I. PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang Probiotik pada awalnya dikemukakan oleh ilmuwan Rusia Elie Metchnikoff pada tahun 1907. Perkembangan selanjutnya mulai diperkenalkan konsep probiotik oleh Fuller (1989) serta konsep prebiotik oleh Gibson dan Roberfroid (1995). Definisi terkini menyebutkan bahwa probiotik merupakan bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah cukup dapat memberikan pengaruh kesehatan pada inang (FAO/WHO, 2006). Menurut Margolles et al. (2009), sumber terbaik untuk isolasi probiotik salah satunya adalah saluran pencernaan manusia. Saluran pencernaan manusia dewasa membawa sekitar 1013 log CFU/ml mikrobia dengan berbagai jenis mikrobia (Ventura et al., 2009). Beberapa strain bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari manusia telah dimanfaatkan secara komersil seperti Lb. rhamnosus GG, Lb. casei Shirota, dan Lb. acidophilus LA-1 (Dunne et al., 2001). Boehm dan Stahl (2007) menjelaskan terdapat hubungan erat antara perkembangan flora saluran pencernaan setelah kelahiran dengan konsumsi ASI yang mengandung oligosakarida. Menurut Martin et al. (2009), pada awal kelahiran, ketika bayi masih mengkonsumsi air susu ibu (ASI) mikrobia saluran pencernaan
yang
mendominasi
adalah
Bifidobacteria.
Seiring
dengan
bertambahnya usia, mikrobia yang mendominasi adalah Firmicutes (termasuk genera Clostridia dan bakteri asam laktat) dan Bacteroides, sedangkan
1
Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria dan Verrucomicrobia terdapat dalam jumlah yang lebih rendah. Wells et al. (2010) melaporkan mikrobia saluran pencernaan memiliki peran integral dalam absorpsi nutrisi, metabolisme, perkembangan epitel, immunomodulator, regulasi penyimpanan lemak dan perlindungan terhadap patogen. Probiotik memberikan efek menguntungkan terhadap ekologi mikrobia saluran
pencernaan,
homeostasis
saluran
pencernaan,
metabolisme
dan
memberikan efek kesehatan bagi inangnya. Probiotik umumnya berasal dari golongan BAL, khususnya genus Lactobacillus dan Bifidobacterium yang merupakan bagian dari flora normal saluran pencernaan manusia (Sujaya et al., 2008). Lactobacillus dan Bifidobacterium
merupakan
probiotik
yang
dapat
memberikan
efek
menguntungkan bagi kesehatan seperti pencegahan diare (Salazar et al., 2007), stimulasi sistem kekebalan (immune) tubuh (Isolauri dan Salminen, 2008), penurunan kadar kolesterol (Lee et al., 2010), pencegahan kanker kolon dan usus (Liong, 2008), pencegahan dermatitis atopik pada anak-anak (Torii et al., 2010) dan penyakit irritable bowel syndrome (Lyra et al., 2010), penanganan alergi (Vanderhoof, 2008) serta pencegahan dan penanganan penyakit infeksi (Wolvers et al., 2010). Genus Bifidobacterium, Lactobacillus dan Lactococcus biasanya digunakan untuk industri fermentasi. Identifikasi dan seleksi BAL yang mampu menghasilkan asam linoleat terkonjugasi (conjugated linoeic acid, CLA) dari
2
sumber asam linoleat sangat penting dilakukan, karena peranan CLA sebagai senyawa bioaktif fungsional bagi kesehatan. Bakteri Asam Laktat umumnya diidentifikasi melalui karakteristik morfologi, metabolit dan fenotipik lainnya, tetapi metode ini dianggap tidak efisien dan tidak lagi akurat karena mengandalkan ekspresi fenotip di bawah kondisi
laboratorium
dan
dapat
menyebabkan
kesalahan
identifikasi
(misidentification) (Chenoll et al., 2003). Teknik terbaru yang banyak diaplikasikan dalam studi identifikasi mikrobia adalah berdasarkan analisis sekuens gen 16S dan gen 23S rRNA. Selain identifikasi, tahap terpenting selanjutnya sebelum suatu isolat dimanfaatkan sebagai probiotik yaitu pengujian potensi isolat teridentifikasi sebagai probiotik. Beberapa kriteria seleksi probiotik dari BAL, menurut Dunne et al. (2001) diantaranya: berasal dari manusia, tidak bersifat patogen, resisten terhadap kondisi asam dalam lambung dan toksisitas empedu, dapat menempel pada jaringan epitel saluran pencernaan, mampu tumbuh dalam saluran pencernaan, memproduksi substansi antibakteri, mampu merangsang respon kekebalan dan mampu mempengaruhi aktivitas metabolisme seperti asimilasi kolesterol dan aktivitas laktase. Probiotik juga terlibat dalam metabolisme lemak, terutama dalam penurunan trigliserida di hati dan peningkatan rantai panjang asam lemak tidak jenuh (poly unsaturated fatty acids, PUFA) dan berhubungan dengan penurunan kadar lipoprotein plasma. Modulasi asam amino, metabolisme metilamin dan glikogenesis serta glukoneogenesis juga dilaporkan merupakan efek probiotik
3
(Wells et al., 2010). Mikrobia saluran pencernaan juga dapat memodulasi komposisi asam lemak dalam jaringan hati, otak dan adiposa dari host melalui sintesis senyawa bioaktif asam lemak seperti CLA. Beberapa manfaat CLA bagi kesehatan telah banyak dilaporkan diantaranya (1) Antikarsinogenik (Coakley et al., 2006), (2) Antiaterosklerosis (Nakamura et al., 2008), (3) Antiinflamasi (Vyas et al., 2012), (4) Antiobesitas (Kennedy et al., 2010) dan (5) Antidiabetes (Belury et al., 2003). Oleh karena itu, produksi metabolit bioaktif CLA dapat dianggap sebagai sifat probiotik yang penting (Wells et al., 2010). Asam linoleat terkonjugasi (CLA) terbentuk dari kombinasi posisi dan isomer geometris terkonjugasi dari asam lemak esensial asam linoleat (LA). Isomer CLA (C18:2 cis-9, trans-11 (c-9,t-11) dan C18:2 trans-10, cis-12 (t-10,c12)) dengan efek biologis yang bermanfaat telah diidentifikasi dalam berbagai model hewan termasuk antikarsinogenesis, immunomodulasi, antiaterosklerosis dan penurunan lemak tubuh (Hur et al., 2007). Senyawa ini secara alami terdapat dalam berbagai makanan, termasuk produk ruminansia seperti lemak susu dan daging yang telah ditemukan mengandung sejumlah besar CLA. Produk susu dari ruminansia merupakan sumber yang kaya akan CLA, di antaranya C18:2 c-9, t-11 adalah isomer utama (Kirchnenova et al., 2012). Keberadaan senyawa ini dalam produk susu sebagian terjadi karena isomerisasi dan biohidrogenasi dari asam linoleat dan linolenat dalam rumen oleh bakteri rumen, seperti Butyrivibrio fibrisolvens dan Megasphaera elsdenni (Jouany et al., 2007). Fungsionalitas probiotik dari BAL juga dapat dilihat melalui kemampuan sintesis CLA. Oleh karena itu, perlu dilakukannya penelitian untuk mengetahui
4
isolat bakteri asam laktat asal sistem pencernaan manusia yang berpotensi untuk produksi CLA sebagai potensial probiotik.
1.2
Permasalahan Penelitian Penelitian sebelumnya oleh Taufiq (2012) mengenai isolasi dan
identifikasi BAL dari feses bayi telah dilakukan dan diperoleh 6 isolat kandidat BAL, 1 diantaranya telah teridentifikasi. Isolat tersebut merupakan bakteri Gram positif, katalase negatif, morfologi sel berbentuk batang, tidak memproduksi gas dalam medium fermentasi dan non motil. Hasil uji pertumbuhan menunjukkan isolat tersebut mampu hidup pada kondisi fakultatif anaerob dan mampu tumbuh pada suhu 37 dan 45°C. Berdasarkan kunci identifikasi dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 2000), isolat tersebut memiliki ciri genus Lactobacillus, akan tetapi kelima isolat lainnya belum teridentifikasi. Identifikasi molekuler dengan 16S rRNA penting untuk dilakukan agar diketahui identitas isolat BAL terpilih hingga tingkat spesies dan menjadi dasar untuk identifikasi karakter khas bakteri lebih lanjut. Selanjutnya pada isolat yang telah teridentifikasi dilakukan pengujian terhadap potensi probiotik secara in vitro meliputi ketahanan pada pH rendah, ketahanan terhadap garam empedu, aktivitas antimikrobia terhadap patogen, kemampuan perlekatan pada saluran pencernaan dan kemampuan pemanfaatan prebiotik inulin sebagai satu-satunya sumber karbon. Setelah dilakukan pengujian tersebut, isolat menunjukkan potensi sebagai probiotik secara in vitro, sedangkan lima isolat lainnya belum diketahui memiliki kemampuan sebagai probiotik secara
5
in vitro. Kemampuan enam isolat dalam sintesis senyawa bioaktif CLA juga belum diketahui. Dengan demikian identifikasi dan karakterisasi isolat BAL dari feses bayi terhadap kemampuan sintesis CLA penting dilakukan, untuk mendukung fungsionalitas isolat sebagai kandidat probiotik.
1.3 Keaslian Penelitian Identifikasi BAL berdasarkan analisis urutan basa (sequencing) gen 16S rRNA merupakan metode utama untuk penentuan spesies. Balcazar et al. (2007) melakukan identifikasi BAL yang diisolasi dari isi pencernaan ikan salmon menggunakan analisis urutan basa gen 16S rRNA. Hasilnya menunjukkan bahwa dengan mengamplifikasi dan melakukan analisis urutan basa terhadap 500 pasang basa yang menyandi gen 16S rRNA dapat diketahui spesies dan galur BAL yang diisolasi dengan tepat. Pemanfaatan gen 16S rRNA dalam identifikasi prokariotik di Indonesia telah cukup banyak dikembangkan. Penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Widodo et al. (2012) memperoleh 6 isolat dari isolat klinis feses bayi, satu diantaranya telah teridentifikasi sebagai BAL yaitu Lb. casei strain AF yang memiliki potensi probiotik secara in vitro. Lima isolat lainnya belum teridentifikasi baik secara seluler maupun molekuler sebagai BAL. Pada penelitian ini identifikasi kelima isolat kandidat BAL akan dilakukan melalui pendekatan molekuler berbasis amplifikasi gen 16S rRNA dengan primer plb16 dan mlb16. Selain itu kemampuan potensi probiotik dari kelima isolat tersebut juga akan diuji secara in vitro.
6
Penelitian yang dilakukan oleh Alonso et al. (2003) menunjukkan Lactobacillus dan Bifidobacteria yang berasal dari saluran pencernaan manusia mampu memproduksi CLA. Potensi dua isolat Lb.acidophilus dan dua Lb. casei dari saluran pencernaan menunjukkan aktivitas isomerase. Lb. casei dan Lb. acidophilus yang berasal dari saluran pencernaan terbukti mampu untuk menghasilkan isomer CLA c-9, t-11; t-10, c-12 dan t-9, t-11. Fungsionalitas probiotik dari isolat klinis asal feses bayi Indonesia dalam mensintesis senyawa bioaktif CLA belum pernah dilaporkan. Pada penelitian ini akan dilakukan seleksi untuk melihat kemampuan keenam isolat kandidat probiotik dalam mensintesis senyawa bioaktif CLA melalui konversi asam linoleat bebas.
1.4 Tujuan Penelitian Berdasarkan latar belakang dan permasalahan pentingnya karakterisasi isolat bakteri asam laktat kandidat probiotik, maka tujuan penelitian ini adalah mengetahui: 1) Posisi taksonomi spesies isolat bakteri asam laktat kandidat probiotik dengan analisis sekuen gen 16S rRNA, 2) Karakterisasi kemampuan isolat sebagai kandidat probiotik secara in vitro dan 3) Karakterisasi kemampuan isolat dalam mensintesis senyawa bioaktif CLA.
1.5 Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah didapatkannya isolat bakteri asam laktat kandidat probiotik asal feses bayi yang memiliki kemampuan sintesis CLA.
7
