HASIL
Aktivitas Antimikrob Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob Ekstrak kasar yang didapatkan dari isolat HAL-13 memiliki aktivitas antimikrob terbaik (Tabel 1). Aktivitas antimikrob spektrum luas ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat maupun ekstrak n-butanol isolat tersebut (Gambar 1). Ekstrak nbutanol dari isolat HAA-01 memiliki aktivitas antimikrob berspektrum luas yang lebih baik dibandingkan ekstrak etil asetat (Gambar 2). Ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAL-74 menunjukkan aktivitas antimikrob tertinggi terhadap strain uji C. tropicalis dan C. albicans. Ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL-13, HAA-01, maupun HAL-74 mampu menghambat pertumbuhan P. aeruginosa.
Tabel 1 Diameter zona bening (dalam milimeter) yang dihasilkan dari aktivitas ekstrak kasar senyawa antimikrob (100 mg/mL) bakteri yang bersimbiosis dengan spons. Isolat
PA
SA
EPEC K1-1
CA
CT
Etil asetat
8
20
14
10
9
n-butanol
12
8
10
10
9
Etil asetat
4
4
8
16
-
n-butanol
20
4
-
-
16
Etil asetat
2
2
-
-
-
n-butanol
13
22
12
9
8
-
-
-
-
-
30
30
-
Tidak
Tidak
diuji
diuji
HAL-13
HAL-74
HAA-01
Metanol (K-) Ampisilin
Keterangan: PA SA EPEC K1-1 CA CT
: Pseudomonas aeruginosa : Staphylococcus aureus : Enteropatogenik Escherichia coli K1-1 : Candida albicans : Candida tropicalis
18
K
K
S. aureus
P. aeruginosa
K
EPEC K1-1
K
K
C. albicans
C. tropicalis
Gambar 1 Aktivitas antimikrob berspektrum luas dari ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAL-13. K: Kontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm.
K
S. aureus
K
K
P. aeruginosa
EPEC K1-1
K
C.albicans
Gambar 2 Aktivitas antimikrob berspektrum luas dari ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAA-01. K: Kontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm.
19
Uji Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob menggunakan Metode Bioautografi Analisis ekstrak kasar dari tiap isolat yang diteliti menggunakan kromatografi lapis tipis menunjukkan setidaknya ada satu bercak fraksi senyawa aktif yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap strain uji S. aureus dan EPEC K1-1 (Tabel 2). Dua bercak fraksi senyawa aktif dengan Rf 0.31 dan Rf 0.81 (Gambar 3) dari ekstrak etil asetat isolat HAL-13 memiliki aktivitas terhadap EPEC K1-1 dan S. aureus. Satu bercak fraksi senyawa dengan Rf 0.85 dari ekstrak n-butanol isolat HAA-01 dan Rf 0.28 dari ekstrak n-butanol HAL-74 memiliki aktivitas terhadap strain uji. Aktivitas antimikrob bercak fraksi senyawa aktif terlihat dari zona bening yang terbentuk di sekeliling lempeng kromatogram (Gambar 4). Tabel 2 Nilai Rf bercak fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap EPEC K1-1 dan S. aureus. Isolat
Eluen KLT
Nilai Rf
HAL-13
n-butanol:etil asetat:air (2:5:1)
Rf 1 = 0.31; Rf 2 = 0.81
HAL-74
heksan-metanol (2:2)
0.28
HAA-01
n-butanol:etil asetat:air (2:5:1)
0.85
Rf 0.81
Rf 0.85
Rf 0.31
HAL-13
Rf 0.28
HAA-01
HAL-74
Gambar 3 Kromatografi lapis tipis ekstrak kasar senyawa antimikrob dari ketiga isolat bakteri yang bersimbiosis dengan spons.
20
HAL-13 (Rf 0.31)
HAL-74 (Rf 0.28)
EPEC K1-1
EPEC K1-1
HAL-13 (Rf 0.31)
EPEC K1-1
HAL-74 (Rf 0.28)
S. aureus
HAA-01 (Rf 0.85)
S. aureus
HAA-01 (Rf 0.85)
S. aureus
Gambar 4 Aktivitas antimikrob yang ditunjukkan oleh bercak fraksi senyawa aktif terhadap strain uji EPEC K1-1 dan S. aureus. Pemurnian Senyawa Antimikrob dari Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob Isolat HAL-13 Sebanyak
37 fraksi
senyawa
berhasil
didapatkan
melalui proses
kromatografi kolom. Lima fraksi senyawa diketahui memiliki aktivitas antibakteri (Tabel 3), namun tidak ada fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap strain uji C. albicans dan C. tropicalis. Fraksi BS13-5 yang terelusi dengan eluen klorofom-metanol (90%-10%) serta BS13-11 yang terelusi dengan eluen
klorofom-metanol
(90%-10%)
menunjukkan
aktivitas
antibakteri
berspektrum luas terbaik terhadap S. aureus, P. aeruginosa, dan EPEC K1-1 (Gambar 5). Fraksi BS13-2 yang terelusi dengan eluen kloroform-metanol (50%50%) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap EPEC K1-1 dan P. aeruginosa. Kelima fraksi senyawa tersebut dilarutkan sesuai jenis eluennya pada kromatografi kolom dengan konsentrasi 5.4 mg/mL.
21
Tabel 3 Aktivitas antimikrob fraksi senyawa hasil kromatografi kolom. Sistem Eluen dan Fraksi Strain Uji Senyawa PA SA EPEC K1-1 CA CT Klorofom-metanol (90%-10%) Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2 Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5 + + + Klorofom-metanol (80%-20%) Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2 Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5 Fraksi BS13-6 Fraksi BS13-7 + + + Fraksi BS13-8 Fraksi BS13-9 Fraksi BS13-10 Fraksi BS13-11 + + + Klorofom-metanol (70%-30%) Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2 Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5 Fraksi BS13-6 Klorofom-metanol (50%-50%) Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2 + + Fraksi BS13-3 + + + Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5 Fraksi BS13-6 Fraksi BS13-7 Fraksi BS13-8 Klorofom-metanol (30%-70%) Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2 Klorofom-metanol (10%-90%) Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2 Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5 Keterangan: + = Fraksi senyawa memiliki aktivitas terhadap strain uji. - = Fraksi senyawa tidak memiliki aktivitas terhadap strain uji.
22
K
K K
BS13-5
BS13-11 BS13-5
EPEC K1-1
BS13-11
P. aeruginosa
BS13-5
BS13-11
S. aureus
Gambar 5 Aktivitas antibakteri berspektrum luas yang ditunjukkan oleh fraksi BS13-5 dan BS13-11 yang dielusi dari kolom dengan eluen klorofommetanol (90%-10%) dan klorofom metanol (80%-20%). K: Kontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm. Pemurnian Senyawa Antimikrob dengan Teknik Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Senyawa antimikrob yang terdapat dalam fraksi aktif dapat diekstraksi secara terpisah dari lempeng gel silika pada pengerjaan KLT. Fraksi BS13-5 merupakan fraksi yang membawa paling banyak senyawa aktif dibandingkan fraksi aktif lainnya (Tabel 4). Empat senyawa dengan nilai Rf 0.35, 0.41, 0.72, dan 0.87 berhasil didapatkan dari fraksi BS13-5 melalui teknik KLT preparatif (Gambar 6). Keempat senyawa tersebut memiliki aktivitas antibakteri. Analisis KLT untuk fraksi aktif BS13-7 hanya menghasilkan satu bercak senyawa pada nilai Rf 0.73. Dua senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri juga didapatkan dari fraksi BS13-11. Kedua senyawa tersebut memiliki nilai Rf 0.27 dan 0.66 (Gambar 6). Dua senyawa dengan nilai Rf 0.35 dan 0.41 dari fraksi aktif BS13-5 menunjukkan aktivitas antibakteri terbaik terhadap strain uji EPEC K1-1. Zona bening yang dibentuk oleh kedua senyawa tersebut mencapai 12 mm untuk masing-masing senyawa (Gambar 7).
23
Tabel 4 Hasil analisis kromatografi lapis tipis terhadap fraksi aktif. Fraksi Aktif
Eluen KLT
Nilai Rf Bercak Senyawa Aktif λ 254 nm
BS13-5
Etil asetat
Rf = 0.87
λ 366 nm Rf1 = 0.35; Rf2 = 0.41; Rf3 = 0.72
BS13-7
Klorofom-metanol Rf = 0.73
Rf = 0.73
(9:1) BS13-11
BS13-2
Klorofom-metanol
Rf = 0.27; Rf =
(8:2)
0.66
Klorofom-metanol
-
(7:3) BS13-3
Klorofom-metanol
-
(7:3)
Senyawa aktif (Rf 0.72)
Senyawa aktif (Rf 0.66)
Senyawa aktif (Rf 0.41) Senyawa aktif (Rf 0.35)
BS13-5
Senyawa aktif (Rf 0.27)
BS13-11
Gambar 6 Kromatografi lapis tipis fraksi aktif BS13-5 dan BS13-11 yang menunjukkan nilai Rf senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. Deteksi senyawa dilakukan pada panjang gelombang UV 366 nm.
24
BS13-5 Rf 0.41
K
K
BS13-5 Rf 0.72
BS13-5 Rf 0.35
K
K
BS13-11 Rf 0.27
K
K
BS13-5 Rf 0.87
K K
BS13-11 Rf 0.66
Gambar 7 Aktivitas antibakteri enam senyawa (Rf 0.35, Rf 0.41, Rf 0.72, Rf 0.87, Rf 0.27 dan Rf 0.66) yang diperoleh dengan teknik KLT preparatif terhadap EPEC K1-1. K: Kontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm. Amplifikasi Fragmen DNA Penyandi Domain Ketosintase Fragmen DNA penyandi domain ketosintase berhasil teramplifikasi dalam penelitian ini. Visualisasi DNA amplikon hasil PCR menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) memperlihatkan DNA penyandi domain ketosintase yang diperoleh dalam penelitian ini berukuran sekitar 700 pasang basa (Gambar 8).
Kloning dan Analisis Bioinformatika Kloning molekuler fragmen DNA penyandi domain ketosintase untuk ketiga isolat dalam penelitian ini telah berhasil dilakukan dengan menggunakan vektor kloning pGEMT-Easy (PROMEGA). Pemotongan plasmid rekombinan hasil isolasi dari beberapa koloni putih E. coli DH5α menggunakan enzim restriksi EcoRI telah menghasilkan pita berukuran sekitar 3000 pb yang menunjukkan ukuran pGEMT-Easy, serta pita berukuran sekitar 700 pb yang menunjukkan ukuran dari fragmen penyandi domain ketosintase (Gambar 9).
25
Hasil
analisis
bioinformatika
menggunakan
program
BLASTX
menunjukkan bahwa sekuen fragmen penyandi domain ketosintase dari isolat HAL-13 dan HAA-01 memiliki homologi sebesar 98% dengan domain ketosintase dari kluster gen PKS tipe 1 B. subtilis BSN5. Sedangkan fragmen penyandi domain ketosintase dari isolat HAL-74 memiliki homologi sebesar 87 % dari fragmen penyandi ketosintase B. amyloliquefaciens (Tabel 5). M
1
2
3
10000 pb
1500 pb 750 pb 500 pb
700 pb
Gambar 8 Elektroforesis gel agarosa fragmen DNA penyandi domain ketosintase yang berukuran 700 pb hasil amplifikasi dengan teknik PCR. M = 1 kb DNA Ladder; Lane 1 = HAL-13; Lane 2 = HAL-74; Lane 3 = HAA-01. M
1
2
3
3000 pb
pGEMT-Easy (3kpb)
750 pb
DNA sisipan (700 pb)
Gambar 9 Elektroforesis gel agarosa plasmid rekombinan pGEMT-Easy-KS yang dipotong dengan enzim restriksi EcoR1. Lane 1: 1 Kb DNA Ladder ; Lane 2, 3, dan 4: Fragmen DNA penyandi domain ketosintase isolat HAL-13, HAL-74, dan HAA-01.
26
Tabel 5 Analisis bioinformatika sekuen fragmen DNA penyandi domain ketosintase menggunakan program BLASTX. Kode
Homologi
No. Akses
Isolat
Identitas e-value (%)
HAL-13
PKS tipe 1 B. subtilis BSN5
YP_004207774
98 %
2e-131
HAL-74
PKS tipe 1 B.
YP_001422333
87 %
2e-117
YP_004207774
98%
amyloliquefaciens HAA-01
PKS tipe 1 B. subtilis BSN5
2e-125
Tingkat kemiripan antara sekuen asam amino domain ketosintase dari isolat HAL-13 dan HAA-01 terhadap B. subtilis BSN5 lebih tinggi dibandingkan sekuen domain ketosintase dari isolat HAL-74. Sekuen asam amino penyusun domain ketosintase pada isolat HAL-74 dan B. amyloliquefaciens FZB42 menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi (Gambar 10).
Gambar 10 Penyejajaran sekuen asam amino penyusun domain ketosintase isolat HAL-13, HAL-74, HAA-01, serta strain referensi dari GenBank menggunakan program CLUSTALW. Tanda arsir menunjukkan kesamaan asam amino yang dimiliki kelima isolat, sedangkan tanda kotak hitam menunjukkan homologi yang tinggi antara sekuen domain ketosintase.
27
Berdasarkan analisis hubungan filogeni berdasarkan sekuen asam amino penyusun domain ketosintase, isolat HAL-13 dan HAA-01 memiliki hubungan filogeni yang dekat dengan Streptomyces coelicolor A3 (2) dan S. avermitis MA4680. Isolat HAL-74 memiiki kekerabatan yang dekat dengan strain referensi B. amyloliquefaciens FZB42 dan B. amyloliquefaciens LL3 (Gambar 11). Isolat HAL-74, B amyloliquefaciens FZB42, serta B. amyloliquefaciens LL3 membentuk kelompok filogeni yang terpisah dari isolat Isolat HAL-13 dan HAA01 serta Streptomyces coelicolor A3 (2) dan S. avermitis MA-4680.
Gambar 11 Pohon filogeni ketiga isolat bakteri HAL-13, HAA-01, dan HAL-74 yang bersimbiosis dengan spons Haliclona sp. dan strain referensi dari GenBank berdasarkan sekuen asam amino penyusun domain ketosintase kompleks enzim PKS tipe 1.
PEMBAHASAN
Isolat HAL-13 menghasilkan ekstrak kasar senyawa antimikrob yang memiliki aktivitas antimikrob berspektrum luas terbaik diantara dua isolat lainnya. Senyawa
antimikrob yang dihasilkan isolat HAL-13
dapat
diekstraksi
menggunakan pelarut etil asetat maupun n-butanol. Aktivitas terbaik terhadap EPEC K1-1 dan S. aureus ditunjukkan oleh ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL-13 dan HAA-01. Isolat HAL-74 menghasilkan ekstrak kasar senyawa antimikrob yang memiliki aktivitas yang lebih baik terhadap C. albicans maupun C. tropicalis dibandingkan ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL-13 dan HAA-01 (Tabel 1). Uji bioautografi terhadap ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL-13, HAA-01, dan HAL-74 telah menghasilkan empat bercak fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap EPEC K1-1 dan S. aureus. Dua bercak fraksi senyawa aktif dengan nilai Rf 0.31 dan 0.81 didapatkan dari ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAL-13, sedangkan ekstrak kasar senyawa antimikrob HAA-01 dan HAL-74 masing-masing menghasilkan satu bercak senyawa aktif dengan nilai Rf 0.85 dan 0.28 (Gambar 4). Analisis bioautografi yang dilakukan dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui posisi (nilai Rf) fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob. Fraksi aktif akan menimbulkan zona bening disekitar lempeng KLT pada analisis bioautografi, sedangkan fraksi yang tidak menimbulkan zona bening merupakan pengotor pada ekstrak kasar bakteri. Metode bioautografi merupakan salah satu teknik mendeteksi fraksi senyawa aktif pada lempeng KLT selain dengan reaksi pembentuk warna maupun penyinaran UV. Ketiga metode tersebut sangat berperan dalam proses purifikasi senyawa antimikrob (Sudirman 2005). Deteksi fraksi senyawa pada lempeng silika gel dalam penelitian ini hanya menggunakan dua panjang gelombang sinar UV yaitu 254 nm dan 366 nm serta metode bioautografi. Sehingga tidak semua fraksi senyawa yang terdapat pada ekstrak kasar terdeteksi. Enteropatogenik Escherichia coli K1-1 yang resisten terhadap ampisilin dan S. aureus dipilih sebagai strain uji untuk metode bioautografi dalam penelitian ini
29
karena penyakit infeksi menular yang disebabkan oleh kedua bakteri patogen tersebut yaitu diare yang disebabkan EPEC dan ISPA yang disebabkan S. aureus masih merupakan masalah klinis yang umum terjadi di Indonesia. Keempat fraksi senyawa yang terdeteksi pada teknik bioautografi dalam penelitian ini aktivitasnya tidak dihambat oleh enzim β-laktamase yang dimiliki strain uji EPEC K1-1. Hal ini memunculkan dugaan bahwa senyawa antimikrob yang terkandung dalam keempat fraksi senyawa aktif tidak teergolong senyawa β-laktam. Isolat HAL-13 dipilih untuk diteliti lebih lanjut, karena ekstrak kasar senyawa antimikrob yang dihasilkan dari isolat tersebut memiliki aktivitas hambat berspektrum luas terbaik dibandingkan dua isolat bakteri lainnya. Fraksinasi senyawa dari ekstrak kasar etil asetat HAL-13 dilakukan menggunakan metode kromatografi kolom. Metode tersebut memungkinkan pemisahan senyawa dengan kuantitas yang lebih besar dibandingkan teknik KLT preparatif. Analisis fraksi senyawa yang dielusi dari kolom gel silika dilakukan dengan metode KLT analitik, deteksi bercak senyawa pada lempeng KLT dilakukan pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Deteksi bercak senyawa pada fraksi hasil kromatografi kolom menggunakan pereaksi pewarna tidak dilakukan dalam penelitian ini. Kromatografi kolom merupakan metode yang umum digunakan dalam memisahkan senyawa dari campurannya. Prinsip utama pengerjaan kromatografi kolom dalam penelitian ini adalah memisahkan berbagai senyawa yang terdapat pada ekstrak kasar bakteri dengan memanfaatkan polaritas yang berbeda dari setiap senyawa. Pemilihan fase diam (absorban) dan fase gerak (eluen) merupakan faktor utama yang menentukan keberhasilan fraksinasi senyawa menggunakan kromatografi kolom. Gel silika lebih sering digunakan sebagai fase diam karena memiliki kapasitas tampung yang besar terhadap sampel dan cenderung tidak menimbulkan reaksi terhadap senyawa yang dipisahkan (Hurtubise 2010). Lima fraksi senyawa yang didapatkan dari metode kromatografi kolom memiliki aktivitas antibakteri, empat fraksi aktif (BS13-5, BS13-7, BS13-11, dan BS13-3) memiliki aktivitas terhadap bakteri gram positif maupun gram negatif. Tidak ada fraksi senyawa hasil kromatografi kolom yang mampu menghambat C. albicans maupun C. tropicalis. Aktivitas anticendawan pada ekstrak kasar HAL-
30
13 diduga merupakan faktor kombinasi lebih dari satu senyawa aktif, sehingga dapat hilang akibat proses pemurnian terhadap senyawa antimikrob. Fraksinasi menggunakan kolom gel silika kemungkinan telah memisahkan senyawa aktif satu dari yang lainnya ataupun senyawa aktif dari pengotornya (Sudirman 2005). Senyawa antimikrob yang terdapat dalam fraksi aktif telah dapat ditentukan posisinya melalui teknik KLT preparatif. Fraksi BS13-5 dan fraksi BS13-11 merupakan fraksi aktif yang memiliki lebih dari satu senyawa antibakteri. Fraksi BS13-5 menghasilkan 4 senyawa antibakteri. Dua senyawa memiliki aktivitas terbaik pada Rf 0.35 dan 0.41. Sedangkan fraksi BS13-11 menghasilkan 2 senyawa antibakteri dengan nilai Rf 0.27 dan 0.66. Senyawa dengan nilai Rf 0.35 dan 0.41 (BS13-5) serta Rf 0.27 (BS13-11) memiliki aktivitas antimikrob yang kuat terhadap EPEC K1-1. Ketiga senyawa tersebut terdeteksi pada panjang gelombang UV 366 nm. Analisis kromatografi lapis tipis terhadap senyawasenyawa aktif yang terdapat pada fraksi BS13-5 dan BS13-11 dilakukan menggunakan jenis eluen yang berbeda (etil asetat dan campuran klorofommetanol). Hal ini menunjukkan polaritas yang berbeda dari senyawa aktif yang terdapat pada kedua fraksi aktif tersebut. Enteropatogenik Escherichia coli K1-1 digunakan sebagai strain uji pada teknik bioautografi maupun uji bioaktivitas terhadap senyawa aktif hasil pemurnian menggunakan teknik KLT preparatif karena bakteri tersebut memiliki nilai klinis sebagai penyebab penyakit diare dan memiliki aktivitas enzim βlaktamase. Senyawa antibiotik yang tergolong β-laktam seperti ampisilin tidak akan menghambat pertumbuhan bakteri tersebut (Ogawara 1981; Jacoby 2009), sehingga senyawa aktif (Tabel 4) yang diperoleh melalui teknik KLT preparatif dapat diasumsikan berbeda dari kelompok senyawa β-laktam. Hingga saat ini aktivitas dan penyebaran enzim β-laktamase diantara strain-strain enteropatogenik E. coli dan methicilin-resistance S. aureus (MRSA) menjadi masalah serius dalam penanganan penyakit infeksi yang diakibatkan kedua kelompok bakteri patogen tersebut (Ogawara 1981; Koch 2003). Eksplorasi dan penggunaan senyawa antimikrob diluar kelompok β-laktam merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan. Tiga senyawa antimikrob dengan nilai Rf 0.35 dan 0.41 (BS13-5) serta Rf 0.27 (BS13-11) yang berhasil diperoleh dalam penelitian ini memiliki potensi
31
untuk dikembangkan menjadi agen kemoterapi untuk menangani penyakit infeksi yang disebabkan oleh strain-strain EPEC maupun S. aureus yang resisten antibiotik golongan β-laktam. Senyawa bioaktif memiliki kelarutan yang berbeda pada setiap pelarut. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan tingkat polaritas dari setiap pelarut organik. Pelarut yang bersifat polar akan cenderung menarik senyawa polar, sedangkan pelarut yang nonpolar akan menarik senyawa nonpolar. Pemilihan suatu pelarut dalam ekstraksi dari substrat cair ditentukan oleh sifat solut (senyawa target), jenis substrat, dan nilai koefisien partisi serta rasio distribusi pelarut (Jeffery et al. 1989). Selektivitas dan efisiensi dalam proses ekstraksi dari substrat cair seperti kultur cair bakteri sangat tergantung pada pemilihan pelarut organik yang tepat. Pelarut organik yang digunakan sebaiknya memiliki sifat-sifat seperti kelarutan yang rendah pada fase akuosa, mudah diuapkan, memiliki kompatibilitas dengan metode kromatografi yang akan digunakan, dan memiliki koefisien distribusi (nilai Kd) yang tinggi (Dean 2009). Pelarut etil asetat dan nbutanol digunakan dalam penelitian ini karena bersifat nonpolar terhadap air dan memiliki koefisien partisi yang tinggi terhadap substrat cair sehingga mudah dipisahkan dari kultur cair bakteri serta menghasilkan ekstrak dengan kuantitas lebih banyak. Besarnya zona hambat yang dihasilkan senyawa bioaktif dipengaruhi oleh sifat fisik dan kimia dari senyawa tersebut. Semakin besar berat molekul senyawa bioaktif akan memperbesar zona hambat yang dihasilkan. Faktor lain yang mempengaruhi penghambatan terhadap mikroorganisme antara lain adalah kepadatan populasi sel, kepekaan mikroba target terhadap senyawa antimikrob, kandungan bahan organik, dan lama waktu mikroba target terpapar bahan antimikrob (Lay 1994). Potensi genetik ketiga isolat bakteri yang bersimbiosis dengan spons Haliclona sp. dalam penelitian ini dipelajari dengan mendeteksi keberadaan kluster gen penyandi kompleks enzim PKS tipe 1. Pencarian senyawa bioaktif baru dari bakteri maupun cendawan saat ini umumnya difokuskan pada eksplorasi enzim PKS baru dengan menganalisis keragaman dari fragmen DNA penyandi domain ketosintase. Domain ketosintase berperan dalam reaksi kondensasi dari pemanjangan rantai poliketid dan biosintesis metabolit dengan berbagai variasi
32
pada strukturnya (Moffit & Neilan 2003). Isolat HAL-13, HAL-74 dan HAA-01 memiliki fragmen DNA penyandi domain ketosintase yang merupakan domain terkonservasi pada kompleks enzim poliketid sintase. Berdasarkan hasil analisis bioinformatika sekuen DNA penyandi domain ketosintase menggunakan program BLASTX, sekuen asam amino penyusun domain ketosintase pada isolat HAL-13 dan HAA 01 memiliki homologi sebesar 98% dengan nilai e-value sebesar 2e-131 (HAL-13) dan 2e-125 (HAA-01) terhadap B. subtilis BSN5. Nilai tersebut menunjukkan sebanyak 98% sekuen asam amino penyusun domain ketosintase isolat HAL-13 dan HAA-01 adalah identik dengan sekuen domain ketosintase B. subtilis BSN5 yang ada di GenBank. Sekuen domain ketosintase isolat HAL-74 memiliki homologi dengan yang dimiliki B. amyloliquefaciens FZB42 sebesar 87% dengan nilai e-value sebesar 2e-117. Bacillus subtilis BSN5 telah dilaporkan oleh Deng et al. (2011) mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang menghambat pertumbuhan Erwinia carotovora. Analisis menggunakan program BLASTX untuk sekuen asam amino penyusun domain ketosintase pada isolat HAL-13 dan HAA-01 terhadap strain referensi B. subtilis BSN5 menunjukkan nilai homologi yang sama. Analisis penyejajaran asam amino domain ketosintase untuk ketiga bakteri tersebut menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi (Gambar 10). Berdasarkan hasil tersebut terdapat kemungkinan bahwa isolat HAL-13 dan HAA-01 menghasilkan senyawa poliketid yang sama dengan yang dihasilkan oleh B. subtilis BSN5. Isolat HAL-13 dan HAA-01 juga memiliki hubungan filogeni yang dekat dengan S. coelicolor A3(2) dan S. avermitis MA-4680 (strain referensi) yang tergolong ke dalam Actinobacteria. Banyak strain-strain dari kelompok Actinobacteria diketahui memiliki kluster gen penyandi enzim PKS tipe 1 dan telah diketahui sebagai sumber penting dari berbagai senyawa bioaktif (Moore et al. 2005). Bacillus amyloliquefaciens FZB42 telah dilaporkan mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang menghambat pertumbuhan patogen tanaman (Chen et al. 2007). Analisis sekuen DNA penyandi domain ketosintase dari isolat HAL-74 menggunakan program BLASTX menunjukkan tingkat homologi yang rendah dengan yang dimiliki oleh B. amyloliquefaciens FZB42. Hal ini juga diperkuat
33
dengan hasil analisis penyejajaran sekuen asam amino penyusun domain ketosintase antara yang dimiliki oleh isolat HAL-74 dengan B. amyloliquefaciens FZB42 (Gambar 10). Analisis hubungan filogeni menggunakan metode neighborjoining menunjukkan bahwa isolat HAL-74 memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan B. amyloliquefaciens FZB42 dan B. amyloliquefaciens LL3. Rendahnya homologi sekuen asam amino penyusun domain ketosintase yang dimiliki isolat HAL-74 dengan sekuen domain ketosintase yang terdapat di GenBank merupakan indikasi bahwa senyawa poliketid yang dihasilkan oleh isolat HAL-74 merupakan senyawa baru.
