Het effect van insuline op de differentiatie van C 2 C 12 skeletspiercellen

Het effect van insuline op de differentiatie van C2C12 skeletspiercellen David Hautemann BMTE05.11 Februari 2005

Interne Stage Begeleiding: Ir. Debby Gawlitta Dr. Ir. Carlijn Bouten Technische Universiteit Eindhoven Faculteit Biomedische Technologie

Het effect van insuline op de differentiatie van C2C12 skeletspiercellen

Inhoudsopgave INHOUDSOPGAVE ..............................................................................................................................1 INLEIDING ............................................................................................................................................2 HOOFDSTUK 1: MYOGENESE .........................................................................................................3 IN VIVO.................................................................................................................................................3 IN VITRO ...............................................................................................................................................3 HOOFDSTUK 2: EXPERIMENT ........................................................................................................6 MATERIALEN EN METHODEN.................................................................................................................6 Materialen en celkweekmedia..........................................................................................................6 Celkweek en inductie tot differentiatie.............................................................................................6 Visualisatie ......................................................................................................................................7 Analyse.............................................................................................................................................7 RESULTATEN.........................................................................................................................................7 DISCUSSIE ...........................................................................................................................................13 Visualisatie ....................................................................................................................................13 Analyse...........................................................................................................................................13 Resultaten ......................................................................................................................................13 CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN ...........................................................................................14 BIJLAGE 1: RESULTATEN VAN HET EXPERIMENT ...............................................................15 LITERATUURLIJST ..........................................................................................................................16

1


Inleiding Decubitus is een ziekte waarvan de pathogenese nog niet volledig begrepen wordt. Er zijn hier enkele hypotheses over, waarvan er een stelt dat de aanhoudende druk op de spiercellen in spierweefsel een significante rol speelt in het schadeproces [1]. Om deze hypothese te kunnen testen en om te zien hoe spiercellen reageren op aanhoudende druk is er een experimenteel model nodig waarop langdurige belasting uitgevoerd kan worden. Het huidige model waarmee gewerkt wordt bestaat uit C2C12 skeletspiercellen gezaaid in een collageen matrigel oplossing die zich bevindt tussen 2 zijdedraadjes die fungeren als pezen. De myoblasten worden gekweekt en planten zich voort in een groeimedium (GM). Wanneer het medium verwisseld wordt naar differentiatie medium (DM) fuseren de myoblasten tot multinucleaire myotubes. De myotubes in dit model zijn echter nog niet erg volwassen en er bestaat de behoefte om het model te verbeteren. Het doel van dit onderzoek is om het huidige Tissue Engineered (TE) skeletspiertje te optimaliseren. Verschillende literatuurbronnen beweren dat insuline de myogenese bevordert. Door middel van een monolaag experiment zal de werking van het huidige DM vergeleken worden met een DM waar insuline inzit.

2


Hoofdstuk 1: Myogenese In Vivo In vivo vindt skeletspiervorming plaats doordat individuele spier precursor cellen myoblasten worden. Deze cellen migreren naar de plaats waar de vorming zal gaan plaatsvinden. Daar fuseren deze cellen en vormen ze multi-nucleaire skeletspiercellen, de myotubes. Deze myotube kan 35 kernen per mm bevatten en 1 tot 4 cm lang worden [2]. De kernen zullen in eerste instantie op de lengte-as in de myotube liggen. Naarmate de myotube zich ontwikkelt, zullen de kernen zich naar de zijkant positioneren. Verder zullen er tijdens de ontwikkeling van myotube naar spiervezel, sarcomeren worden opgebouwd. Dit zijn de kleinste contractiele elementen van de spier bestaande uit actine en myosine eiwitten [3]. In figuur 1.1 worden de verschillende stappen van de myogenese globaal weergegeven. In figuur 1.2 is een volwassen stukje skeletspiervezel te zien. De donkere platte kernen liggen aan de zijkant. De dwarsstreping wordt veroorzaakt door de verschilllende banden in de sarcomeren.

Figuur 1.1: Myogenese [4].

Figuur1. 2: Skeletspiervezels gekleurd met Hematoxyline-Eosine [5].

In Vitro Voor in vitro skeletspiervorming wordt in onderzoeken veelvuldig gebruik gemaakt van C2C12 skeletspiercellen afkomstig van muizen [6]. Om deze cellen te laten prolifereren wordt een groeimedium (GM) gebruikt wat onder andere voedingsstoffen en groeifactoren bevat. In het GM zit Fetal Bovine Serum (FBS). Hierin zitten in ongedefinieerde hoeveelheden

3


verschillende groeifactoren die er voor zorgen dat de proliferatie goed verloopt. Indien men de cellen wil aanzetten tot differentiatie, zal gestopt moeten worden met het toedienen van GM. Volgens Lange et al. geeft enkel serumdeprivatie aanleiding tot differentiatie [7]. Om cellen aan te zetten tot differentiatie wordt in de praktijk veelvuldig gebruik gemaakt van paardenserum, in het Engels Horse Serum (HS) wat een gereduceerd serum is. In een aantal onderzoeken wordt gebruik gemaakt van DM waaraan insuline is toegevoegd [8] [9]. Goto et al. stellen dat door het toevoegen van insuline aan DM, de differentiatie wordt bevorderd. Figuur 1.3 hieronder is afkomstig uit het artikel van Goto et al. De monolaag links kreeg DM met 5 µg/mL insuline toegediend en de rechter monolaag kreeg DM zonder insuline. Te zien is dat de linker monolaag enkele grotere myotubes bevat dan de rechter monolaag. In het experiment van Goto et al. bevatte het DM ook HS. Echter, volgens het artikel maakte het niet uit of het DM serum bevatte of serumvrij was. In figuur 1.4 worden ook 2 monolagen vergeleken. De linkerlaag kreeg DM dat HS bevatte, de laag rechts kreeg serumvrij DM plus 50 nM insuline. Ook hier is te zien dat het DM met insuline tot grotere myotubes heeft geleid.

Figuur1.3: Foto’s van monolagen genomen met lichtmicroscoop. De monolaag links kreeg DM plus 5 µg/mL insuline. De rechter kreeg DM zonder insuline. De foto’s werden genomen 72 uur na toediening van DM. De balk is 70 µm lang [8].

Figuur1.4: Twee monolagen gefotografeerd 72 uur na toediening van DM met HS (links) of DM met 50 nM Insuline (rechts) [9].

Naast het samenstellen van het medium is verankering van de cellen een ander zeer belangrijk aspect dat invloed heeft op de differentiatie. Bij het kweken van monolagen zorgt de adhesie aan een oppervlak ervoor dat de cel de S-phase van de cel-cyclus in kan gaan zodat celdivisie mogelijk wordt. De kans hierop wordt veel kleiner indien er weinig of geen adhesie is [3]. In een 3-dimensionale structuur wordt deling mogelijk indien cellen gehecht zitten in een matrix. Zo bestaat het huidige spiermodel uit een mix van Matrigel en collageen die voor de structuur zorgt. In dit onderzoek zal de invloed van mediumsamenstelling op de myogenese bekeken worden. Er zijn ook nog andere methoden om de myogenese te bevorderen zoals door gebruik te maken van spanning of electrostimulatie [10]. Deze methoden zijn echter gecompliceerd en

4


tijdrovend en voor het decubitus onderzoek is een protocol nodig om een TE spiertje te kweken dat in een zo kort mogelijke kweekperiode, zo gematureerd mogelijk is.

5


Hoofdstuk 2: Experiment De myoblasten in het huidige TE skeletspiertje differentiëren door er een paardenserum bevattend DM aan toe te voegen. Sommige experimentele onderzoeken naar myogenese maken gebruik van serum-vrije media, omdat de samenstelling van het serum niet goed te bepalen is en bij die onderzoeken het juist essentieel is dat de media goed gedefinieerd zijn om de rol van bepaalde stoffen in de myogenese te kunnen achterhalen [8]. In hoofdstuk 1 zijn twee artikelen aangehaald die stellen dat insuline in serum-vrij medium de differentiatie van myoblasten naar myotubes bevordert ten opzichte van het veel gebruikte DM met 2% HS. Om te onderzoeken of insuline werkelijk betere myotubes oplevert, is een monolaag experiment uitgevoerd. Beter houdt enerzijds in dat de kwantiteit van myotubes toeneemt en anderzijds dat de kwaliteit van de myotube wordt verhoogd. De kwaliteit, of anders gezegd, de maturiteit, uit zich in de lengte, dikte, het aantal kernen per myotube en de ligging van de kernen. Cellen, gezaaid op een 12- of 24 wells-plaat werden na een periode van proliferatie in het huidige GM aangezet tot differentiatie door er een DM aan toe te voegen, dat serum vrij was (DM-) , Serum bevatte (DM S+) of Serum vrij was en insuline bevatte (DM I+). De monolagen werden vervolgens vergeleken door ze te kleuren zodat verschillen in de morphologie duidelijk zichtbaar werden. Materialen en methoden Materialen en celkweekmedia Voor de verschillende media zijn de volgende ingredienten gebruikt: Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM) met 4,5 g/L Glucose en L-Glutamine (BioWhittakertm), een oplossing van 10 mg/L Gentamycine (Biochrom AG); een NonEssential Amino-Acid oplossing, HEPES, fetal bovine serum, paardenserum (HS) en een Insuline oplossing van 10 mg/mL. De 12- en 24-Wells platen waren gemaakt van polystyreen. In tabel 2.1 staan de samenstellingen beschreven voor de celkweek media. De concentratie insuline in het DM I+ bedroeg 5 µg/mL zoals beschreven in hoofdstuk 1. GM DM DM S+ DM I+ (ml) (%) (ml) (%) (ml) (%) (ml) (%) ingrediënt DMEM 500 500 500 500 Gentamycine (10 mg/L) 2,5 0,5 2,5 0,5 2,5 0,5 2,5 0,5 Non-Essential Amino-Acid 5 1 5,0 1 5 1 5 1 HEPES 10 2 10 2 10 2 10 2 fetal bovine serum 75 15 0 0 0 0 0 0 HS 0 0 0 0 10 2 0 0 Insuline (10 mg/mL) 0 0 0 0 0 0 0,25 0,05 Tabel 2.1: Samenstelling van de verschillende media

Verder zijn een phase-contrast microscoop en een digitale camera gebruikt om opnames te maken bij vergrotingen van 2,5x , 5x, 10x, 20x en 40x. Celkweek en inductie tot differentiatie Skeletspiermyoblasten van muizen, C2C12, waren afkomstig van ECACC. Deze cellen werden in een incubator gehouden in een kweekfles met GM bij 37 C0 en 5% CO2 totdat ze gebruikt werden voor het experiment. Hiervoor werden de cellen 2 keer gespoeld met phosphate buffered saline (PBS), getrypsineerd, opgelost in GM en gezaaid op de wells-platen. C2C12 skeletspiercellen van passage 29 werden op dag 1 18x gezaaid met een dichtheid van 4*104 cellen per cm2 op een 24 wells-plaat. Op dag 3 bereikten ze confluentie en werd er na 2 keer spoelen met PBS, overgegaan op DM-, DM S+ of DM I+. Elk differentiatiemedium werd

6


in 6-voud toegevoegd aan de monolaag cellen. Op dag 7 werden de monolagen gefixeerd met een 10% formaline oplossing en bewaard in PBS voor een Hematoxyline Eosine kleuring op een later tijdstip. Een tweede experiment werd uitgevoerd door cellen van passage 14 te zaaien op een 12-wells plaat. Op dag 3 werd een confluentie van ca. 90 % bereikt en werd er overgestapt op de 3 differentiatie media die in 4-voud werden toegevoegd. Op dag 5, na twee dagen blootgesteld te zijn aan DM, werden de monolagen gefixeerd. Visualisatie De gefixeerde monolagen werden gekleurd met Hematoxyline en Eosine (HE). Om de verschillende stappen van de kleuring goed te kunnen doorlopen werden de wells-platen door midden gezaagd. Na de kleuring werden foto’s gemaakt bij diverse vergrotingen variërend van 2,5x tot 40x. Er zijn ook foto’s gemaakt van de monolagen direct na de Hematoxyline kleuring. Hematoxyline zorgde ervoor dat de kernen blauw kleurden en ook dat de tubes licht blauw kleurden. Eosine kleurde het cytoplasma paars. Analyse De foto’s met vergroting 5x werden verder bewerkt en geanalyseerd met het programma Adobe photoshop. In dit programma werden de tubes met de hand zwart gekleurd en genummerd. Vervolgens werden de lengtes opgemeten en het oppervlak dat deze tubes besloegen bepaald. Doordat er ook een foto was gemaakt van een telraam met een bekende afmeting kon de verhouding tussen pixel en µm bepaald worden. De dikte van de tubes kon niet direct worden bepaald, omdat de myotubes zelf niet overal even dik waren. Verder werden uiteindelijk in het programma de zwart gemaakte tubes tegen een witte achtergrond gehouden zodat het programma het aantal zwarte en witte pixels kon tellen om het oppervlak wat de tubes besloegen te kunnen bepalen (zie ook figuur 2.3). Door het oppervlak door de lengte te delen werd de gemiddelde tube dikte bepaald. Resultaten Gedurende beide experimenten kon al opgemerkt worden dat de media die aan de monolagen werden toegevoegd, op verschillende manieren van kleur veranderden. De kleur van de drie media veranderde in verschillende mate van roze richting oranje. Vooral de DM S+ en DM I+ veranderden sterk. Van de experimenten zijn foto’s genomen. De kleuring van het eerste experiment mislukte. Bij de herhaling verliep de kleuring wel goed en van dit experiment zullen nu verder de resultaten besproken worden. In figuur 2.1 is de halve 12-wells plaat te zien na hematoxyline kleuring. Duidelijk is, dat de monolaag die DM- kreeg toegediend, de minste kleur bevat.

Figuur 2.1: wells plaat na Hematoxyline kleuring. Kolommen v.l.n.r. DM I+, DM -, DM S+

7

Het effect van insuline op de differentiatie van C2C12 skeletspiercellen a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figuur 2.2: foto’s genomen op dag 5 van monolagen behandeld met de verschillende DM’s gekleurd met hematoxyline. a) en b) DM I+; c) en d) met DM; e) en f) met DM S+. Foto’s a) c) en e) zijn 2,5x vergroot. Foto’s b) d) en f) zijn 10x vergroot.

In figuur 2.2 zijn opnames te zien van van de verschillende monolagen van het experiment. Bij vergroting 2,5x is te zien dat indien myotubes zich vormen, dit het intensiefst gebeurt in het centrum van de wells-platen, daar waar de confluentie ook steeds het grootst was na 3 dagen GM. De foto’s bij 10x vergroting zijn in het centrum van de wells-plaat genomen. Deze foto’s laten duidelijk zien dat de monolagen zich op verschillende wijze hebben ontwikkeld. De DM I+ monolaag laat meer tubes zien dan de andere 2 monolagen, maar er zijn ook een heleboel celclusters waarneembaar. De monolaag behandeld met DM- laat geen spoor van myotubes zien. Het DM S+ heeft wel myotubes opgeleverd, echter in mindere mate dan DM I+. In figuur 2.3 zijn de foto’s te zien die werden gebruikt voor de karakterisatie van de tubes op de monolagen en hoe ze werden bewerkt. Aangezien na twee dagen het gebruik van DMgeen tubes opleverde, werden foto’s van monolagen behandeld met dit medium niet verder bewerkt. Tabel 1 bevat de gegevens over kwantiteit en over de lengte en dikte van de myotubes. (Zie ook bijlage 1.)

8

Het effect van insuline op de differentiatie van C2C12 skeletspiercellen a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figuur 2.3: Foto’s bij vergroting 5x van monolagen behandeld met DM I+ (a,c,e) en DM S+ (b,d,f). a en b vertonen de originele foto’s. in figuur c en d zijn de tubes zwart gemaakt en genummerd en is het gebied afgebakend wat voor oppervlakbepaling gebruikt wordt. Figuur e en f laten de tubes tegen een witte achtergrond zien

In tabel 2.2 valt op dat er meer dan twee keer zoveel tubes ontstaan zijn in DM I+ vergeleken met DM S+. De ratio is 2,30. De totale lengte verhoudt zich met 2,54. Deze twee komen niet overeen en er is een gemiddeld lengteverschil van 10%. Echter de standaard deviaties zijn hoog. Door het aantal zwarte pixels in figuren 3e en 3f te delen door het totaal aantal pixels wordt het relatieve oppervlak bepaald. De DM I+/DM S+ ratio is hier 2,25, iets minder dan de ratio tussen de gemiddelde lengtes. De gemiddelde dikte van de tubes is bepaald door het totale oppervlak van de tubes te delen door de som van de lengtes. De DM I+/DM S+ ratio is hier 0,89. Myotubes lengte aantal 106 DM I+ 46 DM S+ ratio DM I+/DM S+ 2,30

relatieve

gemiddelde

totaal (mm)

gemiddeld (µm) st dev (µm)

oppervlak (%)

dikte (µm)

58,6 23,1

553 503

8,50 3,77

41 46

2,54

1,10

2,25

0,89

±244 ±309

Tabel 2.2: gegevens over de myotubes op monolagen behandeld met DM I+ en DM S+

9


In figuur 2.4 is een histogram te zien waarin de myotubes per lengte onderverdeeld zijn in vakken van 150 mu. relatief aantal tubes per lengte 45,0 DM S+

39,1

40,0

DM I+

35,0 32,1 30,0 %van totaal

26,1 25,0 19,8 20,0

17,4 15,1

15,0

13,2 10,4

10,0 6,5 3,8

5,0 2,2 0,0 0,0

2,2

2,2

3,8 2,2

2,2

1,9 0,0 0,0

0,0

0,0

0,0

0,0 0,0

0,0 0

150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

1650

1800

lengte (mu)

Figuur 2.4: Relatief aantal tubes gevormd in DM I+ en DM S+ per lengtevak van 150 mu

In figuur 2.5 en 2.6 zijn 4 foto’s te zien van de monolagen in DM I+ en DM S+ nadat ze waren gekleurd met hematoxyline en hematoxyline-eosine bij 20x vergroting. De toevoeging van eosine die het cyotplasma paars kleurde heeft er niet toe geleid dat de kernen duidelijker opvielen. De meest duidelijke foto van de vier is figuur 2.6a. De kernen vallen goed op, alleen is het niet altijd duidelijk of de kernen bij een myotube of een aparte cel horen.

10


a)

b)

Figuur 2.5: opnames van DM I+ bij 20x vergroting. a) Hematoxyline kleuring, b) HE kleuring.

11


a)

b)

Figuur 2.6: opnames van DM S+ bij 20x vergroting. a) Hematoxyline kleuring, b) HE kleuring

12


Discussie Visualisatie De foto’s die genomen waren na de hematoxyline kleuring zijn gebruikt voor de analyse. Het kleuren met eosine heeft er niet toe geleid dat de resultaten duidelijker werden. Bepaling van het aantal kernen per myotube was niet mogelijk, omdat de foto’s en de kleuringen niet voor genoeg onderscheiding zorgden. Ook de overlapping van enkelkernige cellen en myotubes zorgde ervoor dat het niet mogelijk was om precies te bepalen waar de kernen bij hoorden. Analyse De bewerking van de foto’s voor de karakterisering van de myotubes is met de hand gebeurd. Hierdoor kan het zijn dat kleinere myotubes niet zijn opgevallen en meegenomen. Doordat er veel celclusters in de opname van tubes in DM I+ zaten was het moeilijk om secuur de myotubes zwart te kleuren. Het kan dus goed zijn dat de opgemeten lengte van de tubes en het bepaalde oppervlak dat ze besloegen in werkelijkheid afwijkt. Ook kunnen kleinere tubes hierdoor niet zijn opgevallen. Resultaten Uit de resultaten is duidelijk gebleken dat DM I+ zorgde voor 2,30 maal zo veel myotubes als het huidige DM S+. Ook waren de myotubes in DM I+ gemiddeld 10% langer, echter de standaard deviaties zijn erg groot en dus kan niet met zekerheid gesteld worden dat DM I+ leidt tot langere myotubes. Hierdoor kan ook niet gesteld worden dat DM I+ leidt tot dunnere myotubes. Met het monolaag experiment is het niet mogelijk gebleken om het aantal kernen per tube te bepalen en de lengtes en de diktes nauwkeurig te meten dus over de invloed van insuline op de kwaliteit van een myotube kunnen geen conclusies getrokken worden. Wel kan worden geconcludeerd dat het gebruik van DM I+ in plaats van het huidige DM S+ voor ruim twee keer zoveel myotubes zorgt wat een aanzienlijke winst in kwantiteit betekent. Verder is door de vorming van celclusters karakterisering moeilijk gebleken. Ook zouden deze clusters de meetresultaten bij drukproeven kunnen verstoren.

13


Conclusies en aanbevelingen Uit het experiment is gebleken dat DM I+ het aantal myotubes verdubbelt ten opzichte van het huidige DM S+. Een verschil in maturiteit van de myotubes kon niet aangetoond worden. Het DM I+ zorgde ook voor celclusters die het karakterizeren bemoeilijkten en mogelijk de drukproefmetingen kunnen verstoren. Indien er een manier gevonden kan worden, die ervoor zorgt dat dezen uitblijven, dan is het nieuwe DM I+ een beter alternatief voor het huidige DM S+. Naar aanleiding van de resultaten is het daarom interessant om nog een aantal zaken te onderzoeken. Bij het samenstellen van DM I+ is een concentratie insuline gebruikt van 5 µg/mL zoals in het onderzoek van Goto et al. Echter, of deze concentratie optimaal is, is niet bekend. Door de hoeveelheid toe te voegen insuline te variëren, kan een optimale concentratie bepaald worden. Ook is het dan interessant om te zien of het toevoegen van insuline aan het huidige DM S+ een cummulatief positief effect heeft. Verder is het experiment uit praktische overwegingen uitgevoerd met monolagen. Aangezien verankering een zeer belangrijke rol speelt bij differentiatie en deze bij polystyrene wellsplaten anders is dan bij een Matrigel-collageen oplossing, is het interessant om het experiment met TE spiertjes te herhalen.

14


Bijlage 1: resultaten van het experiment

meetdata van het monolaag experiment medium aantal tubes tubenr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

DM I+ 106 lengte px 135 120 105 80 90 111 162 137 147 189 139 132 138 327 268 135 104 84 78 82 163 130 240 130 208 205 134 87 106 72 138 114 275 200 80 110 235 160 163 310 182 165 380 145 126 247 222 89 165 185 202 78 185 135

lengte (mu) 469 417 365 278 313 385 563 476 510 656 483 458 479 1135 931 469 361 292 271 285 566 451 833 451 722 712 465 302 368 250 479 396 955 694 278 382 816 556 566 1076 632 573 1319 503 438 858 771 309 573 642 701 271 642 469

tubenr 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 lengte gem. lengte totaal

lengte px 239 77 295 273 77 88 57 92 125 66 140 106 360 230 170 60 98 145 104 143 220 65 320 155 115 327 150 183 188 135 215 220 155 117 170 250 138 169 168 155 230 143 177 68 81 220 123 115 82 215 147 198 159 16888 px

lengte (mu) 830 267 1024 948 267 306 198 319 434 229 486 368 1250 799 590 208 340 503 361 497 764 226 1111 538 399 1135 521 635 653 469 747 764 538 406 590 868 479 587 583 538 799 497 615 236 281 764 427 399 285 747 510 688 553 ±244 58,6 mm

medium aantal tubes tubenr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 lengte gem. lengte totaal

DM S+ 46 lengte px 88 60 80 115 110 70 88 150 76 163 85 350 90 106 76 168 54 43 167 370 160 167 270 440 118 134 72 146 160 87 115 350 314 135 120 128 124 130 90 88 124 114 202 137 114 110 145 6658 px

lengte (mu) 306 208 278 399 382 243 306 521 264 566 295 1215 313 368 264 583 188 149 580 1285 556 580 938 1528 410 465 250 507 556 302 399 1215 1090 469 417 444 431 451 313 306 431 396 701 476 396 382 503 ±309 23,1 mm

15


Literatuurlijst 1. Compressive deformation and damage of muscle cell subpopulations in a model system, Bouten C et al. Annals of biomedical engineering 2001 Feb; 29(2):153-63. 2. http://classes.aces.uiuc.edu/AnSci312/Muscle/FUSION.JPG 3. Molecular Biology of The Cell, Alberts et al. 1994. 4. The molecules that make muscle, Donald Gullberg, Nature volume 424, july 2003 5. http://www.gen.umn.edu/courses/1135/lab/histolab/muscleimages.html 6. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle, Yaffe D, Saxel O. , Nature, 1977 Dec 22-29; 270(5639):725-7. 7. Enhanced myogenic differentiation by extracellular matrix is regulated at the early stages of myogenesis. Langen RC et al. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 2003 Mar; 39(3):163-169. 8. Serum-free culture conditions for analysis of secretory proteinases during myogenic differentiation of mouse C2C12 myoblasts, Goto et al. Analytical Biochemistry 1999 Aug 1; 272(2):135-42. 9. Insulin Produces Myogenesis in C2C12 Myoblasts by Induction of NF-jB and Downregulation of AP-1 Activities, Ruben Conejo R. et al. Journal of Cellular Physiology, 186: 82±94 (2001) 10. http://www-personal.umich.edu/~bobden/muscle_tissue_engineering.html

16

Het effect van insuline op de differentiatie van C 2 C 12 skeletspiercellen

Recommend Documents