door Wouter D’Haene [22], is men vertrokken vanuit de volgende methode.
De methode bestaat uit de volgende hoofdstappen: - Destructie van yoghurt met de moffeloven bij 550 °C. - Vrije kobalt weer in oplossing brengen met geconcentreerd zoutzuur. - Neutraliseren tot alkalische pH>9. - Kobaltcomplex vormen met 1 m% APDC. - Extraheren in pure MIBK. - Meten bij 240,7 nm met grafietoven AAS.
3.2 Omrekening van vitamine B12-gehalte in yoghurt Als proefyoghurt is gekozen voor Danone Nutri Day Nature. Bij de eerste proeven wordt vooral gebruik gemaakt van volle yoghurt die volgens het etiket 0,25 µg vitamine B12 per 100 g yoghurt bevat. Latere proeven werden uitgevoerd met magere yoghurt die 0,32 µg vitamine B12 bevat per 100 g yoghurt.
Figuur 11: Etiket volle yoghurt
Figuur 12: Etiket magere yoghurt
24
In de meeste proeven wordt er gewerkt met 10,0 g yoghurt die later opgelost wordt in 5,00 ml MIBK.
Volle yoghurt: 0,25 µg vitamine B12 in 100 g = 0,025 µg in 10,0 g = 1,84.10-11 mol vitamine B12 M (vit B12) = 1355,38 g/mol Per mol B12 komt exact 1 mol Co vrij. 1,84.10-11 mol Co = 0,00109 µg Co in 10,0 g yoghurt = 0,109 µg/kg = 0,11 ppb Co M (Co) = 58,93 g/mol 10,0 g yoghurt opgelost in 5,00 ml MIBK komt overeen met 0,22 ppb Co
Magere yoghurt: 0,32 µg B12 / 100 g = 2,36.10-11 mol B12/Co = 0,00139 µg Co / 10,0 g = 0,139 ppb Co Opgelost in 5,00 ml MIBK: 0,28 ppb Co
3.3 Destructie Een goede destructie is noodzakelijk om de gebonden Co in de B12-molecule los te krijgen. In het werk van Wouter D’Haene is daar al heel wat werk en onderzoek naar geleverd en daaruit bleek dat de droge destructie met de moffeloven de beste resultaten opleverde. Mijn werk is dan ook vanuit dit standpunt vertrokken. Na de destructie worden de assen terug in oplossing gebracht met geconcentreerd zoutzuur, die de voorkeur krijgt op salpeterzuur wegens zijn lager Co-gehalte. Het is noodzakelijk dat de monsters eerst gedroogd worden.
Door de molecule aan een hoge temperatuur bloot te stellen te maken zullen stelselmatig alle covalente bindingen breken. Alle organische verbindingen worden afgebroken tot kleinere moleculen (zoals o.a. CO2) die het mengsel verlaten. Enkel de zouten waarbij het kookpunt hoger ligt dan de ingestelde temperatuur, blijven achter. Ongehydrateerde kobaltverbindingen zijn gekend voor hun hoge kooktemperatuur vb. CoCl2 bij 1049 °C, CoO bij 1785 °C. Kobalt zelf heeft een kooktemperatuur van 1495 °C.
25
3.4 Opconcentratie Zoals eerder vermeld is de concentratie aan kobalt in yoghurt uitermate klein. Ook de invloed van de yoghurtmatrix kan belemmerend werken. Vandaar dat er een keuze werd gemaakt om te werken met een extractie vanuit de waterige fase naar een apolaire fase. De complexatie van het vrijgestelde kobalt met APDC is heel selectief en is dus uitermate gewenst. Enkel met een aantal ander metalen (vnl. b-elementen) kan het een soortgelijk complex vormen. Vanaf een pH van 8 à 10 is de complexatie van metalen beperkt tot kobalt, koper en chroom, waarvan men de afwezigheid mag verwachten in yoghurt. Om de juiste zuurtegraad te bereiken wordt de oplossing eerst gebufferd tot een alkalische pH.
3.5 Meting Via GF-AAS wordt het gehalte aan kobalt gemeten bij een golflengte van 240,7 nm, een specifieke lijn voor Co. Er wordt gedroogd bij 120 °C omdat het kookpunt van methyl-isobutylketon 116 °C bedraagt. Uit onderzoek is gebleken dat verassen bij 1000 °C nog steeds een grote absorbantie toont. Atomiseren gebeurt bij 2200 °C. Als wasvloeistof wordt pure MIBK gebruikt. Het gebruik van matrixmodificatie is hier weinig zinvol. Preconcentreren in het oventje zelf na de verassingsfase heeft duidelijk hogere absorbanties en kleinere achtergrondsignalen. Hoe meer preconcentraties na elkaar gebeuren, hoe hoger de absorbanties, hoe kleiner de relatieve afwijking, hoe beter het rendement, maar ook hoe langer het duurt. Door de hoge affiniteit tussen plastics en MIBK is het aangeraden om na iedere meting de autosampler te spoelen om verlies aan product te vermijden [11]. Door het gekende geheugeneffect van grafiet is het ook gewenst om na ieder monster het oventje te reinigen door het even op te warmen bij 2600 °C en er een grote gasstroom (0,3 l/min) door te sturen.
26
4. Onderzoek en bevindingen
4.1 Destructie 4.1.1 Probleem Wanneer we een hoeveelheid yoghurt willen gaan opwarmen, gaan heel wat van de aanwezige proteïnen denatureren. Daarbij gaan deze in hun vaste toestand water vasthouden dat bij hogere temperatuur gaat verdampen. In het eiwit ontstaat een druk en het barst open. Daarbij kan het uit het kroesje spatten met verlies van product als gevolg. Het is dus noodzakelijk dat we het product drogen. Daarbij zijn twee methoden onderzocht: droogstoof en drogen met een bunsenvlam. Daarnaast is het gebruik van de moffeloven het deel van de methode dat de meeste tijd in beslag nam, vandaar dat onderzocht werd of destructie met de bunsenbrander niet sneller en efficiënter zou zijn. Ook de destructietemperatuur werd onderzocht.
4.1.2 Proefopzet
4.1.2.1 Drogen 10 gram yoghurt wordt op een matige vlam eerst gedroogd en daarna op een hevige vlam verkoold. In een ander kroesje wordt 10 gram yoghurt in de droogstoof bij 120 °C gebracht.
4.1.2.2 Droge destructie met bunsenbrander Tijdens de eerste proefdagen werd een hoeveelheid yoghurt zowel via de moffeloven als met een bunsenbrander gedestrueerd. Onder de trekkast wordt de yoghurt eerst gedroogd bij een matige vlam, vervolgens verkoold bij een hogere vlam en tenslotte verhit bij de warmste vlam tot alle zwarte kool is verdwenen en enkel witte as overblijft.
4.1.2.3 Moffeltemperatuur Nadat er gemerkt werd dat niet altijd alle yoghurt volledig gedestrueerd wordt bij 550 °C, werd de keuze gemaakt om de moffeltemperatuur op te hogen tot 750 °C.
27
4.1.3 Resultaten
4.1.3.1 Drogen Bij het drogen en verkolen met de bunsenvlam is het opgevallen dat de opwarming te vlug gebeurt, met spatten tot gevolg (zie 4.1.1 Probleem ) en dat de warmteverdeling niet steeds uniform is. Het werken met een bunsenvlam is wel sneller. Na één dag drogen in de droogstoof is de yoghurt al heel wat van zijn volume verloren, toch leek het nog niet voldoende droog om spatten in de moffeloven te vermijden. Na één week ziet de yoghurt er al bruin uit en klaar om gemoffeld te worden.
4.1.3.2 Droge destructie met bunsenbrander Tabel 2: Resultaten droge destructie met bunsenbrander
Product
Absorbantie
10 gram yoghurt gedestrueerd in moffeloven
0,0429
10 gram yoghurt gedestrueerd met
0,0239
bunsenbrander 10 g yoghurt gespiked met 87 ppb Co in
0,4696
moffeloven 10 g yoghurt gespiked met 87 ppb Co met
0,3517
bunsenbrander 10 g yoghurt gespiked met 2 ppm Co in
0,0862
moffeloven 10 g yoghurt gespiked met 2 ppm Co met
0,0382
bunsenbrander De meetomstandigheden : zie bijlage.
Aangezien de derde meting boven het meetbereik van het toestel ligt laten we deze even buiten beschouwing. De absorbanties van de met de bunsenbrander gedestrueerde yoghurt liggen gemiddeld op 53% van de absorbanties van de yoghurt gedestrueerd in een moffeloven.
4.1.3.3 Moffeltemperatuur Uit de proeven is gebleken dat we heel wat stabielere waarden bekomen bij 750 °C (zie tabel 10,11 & 12). De variatie op de absorbanties bij yoghurtstalen is heel wat kleiner.
28
4.1.4 Discussie
4.1.4.1 Drogen Bunsenbrandervlammen zijn niet steeds gemakkelijk te regelen, het is dan ook moeilijk om enerzijds zo weinig mogelijk roetvorming en anderzijds zo egaal mogelijke warmteverdeling te creëren. Door de geleidelijke en uniforme temperatuursstijging in de droogstoof kon de yoghurt drogen zonder product te verliezen via spatten. De bruine kleur verwijst naar de caramelisatie van de aanwezige suikers.
4.1.4.2 Droge destructie met bunsenbrander Uit de verminderde absorbantie onder dezelfde omstandigheden kan men enkel concluderen dat er ook minder vrije kobalt aanwezig is na droge destructie met de bunsenbrander. Een mogelijke verklaring is dat er niet voldoende warm kan gedestrueerd worden, waardoor niet alle vitamine B12 zijn kobalt heeft vrijgesteld.
4.1.4.3 Moffeltemperatuur Uit de stabielere resultaten kunnen we veronderstellen dat bij 750 °C alle vitamine B12 daadwerkelijk zijn kobalt vrijgegeven heeft.
4.1.5 Besluit De beste destructie komt dus voor wanneer men het product eerst droogt gedurende een aantal dagen in een droogstoof bij 120 °C. De eigenlijke destructie is optimaal bij 750 °C in een moffeloven.
4.2 Buffer 4.2.1 Probleem Heel wat tijd van de methode bij Wouter D’Haene [22] ging verloren in het aanpassen van de pH d.m.v. geconcentreerd HCl en geconcentreerd NaOH. Daarom wordt al vlug gekozen voor het gebruik van een alkalische buffer. Volgende buffers werden onderzocht: * HCO3-/CO32-
* NH4+/NH3
* HPO42-/PO43-
* borax/OH-
29
4.2.2 Proefopzet Yoghurtstalen worden gedestrueerd en na oplossing met 0,5 ml geconcentreerd zoutzuur gebufferd tot pH’s hoger dan 9. De monsters worden daarna gewoon opgeëxtraheerd en gemeten met de gekende methode. De benodigde hoeveelheid buffer wordt bepaald door voorafgaand onderzoek. 0,5 ml geconcentreerd HCl wordt gebufferd tot een alkalische pH van hoger dan 9 wordt verkregen. Bij de monsters worden diezelfde hoeveelheid buffer gebruikt. Naast yoghurtmonsters wordt ook het effect bepaald bij waterstalen, 0,2 ppb standaard en 1 ppb standaarden.
4.2.3 Resultaten
4.2.3.1 Carbonaatbuffer Bij het gebruik van de carbonaatbuffer worden bij de monsters een witte neerslagvorming en een gasontwikkeling waargenomen. Na toevoeging van de APDC-oplossing gaat een deel van de neerslag terug in oplossing. De buffer is opgesteld uit 30 g NaHCO3 en 70 g Na2CO3, opgelost en aangelengd tot 500 ml. De pH van deze buffer bedraagt 10,67. Door toevoeging van 8 ml is de aangezuurde heroplossing van de assen geneutraliseerd tot een pH > 9 .
4.2.3.2 Ammoniakbuffer 10 g ammoniumchloride en 100 ml geconcentreerde ammoniakoplossing hebben samen een pH van 10,23. Door de sterk bufferende werking is 5 ml al voldoende om de zure oplossing te bufferen tot pH > 9.
4.2.3.3 Fosfaatbuffer Ook hier heeft men een neerslagvorming waargenemen. Bij de eerste toepassingen werd zelfs een schijnbare gasontwikkeling waargenomen, maar het bleek al snel om het koken van de oplossing te gaan. De reactie tussen verzadigd trinatriumfosfaat en geconcentreerd zoutzuur blijkt heel exotherm te zijn. De buffer bestaat uit 15 g Na3PO4 / 100 ml opl. Dit is de meest verzadigde vorm met een pH van 12,4. Met 10 ml wordt de oplossing gebufferd.
30
4.2.3.4 Boraxbuffer 10 ml verzadigde boraxopl. (5 g / 100 ml) wordt aangevuld met 10 ml 0,5 M NaOH-opl. De pH van deze buffer bedraagt 12,8. Ondanks deze hoge pH heeft deze buffer onvoldoende bufferend vermogen om de HCl te neutraliseren. Er is 25 ml nodig.
4.2.3.5 Meetwaarden Tabel 3: Buffers
Absorbantie
Absorbantie
Absorbantie
0 ppb
0,2 ppb
1 ppb
standaard
standaard
standaard
Carbonaat
0,0452
0,0336
0,0820
0,0223
Fosfaat
0,0223
0,0283
0,0571
0,0175
Borax
0,0427
0,0303
0,0612
0,0207
Ammonium
0,0035
0,0040
0,0124
0,0037
Absorbantie yoghurtmonster
De meetomstandigheden : zie bijlage.
4.2.4 Discussie
4.2.4.1 Carbonaatbuffer Wanneer er na aanzuren gebufferd wordt met de carbonaatbuffer merken we enerzijds een neerslagvorming van o.a. CaCO3 en MgCO3. Anderzijds wordt CO2 gevormd. Op deze manier worden al enkele elementen uit de matrix gedeactiveerd. Toch merkt men dat bij toevoeging van APDC-oplossing, waarin ook hydroxiden aanwezig zijn, een deel van de neergeslagen ionen weer in oplossing gaan. Dit zou kunnen wijzigen op het complexeren van bepaalde metalen. Dinatriumcarbonaat en natriumwaterstofcarbonaat zijn relatief goed oplosbaar. Je kunt maximale concentraties maken van respectievelijk 300 g/l en 100 g/l [5]. Wat ervoor zorgt dat je kleinere hoeveelheden aan bufferoplossing nodig hebt. Met een pKa van 10,4 voor bicarbonaat is de ligging van het bufferevenwicht dan ook sterk aan de alkalische kant. De verkregen absorbanties zijn ook het hoogst bij het gebruik van deze buffer.
31
4.2.4.2 Ammoniakbuffer Al vlug wordt het gebruik van ammoniak als buffer geannuleerd wegens de opvallend kleine meetwaarden. De kleine absorbanties van de metingen bij het gebruik van een ammoniakbuffer zouden kunnen te wijten zijn aan de verschuiving van het APDC-dissociatie-evenwicht (VI). Door de overmaat aan aanwezige en gevormde ammoniumionen in de buffer wordt het dissociatieevenwicht aan de ongunstige kant beïnvloed waardoor onvoldoende vrij beschikbaar ligand aanwezig is voor complexatie. Toch gaat het hier over concentraties op ppb-niveau, wat deze mogelijkheid dan weer tegenspreekt. Met een oplosbaarheid van 297 g/l [5] is ammoniumchloride is goed oplosbaar en kunnen eveneens grote molariteiten worden bereikt.
Met
een pKa van 9,25 heeft
de ammonium/ammoniak-buffer alkalische
eigenschappen.
4.2.4.3 Fosfaatbuffer De
gebruikte
fosfaatbuffer
bestaat
uit
een
verzadigde
(15
g/l)
[17]
trinatriumfosfaatoplossing. Door een zodanig kleine oplosbaarheid is een groter volume aan buffervloeistof noodzakelijk. De gemeten absorbanties zijn bruikbaar, maar niet maximaal. Omdat we in de yoghurtmonsters kleine hoeveelheden kobalt en dus logischerwijs kleine absorbanties meten is dit een sterk bepalende factor. Fosfaat heeft een nog sterker alkalisch karakter: pKa = 12,67.
4.2.4.4 Boraxbuffer Ook hier zijn de absorbanties niet hoger dan die van de carbonaatbuffer. Hoewel we in eerste instantie hogere absorbanties kregen voor deze buffer bleken die later afkomstig van een contaminatie (waarden niet weergegeven). Met 51 g/l [17] is natriumtetraboraat ook niet echt goed oplosbaar waardoor ook voor deze buffer een groter volume nodig was om het zuur te neutraliseren.
32
4.2.5 Besluit Er wordt gekozen voor de carbonaatbuffer. De motivaties van deze keuze zijn: - kleine benodigde hoeveelheid aan buffer, - sterk bufferend vermogen, - door de aanwezige carbonaten slaan interfererende matrixionen zoals Ca2+ al neer, - hoogste absorbanties voor eenzelfde product; daar het hier al gaat over kleine hoeveelheden Co en absorbanties, weegt deze factor toch sterk door. De nadelen zijn: - kleine hoeveelheden kobalt aanwezig in de buffer.
4.3 Complexant 4.3.1 Probleem In heel wat lectuur wordt ammonium 1 – pyrrolidinedithiocarbamaat aangeraden als complexant [10] om metalen over te extraheren naar een apolaire fase, maar andere hebben het over natriumdiethyldithiocarbamaat [8] [12]. In dit onderzoek wordt het gebruik van DDC vergeleken met APDC. DDC zou ook al bij lagere pH’s een optimaal rendement behalen, waardoor de benodigde hoeveelheid aan buffer zou afnemen. Dit laatste is gewenst omdat in de carbonaatbuffer een minimale kobalthoeveelheid te detecteren valt. Bij lagere ionconcentratie zou het meetproces beter moeten verlopen, omdat er minder storende ionen aanwezig zijn.
4.3.2 Proefopzet Er worden extracties uitgevoerd op waterige standaardoplossingen.
33
4.3.3 Resultaten Tabel 4: Complexanten
Absorbanties met APDC
Absorbanties met DDC
geëxtraheerd
geëxtraheerd
0 ppb
0,0257
0,0136
0,5 ppb
0,0098
0,0038
1 ppb
0,0193
0,0044
2 ppb
0,0408
0,0090
De meetomstandigheden : zie bijlage.
Complexanten APDC
Absorbantie
0,05
DDC
0,04 APDC y = 0,0208x - 0,001 R2 = 0,9991
0,03 0,02 0,01 0 0
0,5
1
1,5
2
DDC y = 0,0036x + 0,0015 R2 = 0,949 2,5
Concentratie (ppb)
Figuur 13: Complexanten
4.3.4 Discussie Uit de resultaten kan men afleiden dat de complexatie met DDC niet echt goed meer werkt bij concentraties lager dan 1 ppb. Aan de lagere absorbantiewaarden te zien kunnen we besluiten dat er minder Co meegeëxtraheerd wordt. Gezien de hoeveelheid kobalt, aanwezig na destructie bij yoghurt, wordt voor verder onderzoek gekozen voor APDC. Ook hier is duidelijk dat watermetingen (= 0 ppb) abnormale waarden weergeven (zie 4.7 Blanco).
4.3.5 Besluit Blijkbaar heeft diethyldithiocarbamaat een minimale hoeveelheid van 1 ppb Co nodig om voldoende goed te kunnen complexeren. APDC kan meer kobalt overbrengen naar de MIBKfase.
34
4.4 Temperatuurscontrole 4.4.1 Probleem Na de eerste metingen worden steeds variabele absorbanties gemeten voor eenzelfde hoeveelheid aan kobaltoplossing. De oorzaak hiervan is het niet goed opgelost zijn van de verouderde en niet koel bewaarde APDC. Toch wordt voor alle zekerheid met een willekeurig monster onderzoek geleverd naar de optimale verassings- en atomisatie temperatuur. In het “cookbook” [18] worden volgende respectievelijke temperaturen vermeld: verassen bij 1100 °C en atomiseren bij 2100 °C.
4.4.2 Proefopzet In een eerste opzet wordt gekozen om de absorbanties i.f.v. de verassingstemperatuur te gaan uitzetten. De atomisatietemperatuur wordt daarbij bij 2400 °C ingesteld. In een tweede deel wordt de absorbantie i.f.v. de atomisatietemperatuur uitgezet. De verassingstemperatuur wordt bij 1000 °C ingesteld.
4.4.3 Resultaten
4.4.3.1 Waterig kobaltmengsel In eerste instantie worden de tests uitgevoerd bij waterige kobaltoplossingen. Tabel 5: Waterige kobaltoplossing, verassingstemperatuur
Verassingstemperatuur (°C)
Absorbantie
200
0,0719
400
0,0768
600
0,0765
800
0,0786
1000
0,0792
1200
0,0821
1400
0,0584
1600
0,0060
De meetomstandigheden : zie bijlage.
35
Tabel 6: Waterige kobaltoplossing, atomisatietemperatuur
Atomisatietemperatuur (°C)
Absorbantie
2600
0,0792
2400
0,0792
2200
0,0817
2000
0,0782
1800
0,0644
1600
0,0270
De meetomstandigheden : zie bijlage.
4.4.3.2 Apolair kobaltmengsel In de daaropvolgende fase wordt een even geconcentreerd apolair mengsel na extractie met MIBK, eveneens gemeten. Tabel 7: Apolaire kobaltoplossing, verassingstemperatuur
Verassingstemperatuur (°C)
Absorbantie
200
0,0483
400
0,0513
600
0,0452
800
0,0438
1000
0,0411
1200
0,0438
1400
0,0359
1600
0,0073
De meetomstandigheden : zie bijlage.
Tabel 8: Apolaire kobaltoplossing, atomisatietemperatuur
Atomisatietemperatuur (°C)
Absorbantie
2600
0,0408
2400
0,0411
2200
0,0410
2000
0,0398
1800
0,0247
1600
0,0075
De meetomstandigheden : zie bijlage.
36
4.4.3.3 Grafiek
Absorbantie
Verassing en atomisatie 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
verassing waterig atomisatie waterig verassing apolair atomisatie apolair
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Temperatuur (°C)
Figuur 14: Verassings- en atomisatietemperaturen
4.4.4 Discussie Er is een min of meer stabiel gebied in de verassingscurves tot ongeveer 1100 °C. Daarna gaan de gemeten absorbanties gestaag omlaag. Die daling is te wijten aan het verlies van kobalt door verdamping. Omdat de meting pas gebeurt na de atomisatie wordt zo een deel kobalt niet meegemeten. Men dient dus te kiezen voor een temperatuur die zo hoog mogelijk is, om andere matrixelementen te verliezen, maar die eveneens niet te hoog is om geen kobalt te verliezen. 1000 °C lijkt optimaal. Bij de atomisaties merkt men pas een plateau vanaf 2000 °C. Daarvoor is blijkbaar de atomisatietemperatuur nog niet hoog genoeg om alle kobalt in atomaire vorm te krijgen. Het is dus aangeraden om de atomisatietemperatuur wat op te schuiven tot 2200 °C.
Het is ook duidelijk dat de in-MIBK-opgeconcentreerde monsters over een lagere absorbantie beschikken dan overeenkomstige waterige oplossingen. Dit wijst op een onvolledige overgang van polaire naar apolaire fase. Aan de absorbanties te zien zou er kunnen afgeleid worden dat slechts de helft effectief overgaat.
37
4.4.5 Besluit Er wordt gekozen om de verassingstemperatuur bij 1000 °C in te stellen en de atomisatietemperatuur bij 2200 °C zo is men zeker dat variabele absorbanties niet te wijten zijn aan verlies tijdens de verassing of onvolledige atomisatie. Er wordt ook gekozen om het drogen in te stellen bij 120 °C.
4.5 Opconcentratie 4.5.1 Probleem Na enig onderzoek blijkt het haalbaar om een min of meer stabiele recovery terug te vinden. Toch zijn de daarbij verkregen absorbanties nog heel laag (ca. 0,0100 Abs en sd 0,0030) en de standaarddeviaties veel te hoog. Het is dan ook heel zinvol te zoeken naar methoden om hogere absorbanties te verkrijgen. De standaarddeviaties kleiner maken lijkt heel moeilijk, maar als de meetwaarde groter kan worden is de relatieve fout kleiner. Er wordt meestal gemeten met een preconcentratie in het oventje waarbij 2 keer 20 µl werd geïnjecteerd. Er is dus nog ruimte om nog meer te preconcentreren of om grotere volumes te injecteren (toestel kan tot maximaal 70 µl). Er werd ook onderzocht of de opconcentratie a.d.h.v. de extractie nog meer mogelijkheden had nl. 20 g yoghurt i.p.v. 10 g, en kleinere volumes aan MIBK.
4.5.2 Proefopzet
4.5.2.1 Opconcentratie door volumeverandering Een eerste proefopzet bestudeerde de aanpak van de extractie. Volgende combinaties zijn uitgeprobeerd. Tabel 9: Preconcentratie bij de extractie
Verwachte concentratie1
Volume monster (g)
Volume MIBK (ml)
10
5
0,2
10
2
0,5
20
10
0,2
20
5
0,4
20
2
1
1
in MIBK (ppb)
Alle verwachte concentraties en onrechtstreeks dus ook de recovery berekeningen zijn gebaseerd op de omgerekende waarde die vermeld staan op het etiket (zie 3.2 Omrekening van vitamine B12-gehalte in yoghurt).
38
Door verschillende porties van 10 g gemoffelde yoghurt in de scheitrechter samen te extraheren in 5 ml MIBK zorgt men ook voor een opconcentratie.
4.5.2.2 Preconcentratie in oven Bij de preconcentraties in het grafietoventje zijn volgende onderzoeken gebeurd: - het effect van herhaaldelijke preconcentraties per 20 µl (1 x 20 µl, 2 x 20 µl, …) - het effect van herhaaldelijke preconcentraties per 40 µl (1 x 40 µl, 2 x 40 µl) Hier werd naast de verkregen absorbanties, ook de recovery en de fout (standaarddeviatie) vergeleken. Elk
van
die
aspecten
werd
in
afzonderlijke
proeven
bestudeerd,
waardoor
de
absorbantiewaarden tussen de verschillende proeven afwijken. Hierdoor gaat kostbare informatie verloren, maar dit is te wijten aan enerzijds de langere analysetijd bij de verschillende injecties voor één meting en anderzijds aan het duidelijke effect dat de absorbantie in de loop van de tijd daalt voor eenzelfde monster (zie 4.9.4 Verlaging van signaal).
4.5.3 Resultaten
4.5.3.1 Opconcentratie door volumeverandering Tabel 10: Opconcentratie door volumeverandering bij 550 °C
Aantal gram yoghurt in volume MIBK geëxtraheerd
Verwachte concentratie (ppb)
Berekende Gemeten
concentratie
Recovery3
absorbantie
op basis van
(%)
2
ijklijn (ppb)
10 g in 5 ml
0,2
0,0153
0,385
192
10 g in 1 ml
1,0
0,0544
1,692
169
20 g in 5 ml
0,4
0,0105
0,224
56
20 g in 2 ml
1,0
0,2573
8,478
848
20 g in 1 ml
2,0
0,0104
0,221
11
De meetomstandigheden : zie bijlage.
2 3
Bepaald in vergelijkbare omstandigheden : y = 0,0299x + 0,0038 Recovery = berekende concentratie/verwachte concentratie
39
Tabel 11: Opconcentratie door volumeverandering bij 750 °C
Aantal gram yoghurt in volume MIBK geëxtraheerd 10 g volle yoghurt in 2 ml 20 g volle yoghurt in 4 ml 20 g volle yoghurt in 2 ml
Verwachte concentratie (ppb)
Berekende Gemeten
concentratie
absorbantie
op basis van
Recovery (%)
ijklijn (ppb)
0,5
0,0463
1,421
284
0,5
0,0483
1,488
298
1,0
0,0248
0,702
70
2,0
0,0884
2,829
141
0,4
0,0191
0,512
128
0,4
0,0098
0,201
50
0,7
0,0092
0,181
26
0,7
0,0095
0,191
27
0,7
0,0104
0,221
32
0,7
0,0109
0,237
34
20 g volle yoghurt in 1 ml 20 g volle yoghurt in 5 ml 20 g volle yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml
De meetomstandigheden : zie bijlage.
40
Tabel 12: Opconcentratie door volumeverandering bij 900 °C
Aantal gram yoghurt in volume MIBK geëxtraheerd 20 g magere yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml 20 g magere yoghurt in 5 ml
Verwachte concentratie (ppb)
Berekende Gemeten
concentratie
absorbantie
op basis van
Recovery (%)
ijklijn (ppb)
0,7
0,0086
0,160
23
0,7
0,0056
0,061
9
0,7
0,1050
3,39
484
0,7
0,0199
0,538
77
0,7
0,0063
0,084
12
0,7
0,0071
0,110
16
0,7
0,0965
3,100
443
0,7
0,0195
0,525
75
2 keer 10 g magere yoghurt in 5 ml 2 keer 10 g magere yoghurt in 5 ml 2 keer 10 g magere yoghurt in 5 ml 2 keer 10 g magere yoghurt in 5 ml De meetomstandigheden : zie bijlage.
Eerst en vooral is het opgevallen dat de monsters met 20 g yoghurt bij 550 °C nog niet volledig gedestrueerd zijn in tegenstelling tot de monsters waarbij 10 g yoghurt wordt gebruikt. Alleen al aan de kleur van de assen was een verschil waarneembaar.
41
Dit resulteert in heel wisselende resultaten voor zelfde monsterhoeveelheden:
- Bij 550 °C worden o.a. hogere absorbanties gemeten voor lagere concentraties. Recovery’s lopen van 11 tot 848 %. - Bij 750 °C worden wel constante recovery’s gemeten bij yoghurtmonster bestaande uit 20 g magere yoghurt. De grootte van de recovery’s is wel nog niet de gewenste grootteorde nl. 30%. - Wanneer men dergelijk experiment bij 900°C uitvoert, merken we dan weer wisselende recovery’s gaande van 9 % tot 484 %. - Door verschillende porties van 10 g gemoffelde yoghurt samen te extraheren merken we weinig verbetering. De uitgevoerde experimenten hierop geven geen duidelijke evenredige stijging.
4.5.3.2 Preconcentratie in oven ABSORBANTIES, CONCENTRATIES & RECOVERY Tabel 13: Meervoudige injectie
Berekende Aantal
Verwachte
preconcentraties
concentratie
van 20 µl
(ppb)
concentratie Absorbantie
op basis van
Recovery (%)
een ijklijn4 (ppb)
1
0,28
0,0039
0,0494
18
2
0,56
0,0099
0,1906
34
3
0,70
0,0148
0,3059
36
4
1,12
0,0201
0,4306
38
5
1,40
0,0244
0,5318
38
6
1,68
0,0305
0,6753
40
De meetomstandigheden : zie bijlage.
De stijging van de injecties brengt een lineaire stijging van de gemeten concentratie met zich mee. Hierdoor kunnen de resultaten geëxtrapoleerd worden.
4
Bepaald in vergelijkbare omstandigheden: y = 0,0425x + 0,0018
42
Preconcentratie 0,035
Absorbantie
0,03 0,025 y = 0,0052x - 0,0009 R2 = 0,9981
0,02 0,015 0,01 0,005 0 0
1
2
3
4
5
6
7
Aantal injecties van 20 µl
Figuur 15: Preconcentratie
Wanneer deze resultaten en de geëxtrapoleerde resultaten in een grafiek uitgezet worden ten opzichte van de recovery, merkt men een kenmerkende lijn.
Recovery ifv aantal injecties 45% 40%
Recovery
35% 30% 25% 20% 15% Injecties van 20 µl
10%
Injecties van 40 µl
5% 0% 0
2
4
6
8
10
Aantal injecties
Figuur 16: Recovery ifv het aantal injecties
43
12
14
Wanneer men dergelijke experiment uitvoert met injecties per 40 µl, is men bij de eerste injectie (1 keer 40 µl) al in het plateaugedeelte. De overeenkomstige recovery ligt net wat lager dan die van de 20 µl-injecties (37 % i.p.v. 42 %). ABSORBANTIE & STANDAARDDEVIATIE Deze waarden worden iedere keer bepaald bij 2 verschillende monsters van 10 g magere yoghurt die telkens 3 keer worden gemeten. Standaarddeviaties worden berekend door volgende formule :
n
s=
∑ (x i =1
i
− x) 2 (X)
n −1
Tabel 14: Standaarddeviaties bij verschillende injecties
Aantal injecties
Verwachte concentratie (ppb)
Gemiddelde absorbantie
Standaarddeviatie
Procentuele fout5 (%)
1 keer 40 µl
0,56
0,0459
0,0080
17
2 keer 40 µl
1,12
0,0748
0,0071
9
2 keer 20 µl
0,56
0,0498
0,0117
24
4 keer 20 µl
1,12
0,0780
0,0047
6
De meetomstandigheden : zie bijlage.
VERANDERING VAN DETECTIELIMIET In een andere proefopzet wordt de verandering van de detectielimiet gecontroleerd. Een monster wordt een aantal keer geïnjecteerd. Iedere meting is een gemiddelde van drie metingen. De gegeven standaarddeviatie is een maat voor de spreiding van die gegevens. Ter verduidelijking wordt telkens het 95% betrouwbaarheidsinterval weergegeven. Tussen deze twee waarden is er 95% kans de meetwaarde te vinden. Hoe kleiner dit interval, hoe nauwkeuriger de methode. Hier wordt deze vereenvoudigd tot 3 keer de standaarddeviatie.
5
Procentuele fout = standaarddeviatie/gemiddelde absorbantie . 100%
44
Tabel 15: Verandering van detectielimiet Aantal
Standaard-
Procentuele
Recovery
95%
95%
injecties
deviatie
fout (%)
(%)
1 keer 20 µl
0,0018
18,6
66
21
112
2 keer 20 µl
0,0043
18,0
93
39
147
3 keer 20 µl
0,0018
4,7
101
86
117
4 keer 20 µl
0,0037
7,1
105
82
129
1 keer 40 µl
0,0019
26,0
23
-1
47
2 keer 40 µl
0,0029
18,4
29
11
48
3 keer 40 µl
0,0018
6,1
38
31
46
Ondergrens Bovengrens
De meetomstandigheden : zie bijlage.
Foutmarge 160% 140% Recovery
120% 100%
Recovery
80%
95% Ondergrens
60%
95% Bovengrens
40% 20% 0% 0
1
2
3
4
5
Aantal injecties van 20µl
Figuur 17: Foutmarge bij verschillende injecties van 20 µl
Voeren we het experiment met injecties van 40 µl uit, dan wordt eenzelfde verkleining van de relatieve fout waargenomen (zie tabel 15).
INJECTIEVOLUME Absorbanties van even grote geïnjecteerde hoeveelheden (vb. 2 keer 20 µl en 1 keer 40 µl) komen goed overeen (zie tabel 14).
45
MATRIX Het achtergrondsignaal afkomstig van de matrix bereikt, bij alle metingen waar telkens 20 µl wordt geïnjecteerd, een maximale waarde van ongeveer 0,0030. Dit is onafhankelijk van het aantal injecties. Bij 40 µl merken we echter twee opvallende gebeurtenissen. Enerzijds zien we een steeds terugkerende variatie in het achtergrondsignaal (zie figuur 18). Daarbij worden absorbanties gemeten die tot 0,0200 hoog gaan.
Figuur 18: Achtergrondsignaal
Anderzijds merken we bij injecties van 40 µl het ontstaan van stofwolken en vlammen tijdens de meetfase. Dit fenomeen wordt uitgebreider besproken in 4.9.3 Ontstaan van vlammen en stofwolken.
4.5.4 Discussie
4.5.4.1 Opconcentratie door volumeverandering Bij het gebruik van lage volumes aan MIBK, is er een praktische beperking. Na de extractie moet men ten minste 2 ml kunnen overbrengen in het cuvetje. Methodefouten worden op kleine volumes, relatief gezien, groter. Bij grotere massa’s aan monster merken we een niet-uniforme destructie, waardoor wisselende resultaten het gevolg zijn.
46
4.5.4.2 Preconcentratie in grafietoven ABSORBANTIES, CONCENTRATIES & RECOVERY Hoewel het heel logisch is dat met evenredige injecties de absorbanties evenredig stijgen, moet men ook rekening houden met het feit dat er meer matrix in de grafietoven wordt gebracht. Bij grote volumes zorgt dat voor problemen. Die lineariteit van de absorbantie is een handig gegeven om verdere extrapolaties te maken, waarbij men kan vaststellen dat de recoverywaarden stijgen en blijkbaar een soort asymptotisch effect vertonen naar circa 42%. Een maximale recovery is dus te voorspellen, zonder dat men daar veel metingen moet voor doen. Uit diezelfde grafiek kan worden afgeleid dat er na 2 tot 3 preconcentraties waarden bekomen worden die quasi niet veel meer zullen stijgen bij volgende opconcentraties. Een nadeel van vele verschillende injecties is de benodigde tijd. Een meting van 4 injecties duurt ongeveer 10 minuten. Terwijl een meting van één injectie 3,5 minuten duurt.
ABSORBANTIES & STANDAARDDEVIATIE Bij de verschillende proeven wordt duidelijk opgemerkt dat de standaardafwijkingen op zich weinig wijzigen, maar ten opzichte van de verhoogde absorbantiewaarden zorgt dit ervoor dat de relatieve fout verkleint. Vandaar dat het onderzoek naar het behalen van de detectielimiet met deze methode, zijn vervolg moet zoeken in het verkrijgen van hogere absorbanties.
VERANDERING VAN DETECTIELIMIET Zoals hierboven vermeld is de foutmarge bij de recovery steeds kleiner naarmate er meerdere
injecties
gebeuren.
Daar
voor
de
detectielimiet
typisch
drie
keer
de
standaardafwijking wordt genomen, blijft die limiet voor deze methode dus min of meer even groot, maar de meetwaarden worden wel groter waardoor we in detecteerbaar gebied zitten.
INJECTIEVOLUME Het is logisch dat we bij evenredige hoeveelheden, ongeacht de wijze van injectie, dezelfde absorbantiewaarden krijgen.
47
MATRIX Bij kleinere injectiehoeveelheden gebeurt de verdamping voldoende aangepast zodanig dat een minimale hoeveelheid aan restproduct achterblijft. Grotere injectiehoeveelheden laten meer opgeloste zouten achter, die bij de atomisatiefase ook worden geatomiseerd die en voor meer storende effecten zorgen. Een aangepaste droogfase (eventueel kleinere temperatuursstijging) zou misschien een oplossing zijn.
4.5.5 Besluit Opconcentreren in het oventje zorgt ervoor dat onze metingen in detecteerbaar gebied komen. Meerdere injecties bieden volgende voordelen: - hogere absorbanties die lineair stijgen met het aantal injecties; - kleinere relatieve fouten, kleinere standaardafwijkingen; - voorspelbare maximale recovery’s. De nadelen zijn: - meerdere injecties verlengen de analysetijd van een monster, - bij injecties van 40 µl of meer treden storende matrixeffecten op. Opconcentratie door monstervolume of solventvolumeveranderingen leveren weinig zinvolle verbetering.
4.6 Matrixmodifier
4.6.1 Probleem Hoewel bij de extractie met MIBK slechts weinig matrixelementen kunnen meegekomen zijn, werd toch onderzocht of matrixmodificatie zinvol was. Het achtergrondsignaal is meestal nogal beperkt maar er kunnen kleine piekjes met een maximale absorbantie van 0,0030 voorkomen. Gezien de lage absorbanties zou een egalisatie van het achtergrondsignaal betekenisvol zijn.
4.6.2 Proefopzet Verschillende gespikete monsters worden enerzijds met matrixmodificatie (20 µl Mg(NO3)2) [18] en anderszijds zonder matrixmodificatie gemeten en vergeleken. Wegens het feit dat de waterige magniumdinitraatoplossing onoplosbaar is in MIBK wordt niet gekozen voor de zogenaamde natte injectie. De ‘dry first’-methode leek het meest aangeraden.
48
4.6.3 Resultaten Tabel 16: Matrixmodificatie
Absorbantie zonder
Absorbantie met
matrixmodificatie
matrixmodificatie
Monster 1
0,0055
0,0052
Monster 2
0,0060
0,0059
Monster 3
0,0062
0,0058
Monster 4
0,0063
0,0059
Monster 5
0,0083
0,0077
Monster 6
0,0085
0,0070
Monster 7
0,0157
0,0132
Monster 8
0,0691
0,0565
De meetomstandigheden : zie bijlage.
4.6.4 Discussie Zowel de absorbanties van de metingen en het achtergrondsignaal, alsook de recovery’s blijken weinig te variëren met of zonder het gebruik van matrixmodificatie.
4.6.5 Besluit Matrixmodificatie is niet nodig.
4.7 Blanco 4.7.1 Probleem Het is noodzakelijk dat zowel onze standaardijklijn, als onze monsters over een goede blanco beschikken om in te zien welk aandeel van de absorbantie afkomstig is van matrixeffecten. In theorie zou de blanco van de standaardreeks uit geëxtraheerd bigedestilleerd water of een leeg kroesje moeten bestaan. Deze zouden we dan moeten behandelen als de andere standaarden. Bij de sample blank zouden we moeten kunnen beschikken over vitaminevrije yoghurt. Dit is natuurlijk niet voor handen. Bij beide situaties zouden er in principe geen elementen kunnen of mogen overgaan in MIBK-fase en zou de blanco de absorbantie van puur MIBK moeten benaderen. Er is onderzoek gevoerd naar de waarde van lege kroesjes en bigedestilleerd water die op dezelfde manier behandeld zijn geweest of puur MIBK als blanco.
49
4.7.2 Proefopzet De onderzochte blanco’s bestaan uit: 1. Leeg kroesje 2. Leeg glazen bekertje 3. 5 ml bigedestilleerd water 4. 5 ml HPLC water 5. 25 ml bigedestilleerd water Deze worden telkens behandeld met 0,5 ml HCl, 8 ml carbonaatbuffer, 2 ml APDC en opgeconcentreerd in 5,0 ml MIBK. Ze worden onder zelfde omstandigheden (40 µl geïnjecteerd met de gebruikelijke ovenomstandigheden) gemeten.
4.7.3 Resultaten Ter informatie zijn de waardenvan puur MIBK en van een yoghurtmonster aan de kolom toegevoegd. Tabel 17: Blanco's
Absorbantie Leeg kroesje
0,0229
Leeg glazen bekertje
0,0332
5 ml bigedestilleerd water
0,0320
5 ml HPLC water
0,0209
25 ml bigedestilleerd water
0,0491
MIBK
0,0028
Yoghurtstaal
0,0079
De meetomstandigheden : zie bijlage.
We hebben vastgesteld dat bij het toevoegen van buffer aan het aangezuurde water bij meting 3,4 en 5 weinig tot geen CO2-vorming te zien was.
50
4.7.4 Discussie Het valt eerst en vooral op dat alle blanco’s absorbanties vertonen die beduidend hoger liggen dan die van pure MIBK en die van yoghurtstalen. Dit wil zeggen dat er in de reagentia (zoutzuur, carbonaatbuffer, APDC-opl.) een bepaalde hoeveelheid Co aanwezig is. Aangezien we bij de meting van het yoghurtstaal evenveel van deze reagentia toevoegen, zouden we bij die meting eveneens een even grote absorbantie moeten terugvinden, wat niet het geval is. Daarnaast is het ook opgevallen dat, hoe meer water je gebruikt, hoe hoger de absorbantie is, wat betekent dat er in bigedestilleerd water nog kobalt aanwezig zou zijn. Het lijkt heel onwaarschijnlijk maar om ook deze factor uit te schakelen wordt getest met een zeer zuiver HPLC-water. En ook hier meet men absorbanties in dezelfde grootteorde. Verder ziet men dat contaminatie via glaswerk zeker niet uit te schakelen is. Het is dan ook aangeraden om voor iedere meting alle glas- en porseleinwerk te reinigen met warm geconcentreerd zoutzuur. Misschien gaat, bij metingen 3,4 en 5, CO2 oplossen in het water en geeft dit een storend signaal. Even opwarmen zou hier een oplossing kunnen zijn.
4.7.5 Besluit Blanco’s geven een hoger signaal dan puur MIBK en yoghurt. De oorzaak van dit gegeven is niet gekend. Om contaminatie te voorkomen moet steeds alle glas- en porseleinwerk gereinigd worden met warm geconcentreerd zoutzuur.
4.8 Standaard ijklijn 4.8.1 Probleem Bij het bepalen van de concentratie aan kobalt in de oplossing is een goede referentie en ijklijn nodig. Uit tijdsoverweging wordt meestal gewerkt met een masterstandaard waaruit het toestel zelf ingestelde hoeveelheden injecteert en zo automatisch een calibratielijn opstelt. Bij het opstellen van een dergelijke ijklijn kan ingesteld worden of men kiest voor een variabel volume (verschillende hoeveelheden masterstandaard worden geïnjecteerd) of een fixed volume (verschillende hoeveelheden aan standaard worden geïnjecteerd en aangevuld met een diluent). Toch wordt vergeleken of deze automatisch opgestelde lijnen min of meer overeen komen met een zelf opgestelde calibratielijn vanuit zelf verdunde stalen.
51
4.8.2 Proefopzet Drie ijklijnen worden uitgezet: 1. Variabel volume vanuit master 1 ppb. 2. Fixed volume vanuit master 1 ppb met als diluent de blancometing. 3. Zelfverdunde oplossingen.
Zowel masters als zelfverdunde oplossingen worden als volgt gemaakt: Vb. 1 ppb master: 5,0 ml 1 ppb waterige kobaltoplossing wordt in een kroesje gedroogd in de droogstoof. Daarna wordt het in oplossing gebracht met 0,5 ml HCl, gebufferd met 8 ml carbonaatbuffer en wordt er 2 ml APDC-opl. aan toegevoegd. In een scheitrechter brengen we het samen met 5,0 ml MIBK, schudden we het geheel en de apolaire fase wordt in een cuvetje gebracht. Als blancowaarde wordt voor meting 1 MIBK genomen, voor meting 2 een leeg kroesje en voor meting 3 wordt gekozen om geen blanco te gebruiken (zie 4.7 Blanco). Om de zelfgemaakte ijklijn zoveel mogelijk met de monsters te laten overeenkomen wordt ook daar gekozen voor het gebruik van de preconcentratie in de oven (2 keer 20 µl injecteren), terwijl de automatische ijklijnen steeds maar met één injectie (dus 40 µl) werken. Daarnaast wordt het effect van meegemoffelde standaarden en gedroogde standaarden bekeken.
4.8.3 Resultaten Tabel 18: IJklijnen automatisch of zelfgemaakt
Absorbantie
Absorbantie
Absorbantie
Variabel Volume
Fixed Volume
0 ppb
0,0029
0,0225
0,1 ppb
0,0040
0,0246
0,0071
0,2 ppb
0,0050
0,0258
0,0089
0,5 ppb
0,0114
0,0230
0,0234
1 ppb
0,0259
0,0236
Verdunning
De meetomstandigheden : zie bijlage.
52
Zelfgemaakte verdunning
Ijklijnen
Absorbantie
0,05 Variabel volume
0,04
Fixed volume
0,03
Zelfgemaakte verd.
0,02
Variabel volume y = 0,0234x + 0,0014 R2 = 0,9793
0,01 0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Concentratie (ppb)
Zelfgemaakte verd. y = 0,0425x + 0,0018 R2 = 0,9801
Figuur 19: IJklijnen automatisch of zelfgemaakt Tabel 19: IJklijnen gemoffeld of gedroogd
Concentratie (ppb)
Absorbantie gedroogde
Absorbantie gemoffelde
standaarden
standaarden
0,1
0,0277
0,2
0,0413
0,0202
0,4
0,0628
0,0269
0,6
0,0908
0,0300
1
0,0342
De meetomstandigheden : zie bijlage.
Absorbantie
Ijklijn, gemoffeld of gedroogd 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
Gedroogde standaarden Gemoffelde standaarden Gedroogde standaarden y = 0,124x + 0,0154 R2 = 0,9969
0
0,5
1
1,5
Concentratie (ppb) Figuur 20: IJklijnen gemoffeld of gedroogd
53
Gemoffelde standaarden y = 0,0165x + 0,0187 R2 = 0,9162
4.8.4 Discussie Uit de grafiek valt duidelijk af te leiden dat de waarden, verkregen door het gebruik van een fixed volume, weinig zinvol zijn. Uiteraard is de ijkrechte overeenkomstig met de zelfgemaakte verdunningen de beste. Ze is ook het meest betrouwbaar omdat de gemaakte fouten tijdens de behandeling van ieder monster dezelfde zijn. De invloed van matrixfactoren worden bij variabele volumes eveneens in evenredig verband minder groot vandaar dat deze rechte een iets kleinere richtingscoëfficiënt heeft. Ook het feit dat de verdunde standaarden op eenzelfde wijze opgeconcentreerd kunnen worden in de oven pleit in het voordeel. Ondanks het feit dat er bij de verdunde stalen geen gebruik gemaakt is van een blanco merkt men dat de overeenkomstige nulwaarde van de rechte goed overeenkomt met de meetwaarden van puur MIBK. Verder onderzoek zou moeten meer uitsluitsel geven over het opvallende verschijnsel dat de waarden van 2 keer 20 µl verdunde stalen quasi dubbel zo groot zijn in vergelijking met de absorbanties van de overeenkomstige variabel volumes. In sommige andere metingen is opgevallen dat een kwadratische ijklijn betere correlaties geeft. Ook hier kan nog verder onderzoek naar gedaan worden. Voor de validatie (zie 6 Validatie) wordt gebruik gemaakt van de ijklijn opgesteld uit de zelfgemaakte verdunningen.
Bij het onderzoek naar het effect van het moffelen is nogmaals duidelijk geworden dat de absorbanties van even grote hoeveelheden kobalt duidelijk lager liggen. Wat enerzijds wijst op verlies van product door het moffelen. Hier kan eventueel eens onderzoek gedaan worden naar het gebruik van een matrixmodificatie bij de destructie of een optimalisatie van de moffeltemperatuur.
4.8.5 Besluit De ijklijn opgesteld vanuit zelfgemaakte verdunningen lijken het meest betrouwbaar. De identieke behandeling van de waterige kobaltoplossingen, zoals de monsters, is essentieel. Toch moet men bij het moffelen rekening houden met een verliespercentage.
54
4.9 Andere opmerkingen 4.9.1 Geheugeneffect door oventje [18] Door de vele firings en de hoge werkingstemperaturen is het opgevallen dat de coating het relatief vlug begeeft. Daardoor komt het meer poreuze grafiet aan de oppervlakte waardoor steeds meer kobalt in het cuvetje achterblijft. Dit zorgt voor een geheugeneffect. Het is sterk aangeraden tussen alle monstermetingen een “clean cuvet” – fase in te brengen.
4.9.2 Oppervlaktespanning van MIBK [14] In lectuur valt te lezen dat MIBK een grote aantrekking kent ten opzichte van het plastic waaruit de samplerleidingen zijn opgebouwd. Naast een “clean cuvet” is het dus ook aangeraden om een “autosampler wash” – fase na iedere monstermeting uit te voeren. Dit om te vermijden dat monster achterblijft en opstapelt in de automatische sampler.
4.9.3 Ontstaan van vlammen en stofwolken In voorgaande onderdelen is al aangehaald dat bij bepaalde metingen, zeker wanneer er grotere hoeveelheden MIBK worden geïnjecteerd, soms storende stofwolken ontstaan die zelfs kunnen ontvlammen.
Dit resulteert in volgend signaal:
Figuur 21: Signaal bij een vlam
Een verklaring voor dit fenomeen zou kunnen in de zelfontbrandingstemperatuur liggen. MIBK begint in zuurstofrijk midden van zelf te ontbranden vanaf 460 °C [17].
55
Het ontstaan van de vlammen gebeurt net in de meetfase waar de argonstroom wordt stilgelegd en de oven wordt opgewarmd tot 2200 °C. In de veronderstelling dat het opwarmen van de grafietoven net iets later gebeurt dan het afleggen van de argonstroom, kan er luchtzuurstof in het oventje binnendringen. Op het etiket staat vermeld dat de MIBK een verdampingsresidu van 0,0200 % kent, wat de aanwezigheid van stofdeeltjes zou kunnen verklaren. Wanneer die dan opgestuwd worden door de gasstroom gaan die ontbranden.
4.9.4 Verlaging van signaal In functie van de tijd is gemerkt dat voor eenzelfde concentratie aan kobalt, die met eenzelfde methode is vrijgemaakt en opgeëxtraheerd verschillende meetwaarden zijn gedetecteerd. Dit zou kunnen verklaard worden door enerzijds een adsorptie aan het cuvet en anderzijds de stabiliteit van de oven.
4.9.4.1 Adsorptie aan cuvet Zelfs wanneer men eenzelfde mengsel in het plastieken cuvetje een aantal uur laat staan en opnieuw meet merkt men al een verschil die kan tellen. Een monster heeft een absorbantie van 0,0541. Wanneer datzelfde monster onaangeroerd na 2,5 uur opnieuw wordt gemeten verkrijgt men een absorbantie van 0,0472. Gewoon door te laten staan is de absorbantie met 13 % gezakt. Dat bewijst dat metingen direct dienen te gebeuren. Wanneer verschillende cuvetjes in de autosampler worden geplaatst zullen de laatste metingen dus niet overeenkomen met de eerste metingen, wat natuurlijk met zich meebrengt dat ook hier dus een fout optreedt. In de software bestaat de mogelijkheid om op regelmatige momenten een referentiemeting te doen om dit te verhelpen. Ook het gebruik van een inwendige standaard is niet gecontroleerd. Wanneer stalen in afwachting worden bewaard in glazen flesjes kan er eveneens een adsorptie met de wand gebeuren. Er ontstaan aantrekkingen tussen de meer polaire groepen aan het plastiek of het glas met het kobaltcomplex. Waardoor de adsorptie naar verloop van tijd een feit is. Metingen gebeuren dus best zo snel mogelijk na de extractie.
56
4.9.4.2 Andere redenen Reeds eerder vernoemde fenomenen kunnen eveneens de reden waarom bepaalde metingen zo verschillend kunnen zijn: - geheugeneffect - oppervlaktespanning van MIBK - poreusiteit grafiet
4.10 Mogelijk vervolgonderzoek
4.10.1 Blanco Zoals vermeld is het onderzoek naar goede blancowaarden niet zo evident. Om de systematische fout afhankelijk van de methode te elimineren, is het onderzoek naar een goede blancometing belangrijk. Het gebruik van ultrapuur water of een van vitamine ontdaan yoghurtstaal zijn misschien alternatieven.
4.10.2 Preconcentratie in oven Uit de eerste resultaten blijkt dat het effect van preconcentraties in de oven lineair stijgen. Wanneer we nu grotere injectievolumes zouden kunnen herhaaldelijk injecteren is ook daar de mogelijkheid om hogere absorbanties te verkrijgen die op hun beurt kleinere relatieve fouten met zich meebrengen.
4.10.3 Matched standaarden Hoewel de ijklijn op basis van zelfverdunde standaardoplossingen goede resultaten en goede correlaties met zich meebrengt, zou een automatische calibratie vanuit een masterstandaard toch wel tijd- en werkbesparend zijn. Hier kan nog onderzoek geleverd worden naar het gebruik van een standaardoplossing die soortgelijke ionconcentraties heeft als de yoghurt. Ook het gehalte aan andere organische (biochemische) macromoleculen zou geëvenaard kunnen worden. Zelfs standaarden op basis van een vitamine B12-concentratie, die op hun beurt gedestrueerd worden, zouden moeten kunnen.
4.10.4 Methoden om absorbanties hoger te krijgen Concrete voorstellen zijn er hier niet maar er ligt potentieel in de methode als de absorbanties voor de yoghurtmonsters hoger zouden kunnen zijn.
57
4.10.5 Inwendige standaarden De mogelijke fouten i.v.m. dalende absorbantiewaarden, de adsorptie t.o.v. de wand, het effect van de extractie, kunnen nog verder onderzocht worden door het toevoegen van een interne standaard aan de oplossing. De keuze van een koper- of chroomzout zou het best zijn, omdat ook koper en chroom meegecomplexeerd worden met APDC bij deze pH.
4.10.6 Matrixmodificatie bij destructie en temperatuursoptimalisatie De destructie in de moffeloven is oorzaak van verlies aan kobalt. Door modificatie met een gepaste modifier en een optimalisatie van de temperatuur moet deze fout minimaliseren. In lectuur [18] wordt magnesiumdinitraat aangeraden.
4.10.7 Preconcentratie op microkolom [2] In verschillende lectuur raadt men aan het gevormde Co-APDC-complex te preconcentreren op een microkolom. Daarbij wordt een relatief groot volume aan waterige oplossing met Co behandeld met de gekende complexant en over een microkolom gebracht waar het op een apolaire fase achterblijft. Na spoelen – om alle polaire bestanddelen weg te wassen – kan met een kleine hoeveelheid MIBK het complex opnieuw uit de kolom in vloeibare fase worden gebracht.
4.10.8 Andere complexanten [15] In het vermelde artikel staat een methode beschreven waar men naast het opconcentreren in een “solid phase” extractie, gaat complexeren met dithioxamide. De verkregen detectielimiet voor kobalt is 0,5 ppb. Misschien dat ook met deze complexant een bruikbare opconcentratie kan ontwikkeld worden.
58
5. De uiteindelijke methode 5.1 Recept 5.1.1 Oplossingen Alle oplossingen worden aangelengd met bigedestilleerd water.
Buffer: 6,0 g NaHCO3 + 14,0 g Na2CO3 oplossen en aanlengen tot 100,0 ml. NaOH: 3,0 mol/l: 1,2 g NaOH in 10,0 ml. APDC – oplossing: 1,0 m%: 1,0 g APDC + 3,0 ml 3,0 mol/l NaOH aanlengen tot 100,0 ml Deze oplossing wordt het best koud bereid en bewaard in de koelkast. Co-standaard: 1 ppb: Verdun de 1000 ppm Co-standaard 3 keer 100x (1,00 ml in 100,0 ml).
Andere stoffen: Geconcentreerd zoutzuur, MIBK.
5.1.2 Werkwijze monsters - Weeg 10,0 g yoghurt af in een gereinigd porseleinen kroesje. - Laat het monster 1 week drogen in een droogstoof bij 120 °C of warm het voorzichtig op aan een matige bunsenvlam tot de verkolingsfase begonnen is. Let bij het opwarmen op voor openspattende eiwitten. - Laat het kroesje gedurende ten minste 5 uur moffelen bij 750 °C. - Voeg aan de afgekoelde kroesjes 0,5 ml geconcentreerd zoutzuur toe en los zo alle assen op. - Voeg 8,0 ml carbonaatbufferoplossing toe. - Voeg 2,0 ml APDC-oplossing toe. - Breng de inhoud van het kroesje over in een gereinigde scheitrechter en spoel het kroesje na men een weinig bidgestilleerd water. - Breng in de scheitrechter 5,00 ml MIBK. - Schud krachtig gedurende 30 s. - Laat de onderste fase lopen en vang de bovenste fase op. - Vul een cuvetje en breng het in de autosampler. - Meet bij 240,7 nm naar de aanwezigheid van Co, pas deuteriumcorrectie toe. Zet alle andere instellingen zoals opgegeven in het kookboek (of in bijlage). - Injecteer in hoeveelheden van 20 µl en gebruik de preconcentratie in het oventje; laat het programma hernemen na de verassingsfase. Stel in op drie preconcentraties.
59
- Gebruik volgend ovenprogramma: Tabel 20: Temperatuurprogramma
Temperatuur
Verblijftijd
Ramp
(°C)
(s)
(°C/s)
verdamping
120
30
10
Argon
0,2
verassing
1000
20
150
Argon
0,2
atomisatie
2200
3
Argon
Geen
reiniging
2600
3
Argon
0,3
Fase
Gas
Gasstroom (l/min)
- Laat de meting doorgaan tijdens de atomisatiefase. - Laat na iedere monstermeting de cuvet reinigen en autosampler spoelen. - Gebruik het gemiddelde van 3 opeenvolgende metingen.
5.1.3 Werkwijze ijklijn vanuit masterstandaard - Breng 5,00 ml 1 ppb Co-standaard in een gereinigd kroesje. - Droog het kroesje op dezelfde manier als de monsters. - Moffel het kroesje met de monsters mee voor ten minste 5 h bij 750 °C. - Breng in het afgekoelde kroesje achtereenvolgens: 0,5 ml geconc. HCl; 8,0 ml carbonaatbuffer en 2,0 ml APDC-opl. - Breng in een scheitrechter, voeg 5,00 ml MIBK toe en schud krachtig. - Breng de bovenste vloeistof over in een cuvetje. - Meet bij 240,7 nm, met deuteriumcorrectie bij hetzelfde ovenprogramma. - Laat vanuit de masterstandaard een automatische ijklijn opbouwen door het injecteren van variabele volumes. - Werk met evenredige volumes als de preconcentratie van de monsters. - Neem als blanco pure MIBK.
60
5.2 Fouten Bij de volledige methode moet men nog rekening houden met fouten. - Men meet alle cobalaminen, biologisch actieve maar ook niet-actieve. - Men veronderstelt dat na destructie alle vitamine B12 volledig gedestrueerd is en alle Co vrij beschikbaar is, wat niet zo is. De daarbij gemaakte fout is niet even groot bij de monsters in vergelijking met de automatisch verdunde standaarden. Zelfgemaakte verdunningen zijn beter. - Men gaat ervan uit dat alle kobalt zich complexeert met PDC- en overgaat in apolaire fase. - Daar het over een zodanig kleine concentratie gaat is de adsorptie t.o.v. van het materiaal zeker niet te verwaarlozen. Het adsorptieverlies stijgt i.f.v. de tijd. - De poreusheid van het grafietoventje stijgt i.f.v. het aantal firings. - De meetfout is niet te verwaarlozen. - Blanco’s uit opgeconcentreerd bigedestilleerd water geven een signaal aan dat hoger is dan het yoghurtsignaal.
61
6. Validatie In eerste instantie werd een validatie uitgevoerd waarbij 10 keer 10,0 g yoghurt werd behandeld zoals de opgegeven methode maar met slechts 2 preconcentraties in de oven. Daarna werd, wegens het resultaat, ook nog een validatie uitgevoerd met de methode met drie preconcentraties in het grafietoventje.
6.1 Twee keer preconcentreren. 6.1.1 Metingen Telkens werd 10,0 g magere yoghurt gedestrueerd en volgens de gegeven methode van hoofdstuk 5 behandeld. In onderstaande tabel zijn de gemeten absorbanties weergegeven. Deze werden met de ijklijn ( zie fig. 19 : abs = 0,0424 . conc + 0,0018) omgerekend. Tabel 21: Meetresultaten validatie 2 keer preconcentreren
Meting
Absorbantie
Concentratie (ppb)
1
0,0302
0,668
2
0,0156
0,325
3
0,0165
0,346
4
0,0124
0,249
5
0,0102
0,198
6
0,0133
0,271
7
0,0107
0,209
8
0,0080
0,146
9
0,0085
0,158
10
0,0058
0,094
Alle absorbanties zijn een gemiddelde van 3 opeenvolgende metingen. Bij meting 5 is één van de deelmeting niet meegerekend omdat de achtergrond te hoog was (zie 4.9.3 Opmerkingen).
62
6.1.2 Gemiddelde, recovery, standaardafwijking Met behulpvan de methode van Dean en Dixon6 is besloten om meting 1 als uitschieter te beschouwen en niet mee te rekenen met de rest van de validatie. Tabel 22: Validatie 2 keer preconcentreren
Concentratie Co in
Gemeten
yoghurt (ppb)
concentratie (ppb)
2
0,56
0,325
58
3
0,56
0,346
62
4
0,56
0,249
45
5
0,56
0,198
35
6
0,56
0,271
48
7
0,56
0,209
37
8
0,56
0,146
26
9
0,56
0,158
28
10
0,56
0,094
17
Meting
Recovery (%)
De gemiddelde waarde voor deze 9 metingen is 0,2217 ppb Co, wat overeen komt met een recovery van 40 %. Dit kobaltgehalte zou wijzen op de aanwezigheid van 0,125 µg vitamine B12 per 100 g magere yoghurt. De standaardafwijking bedraagt 0,0837. Wat wijst op een procentuele fout van 37,7 %. De 95 % betrouwbaarheidsgrens: 0,2217 ± 0,0642 ppb. Dit is bepaald door volgende formule: betrouwbaarheidsinterval = tn . s/√(n) met
(XI)
tn = 2,3 voor n= 9 en 95% en tn = 3,4 voor n=9 en 99% s = standaarddeviatie n = het aantal metingen
Hier is de ondergrens, 0,1575 ppb, wat overeenkomt met een recovery van 28 %. De 95 % bovengrens, 0,2859 ppb, komt overeen met 51 %. Het 99 % betrouwbaarheidsinterval: 0,2217 ± 0,0948 ppb. Ondergens; 0,1268 ppb of 23 % recovery. Bovengrens; 0,3166 ppb of 57 % recovery. 6
Het verschil tussen deze meting en zijn dichtste buur, gedeeld door de range is groter dan de Q-waarde die Dean en Dixon hebben opgesteld (Q voor 10 metingen = 0,464).
63
6.1.3 Detectielimiet Als de detectielimiet wordt vereenvoudigd tot het drievoud van de standaardafwijking, zou dat overeenkomen met 0,2511.
Men merkt dus dat onze meting van 0,2217 ppb een waarde is die lager is dan de huidige detectielimiet. Wat duidelijk maakt dat 2 keer preconcentreren niet voldoende is.
6.2 Drie keer preconcentreren 6.2.1 Metingen Telkens werd 10,0 g volle yoghurt gedestrueerd en volgens de gegeven methode van hoofdstuk 5 behandeld. In onderstaande tabel zijn de gemeten absorbanties weergegeven. Deze werden met de ijklijn ( zie fig. 19 : abs = 0,0424 . conc + 0,0018) omgerekend. Tabel 23: Meetresultaten validatie 3 keer preconcentreren
Meting
Absorbantie
Concentratie (ppb)
1
0,0214
0,461
2
0,0164
0,344
3
0,0168
0,353
4
0,0141
0,289
5
0,0149
0,308
6
0,0161
0,336
7
0,0157
0,327
8
0,0218
0,471
9
0,0165
0,349
10
0,0148
0,306
Alle absorbanties zijn een gemiddelde van 3 opeenvolgende metingen.
64
6.2.2 Gemiddelde, recovery, standaardafwijking Tabel 24: Validatie 3 keer preconcentreren
Concentratie Co in
Gemeten
yoghurt (ppb)
concentratie (ppb)
1
0,66
0,461
70
2
0,66
0,344
52
3
0,66
0,353
53
4
0,66
0,289
44
5
0,66
0,308
47
6
0,66
0,336
51
7
0,66
0,327
50
8
0,66
0,471
71
9
0,66
0,346
52
10
0,66
0,306
46
Meting
Recovery (%)
De gemiddelde waarde voor deze 10 metingen is 0,3541 ppb Co, wat overeen komt met een recovery van 54 %. Dit kobaltgehalte zou wijzen op de aanwezigheid van 0,136 µg vitamine B12 per 100 g magere yoghurt. De standaardafwijking bedraagt 0,0622. Wat wijst op een procentuele fout van 17,6 %. De 95 % betrouwbaarheidsgrens: 0,3541 ± 0,0433 ppb. Dit is bepaald door volgende formule: betrouwbaarheidsinterval = tn . s/√(n) met
(XI)
tn = 2,2 voor n= 10 en 95% en tn = 3,3 voor n=10 en 99% s = standaarddeviatie n = het aantal metingen
Hier is de ondergrens, 0,3109 ppb, wat overeenkomt met een recovery van 47 %. De 95 % bovengrens, 0,3974 ppb, komt overeen met 60 %. Het 99 % betrouwbaarheidsinterval: 0,2217 ± 0,0650 ppb. Ondergens; 0,2892 ppb of 44 % recovery. Bovengrens; 0,4191 ppb of 63 % recovery.
65
6.2.3 Detectielimiet Als de detectielimiet wordt vereenvoudigd tot het drievoud van de standaardafwijking, zou dit overeenkomen met 0,1866.
Men merkt dus dat onze meting van 0,3541 ppb een waarde is duidelijk hoger ligt dan de huidige detectielimiet.
66
7. Besluit Het onderzoek naar een snelle bepaling van vitamine B12 in yoghurt heeft geleid tot een drieledige methode. 1. Destructie Het monster wordt na drogen gedestrueerd door het te verhitten bij 750 °C gedurende een aantal uur in een moffeloven. 2. Opconcentratie De assen worden opgelost met geconcentreerd zoutzuur en het vrijgestelde kobalt wordt gecomplexeerd met ammonium 1-pyrrolidinedithiocarbamaat in gebufferd, alkalisch midden. In een scheitrechter verkiest het gevormde complex de apolaire fase van methyl-isobutylketon. 3. Meting De geëxtraheerde kobalt in het MIBK-mengsel wordt in een elektrisch opgewarmde grafietoven geëxciteerd en absorbeert daarbij licht met een golflengte van 240,7 nm. De absorbantie is een maat voor de concentratie aan kobalt. Naast een aangepast temperatuurprogramma wordt gebruik gemaakt van een opconcentratie in het oventje na de verassingsfase.
Door een optimalisatie van de methode is men erin geslaagd om een recovery van 54 % te behalen.
De
methode
kent
al
een
nauw
spreidingsbebied.
Het
95
%
betrouwbaarheidsinterval is te vinden tussen 47 en 60 % recovery. Ondanks de kleine hoeveelheden kobalt aanwezig in het monster haalt de gemeten waarde (0,3541 ppb Co) net de detectielimiet (0,1866).
De optimalisatie bevindt zich vnl. in het onderzoek naar het gebruik van verschillende bufferoplossingen, complexanten en de opconcentratie in het toestel. Die onderzoeken hebben geleid tot volgende conclusies: - De destructie gebeurt het best bij 750 °C om alle bindingen zeker te breken. Daar kobaltzouten hoge kookpunten hebben zal het verlies aan kobalt beperkt zijn. - Carbonaatbuffers hebben als voordeel dat men met een weinig volume een sterk bufferende werking kan creëren en een neerslag van de interfererende calciumionen bekomt. Het belangrijkste nadeel is dat de buffer ook een kleine hoeveelheid kobalt bevat.
67
- Dinatriumdiethyldithiocarbamaat is geen beter alternatief omdat er ten minste 1 ppb Co dient aanwezig te zijn om voldoende te kunnen complexeren. De verkregen signalen liggen ook lager. - Om een voldoende verassing en geen verlies in de atomisatiefase te hebben gebeurt de verassing best bij 1000°C en de atomisatie best bij 2200°C. - Opconcentreren in het toestel heeft veel gunstige effecten. De absorbantie stijgt lineair met het aantal injecties, waardoor de maximale recovery voorspelbaar wordt. De relatieve fout daalt i.f.v. het aantal injecties. Meerdere injecties kennen als nadeel dat de analysetijd langer wordt.
Injecties met grotere volumes kennen dan als nadeel dat verschillende
matrixeffecten beginnen te storen. - Matrixmodificatie en variëren van monster- en solventvolumes levert weinig zinvolle verbetering. - De methode is heel gevoelig voor contaminaties. - Het gebruik van blanco’s is nog een probleem. - IJklijnen met zelfgemaakte verdunningen leveren betere resultaten dan het werken met één masterdstandaard waarvan men variabele volumes injecteert.
Qua vervolgonderzoek lijkt het weinig succesvol om de absolute fout te verkleinen. Door ervoor te zorgen dat we grotere signalen krijgen (door bv. nog verdergaande opconcentraties) zal men een verkleining van de relatieve fout bereiken. Het lijkt wel zinvol om op zoek te gaan om de recovery nog meer in de buurt van 100% te krijgen. Daarnaast kan ook de opstelling van de calibratielijn en het onderzoek naar betere blancowaarden nog vorderingen boeken.
68
Bijlagen Standaard meetomstandigheden
Monster:
10 g joghurt Danone Nature NutriDay Volle yoghurt
Drogen:
1 week in droogstoof
Destructie:
5 uur in moffeloven bij 550 °C
In oplossing brengen:
0,5 ml geconcentreerd HCl
Bufferen:
8 ml HCO3-/CO32- - buffer
Complexeren:
2 ml 1 m% APDC - opl.
Extractie:
5 ml MIBK + 20 keer schudden
Injectie:
20 µl – 2 keer preconcentreren
Temperatuursprogramma: Temperatuur
Verblijftijd
Ramp
(°C)
(s)
(°C/s)
verdamping
120
30
10
Argon
0,2
verassing
1000
20
150
Argon
0,2
atomisatie
2200
3
Argon
Geen
reiniging
2600
3
Argon
0,3
Fase
Meten:
atomisatiefase
Golflengte:
240,7 nm
Bandpass:
0,2 nm
Lamp current:
80%
Achtergrondcorrectie:
deuterium
Aantal metingen per meting: 3 Injectietemperatuur:
kampertemperatuur
Matrixmodificatie:
geen
Wassen:
na elk monster
Cuvette clean:
na elk monster bij 2900 °C
Meettijd:
4s
X
Gas
Gasstroom (l/min)
Onderzoek Telkens worden de wijzigingen tov de standaardmethode weergegeven. Tabel 2:
1 keer 20 µl niet op voorhand gedroogd verdamping 100 °C, verassing 1100 °C, atomisatie 2100 °C
Tabel 3:
ook waterige standaarden, van deze werden 1 keer 40 µl geïnjecteerd wisselende bufferoplossingen gemoffeld bij 750 °C
Tabel 4:
waterige standaarden, 1 keer 40 µl
Tabel 5 & 6:
waterige kobaltoplossingen 1 ppb, 1 keer 40µl HNO3, 1 m% als wasmiddel wisselende temperatuursprogramma’s
Tabel 7 & 8:
opgeconcentreerd in MIBK 1 ppb, 1 keer 40 µl wisselende temperatuursprogramma’s
Tabel 10,11 & 12:
wisselende volumes aan yoghurt en MIBK zowel volle als magere yoghurt variabele moffeltemperaturen
Tabel 13:
wisselend aantal preconcentraties in oven magere yoghurt gemoffeld bij 750 °C 2 resamples
Tabel 14 &15:
magere yoghurt wisselende aantal injecties en injectievolume gemoffeld bij 750 °C
Tabel 16:
magnesiumdinitraat als matrixmodifier gemoffeld bij 750 °C
Tabel 17:
geen aanpassingen
Tabel 18 &19:
standaarden eventueel gemoffeld bij 750 °C
XI
Literatuurlijst (1) A. Carlosena, M. Gallego and M. Valcárcel, ‘Evaluation of various sample preparation procedures for the determination of chromium, cobalt and nickel in vegetables’, J. Anal. At.
Spectrom., 12 (1997). (2) A. M. Haji Shabani, S. Dadfarnia en K. Deghan, ’On-line preconcentration and determination of cobalt by chelating microcolumns and flow injection atomic spectrometry.’,
Talanta, 59 (2003). (3) A. S. Ribeiro, M. A. Vieira, A. Furtado da Silva, D. L. Gallindo Borges, B. Welz, U. Heitmann en A. J. Curtius, ‘Determination of cobalt in biological samples by line-source and high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry using solid sampling or alkaline treatment’, Spectrochimica Acta PartB, 60 (2005).
(4) A. Dumoulin, ‘Spectrofotometrische analysen’, syllabus, Hogeschool West-Vlaanderen, Kortrijk, cursoa, 2006.
(5) Acros organics http://www.acros.com
(6) B. Vanterwyngen, ‘HPLC-methode voor de detectie van vitamine B12’, Eindwerk, Hogeschool West-Vlaanderen en Biofun, Kortrijk en Oostkamp-Moerbrugge, 2005.
(7) C. C. Nascentes, M. Aurelio en Z. Arruda, ‘Cloud point formation based on mixed micelles in the precense of electrolytes for cobalt extraction and preconcentration’, Talanta, 61 (2003).
(8) D. Zendelovska, G. Pavlovska, K. Cundeva en T. Stafilov, ‘Electrothermal atomic absorption spectrometric determination of cobalt, copper, lead and nickel traces in aragonite following and extraction seperation.’, Talanta, 54 (2001).
(9) E.D. Caldas, M.F. Gine-Rosias and J.G. Dorea, ‘Determination of cobalt in human liver by atomic absorption spectrometry with electrothermal atomization’, Anal. Chim. Acta, 254 (1991).
XII
(10) G. L. Donati, C. C. Nascentes, A. R. A. Nogueira, M. A. Z. Arruda en J. A. Nobrega,’Acid extraction and cloud point preconcentrations as sample preparation startegies for cobalt determination in biological materials by thermospray flame furnace atomic absorption spectrometry.’, Microchemical Journal, 82 (2006).
(11) H. Mosbaek, P. E. Holm en J. C. Tjell, ‘Automated on-line solvant extraction and AAS – graphite furnace determination of trace metals in difficult matrices’, JAAS, 2003.
(12)
H.
Sato
en
J Ueda,
‘Coprecipitation
of
trace
metal
ions
in
water
with
bismuth(III)diethyldithiocarbamate fora in electrothermal atomic absorption spectrometric determination’, Analytical sciences, 17 (2001).
(13) L. Husakova, A. Bobrowski, J. Sramkova, A. Krolicka en K. Vytras, ‘Catalytic adsorptive stripping voltammetry versus electrothermal atomic absorption spectrometry in the determination of trace cobalt and chromium in human urine’, Talanta, 66 (2005).
(14) L. M. Voth, ‘Determination od chromium, lead and cadmium in drinking water by solvent extraction and flame microsampling’, Varian instruments at work, Varian AA resource center, Park Ridge, Illionois USA, (1981).
(15) M. Ghaedi, F. Ahmadi en A. Shokrollahi, ‘Simultaneous preconcentration and determination of copper, nickel, cobalt and lead ions content by flame absorption spectrometry’, Journal of Hazardous Materials, 142 (2007).
(16) M. Jamaluddin Ahmed en M. Nasir Uddin, ‘A simple spectrophotometric method for the determination of cobalt in industrial, enviromental, biological and soil samples using bis(salicylaldehyde)orthophenylenediamine’, Chemosphere, 67 (2007).
(17) Merck http://www.merck.de
(18) Morton, Solaar methods manual, Cambridge U.K., thermo elemental, 2001.
(19) P.Michel, ‘Vitamine B12 en veganisme : een literatuurstudie’, Utrecht, uitgeverij Den Giraffe, 1997.
XIII
(20) S. Yamada, K. Yamada, N. Nishikawa, R. Hioki, M. Nirasawa, K. Kii, H. Ryugo, M. Iwama en M. Fukuda, ‘Determination of viatmin B12 using the enzyme glycerol dehydrase’, Scand J
Clin Lab Invest, 64 (2004). (21) Thermo-Elemental http://www.thermo.com
(22) W. D’Haene, ‘Ontwikkelen en optimaliseren van een meetmethode voor de bepaling van cobalt in een yoghurtmatrix.’, Eindwerk, Hogeschool West-Vlaanderen, Kortrijk, 2007.
(23) Wikipedia http://www.wikipedia.be
(24) X. Luo, B. Chen, L. Ding, F. Tang en S. Yao, ’HPLC – ESI – MS analysis of vitamin B12 in food products and miltivitamins-multiminerals tablets.’ Analytica Chimica Acta, 562 (2006).
XIV
XV
