0
ISOLASI DAN UJI ANTIMIKROB METABOLIT SEKUNDER EKSTRAK KULTUR JAMUR ENDOFIT AFKR-5 DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava (L) Merr)
FAUZI DARMA ANGGRAINI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK FAUZI DARMA ANGGRAINI. Isolasi dan Uji Antimikrob Metabolit Sekunder Ekstrak Kultur Jamur Endofit AFKR-5 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr). Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan ANDRIA AGUSTA. Jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan obat diketahui menghasilkan senyawa metabolit sekunder bioaktif seperti tumbuhan inangnya. Penelitian ini bertujuan mendapatkan metabolit sekunder bioaktif sebagai antimikrob dari jamur endofit AFKR-5 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Kebun Raya Bogor. Fraksi metanol ekstrak etil asetat kultur AFKR-5 dalam media kaldu dekstrosa kentang mampu melakukan bioproduksi metabolit sekunder bioaktif F3.4 (10.375 mg/L) dengan faktor retensi 0.30. Uji aktivitas antimikrob dengan metode difusi cakram Kirby-Bauer menunjukkan bahwa F3.4 bersifat antimikrob berspektrum luas terhadap 3 mikrob patogen, yaitu bakteri Gram positif Staphylococcus aureus, bakteri Gram negatif Escherichia coli, dan kapang Candida albicans. Penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) dilakukan dengan metode mikrodilusi cair. F3.4 memiliki potensi tertinggi dengan nilai KHM 16 µg/mL terhadap C. albicans, 2× lebih kuat dibandingkan dengan antijamur komersial Nistatin yang hanya bersifat fungistatik dengan nilai KHM 32 µg/mL. F3.4 bersifat fungisidal dengan nilai KBM 32 µg/mL terhadap C. albicans, sehingga berpotensi dikembangkan menjadi antimikrob, khususnya sebagai antijamur.
ABSTRACT FAUZI DARMA ANGGRAINI. Isolation and Antimicrobial Test of Secondary Metabolites from Endophytic Fungi AFKR-5 Culture Extract Associated with Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) Plant. Supervised by DUDI TOHIR and ANDRIA AGUSTA. Endophytic fungi associated with medicinal plant were known to produce bioactive secondary metabolites similar to its host plant. This study aimed to obtain bioactive secondary metabolites as antimicrobial from endophytic fungi AFKR-5 associated with akar kuning plant from Bogor Botanical Garden. Methanol fraction of ethyl acetate extract from AFKR-5 culture in potato dextrose broth medium was capable to produce the bioactive secondary metabolites F3.4 (10.375 mg/L) with retention factor of 0.30. Antimicrobial activity test using Kirby-Bauer disc diffusion method showed that F3.4 was a broad antimicrobial spectrum on 3 pathogenic microbes, namely Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus, Gram-negative bacteria Escherichia coli, and Candida albicans mold. The determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum fungicidal concentration (MFC) were carried out with liquid microdilution method. F3.4 was the most potential with MIC value of 16 µg/mL against C. albicans, twice as stronger than the commercial antifungal Nystatin which was only fungistatic with MIC value of 32 µg/mL. F3.4 was fungicidal with MFC value of 32 µg/mL against C. albicans, so that it is potential to be developed as antimicrobial, especially antifungal.
ISOLASI DAN UJI ANTIMIKROB METABOLIT SEKUNDER EKSTRAK KULTUR JAMUR ENDOFIT AFKR-5 DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava (L) Merr)
FAUZI DARMA ANGGRAINI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi : Isolasi dan Uji Antimikrob Metabolit Sekunder Ekstrak Kultur Jamur Endofit AFKR-5 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) Nama : Fauzi Darma Anggraini NIM : G44051737
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Drs Dudi Tohir MS NIP 19571104 198903 1 001
Dr Andria Agusta NIP 19690816 199403 1 003
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat limpahan rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul Isolasi dan Uji Antimikrob Metabolit Sekunder Ekstrak Kultur Jamur Endofit AFKR-5 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr). Penelitian dilakukan di Laboratorium Biosains-Fitokimia Bidang Botani Puslit Biologi LIPI Cibinong. Penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam dan penghargaan kepada Bapak Drs Dudi Tohir, MS dan Bapak Dr Andria Agusta selaku pembimbing yang senantiasa dengan kesabaran memberikan arahan, dorongan, semangat, saran dan solusi kepada penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada pihak Puslit Biologi LIPI Cibinong dan Bapak Dr Andria Agusta selaku Kepala Laboratorium Biosains-Fitokimia yang telah mengizinkan dan memfasilitasi penulis dalam melaksanakan penelitian ini. Penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Dr Praptiwi, Ibu Dra Yuliasri Jamal, MSc, Kak Sultoni, Bu Hertina, Kak Asep beserta staf lain dari Lab Biosains-Fitokimia Bidang Botani Puslit Biologi LIPI Cibinong yang telah banyak membantu selama penelitian, dan seluruh staf LIPI Cibinong. Ungkapan terima kasih mendalam juga rasa sayang ditujukan untuk keluarga terutama Bapak, Mama, Pupu Eric Rosady, Diah Paramita, Mas Iim, Kharisma, Dawud, Satria, Ir Widya Rachman, Bunda Retno D Lestari, dan para sahabat atas doa, kasih sayang, dan motivasinya, serta teman-teman IPB (Malia, Dian, Aulia, Diah, Vani, Dwi, Marlia, Irma, dkk), Kak Budi Arifin, Msi atas segala dukungan dan bantuannya, para dosen IPB, seluruh staf laboran, karyawan Komdik Departemen Kimia, Bu Aah, Kak Eko, Pak Didi, para staf IPB, para dokter, Prof Putra, teman-teman Primagama Merdeka Bogor, teman-teman di Lab Biosains, dan semua pihak yang telah ikut membantu atas segala dukungan, doa, dan semangatnya. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, September 2012
Fauzi Darma Anggraini
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 7 Agustus 1987 sebagai putri dari pasangan Bapak Darsono dan Ibu Siti Hasanah. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Depok dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Semenjak SMA penulis aktif mengikuti organisasi kepemudaan, generasi penerus, dan karang taruna, beberapa perlombaan sains, dan Olimpiade Sains Nasional untuk bidang Kimia pada Tahun 2004. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif menjadi panitia dan peserta beberapa acara yang diadakan oleh Imasika Departemen Kimia IPB. Selain itu, penulis pernah menjadi staf pengajar di bimbingan belajar BTA Bogor, staf Petani Center pada Himpunan Alumni IPB, dan semenjak tahun 2007 sampai sekarang penulis aktif sebagai instruktur Smart, tim marketing, koordinator dan pembuat soal mata pelajaran Kimia di Lembaga Bimbingan Belajar Primagama sektor Bogor. Bulan Juli– Agustus 2008, penulis melaksanakan kegiatan praktik lapangan di Puslit Biologi LIPI Cibinong dengan judul Isolasi dan Uji Antibakteri Metabolit Utama Ekstrak Kultur Jamur Endofit GNDP-2 yang Diperoleh dari Tumbuhan Gambir. Pada tahun yang sama penulis juga berkesempatan menjadi peserta Jambore Kebangsaan Nasional di Manokwari, Papua Barat yang dilaksanakan oleh Kesbangpol, Kementrian Dalam Negeri Republik Indonesia.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................................ viii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG...........................................................x PENDAHULUAN ...................................................................................................1 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ...............................................................................................2 Metode ............................................................................................................2 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Kultivasi Jamur Endofit ........................................................................4 Hasil Penapisan Metabolit Sekunder Kultur Jamur ........................................6 Potensi Antimikrob Ekstrak Kultur ................................................................7 Hasil Partisi dan Fraksionasi Ekstrak Kultur Aktif ........................................8 Aktivitas Antimikrob Fraksi Dominan ...........................................................9 Hasil Isolasi dan Pemurnian Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif Ekstrak Kultur .................................................................................................9 Bioaktivitas Antimikrob Isolat Metabolit Sekunder Dominan Fraksi Teraktif ..............................................................................................10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .......................................................................................................12 Saran .............................................................................................................12 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................12 LAMPIRAN ...........................................................................................................17
DAFTAR TABEL Halaman 1 Rendemen ekstrak kultur AFKR-5 ......................................................................6 2 Uji aktivitas penghambatan mikrob oleh ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 konsentrasi 100 µg/cakram..................................................................................7 3 Hasil partisi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB dengan n-heksanaMeOH (1:1) (v/v) ................................................................................................8 4 Bobot dan warna fraksi-fraksi pada Gambar 8 ....................................................9 5 Aktivitas penghambatan mikrob fraksi dominan ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB ...........................................................................................9 6 Diameter daya hambat fraksi F3.4 ....................................................................11 7 Hasil uji KHM F3.4 ...........................................................................................11
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Profil isolat jamur endofit AFKR-5 selama peremajaan pada media PDA .........5 2 Jamur endofit AFKR-5 dalam media kultivasi PDB dan GYP ...........................5 3 Ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a) dan GYP (b) .............................6 4 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (I) dan GYP (II) ..........6 5 Zona hambat ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E. coli (a), S. aureus (b), dan C. albicans (c) .....................8 6 Profil partisi n-heksana-MeOH (1:1) (v/v) ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB ..........................................................................................................8 7 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a, c, dan e) dan hasil partisi MeOH (1) dan n-heksana (2) (b, d, dan f) ................................................8 8 Fraksi-fraksi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB fraksi MeOH.............9 9 Zona hambat fraksi F3 konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E. coli (a), S. aureus (b), dan C. albicans (c) ........................................................................9 10 Profil KLT fraksi F3 dalam ekstrak EtOAc: setelah disemprot VH (a), fraksi MeOH (I) dan n-heksana (II) setelah disemprot VH (b) dan CH (c), fraksi MeOH: orisinal (d), di bawah UV 254 nm (e), setelah disemprot VH (f), dan setelah disemprot CH (g) .................................................................9 11 Profil KLT preparatif fraksi F3 ........................................................................10 12 Profil KLT fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 .............................................10
13 Fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 ...............................................................10 14 Zona hambat fraksi F3.4 (I), kontrol positif Kloramfenikol (IIa dan IIb), dan Nistatin (IIc), pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap: E. coli (a), S. aureus (b), C. albicans (c) .................................................................................10 15 Nilai KHM fraksi F3.4 ......................................................................................12
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi dan prosedur pembuatan media.......................................................18 2 Diagram alir penelitian ......................................................................................19 3 Bagan penentuan nilai KHM .............................................................................20 4 Contoh perhitungan kadar bioproduksi kultur...................................................20 5 Profil fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 ......................................................21 6 Hasil penentuan KHM fraksi F3.4 dan kontrol positif ......................................22 7 Optimasi penentuan KHM dan KBM fraksi F3.4 terhadap E. coli (a), S. aureus (b), dan C. albicans (c) ..........................................................................23
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG Singkatan
Keterangan
A.flava b/b bk C. albicans CFU CH CMMA DCM DDH E. coli EtOAc GC GYP KBM KHM KLT LAF MeOH MHA MHB N2 NA PDA PDB Rf S. aureus SB UV v/v VH
Arcangelisia flava (L) Merr ‘akar kuning’ bobot/bobot bobot kering Candida albicans colony forming units Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% corn meal mealt agar ‘agar-agar tepung jagung malt’ diklorometana diameter daya hambat Escherichia coli etil asetat growth control ‘kontrol pertumbuhan’ glucose yeast pepton ‘glukosa-ekstrak khamir-pepton’ konsentrasi bunuh minimum konsentrasi hambat minimum kromatografi lapis tipis laminar air flow ‘lemari aliran udara laminar’ metanol Mueller hinton agar ‘agar-agar Mueller Hinton’ Mueller hinton broth ‘kaldu Mueller Hinton’ gas nitrogen nutrient agar ‘agar-agar nutrien’ potato dextrose agar ‘agar-agar dekstrosa kentang’ potato dextrose broth ‘kaldu dekstrosa kentang’ faktor retensi Staphylococcus aureus Sabouraud broth ‘kaldu dekstrosa Sabouraud’ ultraviolet ‘ultraungu’ volume/volume vanilin-H2SO4
1
PENDAHULUAN Jamur endofit merupakan salah satu golongan mikrob endofit yang paling banyak ditemukan di alam (Strobel & Daisy 2003) dan sumber yang kaya akan metabolit sekunder bioaktif (Tan & Zou 2001). Oleh karena itu, Owen dan Hundley (2004) menyebutnya sebagai chemical synthesizer inside plant. Jamur ini hidup berasosiasi secara simbiosis mutualisme dengan tumbuhan inangnya. Jamur endofit menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu tanpa menimbulkan tanda-tanda adanya infeksi (Bacon & White 2000) lalu menghasilkan enzim dan metabolit sekunder yang bermanfaat bagi fisiologi dan ekologi tumbuhan inang (Tan & Zou 2001; Prihatiningtias 2006; Zhang et al. 2006), mikotoksin, dan juga antibiotik (Carrol 1988; Clay 1988) yang dimanfaatkan tumbuhan inang untuk melawan penyakit yang ditimbulkan oleh patogen tumbuhan. Sebaliknya, jamur endofit dapat memperoleh nutrisi untuk melengkapi siklus hidupnya dari tumbuhan inangnya (Petrini et al. 1992; Bacon & White 1994; Rao 1994). Jamur endofit berperanan penting dalam industri farmasi karena kemampuannya dalam memproduksi senyawa metabolit yang bervariasi, baik dari struktur maupun fungsinya. Berbagai golongan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, kuinon, terpenoid, antrakuinon, fenil propanoid, turunan isokumarin, peptida, dan senyawa alifatik, telah diisolasi dan dicirikan dari kultur jamur endofit (Agusta 2009). Senyawa bioaktif yang berasal dari jamur endofit ada yang berpotensi antimikrob (menghambat pertumbuhan atau membunuh mikrob-mikrob patogen) (Castillo et al. 2002; Strobel & Daisy 2003; Owen & Hundley 2004; Agusta et al. 2006; Simamarta et al. 2007; Jamal et al. 2008, 2009; Agusta 2009); antikanker (Kumala 2005), contohnya senyawa taksol (Stierle et al. 1993, 1994; Li et al. 1996; Strobel et al. 1996); antiserangga (Azevedo et al. 2000); zat pengatur tumbuh (Tan & Zou 2001); serta penghasil enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase, ligninase (Choi et al. 2005), dan kitinase (Zinniel et al. 2002). Potensi biologis dari jamur endofit lainnya ialah sebagai antiimunosupresif (Lee et al. 1995), anti-HIV, antioksidan (Strobel et al. 2002), antivirus (Guo et al. 2000), antidiabetes (Zhang et al. 1999, Strobel & Daisy 2003), anti-HSV-1, antituberkular (Agusta 2009), dan antimalaria (Lu et al. 2000; Simanjuntak et al. 2002; Castillo et al. 2003).
Tumbuhan famili Menispermaceae seperti akar kuning (Arcangelisia flava) memiliki aktivitas biologi sebagai antimikrob dan sitotoksik (Dzulkarnain et al. 1996; Subeki et al. 2005; Harborne 2006). Alkaloid protoberberin yang terdapat dalam akar kuning dilaporkan aktif sebagai antibiotik melawan bakteri Gram positif maupun Gram negatif seperti Escherichia coli, Salmonella typhosa, Neisseria gonorrhoeae, Diplococcus pneumoniae, Shigela dysentriae, dan Staphylococcus aureus (Jamal et al. 2011). Selain itu, tumbuhan ini telah digunakan untuk mengobati penyakit kuning, sebagai obat cacing, obat seriawan, dan di Ambon digunakan sebagai plester pada penyakit cacar (Heyne 1987). Khasiat antimalaria (Kaur et al. 2009), hepatoprotektor (Meistiani 2001; Batubara 2003), serta antioksidan dan antikanker (Keawpradub et al. 2005), juga telah dilaporkan pada tumbuhan akar kuning. Akan tetapi, pengobatan menggunakan tumbuhan obat membutuhkan banyak biomassa dan waktu tumbuh yang lama, serta dapat mengganggu kelestarian alam jika dieksploitasi secara berlebihan, sehingga diperlukan inovasi yang efektif dan efisien sebagai solusi permasalahan tersebut. Cara inovatif untuk mengefisienkan sumber senyawa bioaktif adalah dengan memanfaatkan jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan obat tersebut. Jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki aktivitas senyawa bioaktif yang sama atau bahkan lebih baik dibandingkan dengan tumbuhan inangnya, karena mekanisme perubahan kimia oleh mikroorganisme sangat mirip dengan yang terjadi pada organisme tingkat tinggi. Hal ini menguntungkan karena siklus hidup jamur endofit lebih singkat dari-pada tumbuhan inangnya dan dapat diproduksi dalam skala besar dengan menggunakan proses fermentasi. Hal ini merupakan peluang yang dapat dioptimalkan untuk memproduksi metabolit sekunder secara efisien dan cepat dengan tetap menjaga kelestarian tumbuhan obat, terutama yang sudah dikategorikan langka seperti akar kuning (Setyowati & Wardah 2007). Penelitian sebelumnya telah dilakukan oleh para peneliti Laboratorium Biosains, Bidang Botani, Puslit Biologi LIPI, terhadap beberapa isolat jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning. Di antaranya, metabolit sekunder 1,2-diamino-9,10-antrasenadion yang bersifat antibiotik, diisolasi dari jamur endofit AFK-8 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Kalimantan (Praptiwi et al. 2010). Jamur endofit
2
AFAS.F3 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Sukabumi juga dilaporkan memiliki kemampuan untuk memproduksi floroglusinol sebanyak 14.9 mg/L pada media kultivasi PDB (Jamal et al. 2011). Penggalian potensi antimikrob isolat kultur jamur endofit lainnya yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning perlu dilakukan. Oleh sebab itu, penelitian ini bertujuan mengisolasi metabolit sekunder bioaktif antimikrob dari kultur jamur endofit AFKR-5 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning koleksi Kebun Raya Bogor.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan utama adalah AFKR-5, salah satu galur jamur endofit AFKR hasil isolasi Dr Andria Agusta dari jaringan akar muda tumbuhan akar kuning asal Kebun Raya Bogor koleksi Lab Biosains-Fitokimia, Bidang Botani, Puslit Biologi LIPI Cibinong. Bahan kimia meliputi pelarut yang umum di laboratorium, dimetil sulfoksida (DMSO), gas N2, silika gel 60 (70230 mesh ASTM), reagen Dragendorf, vanilin-H2SO4, Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%, antijamur komersial Nistatin (Sigma), dan antibiotik komersial Kloramfenikol (Sigma). Media yang digunakan meliputi agar-agar nutrien (NA) (Difco), agar-agar dekstrosa kentang (PDA) (Difco), glukosa-ekstrak khamir-pepton (GYP), kaldu dekstrosa kentang (PDB) (Difco), kaldu dekstrosa Sabouraud (SB) (Criterion), agar-agar Mueller Hinton (MHA) (Criterion), dan kaldu Mueller Hinton (MHB) (Criterion). Komposisi dan prosedur pembuatan media dapat dilihat di Lampiran 1. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25923 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923, sedangkan kapang uji yang digunakan adalah kapang patogen Candida albicans ATCC 10231. Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat untuk ekstraksi, purifikasi, dan uji antimikrob, alat-alat kaca, penguap putar (Heidolph WB), UV-viewing cabinet, vorteks, test tube mixer (Vortex Sibata), autoklaf (Hiclave HVE 5.0 Hirayama), spreader, inkubator, pengering-beku (Eyela FDE 1200), syringe driven filter unit (Miller GP) ukuran 0.22 µm, platform shaker (Innova 2100), inkubator/ penangas air kocok (Kottermann), pengaduk magnet (Cimarec 3), pelat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel 60 F254 (Merck), mikro-
pipet, microtiter plate, dan laminar air flow (LAF). Metode Lingkup Penelitian Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 2. Penelitian terdiri atas kultivasi isolat AFKR-5 pada media PDB dan GYP, ekstraksi hasil bioproduksi kultur AFKR-5, uji aktivitas antimikrob ekstrak kultur AFKR-5, fraksionasi ekstrak kultur aktif, uji aktivitas antimikrob fraksi dominan ekstrak aktif, pemurnian fraksi dominan teraktif dengan KLT preparatif, serta penentuan konsentrasi hambat dan bunuh minimum (KBM) dan (KBM) metabolit sekunder bioaktif. Kultivasi Jamur Endofit AFKR-5 (Jamal et al. 2009; Agusta et al. 2010) Peremajaan Isolat Jamur endofit AFKR-5 diisolasi dengan media agar-agar jagung-malt (CMMA) pada keadaan aseptik sampai didapatkan isolat murni kemudian dipindahkan ke dalam media NA atau agar miring. Isolat AFKR-5 selanjutnya diremajakan dalam media PDA 39 g/L. Isolat AFKR-5 dalam agar-agar miring dipotong dengan diameter ± 0.5 × 0.5 cm2 dan dipindahkan ke atasnya. Media yang telah berisi jamur lalu diinkubasi pada suhu kamar dan kondisi gelap minimum 7 hari. Kultivasi Isolat (Jamal et al. 2009; Agusta et al. 2010) Dua potong inokulum jamur AFKR-5 setelah peremajaan berumur 1 minggu berdiameter ± 0.5 × 0.5 cm2 diinokulasikan masing-masing pada 200 mL media PDB (24 g/L) dan media GYP (27.21 g/L) yang sudah steril dan dingin. Kultur dibuat 4× ulangan dalam Erlenmeyer 500 mL, 1 Erlenmeyer lainnya hanya berisi media dan digunakan sebagai blangko. Seluruhnya diinkubasi di platform shaker pada suhu 27 C dengan kecepatan 120 rpm selama 14 hari. Penapisan Metabolit Sekunder Kultur Ekstraksi Kultur Filtrat (fraksi air) terlebih dahulu dipisahkan dari miselium (biomassa) dengan kertas saring. Filtrat ditampung dalam labu bulat dan dikering-bekukan kemudian bobotnya ditimbang. Miselium dihancurkan dan dimaserasi
3
dengan etil asetat (EtOAc) sebanyak 3×1 L atau sampai miselium tidak berwarna sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 1 jam untuk setiap ekstraksi. Ekstrak EtOAc disaring dari fragmen miselium lalu dipisahkan dengan corong pisah. Lapisan atas (fraksi EtOAc) dipekatkan dengan penguap putar dalam kondisi vakum, suhu air bak 30 °C, kemudian dikeringbekukan dan ditimbang bobotnya. Analisis Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak EtOAc kultur jamur dipantau pada pelat KLT silika gel 60 F254. Metode KLT dilakukan menurut Wall-hausser (1969). Ekstrak ditotolkan pada titik awal di pelat berukuran 3 × 6 cm2. Dibuat 3 buah pelat KLT, masing-masing terdiri atas 1 atau 2 titik penotolan. Bejana pengembang diisi dengan campuran diklorometana (DCM)-MeOH 10:1 (v/v) dan dibiarkan beberapa menit hingga jenuh. Pelat dimasukkan ke dalam bejana dan dielusikan sampai batas pelarut atau garis depan mendekati bagian ujung. Batas pelarut ditandai dengan pensil segera setelah pelat dikeluarkan dari bejana. Bercak diamati di bawah penyinaran sinar UV 254 dan 366 nm. Bercak tertentu akan berpendarflour dan ditandai dengan pensil. Deteksi kemudian dilakukan menggunakan pereaksi pembentuk warna, yang disemprotkan merata pada permukaan pelat. Pereaksi yang digunakan di antaranya ialah Dragendorf, vanilin-H2SO4, dan Ce(SO4)2 1%/ H2SO4 10% (Krebs et al. 1969). Pelat yang disemprotkan pereaksi Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% dan vanilin-H2SO4 dipanaskan di atas penangas hingga timbul warna yang jelas pada bercak. Uji Aktivitas Antimikrob Ekstrak Kultur Aktivitas antimikrob diuji dengan metode cakram (paper disk) Kirby-Bauer menurut panduan dalam National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2003, 2006) serta Sung & Lee (2007). Bakteri patogen E. coli dan S. aureus pada media NA yang diinkubasi 24 jam diambil sebanyak 2 ose kemudian dikultivasi pada media MHB pada suhu 37 C selama 48 jam dalam inkubator bergoyang. Bakteri uji dalam media MHB selanjutnya diinokulasi sebanyak 0.2 mL ke dalam 20 mL media MHA, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Sementara kapang uji yang digunakan, yaitu C. albicans diremajakan pada media SB dan diinokulasi pada media PDA dengan suhu inkubasi 30 C.
Uji aktivitas antimikrob dilakukan terhadap ekstrak EtOAc dan fraksi air kultur AFKR-5 pada media GYP dan PDB. Cakram kertas saring steril ditetesi 10 µL larutan ekstrak uji dengan konsentrasi 10 µg/µL dengan menggunakan mikropipet steril, lalu diletakkan di atas inokulan bakteri atau kapang uji. Aseton digunakan sebagai pelarut dan kontrol negatif. Kontrol positif ialah Nistatin dan Kloramfenikol sebagai antijamur dan antibakteri komersial, masing-masing dengan konsentrasi 10 µg/µL sebanyak 10 µL. Inokulan yang sudah diberi larutan stok diinkubasi dengan suhu 30 C untuk jamur dan 37 C untuk bakteri, selama 24 jam, lalu diamati zona hambatnya. Partisi dan Fraksionasi Ekstrak Kultur Aktif Ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 pada media PDB yang aktif sebagai antimikrob selanjutnya dipartisi dengan n-heksana dan MeOH. Fraksi MeOH dan n-heksana masingmasing dikumpulkan dan dipekatkan dengan penguap putar. Hasil partisi dipantau dengan KLT. Pelat KLT silika gel 60 F254 (Merck) sebagai fase diam dan fase geraknya campuran pelarut DCM-MeOH (10:1) (v/v). Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 dan 366 nm, kemudian disemprot dengan pereaksi Dragendorf, vanilin-H2SO4, dan Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%. Pemisahan kandungan kimia dari fraksi MeOH dilakukan dengan kromatografi kolom. Digunakan sistem isokratik dengan komposisi fase gerak DCM-MeOH (20:1; 15:1; 10:1; 5:1; 3:1; 2:1; 1:1) (v/v) dan fase diam silika gel 60 (70230 mesh ASTM). Eluat yang keluar dari kolom ditampung ke dalam tabung-tabung reaksi dan dipantau dengan KLT. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 dan 366 nm lalu disemprot dengan pereaksi Ce(SO4)2 1%/ H2SO4 10%. Tabung eluat dan nilai Rf yang sama digabung dan dijadikan 1 fraksi. Setiap fraksi dipekatkan, bila masih mengandung air dikeringkan dengan pengering-beku, kemudian ditimbang bobot keringnya. Uji Aktivitas Antimikrob Fraksi Dominan Tahapan uji aktivitas antimikrob sama seperti saat uji aktivitas awal. Bedanya stok larutan uji yang digunakan adalah fraksi-fraksi dominan dari ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB, yaitu F3 dan F10, serta fraksi n-
4
heksana hasil partisi ekstrak EtOAc sebelumnya. Isolasi dan Pemurnian Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif Fraksi F3 yang diperoleh sebagai fraksi dominan teraktif dimurnikan dengan KLT preparatif. Adsorben yang digunakan ialah pelat KLT silika gel 60 F254 (Merck). Pemisahan dilakukan menurut Wallhausser (1969). Sebanyak 20 mg fraksi F3 dilarutkan dalam aseton kemudian ditotolkan sedikit demi sedikit pada seluruh titik awal di pelat berukuran 10 × 20 cm2, penotolan berikutnya dilakukan bila penotolan sebelumnya sudah mengering sampai seluruh larutan habis. Bejana pengembang diisi dengan campuran pelarut DCM-aseton, 5:1 (v/v) dan dibiarkan beberapa menit hingga jenuh. Pelat dimasukkan ke dalam bejana dan dibiarkan sampai batas pelarut atau garis depan mendekati bagian ujung pelat. Batas pelarut ditandai segera setelah pelat dikeluarkan dari bejana. Bercak diamati di bawah penyinaran sinar UV pada 254 dan 366 nm. Bercak tertentu akan berpendar. Bercak yang terlihat baik di bawah UV ditandai dan dikerok kemudian masing-masing dilarutkan dengan aseton dan dipekatkan dengan penguap putar. Setiap fraksi dikeringkan dengan gas N2 kemudian ditimbang bobotnya. Fraksi dominan, yaitu F3.4 ditentukan nilai hambatnya terhadap mikrob uji. Penentuan Nilai Hambat Metabolit Sekunder Dominan Fraksi Teraktif Penentuan Diameter Daya Hambat (DDH) Penentuan DDH fraksi F3.4 dilakukan seperti pada uji aktivitas antmikrob awal. Cakram steril diteteskan larutan stok dengan konsentrasi 10 µg/µL menggunakan mikropipet steril sebanyak 5 dan 10 µL lalu diletakkan di atas inokulan mikrob uji. Aseton digunakan sebagai pelarut dan kontrol negatif, sedangkan sebagai kontrol positif digunakan Kloramfenikol dan Nistatin. Inokulan yang sudah diberi larutan uji diinkubasi dengan suhu 30 C untuk jamur dan 37 C untuk bakteri, selama 24 jam. Zona hambat yang ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar cakram diamati dan diukur reratanya. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Sampel uji dipersiapkan dengan konsentrasi 512 µg/mL menggunakan pelarut DMSO. Pengenceran sampel uji dilakukan berseri dari
konsentrasi 512 µg/mL menjadi 256, 128, dan seterusnya sampai 0.06 µg/mL menggunakan microtiter plate dengan 12 × 8 kolom. Untuk bakteri digunakan media MHB dan untuk kapang digunakan media SB. Misalnya, untuk uji terhadap kapang, kolom 1 berisi 0.1 mL media SB 2×, kolom 2–12 berisi 0.1 mL media SB 1×, dan disediakan kolom lain untuk kontrol pertumbuhan (GC) dan blangko. Blangko berisi 0.2 mL media SB, begitu juga untuk uji terhadap bakteri patogen. Sampel uji dipipet 0.1 mL ke dalam kolom 1, kemudian dari kolom 1 dipipet 0.1 mL ke dalam kolom 2 dan seterusnya sampai kolom 12, lalu dari kolom 12 dibuang 0.1 mL. Uji dilakukan 3× ulangan (Lampiran 3). Inokulum dipersiapkan dari mikrob uji yang telah diremajakan dan diencerkan untuk mendapatkan koloni mikrob 15 × 105 CFU/ mL. Mikrob uji tersebut dipipet 0.1 mL ke setiap kolom 1 sampai 12, kemudian microtiter plate diinkubasi bergoyang pada suhu 37 C selama 2448 jam. Dengan pengamatan visual, ditentukan konsentrasi terendah kolom masih mempertahankan kebeningannya, sebagai nilai KHM. Hasilnya dibandingkan dengan pengukuran nilai KHM antimikrob komersial, yaitu Kloramfenikol (antibakteri komersial) dan Nistatin (antijamur komersial).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Kultivasi Jamur Endofit (Jamal et al. 2009; Agusta et al. 2010) Isolat dan Hasil Peremajaan Galur jamur endofit AFKR-5 (Gambar 1), diisolasi dari jaringan akar muda tumbuhan A. flava asal Kebun Raya Bogor (Agusta et al. 2010). Isolat jamur AFKR-5 koleksi dalam media agar miring sudah menghasilkan miselium berwarna hitam, maka harus diremajakan dan minimum berumur 7 hari sebelum dikultivasi lebih lanjut pada media cair. Tujuannya ialah memastikan isolat dapat tumbuh di media PDA tanpa kontaminan, serta sudah menghasilkan miselium (Gambar 1a) dan pigmen warna (Gambar 1b). Lama waktu inkubasi juga dapat memengaruhi produksi metabolit sekunder saat proses kultivasi selanjutnya. Kecepatan berkembang dan ada tidaknya pigmentasi pada media PDA menjadi parameter dalam mengamati morfologi koloni. Secara makroskopik, jamur endofit AFKR-5 memiliki miselium berwarna putih seperti kapas (Gambar 1a; 1b; 1c), dengan ciri koloni berdasarkan panduan Benson (2001), konfigurasi
5
concentric (sepusat), bentuk tepi wavy (undulate atau bergelombang), dengan elevasi hilly (berbukit). Ciri-ciri ini mirip dengan koloni jamur Aspergillus sp. Miselium sudah mulai terbentuk pada hari ke-3 (Gambar 1a), jumlah dan ukurannya bertambah besar sejalan dengan bertambah lamanya waktu inkubasi. Bagian bawah koloni jamur atau substrat miselium dicirikan oleh penyebaran, tembusan dengan pola pigmentasi berwarna kuning kecokelatan. Warna tersebut mulai terbentuk setelah hari ke-5 dan semakin dominan sampai hari ke-14 (Gambar 1c; 1d). Kemungkinan zat warna diakibatkan adanya asosiasi antara biosintesis metabolit sekunder dan proses sporulasi pada jamur endofit. Kondisi lingkungan yang cocok sangat dibutuhkan untuk terjadinya proses sporulasi seperti media tumbuh, suhu, udara, dan cahaya. Peremajaan isolat AFKR-5 optimum dilakukan pada suhu kamar dan kondisi gelap karena secara fisiologis suhu optimum untuk pertumbuhan jamur endofit sebagai organisme saprofit ialah 2230 C dan tidak memerlukan cahaya untuk tumbuh (Pelczar & Chan 2010). Media PDA digunakan dalam proses peremajaan isolat. Karbohidrat dan glukosida dalam kentang serta dekstrosa dalam media PDA merupakan sumber karbon untuk meningkatkan kecepatan dan pemulihan pertumbuhan jamur. Pada hari ke-21, miselium sudah berwarna cokelat (Gambar 1e; 1f). Hal ini menunjukkan bahwa isolat sudah mati dan tidak menghasilkan metabolit sekunder, kemungkinan karena nutrisi yang tersedia telah habis
Gambar 1 Profil isolat jamur endofit AFKR5 selama diremajakan pada media PDA: hari ke-3 (a), ke-5 (b), ke14 (tampak atas) (c), ke-14 (tampak bawah) (d), ke-21 (atas) (e), dan ke-21 (bawah) (f). Hasil Kultivasi Isolat Jamur endofit bersifat culturable (dapat ditumbuhkan pada kondisi artifisial) (Agusta
2009). Media kultivasi jamur endofit mengandung karbon, nitrogen, belerang dan fosforus, mineral logam, vitamin, dan tentunya air (Pelczar & Chan 2010). Dalam penelitian ini digunakan 2 jenis media, yaitu media GYP 27.21 g/L dan PDB Difco 24 g/L. Kultur AFKR-5 dalam media PDB maupun GYP telah menghasilkan zat warna pada hari ke-7 (Gambar 2a; 2b). Kultivasi dilakukan sampai isolat kultur berumur 14 hari (Gambar 2c; 2d).
Gambar 2 Jamur endofit AFKR-5 dalam media kultivasi PDB dan GYP hari ke-7 (a dan b) dan hari ke14 (c dan d). Media PDB lazim digunakan untuk kultivasi jamur, kapang, dan khamir. Media ini mengandung sumber nutrisi kaya gizi (seduhan kentang) yang mendorong sporulasi kapang, produksi zat warna, dan pertumbuhan jamur secara subur (AOAC 1995; MacFaddin 1985; Pelczar & Chan 2010). Media GYP terdiri atas glukosa, ekstrak khamir, pepton, dan beberapa garam mineral. Ekstrak khamir amat kaya akan vitamin B, juga mengandung karbohidrat tinggi dan nitrogen sehingga digunakan untuk memperkaya media kultur. Pepton mengandung campuran asam amino bebas, peptida, dan protease merupakan sumber utama nitrogen. Kehadiran zat lain seperti garam mineral dapat merangsang pertumbuhan dan adanya logam alkali atau fosfat dapat menyebabkan pH netral pada pepton. Secara umum, biosintesis metabolit sekunder berasosiasi dengan proses sporulasi pada jamur endofit (Agusta 2009; Calvo 1999). Metabolit sekunder diproduksi untuk mengaktifkan proses sporulasi atau disekresikan sepanjang sporulasi berlangsung (Calvo et al. 2002; Agusta 2009). Kondisi lingkungan yang cocok sangat dibutuhkan untuk terjadinya proses sporulasi dan juga menjadi faktor penentu terbentuknya metabolit sekunder. Faktor-faktor seperti perbedaan sumber karbon dan nitrogen, pH, suhu, dan konsentrasi garam dapat memengaruhi sekresi senyawa antimikrob oleh AFKR-5. Dalam penelitian ini, media produksi dipertahankan pada suhu 27 °C, kisaran pH 57, dan dikultivasi pada media produksi selama 14 hari.
6
Hasil Penapisan Metabolit Sekunder Kultur Jamur Kultur jamur endofit AFKR-5 dalam media cair PDB dan GYP terdiri atas fraksi air/filtrat kultur dan fraksi miselium/biomassa kultur. Fraksi air (komponen polar) dipisahkan dari miselium kemudian dikering-bekukan dan didapatkan kadar bioproduksinya dalam media PDB dan GYP masing-masing sebesar 95.75 dan 660.25 mg/L (Tabel 1). Kadar bioproduksi fraksi air AFKR-5 yang lebih kecil dalam media PDB menandakan bahwa metabolit sekunder yang lebih bersifat polar dan larut air lebih sedikit jumlahnya. Tabel 1 menunjukkan, ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 dalam media PDB (Gambar 3a) memiliki kadar bioproduksi terbesar (804.125 mg/L), lebih besar dibandingkan dengan ekstrak dalam media GYP yang lebih kaya akan nutrisi (Gambar 3b) (509.875 mg/L). Contoh perhitungan rendemen diberikan pada Lampiran 4. Tabel 1 Rendemen ekstrak kultur AFKR-5 Ekstrak Fraksi AFKR-5 ekstrak
Bobot (g)
Kemampuan produksi (mg/L)
Warna
EtOAc
0.6433
804.125
Merah-cokelat
Air
0.0766
95.75
Merah
EtOAc
0.4079
509.875
Cokelat
Air
0.5282
660.25
Kuning
PDB GYP
Ekstraksi miselium kultur menggunakan metode maserasi dengan pelarut etil asetat (EtOAc). Pelarut ini umum digunakan dalam mengekstraksi kultur jamur endofit (Sarker et al. 2006; Sarker & Nahar 2007). Sifatnya semipolar sehingga dapat mengekstraksi komponen-komponen yang terdapat dalam kultur jamur. Etil asetat merupakan pelarut dengan polaritas medium (Houghton & Raman 1998). Maserasi dilakukan berulang kali, masingmasing selama 1 jam pada suhu kamar, sampai filtrat dari kultur jamur endofit tidak berwarna lagi, yang menandakan semua senyawa yang berbobot molekul rendah sudah terekstraksi (Harborne 2006). Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel, zat aktif didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang hingga terjadi kesetimbangan konsentrasi. Pengadukan akan meratakan konsentrasi larutan di luar sehingga mempercepat tercapai kesetimbangan konsentrasi bahan ekstraktif. Metode maserasi memerlukan banyak pelarut dan waktu yang lama dalam
prosesnya, tetapi dapat menjaga agar kandungan senyawa dalam contoh yang tidak tahan panas tidak rusak. Senyawa antimikrob yang bersifat atsiri akan menguap dan hilang jika dipanaskan (Branen & Davidson 1993). Ekstrak EtOAc kultur dalam media PDB dan GYP (Gambar 3) selanjutnya dianalisis KLT untuk menentukan jumlah komponen senyawa yang terdapat di dalamnya. Fase diam yang dipakai ialah silika gel 60 F254, merupakan silika yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit asam, tergolong fase normal, dan dapat berpendarflour. Larutan pengembang yang digunakan adalah DCM-MeOH. Gambar 4 (I) dan (II) memperlihatkan profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 dalam media PDB dan GYP.
Gambar 3
Ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a) dan GYP (b).
VH= vanilin-H2SO4, CH = Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%
Gambar 4 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (I) dan GYP (II). Kondisi KLT: pelat silika gel 60 F254, eluen: DCM-MeOH 10:1 (v/v), visualisasi di bawah UV 254 (a) dan 366 nm (b), setelah disemprot penampak noda VH (c) dan CH (d). Profil KLT tersebut menunjukkan komponen yang lebih banyak pada media kultivasi PDB yang juga menghasilkan kemampuan
7
bioproduksi terbesar (Tabel 1). Hal ini kemungkinan disebabkan media PDB, meskipun lebih sederhana komposisinya dibandingkan dengan media GYP (Lampiran 1), mengandung sumber nutrisi kaya gizi (seduhan kentang) yang spesifik mendorong sporulasi kapang, produksi zat warna, dan pertumbuhan jamur secara subur (AOAC 1995, MacFaddin 1985). Secara umum biosintesis metabolit sekunder ini berasosiasi dengan proses sporulasi (Agusta 2009). Penampak-noda vanilin-H2SO4 atau anisaldehida 0.5% dalam H2SO4-HOAc glasialMeOH 5:10:85 digunakan untuk mendeteksi terpenoid, umumnya menghasilkan bercak berwarna ungu, biru, atau merah. Warna ungu menunjukkan triterpenoid, warna hijau biru menunjukkan steroid. Senyawa lain yang dapat dideteksi ialah monoterpena (jingga tipis, biru, hijau kebiru-biruan); seskuiterpena (hijau kecokelatan, biru gelap, ungu, lembayung muda, merah marun, dan hijau tua), iridoid/ monoterpena lakton (biru, ungu, merah-jingga, merah); terpena alkohol (jingga kebiruan); ester geranil, terpinil, neril asetat (biru kelabu); fenolat (merah muda untuk resorsinol dan floroglusinol, flavonoid lignan, fenilpropena/fenilpropanoid; serta fase minyak atsiri/nheksana (merah jambu untuk estragol, anetol, timol; cokelat untuk miristisin, apiol, dan eugenol; merah untuk isoeugenol). Reagen Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% digunakan dalam mendeteksi keberadaan beberapa tipe alkaloid dan komponen lainnya (Houghton & Raman 1998; Gocan 2004; Harborne 2006). Potensi Antimikrob Ekstrak Kultur Berdasarkan Gambar 4 diketahui bahwa ekstrak kultur AFKR-5 memiliki beberapa profil metabolit sekunder. Di antaranya mungkin ada yang mempunyai aktivitas biologis, tetapi ada pula yang tidak. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji aktivitas biologis. Uji diarahkan pada aktivitas sebagai antimikrob. Secara etnofarmasi, tumbuhan A. flava digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional dan memiliki aktivitas biologi sebagai antimikrob (Dzulkarnain et al. 1996; Subeki et al. 2005). Uji aktivitas dilakukan secara kualitatif dengan menggunakan 2 kelompok mikroorganisme uniselular target, yaitu bakteri (prokariotik) dan kapang (eukariotik). Bakteri target yang digunakan meliputi bakteri Gram positif S. aureus dan Gram negatif E. coli, sedangkan kapang yang digunakan ialah C.
albicans. Mikrob target yang digunakan seluruhnya patogen terhadap manusia. Uji bioaktivitas antimikrob dilakukan dengan metode difusi cakram. Larutan stok ekstrak yang diketahui konsentrasinya diserap dengan cakram kertas dan dikontakkan dengan media yang telah diinokulasi mikrob uji. Untuk menurunkan limit deteksi, sistem terlebih dahulu dibiarkan pada suhu rendah selama beberapa jam sebelum diinokulasi. Perlakuan ini memberikan kesempatan kepada larutan stok untuk berdifusi sebelum mikrob tumbuh. Inkubasi selanjutnya dilakukan pada suhu yang sesuai untuk pertumbuhan mikrob uji, yaitu 37 °C untuk bakteri dan 30 °C untuk kapang selama 2448 jam. Apabila terjadi hambatan pertumbuhan terhadap mikrob uji, maka akan terlihat zona bening pada tempattempat tertentu sepanjang ekstrak bermigrasi pada lempengan cakram. Aktivitas senyawa uji dinyatakan dengan zona bening ini. Hasil uji aktivitas menunjukkan bahwa pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap mikrob uji, hanya ekstrak EtOAc kultur dengan media PDB yang berpotensi sebagai antimikrob dengan spektrum luas karena menghasilkan zona hambat terhadap semua mikrob uji, terutama kapang C. albicans (Tabel 2). Hasil ini juga menunjukkan bahwa fraksi air kultur jamur AFKR-5 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan. Sebelumnya telah dilaporkan bahwa pelarut organik memiliki efisiensi lebih tinggi dalam mengekstraksi senyawa untuk aktivitas antimikrob dibandingkan dengan air (Lima-Filho et al. 2002). Tabel 2
Uji aktivitas penghambatan mikrob oleh ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 konsentrasi 100 µg/cakram
Aktivitas daya hambat Kapang uji Bakteri uji C. albicans S. aureus E.coli PDB air GYP + + + PDB EtOAc GYP Kontrol Kloramfenikol + + (+) Nistatin + Kontrol (-) aseton + terbentuk zona bening Sampel AFKR-5
Aktivitas antibakteri ekstrak EtOAc terhadap S. aureus dan E. coli lebih lemah dibandingkan dengan aktivitas antijamur terhadap C. albicans. Zona bening yang terbentuk ditunjukkan pada Gambar 5. Kemampuan antimikrob isolat jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan A. flava merupakan bentuk aktivitas antagonis. Populasi jamur endofit yang lebih heterogen memicu terjadinya kom-
8
petisi di antara kelompok mikroorganisme. Hal ini memicu jamur endofit memiliki karakteristik antimikrob berspektrum luas. Biosintesis senyawa antimikrob berperan penting dalam proses pelekatan, kolonisasi target, hingga kompetisi dalam mendapatkan ruang dan nutrisi dengan mikrob lainnya (Long & Farook 2001; Romanengko et al. 2008).
ponen ekstrak lebih banyak yang bersifat polar. Rendemen fraksi MeOH dan n-heksana berturut-turut 68.8 dan 33.2% (Tabel 3). Pola KLT masing-masing fraksi dipantau dan dibandingkan dengan ekstrak EtOAc awal. Tabel 3 Hasil partisi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB dengan n-heksana-MeOH (1:1) (v/v) Bobot Fraksi ekstrak (g) MeOH 0.3852 n-heksana 0.1912
Gambar 5
Zona hambat ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E. coli (a), S. aureus (b), dan C. albicans (c).
. Hasil Partisi dan Fraksionasi Ekstrak Kultur Aktif Profil KLT ekstrak EtOAc kultur jamur endofit AFKR-5 dalam media PDB masih memperlihatkan beberapa komponen dengan Rf besar. Komponen ini diduga bersifat nonpolar, seperti lemak, minyak, atau hidrokarbon jenuh, karena terjerap sedikit atau tidak terjerap sama sekali pada fase diam yang bersifat polar (Stahl 1985). Untuk memudahkan isolasi zat antimikrob dalam kultur, komponen yang bersifat polar dan nonpolar dipisahkan. Di samping itu, lemak dan minyak terkadang tidak terlalu aktif secara biologis (Houghton & Raman 1998), dapat mengganggu proses difusi komponen bioaktif, dan dapat melindungi sel bakteri dari senyawa antimikrob (Moshi & Mbwambo 2005). Oleh karena itu, diharapkan potensi antimikrob komponen bioaktif ekstrak lebih besar setelah dipartisi. Partisi cair-cair menggunakan pelarut n-heksana-MeOH 1:1 (v/v) sebanyak 3× ulangan (Gambar 6).
Gambar 6
Profil partisi n-heksana-MeOH (1:1) (v/v) ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB.
Ekstrak EtOAc lebih banyak terpartisi dalam fraksi MeOH, menunjukkan bahwa kom-
Rendemen Warna rendemen (% b/b) 68.8 Merah-cokelat 33.2 Putih-kuning
Berdasarkan Gambar 7, sudah terjadi pemisahan antara komponen polar dan nonpolar. Walaupun beberapa bercak sama nilai Rf-nya, warna yang dihasilkan dengan reagen penampak-noda berbeda. Hal ini menunjukkan komponen yang berbeda. Misalnya, pada Gambar 7f.2 garis yang melengkung pada kira-kira Rf = 0.7 berwarna cokelat dan bercak di atasnya berwarna merah menunjukkan komponen minyak (Harborne 2006).
Gambar 7 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a, c, dan e) dan hasil partisi MeOH (1) dan nheksana (2) (b, d, dan f). Kondisi KLT: pelat silika gel 60 F254, eluen: DCM-MeOH 10:1 (v/v), visualisasi di bawah UV 366 nm (a dan b), setelah disemprot penampak noda VH (c dan d) dan CH (e dan f). Fraksi MeOH ekstrak EtOAc sebanyak 0.3852 g selanjutnya difraksionasi dengan kromatografi kolom sistem isokratik dengan komposisi fase gerak DCM-MeOH (20:1; 15:1; 10:1; 5:1; 3:1; 2:1; 1:1) (v/v), MeOH dan fase diam silika gel 60 (70230 mesh ASTM). Didapatkan 10 fraksi (Gambar 8; Tabel 4), dengan fraksi dominan adalah F3 dan F10 dengan bobot masing-masing 22.6 dan 47.9 mg (Tabel 4).
9
Hasil Isolasi dan Pemurnian Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif Ekstrak Kultur
Gambar 8 Fraksi-fraksi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB fraksi MeOH. Tabel 4 Bobot dan warna fraksi-fraksi pada Gambar 8. Fraksi Bobot (mg) F1 1.4 F2 0.9 F3 22.6 F4 9.1 F5 5.7 F6 11.9 F7 4.9 F8 8.5 F9 12 F10 47.9
Warna No tabung Kuning + 1 Kuning + 2 Jingga 35 Cokelat jingga ++ 68 Cokelat jingga + 911 Cokelat jingga + 1223 Cokelat jingga + 2437 Cokelat jingga ++ 3859 Cokelat jingga +++ 6088 Hitam 89habis
Profil KLT fraksi F3 ditunjukkan pada Gambar 10. Warna bercak yang terdeteksi beragam, bergantung pada pendeteksian yang digunakan. Dalam profil KLT ekstrak EtOAc, fraksi F3 terdeteksi berwarna biru-keunguan setelah disemprot penampak noda vanilinH2SO4, setelah dipartisi dalam fraksi MeOH dan disemprot reagen yang sama berwarna ungu, bercak berwarna kuning pudar sebelum disemprot reagen, dan berwarna merah muda dan abu-abu kecoklatan setelah disemprot Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%. Diduga fraksi F3 mengandung metabolit sekunder golongan terpenoid (Houghton & Raman 1998, Harborne 2006).
Aktivitas Antimikrob Fraksi Dominan Fraksi n-heksana ekstrak EtOAc AFKR-5 PDB dan fraksi dominan ekstrak EtOAc fraksi MeOH (F3 dan F10) diuji kembali bioaktivitas antimikrobnya menggunakan metode difusi cakram dengan konsentrasi 10 µg/cakram. Hanya fraksi F3 yang bersifat antimikrob (Tabel 5; Gambar 9). Hal ini menandakan fraksi F3 dalam ekstrak aktif tidak bekerja sinergis da-lam menghambat pertumbuhan mikrob. Daya hambatnya tetap ada walaupun senyawa tersebut tidak berada bersama dengan senyawa lain dalam ekstrak. Tabel 5 Aktivitas penghambatan mikrob fraksi dominan ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB Aktivitas daya hambat Kapang uji Bakteri uji C. albicans S. aureus E.coli Fraksi F3 + + + MeOH F10 Fraksi n-heksana Kloramfenikol + + Kontrol (+) Nistatin + Kontrol (-) aseton + menghambat pertumbuhan mikrob uji Sampel
Gambar 9 Zona hambat fraksi F3 konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E. coli (a), S. aureus (b), C. albicans (c).
VH= vanilin-H2SO4, CH = Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%
Gambar 10 Profil KLT fraksi F3 dalam ekstrak EtOAc: setelah disemprot VH (biru-keunguan) (a), fraksi MeOH (I) dan n-heksana (II) setelah disemprot VH (ungu) (b) dan CH (merah muda) (c), fraksi MeOH: orisinal (kuning pudar) (d), di bawah UV 254 nm (e), setelah disemprot VH (ungu) (f), dan setelah disemprot CH (abuabu kecokelatan) (g). Pemisahan lanjutan terhadap fraksi F3 dilakukan dengan KLT preparatif karena rendemen fraksi sedikit dan nilai Rf antar fraksi berdekatan, sehingga kurang efektif jika dipisahkan dengan kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan ialah pelat KLT silika gel 60 F254 (Merck) dan fase geraknya DCMaseton (5:1) (v/v). Deteksi dengan sinar UV 254 nm menunjukkan bahwa fraksi F3 terpisah menjadi 5 komponen tunggal, yaitu F3.1– F3.5 (Gambar 11). Bercak ke-2, 3, dan 4 berpendar pada UV 366 nm. Bercak tersebut ditandai sebagai fraksi F3.2, F3.3, dan F3.4 dengan warna pendarflour masing-masing kuning, kuning, dan jingga (Gambar 12). Terpenoid setelah pemisahan dengan pelarut dengan kepolaran rendah juga menghasilkan pendarflour berwarna kuning dengan latar be-
10
lakang merah muda. Oleh karena itu, ketiga fraksi tersebut diduga berasal dari golongan terpenoid.
Gambar 11 Profil KLT preparatif fraksi F3. Kondisi KLT: pelat silika gel 60 F254, eluen: DCM-aseton (5:1) (v/v), visualisasi: UV 254 nm.
Gambar 12 Profil KLT fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3. Kondisi KLT: pelat KLT silika gel 60 F254, eluen DCM-aseton (5:1), visualisasi: cahaya matahari (a), UV 254 (b), dan 366 nm (c). Nilai Rf fraksi F3.1–F3.5 berturut-turut 0.72, 0.56, 0.50, 0.30, dan 0.16 (Gambar 12). Seluruh fraksi dikerok dan dilarutkan dengan aseton lalu dipekatkan dengan penguap putar. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 13, bobotnya ditunjukkan di Lampiran 5. Fraksi F3.4 merupakan komponen dominan fraksi F3 dengan bobot 8.3 mg (41% b/b fraksi F3). Bila dihitung berdasarkan rendemen kultur, maka ekstrak kultur AFKR-5 mampu melakukan bioproduksi komponen F3.4 sebesar 10.375 mg/L. Selanjutnya fraksi F3.4 ditentukan nilai penghambatannya terhadap mikrob uji.
mikrob uji diserap dengan kertas cakram dan dikontakkan dengan media agar-agar yang telah diinokulasi mikrob uji pada jumlah tertentu. Air segera diserap ke dalam cakram dari media agar-agar, sementara antimikrob mulai berdifusi ke dalam agar-agar disekitarnya. Laju difusi melalui agar-agar tidak secepat laju keluarnya antimikrob dari cakram. Karena itu, konsentrasi antimikrob paling tinggi paling ada di dekat cakram dan menurun secara logaritmik sebagai fungsi jarak dari cakram (Jorgensen & Turnidge 2007). Laju difusi antimikrob melalui agar-agar bergantung pada sifat difusi dan kelarutan (Bauer et al. 1966) serta bobot molekul senyawa antimikrob. Molekul yang lebih besar akan menyebar lebih lambat. Setelah diinkubasi selama 24 jam, apabila terjadi hambatan pertumbuhan terhadap mikrob uji, maka akan terlihat zona bening. Diameter daerah bening ini merupakan daerah inhibisi sampel uji terhadap mikrob uji. Semakin besar diameternya, semakin besar aktivitas antimikrob. Diameter daya hambat (DDH) komponen bioaktif F3.4 terhadap mikrob uji meningkat dengan meningkatnya konsentrasi (Tabel 6). Pada konsentrasi 100 µg/cakram, F3.4 menghasilkan DDH untuk bakteri uji Gram negatif E. coli dan Gram positif S. aureus sebesar 9 dan 8 mm (Gambar 14.Ia dan b; Tabel 6). Dengan konsentrasi yang sama, F3.4 menghasilkan DDH yang lebih sensitif terhadap kapang uji C. albicans, yaitu 13 mm (Gambar 14.Ic; Tabel 6). Berdasarkan hasil tersebut, dapat dikatakan bahwa F3.4 merupakan antimikrob berspektrum luas, yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme prokariotik seperti bakteri Gram negatif maupun positif, maupun eukariotik (kapang).
Gambar 13 Fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3. Bioaktivitas Antimikrob Isolat Metabolit Sekunder Dominan Fraksi Teraktif Diameter Daya Hambat Uji bioaktivitas antimikrob fraksi F3 juga dilakukan dengan metode difusi cakram Kirby-Bauer. Dengan metode difusi ini, anti-
Gambar 14 Zona hambat fraksi F3.4 (I), kontrol positif Kloramfenikol (IIa dan IIb), dan Nistatin (IIc), pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap: E. coli (a), S. aureus (b), C. albicans (c).
11
Tabel 6 Diameter daya hambat fraksi F3.4 Sampel F3.4 Kontrol (-) aseton Kontrol (+) Kloramfenikol Kontrol (+) Nistatin
Konsentrasi 10 µg/µL (µL) 5 10
Rerata diameter DDH (mm) Bakteri uji Kapang uji C. albicans S. aureus E.coli 9 6.5 7 13 8 9
20
-
-
-
5 10 20 5 10 20
10 15 18
7 10 13.5 -
12 17 20 -
Nilai DDH kontrol positif Kloramfenikol sebagai antibakteri komersial dan Nistatin sebagai antijamur komersial juga meningkat dengan meningkatnya konsentrasi zat uji (Tabel 6). Pada konsentrasi 100 µg/cakram, Kloramfenikol menghasilkan nilai DDH terhadap bakteri E. coli dan S. aureus sebesar 17 dan 10 mm (Gambar 14.IIa dan b; Tabel 6). Dari hasil ini, Kloramfenikol didapati lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan kedua bakteri. Kloramfenikol diketahui bersifat bakteriostatik berspektrum luas, artinya dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun negatif, tetapi tidak membunuhnya sehingga pembasmian bakteri sangat bergantung pada daya tahan tubuh inang (Katzung 2001). Mekanisme kerja Kloramfenikol dalam melawan bakteri adalah dengan menghambat sintesis protein dengan cara berikatan dengan subunit 50s pada ribosom dan berefek pada penghambatan pembentukan protein (Pelczar & Chan 2010). Namun, bakteri S. aureus dan E. coli bersifat resisten baik terhadap fraksi F3.4 maupun kontrol positif Kloramfenikol karena meng-hasilkan DDH < 14 mm pada konsentrasi zat uji sebesar 50 µg/cakram. Nilai DDH Nistatin pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap bakteri kapang uji C. albicans sebesar 15 mm (Gambar 14.IIc; Tabel 6). Dibandingkan dengan fraksi F3.4 yang menghambat bakteri dan kapang, aktivitas Nistatin terbatas hanya pada kapang dan cendawan lain dengan cara bergabung dengan sterol yang terdapat dalam membran sel. Hal ini mengakibatkan kacaunya organisasi di dalam struktur molekular membran, diikuti dengan gangguan pada fungsinya. Sterol bukan komponen membran bakteri sehingga Nistatin tidak efektif bagi bakteri (Agusta 2006; Pelczar & Chan 2010). Konsentrasi Hambat Minimum Konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah antimikrob yang dapat menghambat pertumbuhan mikrob tertentu. Penentuan nilai KHM digunakan oleh
laboratorium diagnostik terutama untuk mengonfirmasi resistensi dan juga untuk menentukan aktivitas in vitro antimikrob baru. Nilai KHM spesifik untuk setiap kombinasi antimikrob dan mikrob, dan digunakan untuk menentukan kepekaan mikrob terhadap antimikrob tersebut. Semakin rendah nilai KHM sebuah antimikrob, semakin peka mikrobnya. Prinsip dasar penentuan KHM adalah mikrob uji yang disiapkan dengan kepadatan tertentu diinkubasi dengan larutan stok yang akan diuji aktivitas antimikrobnya pada konsentrasi berseri yang semakin kecil. Setelah inkubasi, pertumbuhan mikrob ditentukan secara visual atau dengan membandingkan kekeruhan kultur uji dengan kultur kontrol. Kontrol pertumbuhan (GC) adalah kultur yang berisi media dan inokulum mikrob uji, tetapi tidak diberi sampel yang akan diuji bioaktivitasnya. Setelah masa inkubasi, GC akan terlihat keruh yang menandakan terjadinya pertumbuhan mikrob. GC dapat digunakan sebagai standar tidak terjadinya penghambatan pada sumuran uji yang berisi sampel uji. Kontrol negatif berisi media dan inokulum mikrob ditambah pelarut DMSO. Tujuannya memastikan bahwa DMSO sebagai pelarut sampel uji tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap mikrob uji. Blangko hanya berisi media kultur sebagai kontrol untuk memastikan tidak terjadi kontaminasi pada pengujian ini. Konsentrasi sampel uji terendah yang menghasilkan tingkat kejernihan sumur uji mirip dengan blangko dapat ditentukan sebagai nilai KHM (Lampiran 6). Nilai KHM fraksi F3.4 terhadap bakteri Gram positif S. aureus, Gram negatif E. coli, dan kapang C. albicans menunjukkan tingkat kepekaan yang meningkat, berturutturut sebesar 64, 32, dan 16 µg/mL (Tabel 7). Aktivitas antimikrob dapat dibandingkan dengan aktivitas kontrol positif Kloramfenikol dan Nistatin. Tabel 7 Hasil uji KHM fraksi F3.4 KHM (µg/mL) Sampel F3.4 Kloramfenikol Nistatin DMSO
S. aureus 64 32 -
E. coli C. albicans 32 16 64 32 -
Kepekaan terbesar ditunjukkan oleh kapang uji C. albicans dengan nilai KHM terkecil, yaitu 16 µg/mL terhadap fraksi F3 (Gambar 15). Fraksi F3.4 ditemukan bersifat fungisidal pada konsentrasi 32 µg/mL terhadap C. albicans (KBM/KHM < 2) setelah dilakukan optimasi penentuan nilai konsen-
12
trasi bunuh minimum (KBM) fraksi F3.4 terhadap kapang uji C. albicans (Lampiran 7), dengan kultivasi pada media PDA.
Nilai KHM (µg/mL)
70
F3.4 kloramfenikol DMSO nistatin
60 50 40
pada sel mamalia/kanker (Talaro 2008). Pada penelitian ini belum dapat dipastikan mekanisme penghambatan mikrob uji oleh fraksi F3.4. Namun, AFKR-5 dapat dikembangkan ke arah obat antijamur karena bersifat fungisida setelah menjalani uji klinis lebih lanjut.
SIMPULAN DAN SARAN
30
Simpulan
20 10 0 E. coli
S. aureus
C. albicans
mikrob uji
Gambar 15 Nilai KHM fraksi F3.4. Bakteri uji S. aureus menunjukkan kepekaan yang lebih lemah dibandingkan dengan bakteri E. coli. Hal ini dapat dikarenakan bakteri S. aureus cepat menjadi resisten terhadap beberapa antibakteri (Jawetz et al. 2001) atau karena fraksi F3.4 lebih potensial dalam menghambat bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif umumnya lebih peka terhadap senyawa antibakteri karena dinding selnya mengandung lapisan peptidoglikan yang lebih tebal (90%) dibandingkan dengan bakteri Gram negatif (520%). Senyawa antibakteri dapat mencegah sintesis peptidoglikan pada sel yang sedang tumbuh, maka bakteri Gram positif seharusnya lebih peka dibandingkan dengan Gram negatif (Fardiaz & Jenie 1988). Sekalipun terdapat perbedaan, fakta bahwa bakteri Gram negatif adalah patogen paling utama dibandingkan dengan Gram positif memunculkan wawasan baru terhadap perkembangan antibakteri Gram negatif yang berasal dari jamur endofit. Mekanisme kerja antibakteri dapat terjadi melalui berbagai jalur antara lain dengan merusak struktur dinding sel, dengan cara menghambat pembentukannya atau mengubahnya setelah selesai terbentuk; mengubah permeabilitas sel yang akan mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan atau matinya sel; merusak molekul protein dan asam nukleat; menghambat kerja enzim; atau menghambat sintesis asam nukleat dan protein (Pelczar & Chan 2010). Sementara mekanisme kerja antijamur secara garis besar terbagi atas 2 jalur, yaitu apoptosis dan non-apoptosis. Mekanisme antijamur melalui proses apo-ptosis salah satunya ditandai dengan terjadinya degradasi DNA secara terpola dengan panjang 180 pasangan-basa. Proses ini identik dengan proses apoptosis
Jamur endofit AFKR-5 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Kebun Raya Bogor dapat melakukan bioproduksi komponen bioaktif sebagai antimikrob berspektrum luas terhadap bakteri Gram positif S. aureus, Gram negatif E. coli, dan kapang patogen C. albicans. Media kultivasinya ialah PDB dengan kondisi kultivasi menggunakan pengocok pada kecepatan 120 rpm, suhu 27 °C selama 2 minggu, menghasilkan F3.4 sebesar 10.375 mg/L. Aktivitas penghambatan terbesar ialah terhadap kapang Candida albicans dengan nilai DDH pada konsentrasi 100 µg/cakram sebesar 13 mm, nilai KHM sebesar 16 µg/mL, dan bersifat fungisidal dengan nilai KBM 32 µg/mL. Aktivitas F3.4 2× lebih baik dibandingkan dengan antijamur komersial Nistatin yang hanya bersifat fungistatik dengan nilai KHM sebesar 32 µg/mL. Oleh karena itu, isolat AFKR-5 dalam media PDB berpotensi dikembangkan sebagai antimikrob, khususnya menjadi obat antijamur. Saran Perlu dilakukan optimasi faktor-faktor yang memengaruhi produksi antimikrob kultur jamur endofit AFKR-5. Di samping itu, perlu dilakukan identifikasi jamur endofit AFKR-5, serta analisis lebih lanjut berupa penentuan struktur komponen bioaktif F3.4, penentuan mekanisme antimikrobnya, dan pengujian secara klinis agar dapat digunakan untuk pengembangan antimikrob khususnya antijamur untuk manusia.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 1995. Bacteriological Analytical Manual. Ed ke-8. Gaithersburg MD: AOAC International. Agusta A. 2006. Diversivitas jalur biosintesis senyawa terpena pada makhluk hidup se-
13
bagai target obat antiinfektif: tinjauan ulang. Berita Biol 8:142-151. Agusta A, Ohashi K, Shibuya H. 2006. Composition of the endophytic fungi isolated from tea plant Camelia sinensis. J Nat Med 60:268-272. Agusta A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: ITB Pr. Agusta A, Jamal Y, Praptiwi, Fathoni A. 2010. Biooxidation of berberine by the endophytic fungus Coelomycetes AFKR-1 isolated from kayu kuning [Archangelisia flava (L.) MERR: Menispermaceae]. Di dalam: Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity. International Seminar Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity; Bandung, 18-20 Okt 2010. Bandung: Universitas Pajajaran, 2010. hlm hlm 1-6. Atlas RM. 1993. Handbook of Microbiological Media. Boca Raton: CRC Pr. Azevedo JL, W Maccheroni, JO Pereira, W Luiz. 2000. Endophytic microorganism: A review on insect control and recent advances on tropical plants. Electr J Biotechnol 3:40-65. Bacon CW, White JF. 1994. Biotechnology of Endophytic Fungi of Grasses. Boca Raton: CRC Pr. Bacon CW, White JF. 2000. Microbial Endophytes. New York: Marcel Dekker. Batubara I. 2003. Saponin akar kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) sebagai hepatoprotektor: ekstraksi, pemisahan, dan bioaktivitasnya [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol 36:493-496. Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual. Ed ke-8. Fornango J, Smith J, editor. New York: McGraw-Hill. Branen AL, Davidson PM. 1993. Antimicrobial in Food. New York: Marcel Dekker.
[CLSI] National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute. 2003. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, Approved Standard. Ed ke-6. Wayne PA: CL-SI. [CLSI] National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute. 2006. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing, Approved Standard. Ed ke-9. CLSI Document M2 A9.26:1. Wayne PA: CLSI. Calvo AM, Hinze LL, Gardner HW, Keller NP. 1999. Sporogenic effect of polyunsaturated fatty acids on development of Aspergillus spp. Appl Environ Microbiol 65:3668. Calvo AM, Wilson RA, Bok JW, Keller NP. 2002. Relationship between secondary metabolism and fungal development. Microbiol Mol Biol Rev 66:447. Carrol GC. 1988. Fungal endophytes in stem and leaves from latent pathogens to mutualistic symbiont. Ecology 69:2-9. Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ, Hess WM, Poter H, Jenson JB, Albert H, Robinson R, Condron MA, Teplow DB et al. 2002. Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Steptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans. Microbiology 148:2675-2685. Castillo UJ. Harper K, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, Lin J, Hunter M, Maranta M, Ge H et al. 2003. Kakandumycins, novel antibiotica from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Lett 24:183-190. Choi YW, Hodgkiss IJ, Hyde KD. 2005. Enzyme production by endophytes of Brucea javanica. J Agric Tech 1:55-65. Clay K. 1988. Fungal endophytes of grasses: A defensive mutualism between plants and fungi. Ecology 69:10-16. Dzulkarnain B, Sundari D, Chozin A. 1996. Tanaman obat bersifat antibakteri di Indonesia. J Cermin Dunia Kedokteran 110:3548.
14
Fardiaz S, Jenie BSL. 1988. Microbiologi Pangan II. Bogor: PAU IPB.
logy. Ed ke-9. Washington DC: ASM Pr. hlm 1152-1172.
Gocan S, 2004. Analysis of Terpenoids by Thin-Layer Chromatography. Di dalam: Cazes J, editor. Encyclopedia of Chromatography. New York: Marcel Dekker. hlm 1-6.
Katzung BG. 2001. Basic and Clinical Pharmacology. Ed ke-8. San Fransisco: McGraw-Hill.
Guo B, Dai J, Ng S, Huang Y, Leong C, Ong W, Carte BK.. 2002. Cytonic acid A dan B, novel tridepside inhibitor of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaena sp. J Nat Prod 63:602-604. Harborne JB. 2006. Metode Fitokimia. Ed ke-2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Ed ke-4. Balitbang Kehutanan, penerjemah. Jakarta: Yayasan Sarana Warna. Terjemahan dari: Useful Indonesian Plants.
Kaur K, Jain M, Kaur T, Jain R. 2009. Antimalarials from nature. Bioorg Med Chem 17:2950-2962. Keawpradub N, Yuenyongsawad S, Dejadisai S. 2005. Antioxidant and cytotoxic activities of Thai medicinal plants named khaminkhruea: Arcangelisia flava, Coscinum blumeanum, and Fibraurea tinctoria. Songklanakarin J Sci 27:455-467. Krebs KG, Heusser D, Wimmer H. 1969. Spray Reagents. Di dalam: Stahl E, editor. Thin Layer Chromatography: A Labor tory Handbook. Berlin: Springer -Verlaag. hlm 855-911.
Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractination of Natural Extracts. Ed ke-1. London: Chapman & Hall.
Kumala S. 2005. Isolasi dan penapisan mikroba endofit tanaman Brucea-javanica (L) Merr. serta uji sitotoksik metabolit sekunder terhadap beberapa sel kanker secara in vitro [disertasi]. Jakarta: Program Pascasarjana, Universitas Indonesia.
Jamal Y, Ilyas M, Katit A, Agusta A. 2008. Diversitas dan profil metabolit sekunder jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan gambir (Uncaria gambier) serta aktivitasnya sebagai antibakteri. Berita Biol 9:149154.
Lee J. Lobkovsky E. Pliam NB, Strobel GA, Clardy J. 1995. Subglutinols A and B; immunosuppressive compounds from the endophytic fungus Fusarium subglutinans. J Org Chem 60:7076-7077.
Jamal Y, Ilyas M, Katit A, Agusta A. 2009. Keragaman jenis jamur endofit pada tumbuhan pandan wangi (Pandanus amarylifolius) dan aktivitas antijamur metabolit yang diproduksinya. Biota 14:81-86. Jamal Y. Praptiwi, Fathoni A, Agusta A. 2011. Bioproduksi floroglusinol oleh jamur endofit coelomycetes AFAS-F3 yang diisolasi dari tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr. Berk Penel Hayati 16:169172. Jawetz E, Melnick J, Adelberg E. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Ed ke-20. Jorgensen JH, Turnidge JD. 2007. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Di dalam: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry M, Pfaller M, editor, Manual of Clinical Microbio-
Li J, Strobel GA, Sidhu R, Hess WM, Ford EJ. 1996. Endophytic taxol producing fungi from bald cypress, Taxodium distichum. Microbiology 142:2223-2226. Lima-Filho JVM., Carvalho AFFU, Freitas SM, Melo VMM. 2002. Antibacterial activity of extracts of six macroalgae from the northeastern Brazilian coast. Braz J Microbiol 33:311-313. Long RA, Farook A. 2001. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria. Appl Environ Microbiol 67:49754983. Lu H, Zou WX, Meng JC, Hu J, Tan RX. 2000. New bioactive metabolites produced by Colletotrium sp., an endophytic fungus in Artemisia annua. Plant Sci 151:76-73.
15
Moshi MJ, Mbwambo ZH. 2005. Some pharmacological properties of extract of Terminalia sericea roots. J Ethnopharm 97:4347. MacFaddin JF. 1985. Media for Isolation Cultivation-Identification Maintenance of Medical Bacteria. Vol ke-1. Baltimore: Williams & Wilkins. Meistiani Y. 2001. Isolasi dan identifikasi senyawa alkaloid dari akar kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Owen NL, Hundley N. 2004. Endophytes the chemical synthesizer inside plant. Sci Prog 87:79-99. Pelczar MJ, Chan ECS. 2010. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid ke-1 dan 2. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Petrini OTN, Sieber LT, Viret O. 1992. Ecology metabolite production and substrate utilization in endophytic fungi. Nat Toxin 1:189196. Praptiwi, Jamal Y, Fathoni A, Agusta A, 2010. Antimicrobial metabolite from the culture of endophytic fungus AFK-8 isolated from kayu kuning (Archangelisia flava (L.) Merr. Di dalam: Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity. International Seminar Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity; Bandung, 18-20 Okt 2010. Bandung: Universitas Pajajaran, 2010. hlm 35-43. Prihatiningtias W. 2006. Mikroba Endofit Sumber Penghasil Antibiotik yang Potensial. Fakultas Farmasi UGM. [terhubung berkala]. http://www.biotek.lipi.go.id/index.html [19 Mar 2012]. Rao NS. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Ed ke-2. Jakarta: UI Pr. Susilo H, penerjemah. Terjemahan dari: Soil Microorganisms and Plant Growth. Romanengko LA, Naoto T, Masataka U, Natalia IK, Valery VM. 2008. Diversity and antagonistik activity of sea ice bacte-
ria isolated from the sea of Japan. Micro Environ 23:209-214. Sarker SD, Latif Z, Gray AI. 2006. Natural Products Isolation. Ed ke-2. (Methods in Biotechnology. Vol ke-20. New Jersey: Humana Pr. Sarker SD, Nahar L. 2007. Chemistry for Pharmacy Student (General, Organic and Natural Product Chemistry). Chichester: J Wiley. Setyowati FM, Wardah. 2007. Keanekaragaman tumbuhan obat masyarakat Talang Mamak di sekitar Taman Nasional Bukit Tigapuluh, Riau. Biodiversitas 8: 228-232. Simamarta R, Sylvia L, dan Harmastini. 2007. Isolasi mikroba endofit dari tanaman obat sambung nyawa (Gyunura procumbens) dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 15:85-99. Simanjuntak P, Parwati T, Bustanussalam, Prana TK, Wibowo S, Shibuya H. 2002. Isolasi dan kultivasi mikroba endofit penghasil senyawa alkaloid kinkona dari Chinchona spp. J Mikrobiol 7:27-30. Stahl E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: ITB Pr. Terjemahan dari: Drug Analysis by Chromatography and Microscopy: a Practical Supplement to Pharmacopoeias. Stierle A, Stierle D, Strobel GA. 1993. Taxol and taxane production by Taxomyces andreana, endophytic fungus of pacific yew. Science 260:214-216. Stierle A, Stierle D, Strobel G, Bignami G, Grothaus P. 1994. Endophytic fungi of pacific yew (Taxus brevifolia) as a source of taxol, taxanes, and other pharmacophores in bioregulators for crop protection and pest control. J Am Chem Soc 557: 64-77. Strobel GA, Hess WM, Ford E, Sidhu RS, Yang X. 1996. Taxol from fungal endophytes and the issue of biodiversity. J Indust Microbiol 17:417-425.
16
Strobel GA, Ford E, Woapong J, Harper JK, Arif AM, Grant DM, Fung PCW, Chan K. 2002. Isopestacin, an isobenzopuranone from Pestalotiopsis microspora, prossesing antifungal and antioxidant activities. Phytochemistry 60:179-183. Strobel GA, Daisy B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol Mol Biol Rev 67:419502. Subeki, Matsuura H, Takahashi K, Yamasaki M, Yamato O, Maede Y, Katakura K, Suzuki M, Trimurningsih, Chairul et al. 2005. Antibabesial activity of protoberberine alkaloids and 20 hidroxyecdysone from Arcangelisia flava against Babesia gibsoni in culture. J Vet Med Sci 67:223227. Sung WS, Lee DG. 2007. Indole-3-carbaniol against human pathogenic microorganisms. Biol Pharm Bull 30:1865-1869. Talaro KP. 2008. Foundation in Microbiologi. Ed ke-6. New York: McGraw-Hill.
Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat Prod Rep 18:488-459. Wallhausser KH. 1969. Antibiotics. Di dalam: Stahl E, editor. Thin-Layer Chromatography: A Laboratory Handbook. Berlin: Springer-Verlaag. hlm 566-577. Zhang B, Salituro G, Szalkowski D, Li Z, Zhang Y, Royo I, Vilella D, Dez M, Pelaes F, Ruby C et al. 1999. Discovery of small molecule insulin mimetic with antidiabetic activity in mice. Science 284:974-981. Zhang HW, Song YC, Tan RX. 2006. Biology and chemistry of endophytes. Nat Prod Rep 23: 753-771. Zinniel DK, Lambrecht P, Haris NB, Feng Z, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru CA, Arunakumari A, Barletta RG, Vidader AK. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomics crops and prairie plants. Appl Environ Microbiol 68:2198-2208.
17
LAMPIRAN
18
Lampiran 1 Komposisi dan prosedur pembuatan media (Atlas 1993; Agusta 2009) Media agar-agar dekstrosa kentang (PDA) Difco
Media kaldu dekstrosa Sabouraud (SB) Criterion
Bahan Jumlah agar-agar 15 g seduhan kentang 4 g dekstrosa 20 g air 1 L pH akhir 5.6 ± 0.2, suhu 25 ºC
Bahan Jumlah pepton kasein 5 g pepton jaringan hewan 5 g dekstrosa 20 g air 1 L pH akhir 5.7 ± 0.2 pada 25 ºC untuk komposisi media 2×, dibuat 2× resep awal
Peremajaan isolat AFKR-5. Sebanyak 2.34 g bubuk PDA dilarutkan dengan 60 mL air dalam Erlenmeyer 100 mL sambil diaduk. Media disterilkan dengan autoklaf. Setelah didinginkan sampai 4050 °C, media PDA dituang ke dalam 3 buah cawan petri steril, masing-masing berisi 20 mL media. Media dibiarkan memadat. Pembuatan media uji. Media dibuat seperti pada peremajaan isolat jamur, tetapi dengan melarutkan 3,9 g bubuk PDA dalam 100 mL air, dituang ke 5 cawan petri. Semua proses sterilisasi dengan autoklaf dilakukan selama 15 menit pada suhu 121 C (15 lbs). Media kaldu dekstrosa kentang (PDB) Difco Bahan Jumlah pati kentang 4 g dekstrosa 20 g air 1L pH akhir 5.6 ± 0.2, suhu 25 ºC
Media glukosa-ekstrak khamir-pepton (GYP) Bahan glukosa ekstrak khamir pepton K2HPO4 FeSO4∙7H2O MgSO4∙7H2O CaCO3 air
Jumlah 20 g 1 g 5 g 0.5 g 10 mg 0.5 g 0.2 g 1 L
Pembuatan media kultivasi mikrob uji Media MHB. Media MHB dibuat 2 komposisi: 21 g/L, dengan melarutkan 2.1 g MHB dalam 100 mL, dan 42 g/L, dengan melarutkan 4.2 g MHB dalam 100 mL air. Media disterilkan dengan autoklaf. Media SB. Media SB juga dibuat 2 komposisi, 1.5 g SB dalam 50 mL air (30 g/L) dan 3.0 g SB dalam 50 mL air (60 g/L). Media disterilkan dengan autoklaf. Media agar-agar nutrien (NA) Difco Bahan Jumlah agar-agar 15 g gelatin pepton 5 g ekstrak sapi 3 g air 1 L pH akhir 6.8 ± 0.2 suhu 25 ºC
Pembuatan media peremajaan mikrob uji Sebanyak 1.38 g bubuk NA dilarutkan dengan 60 mL air dalam Erlenmeyer 100 mL lalu disterilkan dengan autoklaf. Setelah didinginkan sampai 4050 °C, media dituang ke dalam 6 tabung reaksi steril hingga masingmasing berisi 10 mL media. Tabung dimiringkan dan dibiarkan memadat, kemudian diinokulasikan mikrob uji dan diinkubasi pada suhu 37 C. Media agar-agar Mueller Hinton (MHA)
Pembuatan media kultivasi Media GYP dan 24 g bubuk PDB masing-masing dilarutkan dengan 1 L air. Setelah larut, media dibagi 5 masing-masing dalam Erlenmeyer 500 mL dan diautoklaf. Media kaldu Mueller Hinton (MHB) Criterion Bahan asam kasein hidrolisat
Jumlah 17.5 g
ekstrak sapi Pati air
2 g 1.5 g 1 L
pH 7.4 ± 0.2, suhu 25 ºC
Bahan asam kasein hidrolisat ekstrak sapi pati agar-agar air pH 7.4 ± 0.2, suhu 25 ºC
Jumlah 17.5 g 2 g 1.5 g 17 g 1 L
Pembuatan media uji Sebanyak 7.6 g MHA dilarutkan dalam 200 mL air lalu disterilkan dengan autoklaf. Setelah didinginkan sampai 4050 C, media dituang ke dalam cawan petri steril, masingmasing berisi 20 mL media, dan dibiarkan memadat.
19
Lampiran 2 Diagram alir penelitian
20
Lampiran 3 Bagan penentuan nilai KHM: pengenceran larutan stok (a) dan penambahan inokulum mikrob uji (b) a a )
b a )
Lampiran 4 Contoh perhitungan kadar bioproduksi kultur Bobot kering ekstrak EtOAc: 643.3 mg Bobot kering ekstrak air : 76.6 mg Media kultivasi PDB: 4×200 mL = 0.8 L Kadar fraksi EtOAc media PDB
= =
bobot kering volume media
643.3 mg 0.8 L
= 804.125 mg/L Kadar fraksi air
= =
bobot kering volume media
76.6 mg 0.8 L
= 95.75 mg/L
21
Lampiran 5 Profil fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3
Fraksi
Bobot (mg)
% (b/b)
Kadar bioproduksi (mg/L)
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
5.7 1.3 1.9 8.3 2.4
28.50 6.50 9.50 41.5 12.00
7.125 1.625 2.375 10.375 3.000
Warna fraksi Kuning pudar + Kuning pudar + Kuning pudar ++ Cokelat-jingga ++ Kuning ++
Bobot fraksi F3 awal sebelum dipurifikasi Volume media kultivasi
= 20 mg = 0.8 L
Cara perhitungan % rendemen F3.1
=
bobot sampel bobot F3 awal
=
5.7 mg 20 mg
Asli / cahaya matahari Jingga pudar Jingga-cokelat Kuning pudar
Warna bercak UV 254 nm Kuning pudar Ungu Jingga-lembayung Jingga-cokelat
UV 366 nm Berpendar kuning Berpendar kuning Berpendar jingga pekat -
Rf 0.72 0.56 0.51 0.30 0.16
× 100% (b/b)
× 100% (b/b)
= 28.50 % (b/b) Cara perhitungan kadar bioproduksi F3.1
=
bobot sampel volume media
=
5.7 mg 0.8 L
= 28.50 mg/L 21
22
Lampiran 6 Hasil penentuan KHM fraksi F3.4 (a) dan kontrol positif (b) terhadap S. aureus ATCC 25923 (I), E. coli ATCC 25922 (II), dan C. albicans ATCC 10231
Tanda ( ) menunjukkan sumuran dengan konsentrasi terendah yang masih mempertahankan kebeningannya (nilai KHM dalam µg/mL).
23
Lampiran 7 Optimasi penentuan KHM dan KBM fraksi F3.4 terhadap C. albicans ATCC 10231
Cuplikan sumuran pada media PDA; konsentrasi 32, 16, dan 8 µg/mL, masingmasing 20 µL. (a) sebelum diinkubasi (b) setelah diinkubasi 24 jam (c) setelah diinkubasi 48 jam (d) kontrol pertumbuhan C. albicans setelah diinkubasi 24 dan 48 jam
