Hodnocení morfologie a imunofenotypizace leukocytů jako reflexní testy automatizovaného krevního obrazu: koncept, možnosti a kazuistiky
Kateřina Pilátová, Lenka Zdražilová Dubská Oddělení laboratorní medicíny Masarykův onkologický ústav
Úvod
Mikroskopie nátěru na sklo
Morfologie (např. tvar erytrocytů, přítomnost buněčných inkluzí, struktura jádra aj.)
Přítomnost parazitů, artefaktů aj.
Automatický KO + diff.
Subpopulace lymfocytů (T- a Blymfocyty, NK buňky…)
Flowcytometrie
Imunofenotyp patologických lymfocytů
Přítomnost CD34+ buněk
IDENTIFIKACE 6ti populační dif. rozpočet leukocytů
Automatický analyzátor KO + diff.
Leukocyty
B-ly
Mono
Sysmex XE-5000™ Morfologie buňky SFL (fluorescence) obsah DNA/RNA
Velikost buňky SSC (přímý rozptyl)
T-ly
Laserový paprsek
Morfologie buňky FSC (boční rozptyl) vnitřní struktura / granularita buňky
RELATIVNÍ/ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE
Automatický analyzátor KO + diff.
Erytrocyty Trombocyty
IDENTIFIKACE
Sysmex XE-5000™
Erytrocyty a trombocyty – impedanční metoda (opticky) Hemoglobin – absorpční spektrometrie NRBC, retikulocyty: speciální kanály,
ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE
Digitální mikroskopie
Leukocyty
IDENTIFIKACE včetně nezralých forem a patologií
Velikost buňky Mikroskopie – software (neuronová síť), oko Morfologie buňky Mikroskopie – software (neuronová síť), oko, speciální barvení vlastnosti cytoplazmy (granulace, cytoplazmatické inkluze) vlastnosti jádra (velikost, přítomnost jadérek, struktura chromatinu, segmentace jader)
Přítomnost parazitů, artefaktů aj. Mikroskopie – oko
RELATIVNÍ KVANTIFIKACE
CellaVision® DM1200
Digitální mikroskopie
Erytrocyty Trombocyty
Velikost Mikroskopie – software (neuronová síť), oko
IDENTIFIKACE
Ery: mikrocytóza, makrocytóza, anizocytóza Trombo: makrotrombocyty, mikrotrombocyty, anizocytóza
Morfologie Mikroskopie – software (neuronová sít), oko, speciální barvení Ery: např. abnormální tvar, chromie, inkluze, penízkovatění aj. Trombo: hypochromie trombocytů, shlukování trombocytů NRBC Retikulocyty
ORIENTAČNĚ KVANTIFIKACE trombocyty, schistocyty
CellaVision® DM1200
Flowcytometrie
Leukocyty
IDENTIFIKACE včetně subpopulací lymfocytů, identifikace lymfomových buněk, CD34+ buněk aj....
Anti-CD14
Anti-CD19
B-ly
Mono
Navios, Beckman Coulter
Anti-CD3
Imunofenotyp Fluorescence
Velikost buňky SSC (přímý rozptyl)
T-ly
Laserový paprsek
RELATIVNÍ KVANTIFIKACE ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE Fluorescenční kuličky (např. cirkulující endoteliální buňky, CD34+ buňky)
Morfologie buňky FSC (boční rozptyl) vnitřní struktura / granularita buňky
Flowcytometrie
Erytrocyty Trombocyty
Pouze speciální aplikace: Navios, Beckman Coulter
Ery: paroxysmální noční hemoglobinurie, fetomaternální hemoragie aj. Trombo: diagnostika vrozených poruch funkce destiček, imunitních a megakaryocytárních trombocytopenií, polymorfie systému lidských trombocytárnich antigenů (HPA) ve vztahu k aloimunizaci aj.
Úvod
Mikroskopie nátěru na sklo
Morfologie (např. tvar erytrocytů, přítomnost buněčných inkluzí, struktura jádra aj.)
Přítomnost parazitů, artefaktů aj.
Automatický KO + diff.
Subpopulace lymfocytů (T- a Blymfocyty, NK buňky…)
Flowcytometrie
Imunofenotyp patologických lymfocytů
Přítomnost CD34+ buněk
Kritéria pro nátěr a flowcytometrické vyšetření PK Onkologické diagnózy „C“
Kvantitativní
Neonkologické diagnózy „Z“
Parametr
Hodnota menší než
Hodnota větší než
Jednotka
Parametr
Hodnota menší než
Hodnota větší než
Jednotka
Leukocyty
1,0
30,0*
109/l
Leukocyty
4,0
30,0
109/l
Hemoglobin
60**
ženy: 180 muži: 195
g/l
Hemoglobin
70*
ženy: 180 muži: 195
g/l
Trombocyty
50
1000
109/l
Trombocyty
100*
1000
109/l
Neutrofily
-
20,0*
109/l
MCV
75
105
fl
Eozinofily
-
4,0
109/l
RDW
-
22
%
Monocyty
-
3,0
109/l
Neutrofily
1,0
20,0
109/l
Lymfocyty
-
4,5
109/l
Eozinofily
-
2,0
109/l
Nezralé granulocyty
-
0,3*
109/l
Bazofily
-
0,5
109/l
NRBC počet
-
0,1***
109/l
Monocyty
-
1,5
109/l
Lymfocyty
-
4,0
109/l
0,1
109/l
* Nejsou-li podávány růstové faktory granulocytů.
** Je-li anémie doprovázena trombocytopenií (trombocyty 100x109/l). *** Nejsou-li podávány růstové faktory erytropoézy (erytropoetin).
Nezralé granulocyty NRBC počet
-
0,0
109/l
Retikulocyty počet
-
0,15
1012/l
* Flowcytometrické vyšetření se provádí pouze, je-li současně anémie a trombocytopenie.
Kritéria pro nátěr a flowcytometrické vyšetření PK
Flag WBC Abn Lympho / L_Blasts? Atypical Lympho? Blasts? Immature Gran? Left Shift? RBC Lyse Resistance?
Akce Nátěr C + Z Flow C + Z Nátěr Z Flow Z Nátěr C + Z Flow C + Z Nátěr C + Z Flow C + Z Nátěr Z Flow Z Nátěr C + Z Flow C + Z
NRBC Abn Scattergram
Nátěr C + Z
WBC Abn Scattergram
Nátěr C + Z
Kvalitativní
Flag RBC
Akce
Fragments?
Nátěr C + Z
PLT Clumps?
HGB Defect?
Nátěr C + Z
PLT Abn Distrib.
Nátěr Z
Iron Deficiency?
Nátěr C + Z
PLT Abn Scattergram
Nátěr Z
RBC Agglutination?
Nátěr C + Z
Dimorphic Population
Nátěr Z
RBC Abn Distribution
Nátěr Z
RET Abn Scattergram
Nátěr Z
Flag PLT
Akce Nátěr C + Z
Muž 79 let, C61 (ca prostaty) CT zvětšené a zmnožené uzliny v malé pánvi a RP 14. 4. 2016 – patologický KO + diff.
Kazuistika 1 Automatizovaný KO + diff.
Flowcytometrie
CD45-KrO
HLA-Dr-PC5
lymfo 79 %
Digitální mikroskopie
B-lymfo 74 %
SSC
CD19-FITC
lambda-PE
CD20-PC7
lambda 1%
kappa 98 % kappa-FITC
CD23-APC
CD38-PB
CD79b-PE
CD5-APC750
CD19-PC5
FMC7-FITC
CD10-PC5
Hodnocení: abnormální B-lymfocyty s imunofenotypem CD19+ CD20+ HLA-DR+ CD45+ sIg(kappa)+ FMC7+ CD79b+ CD5+ CD23- CD38+ CD10+ CD200- CD117- CD11c+/- odpovídající monoklonální B-lymfoproliferaci z nezralých buněk. Res: B lymfoproliferace z nezralých buněk
Kazuistika 1
Muž 79 let, C61 (ca prostaty) CT zvětšené a zmnožené uzliny v malé pánvi a RP 14. 4. 2016 – patologický KO + diff.
Imunohistochemie cyklinD1
Hodnocení: abnormální B-lymfocyty s imunofenotypem CD19+ CD20+ HLA-DR+ CD45+ sIg(kappa)+ FMC7+ CD79b+ CD5+ CD23- CD38+ CD10+ CD200- CD117- CD11c+/- odpovídající monoklonální B-lymfoproliferaci z nezralých buněk. Res: B lymfoproliferace z nezralých buněk …. B-PLL?
Kazuistika 1
27.4. 2016 - zahájena léčba obinutuzumabem (anti-CD20) a leukeranem 3. 5. 2016 – kontrola KO + diff
Automatizovaný KO + diff.
Flowcytometrie B-lymfo 0,6 %
CD45-KrO
HLA-Dr-PC5
Lymfo 23 %
SSC
CD19-FITC
T-lymfo 92 %
CD3-APC750
CD34-PC7
Hodnocení: leukopenie, trombocytopenie, v biochemii LDH = 16,51 kat/l (14. 4. 2016: LDH = 4,81 kat/l)
Muž 19 let, zarudlý krk s bílými čepy, únava, afebrilní
Kazuistika 2 Automatizovaný KO + diff.
Digitální mikroskopie
Flowcytometrie
CD45-KrO
Lymfo 65 %
B-lymfo 2,5 % T-lymfo 89 %
Th-lymfo 12 % CD8-APC
CD4-PB
CD19-FITC
CD3-APC750
CD3-APC750
Tc-lymfo 71 %
CD3-APC750
HLA-Dr-PC5
HLA-Dr-PC5
SSC
CD4-PB
SEROLOGIE Cytomegalovirus (CMV) CMV IgG negativní CMV IgM pozitivní Epstein-Baarové virus (EBV) EBV VCA IgG pozitivní EBV VCA IgM pozitivní EBV EBNA IgG negativní
Hodnocení: expanze cytotox. CD8+ T-lymfocytů s reaktivním imunofenotypem. Res: infekční mononukleóza
Žena 67 let, C181 (tu appendixu, dlouhodobá remise) Lymfocytóza v KO + diff. – došetřeno flowcytometricky
Kazuistika 3 Automatizovaný KO + diff.
Flowcytometrie B-lymfo 4%
CD45-KrO
HLA-Dr-PC5
Lymfo 62 %
SSC
T-lymfo 89 %
CD19-FITC
Tc-lymfo 12 %
CD4-PB
CD8-APC
Th-lymfo 16 %
CD3-APC750
CD3-APC750
CD3-APC750
Kazuistika 3
Žena 67 let, C181 (tu appendixu) Lymfocytóza v KO + diff. – došetřeno flowcytometricky
Flowcytometrie
Digitální mikroskopie
gammadelta CD314+ 59 %
TCR gammadelta 59 %
TCRgd-FITC
TCRdelta9-PB
CD314-APC
99 %
TCRgamma9-PC5
Hodnocení: Atypický nález v oblasti T-lymfocytů; cca 60% lymfocytů periferní krve představují gamma delta Tlymfocyty; jež jsou z 99% TCRgamma9/delta2 CD4- CD8low+ CD56low+ CD16low+ NKG2D+ CD69- HLA-Dr-. Res: gammadelta T-lymfocyty s expresí znaků NK buněk.
Kazuistika 4
Žena 79 let, DM II.typu na inzulinoterapii V rámci pravidelné diabetologické kontroly zjištěna v KO leukocyotóza s lymfocytózou První hematologické vyšetření – B-CLL???
Flowcytometrie
CD45-KrO
Automatizovaný KO + diff.
Digitální mikroskopie
lymfo 71 %
HLA-Dr-PC5
SSC B-lymfo 4,5 % T-lymfo 3,1 %
CD4-PB
CD19-FITC
CD3-APC750
88 %
CD3-APC750
Hodnocení: aberantní T-lymfocyty: CD3- CD8- CD4+ CD34- CD14- CD19- CD5+ CD25- CD103- CD27+ CD45RO- CD38- CD16- CD56- dělící se dle exprese CD45 do dvou populací. Res: T-lymfoproliferace
Kazuistika 5
Žena 85 let, vyšetření pro pancytopenii PK + KD
Digitální mikroskopie
Flowcytometrie
CD45-KrO
Automatizovaný KO + diff.
SSC
SSC
CD14-PE
CD34-PC7
Hodnocení: leu: neutropenie, monocytopenie, hypersegmentované granulocyty; ery: makrocytóza, anizocytóza (dimorfní populace), makroovalocyty, knizocyty, stomatocyty; trombocytopenie.
Kazuistika 5
Žena 85 let, vyšetření pro pancytopenii PK + KD
Flowcytometrie
CD45-KrO
Automatizovaný KO + diff.
SSC
SSC
SSC
CD14-PE
CD34-PC7
Hodnocení: Středně buněčný aspirát KD, hyperplastická erytrocytopoéza. Res: megaloblastová anémie.
Kazuistika 6
Muž 68 let, C229 (hepatocelulární karcinom) 8.1.2016 přichází na MOÚ pro susp. tu jater 15.1.2016 v rámci předoperačního vyšetření patologický KO + diff.
Automatizovaný KO + diff.
Flowcytometrie
Digitální mikroskopie
CD45-KrO
Lymfo 32 %
SSC
SSC
CD34+ buňky 7%
CD34-PC7
Hodnocení: flowcytomericky v periferní krvi zachyceno 7% CD34+ buněk/blastů; jedná se o buňky CD45low+ CD34+ CD14- HLA-Dr+ CD19- CD3- CD4-. Morfologicky bez aureových tyčí vzhledu negranulovaných nediferencovaných blastů. Res: hemoblastóza v PK.
Automatizovaný KO + diff.
Flowcytometrie
Digitální mikroskopie
Lymfo 32 %
CD45-KrO
Kazuistika 7
Žena 67 let, C502 (ca mammae) 16.2. chemoterapie 25.2. KO + diff., pro neutropenii podány G-CSF (filgrastim, Zarzio) 29.2. Ko + diff. – kontrola
Granulo cca 40 %
SSC
Mono 19 %
Neutrofily = 20,8 % Lymfocyty = 39,4 % Monocyty = 18,1 % Eozinofily = 2,7 % Bazofily = 2,1 %
Metamyelocyty = 4,8 % Myelocyty = 5,3 % Promyelocyty = 6,4 %
IG = 16,5 % CD14-PE
