SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN GINSENG KUNING (Rennellia elliptica Korth

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN GINSENG KUNING (Rennellia elliptica Korth.)

SKRIPSI

AINUL MARDIAH NIM. 109102000046

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA OKTOBER 2013

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA


SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AINUL MARDIAH NIM. 109102000046

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA OKTOBER 2013 ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama

: Ainul Mardiah

NIM

: 109102000046

Tanda Tangan

:

Tanggal

: 2 Oktober 2013

iii

HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI

Nama NIM Program Studi Judul Skripsi

: Ainul Mardiah : 109102000046 : Farmasi : Skrining, Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

Menyetujui,

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Andria Agusta

Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt.

NIP. 1969081661994031003

Mengetahui, Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt.

iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Ainul Mardiah NIM : 109102000046 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi : Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing 1 : Dr. Andria Agusta

(

)

Pembimbing 2 : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt.

(

)

Penguji

1 : Lina Elfita, M.Si., Apt

(

)

Penguji

2 : Eka Putri, M.Si., Apt.

(

)

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 2 Oktober 2013

v

ABSTRAK

Nama Jurusan Judul

: Ainul Mardiah : Farmasi : Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

Sebanyak dua puluh tiga isolat jamur endofit dari tumbuhan bagian akar, biji, daun dan batang tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) telah dikultivasi pada medium Potato Dextrose Broth/ PDB selama tiga minggu pada suhu ruang dan kondisi statis. Jamur endofit GKBt 2 yang diisolasi dari bagian batang menunjukkan aktivitas antibakteri paling besar terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada uji menggunakan metode bioautografi. Scaling Up kultivasi jamur GKBt 2 selama 3 minggu menghasilkan sebanyak 830 mg ekstrak etil asetat media PDB. Fraksinasi dan pemurnian fraksi aktif yang dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif menghasilkan fraksi F.5.8a dan F.5.8b masing- masing memiliki bobot 4,5 mg dan 5 mg. Hasil uji Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) menunjukkan bahwa F.5.8a dan F.5.8b aktif melawan bakteri S. aureus masingmasing sebesar 256 µg/mL sedangkan nilai KHM terhadap bakteri E. coli masingmasing sebesar 128 µg/mL.

Kata kunci : Ginseng Kuning, Rennellia elliptica Korth, jamur endofit, aktivitas antibakteri, Jamur GKBt 2, fraksi aktif.

vi

ABSTRACT

Name : Ainul Mardiah Program study : Pharmacy Title : Screening, Isolation, and Antibacterial Activity of Bioactive Metabolite From Endophytic Fungi Associated with Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

Twenty-three isolates of endophytic fungi from root, seed, leaf and stem of Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) was cultivated in Potato Dextrose Broth for three weeks in room temperatur and static condition. GKBt 2, the endophytic fungus was isolated from the stem showed the most active of antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli by using bioautography method. Scaling up cultivation of GKBt 2 in 5 L PDB yielded 830 mg ethyl acetat exctract of media. Fractionation and purification of bioactive compound which was performed by using column chromatography and preparative thin layer chromatography produced two fractions, they are F.58a (4,5 mg) and F.58b (5 mg). Fractions F.5.8.a and F.5.8b showed antibacterial activities against S. aureus with Minimum Inhibitory Concentration (MIC) value is 256 µg/ml respectively whereas the MIC value of the fractions against E. coli is 128 µg/ml.

Keywords : Ginseng Kuning, Rennellia elliptica Korth, endophytic fungi, antibacterial activity, GKBt 2 fungi, active fraction.

vii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahiim. Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini. Shalawat beriring salam atas junjungan besar Nabi Muhammad SAW yang telah memberikan petunjuk kebenaran sebagai rahmat sekalian alam Skripsi dengan judul “Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth)” ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana farmasi di Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Penulis menyadari bahwa tanpa adanya bantuan dan bimbingan dari banyak pihak, penelitian dan penyelesaian skripsi ini akan dirasakan sulit. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Bapak Dr. Andria Agusta selaku pembimbing pertama dan Ibu Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua yang senantiasa memberikan arahan, dukungan, semangat, saran dan solusi selama melaksanakan penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Semoga Allah membalas jasa Bapak dan Ibu dengan sebaik-baiknya balasan. 2. Kementrian Agama RI selaku pemberi beasiswa, sehingga penulis dapat menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Prof. Dr. (hc) dr. M.K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

viii

5. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 6. Ibu Dr. Praptiwi, Ibu Yuliasri Jamal, M.Sc., Mas Toni, Teh Dewi, Pak Asep, Pak Lukman beserta staf lain dari Lab Biosains Bidang Botani Puslit LIPI Cibinong yang telah banyak membantu selama penelitian 7. Ayahanda Abdul Jalil AR dan Ibunda Rohani, yang tiada jemu memberikan doa, dukungan, dan nasihat. Keluarga besar Kak Nia, Kak Eli, Kak Indah, Bang Di, Bang Wan, Bang Rus dan Bang Yon yang selalu memberikan motivasi dan kebahagiaan dalam kehidupan ini. 8. Nurul Robiatul Adawiyah, sahabat, kakak, dan teman berbagi duka dan suka yang selalu memberikan keceriaan. 9. Rekan-rekan CSS MoRA 2009 (Community Santri Scholar of Ministry of Religious Affair), teman-teman Farmasi 2009, teman-teman IMAPA, terkhusus untuk sahabat-sahabat terbaik Dian, Mayra, Tika, Rya, Kak ya, Kak Ki, Amah, Elia, Susi, Fina, Leli, Nuyung, Feri, Zaki, Ema, Neneng, Yunita, Dyah, Cucut yang selalu menyemangatiku

ketika

lelah dan menjadi motivator bagiku. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis sangat berterimakasih terhadap adanya kritik dan saran yang membangun sehingga skripsi ini bisa menjadi lebih baik lagi. Saya berharap semoga skripsi ini bermanfaat dan dapat menjadi sumbangan pengetahuan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu kesehatan khususnya, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan pembaca pada umumnya.

Ciputat, 2 Oktober 2013 Penulis

ix

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama

: Ainul Mardiah

NIM

: 109102000046

Program Studi

: Farmasi

Fakultas

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya

: Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :


untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di

: Jakarta

Pada tanggal : 2 Oktober 2013

Yang menyatakan,

(Ainul Mardiah)

x

DAFTAR ISI Halaman

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iv HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ v ABSTRAK ........................................................................................................... vi ABSTRACT ........................................................................................................ vii KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................ x DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................. 1 1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 3 1.3 Hipotesis ............................................................................................. 3 1.4 Tujuan Penelitian................................................................................ 3 1.5 Manfaat Penelitian.............................................................................. 4 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 5 2.1 Jamur Endofit .................................................................................... 5 2.2 Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) .................. 7 2.3 Antimikroba ...................................................................................... 9 2.4 Uji Aktivitas Antimikroba .................................................................. 10 2.5 Kromatografi ...................................................................................... 15 2.6 Bakteri Gram Positif dan Negatif ...................................................... 21 2.7 Bakteri Uji ......................................................................................... 22 BAB 3 METODE PENELITIAN ...................................................................... 24 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 24 3.2 Alat dan Bahan .................................................................................. 24

xi

3.3 Tahapan Penelitian ............................................................................ 26 3.4 Prosedur Kerja 3.4.1

Skrining Produksi Metabolit Sekunder ................................. 26

3.4.2 Uji Aktivitas Antibakteri ......................................................... 27 3.4.3

Scaling Up Kultivasi Jamur GKBt 2 ...................................... 29

3.4.4

Ekstraksi Kultur Jamur hasil Scaling Up .............................. 30

3.4.5

Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat GKBt 2 ................. 31

3.4.6

Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Purifikasi ............................. 32

3.4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 ...................... 35 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 36 4.1 Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder ......................................... 36 4.2 Uji Aktivitas Antibakteri .................................................................. 38 4.3 Scaling Up Kultivasi Jamur Endofit GKBt 2 .................................... 42 4.4 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scalling Up ............................ 43 4.5 Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat GKBt 2 .............................. 45 4.6 Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Purifikasi .......................................... 48 4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2.................................. 50 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 53 5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 53 5.2 Saran .................................................................................................. 53 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 54

xii

DAFTAR GAMBAR Halaman

Gambar 2.1. Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) .................. 7 Gambar 2.2. Klasifikasi metode uji antimikroba ................................................. 12 Gambar 4.1. Hasil skrining bioproduksi metabolit sekunder ekstrak ................... 37 Gambar 4.2. Hasil skrining antibakteri ekstrak etil asetat ................................... 39 Gambar 4.3. Hasil bioautografi antibakteri elusi ekstrak etil asetat GKBt 2 ........ 42 Gambar 4.4. Hasil KLT ektstrak GKBt 2 hasil Scaling Up .................................. 44 Gambar 4.5. Hasil fraksinasi fraksi F.5................................................................. 46 Gambar 4.6. Noda bercak pada preparatif setelah dielusi .................................... 46 Gambar 4.7. Hasil KLT preparatif fraksi murni ................................................... 47 Gambar 4.8. Hasil KLT 2 dimensi fraksi murni ................................................... 48 Gambar 4.9. Pengamatan morfologi jamur endofit GKBt 2 ................................. 51

xiii

DAFTAR TABEL Halaman

Tabel 2.1. Rangkuman jenis kromatografi ..................................................... 16 Tabel 2.2. Ciri bakteri gram positif dan gram negatif .................................... 21 Tabel 3.1. Data 23 isolat jamur endofit tumbuhan Ginseng Kuning ............. 25 Tabel 4.1. Bobot 23 ekstrak etil asetat isolat jamur endofit ............................36 Tabel 4.2. Diameter zona hambat hasil uji aktivitas antibakteri .....................40 Tabel 4.3. Data hasil uji MIC terhadap bakteri uji ..........................................49

xiv

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian ........................................................................... 58 Lampiran 2. Bagan Kerja Uji Aktivitas Antibakteri ...................................... 59 Lampiran 3. Bagan kerja Scaling up dan ektraksi hasil scalling up .............. 60 Lampiran 4. Bagan kerja fraksinasi ................................................................61 Lampiran 5. Perhitungan koloni bakteri uji ................................................... 62 Lampiran 6. Skema pengenceran larutan uji ...................................................63 Lampiran 7. Hasil Uji MIC .............................................................................64 Lampiran 8. Hasil pewarnaan gram bakteri uji ...............................................65 Lampiran 9. Komposisi Media ........................................................................66 Lampiran 10. Alat dan Bahan yang digunakan ...............................................69

xv

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Semakin meningkatnya laju pertumbuhan masyarakat, kebutuhan

akan senyawa baru yang berguna untuk memperbaiki dan mengobati kondisi

masyarakat

dalam

aspek

kesehatan

semakin

meningkat

(Strobel & Daisy, 2003). Kondisi masyarakat yang dimaksud adalah semakin meningkatnya kasus infeksi terhadap penyakit yang disebabkan oleh virus, jamur, dan juga bakteri. Kasus infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan terbesar yang tidak saja terjadi di Indonesia, tapi juga di seluruh dunia (Mardiastuti, et al., 2007). Untuk itu, salah satu penatalaksanaan bagi penderita penyakit infeksi adalah melalui pengobatan menggunakan antibiotik. Namun seiring dengan meluasnya penggunaan antibiotik, timbul masalah baru yaitu meningkatnya resistensi bakteri terhadap obat antibakteri (Mardiastuti, et al., 2007). Resistensi bakteri terhadap obat antibakteri merupakan masalah yang serius di bidang kesehatan dan telah menjadi perhatian masyarakat global. Sehingga pencarian obat antibakteri baru, menjadi penting dan semakin berkelanjutan (Liang, et al., 2012). Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengisolasi metabolit yang aktif sebagai antibakteri, termasuk yang bersumber dari mikroba endofit. Mikroba endofit merupakan mikroorganisme yang berada dalam jaringan tanaman hidup dan merupakan produk alam baru yang potensial untuk dieksploitasi di bidang kedokteran, pertanian, dan industri (Strobel & Daisy, 2003). Mikroba endofit menyediakan cadangan yang melimpah

terhadap

metabolit

bioaktif

untuk

eksploitasi

obat

(Liang, et al., 2012). Produk alami yang dihasilkan oleh mikroba endofit umumnya diperoleh untuk menghambat atau membunuh sejumlah besar dari agen yang membahayakan termasuk agen penyebab penyakit, yang tidak

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2

terbatas pada fitopatogen, tetapi juga terhadap bakteri, fungi, virus, dan protozoa yang menyerang hewan atau tumbuhan (Strobel & Daisy, 2003). Pada kebanyakan kasus, hubungan endofit dengan tanaman inang adalah simbiosis dan mungkin mutualistik. Banyak yang mampu mensintesis senyawa bioaktif yang dapat digunakan oleh tanaman untuk pertahanan terhadap jamur dan bakteri (Nithya & Muthumary, 2011). Sejak berhasil ditemukannya senyawa "emas" paclitaxel dari jamur endofit Taxomyces andreanae pada tahun 1993, banyak ilmuwan yang semakin berminat untuk mempelajari jamur endofit sebagai produsen yang potensial untuk menghasilkan senyawa bioaktif baru. Selama dua dekade terakhir, banyak senyawa bioaktif yang bernilai dengan berbagai aktivitas ditemukan, seperti sebagai antimikroba, insektisida, sitotoksik, dan anti kanker

yang

telah

berhasil

ditemukan

pada

jamur

endofit

(Zhang, et al., 2006 dalam Zhao, et al., 2010). Salah satu kekayaan alam di Indonesia adalah Ginseng Kuning atau Rennellia elliptica. Rennellia merupakan genus asli Asia Tenggara yang pertama kali ditemukan oleh Korthals pada tahun 1851. Tercatat ada dua spesies Rennellia dari Sumatra, yaitu R. elliptica Korth. dan R. ovalis Korth. Hingga sekarang, variasi dan distribusi dari spesies Rennellia di Indonesia belum lengkap diketahui (Suratman, 2008). Hasil dekok dari akar R.elliptica digunakan oleh masyarakat lokal untuk bermacam kegunaan, termasuk sebagai aprodisiak, nyeri badan dan kejang setelah melahirkan. Sebuah studi awal oleh Yusoff, et al., (2010) melaporkan bahwa terdapatnya antrakuinon pada akar tumbuhan R.elliptica (Osman, et al., 2010). Pada tahun 2010, Osman melaporkan bahwa adanya aktivitas antiplasmodik pada ekstrak diklorometan dari akar R.elliptica

yang ditunjukkan dengan kemampuannya menghambat

Plasmodium falciparum (Osman, et al., 2010) serta telah diketahui adanya aktivitas

antioksidan

dari

ekstrak

metanol

tanaman

R.elliptica

(Ahmad, et al., 2010). Sejauh ini, belum ditemukan adanya studi yang terfokus pada aktivitas antibakteri yang terdapat dalam ekstrak jamur endofit pada


3

tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk melakukan skrining dan isolasi metabolit bioaktif jamur endofit yang terdapat pada tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) sebagai antibakteri.

1.2.

Rumusan Masalah

1. Adakah diantara 23 ekstrak jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) yang menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli? 2. Berapakah nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dari metabolit bioaktif yang diisolasi dari jamur terpilih ?

1.3.

Hipotesis Metabolit bioaktif jamur endofit yang diisolasi dari jamur endofit

yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

1.4.

Tujuan Penelitian

1. Untuk melakukan skrining aktivitas antibakteri metabolit bioaktif jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica

Korth.)

terhadap

bakteri

Staphylococcus

aureus

dan

Escherichia coli. 2. Untuk melakukan isolasi metabolit dari jamur terpilih yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. 3. Untuk melakukan penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) terhadap hasil isolasi metabolit bioaktif dari jamur terpilih terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.


4

1.5.

Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi

terkait aktivitas antibakteri dari jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) sebagai wujud pemanfaatan sumber daya alam dalam usaha mendapatkan sumber obat baru yang bermanfaat bagi ilmu pengetahuan.


BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Jamur Endofit Endofit adalah mikroba yang mendiami biotop yaitu tumbuhan

tingkat tinggi, yang baru-baru ini dianggap sebagai sumber metabolit sekunder yang menawarkan potensi di bidang kesehatan, agrikultural dan industri. Endofit mampu hidup pada variasi suhu yang luas, dengan suhu optimum yang biasanya tampak pada suhu 20

0

C dan 26

0

C

(Labeda, 1990). Baru-baru ini endofit dianggap dapat menjadi sumber utama dalam produk bioaktif alami karena banyak endofit yang menduduki jutaan tumbuhan tingkat tinggi (Strobel & Daisy, 2003). Bukti adanya kaitan tanaman dengan mikroba yang ditemukan dalam jaringan fosil batang dan daun menunjukkan bahwa asosiasi endofit mungkin telah berevolusi dari waktu dimana tumbuhan tingkat tinggi pertama kali muncul di bumi, ratusan juta tahun yang lalu (Bacon & White, 2000 dalam Zhao, et al., 2010). Jamur endofit merupakan kombinasi antara jamur dan tumbuhan dimana jamur hidup secara sistematik dan umumnya berada di dalam tumbuhan (Labeda, 1990). Sebagai sumber daya yang baru dan melimpah, jamur endofit memiliki kemampuan khusus untuk menghasilkan senyawa yang serupa dengan senyawa yang berasal dari tanaman inangnya, serta senyawa bioaktif lainnya (Zhao, et al., 2010). Karena jumlah spesies tumbuhan di dunia begitu besar, perlu diketahui strategi tertentu untuk mempermudah pencarian endofit yang memiliki bioaktivitas (Strobel & Daisy, 2003). Beberapa hipotesis yang masuk

akal

sebagai

strategi

pemilihan

tanaman

yang

dapat

dipertimbangkan untuk mendapatkan jamur endofit yang memiliki bioaktivitas adalah sebagai berikut (Strobel & Daisy, 2003) : a. Tanaman dari keadaan lingkungan yang unik, terutama dengan kondisi

biologi yang tidak biasa.

5


6

b. Tanaman yang memiliki sejarah ethnobotanical (digunakan oleh masyarakat) yang berhubungan dengan penggunaan atau aplikasi tertentu merupakan hal menarik untuk diteliti. Tanaman ini dipilih baik secara kontak langsung dengan masyarakat lokal atau melalui literatur. c. Tanaman yang endemik, yang memiliki umur tanaman yang tidak biasa. d. Tanaman yang tumbuh di daerah keanekaragaman hayati yang besar. Selama periode panjang ko-evolusi, jamur endofit telah beradaptasi dalam micro environments khusus secara bertahap dengan berbagai variasi genetik, termasuk penyerapan dari beberapa segmen DNA tanaman ke dalam genom jamur, serta penyisipan segmen DNA jamur ke dalam genom inang. Hal ini bisa menyebabkan endofit tertentu memiliki kemampuan untuk mensintesis beberapa "phytochemical" yang berasal dari tumbuhan inangnya (Zhang, et al., 2006 dalam Zhao, et al., 2010).

2.1.1

Kultivasi Endofit Dalam dua dekade terakhir, para ilmuwan fokus melakukan

penyelidikan terutama tentang keanekaragaman jamur endofit, hubungan antara jamur endofit dan tanaman inangnya, pencarian senyawa bioaktif alami yang berasal dari jamur endofit, dan peningkatan produktivitas dari beberapa kandidat yang potensial dengan pemanfaatan rekayasa genetika, proyek fermentasi mikroba dan langkah-langkah lainnya (Strobel & Daisy, 2004 dalam Zhao, et al., 2010). Dibandingkan dengan media kultur untuk sel tanaman, media kultur untuk sel jamur lebih sederhana, murah dengan persediaan yang melimpah, dan biaya produksi yang relatif rendah. Selain itu, periode fermentasinya cenderung singkat, proses fermentasi mikroba dapat memberikan kondisi pertumbuhan dan pemeliharaan yang baik dan parameter dalam berbagai kultur dapat dikontrol sesuai dengan keinginan (Zhao, et al., 2010).


7

2.2

Tumbuhan Ginseng Kuning / Rennellia elliptica Korth

2.2.1 Klasifikasi Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) Kingdom

: Plantae

Filum

: Magnoliophyta

Class

: Magnoliopsida

Ordo

: Rubiales

Family

: Rubiaceae

Genus

: Rennellia

Spesies

: Rennellia elliptica

(Species 2000 & ITIS Catalogue of Life, 2012).

2.2.2

Morfologi Kayu kecil atau belukar, tinggi 1,5-2 m; batang lignosus; daun

ellips, panjang 8-23 cm, warna hijau pucat–hijau gelap, halus; petiolus panjang; infloresens terminal; bunga berwarna putih atau ungu tua, sangat wangi, pembuluh korola berwarna ungu; infructescence terminal; buah bundar, berwarna hijau (Suratman, 2008).

Gambar 2.1. Tumbuhan Ginseng Kuning / Rennellia elliptica Korth. (Ismail, et al., 2012) Rennellia merupakan genus asli Asia Tenggara, Rennellia pertama kali ditemukan oleh Korthals (1851) didasarkan atas nama dari seorang ahli kelautan inggris J.Rennell (1742-1830). Dia mencatat ada dua spesies Rennellia dari Sumatra, yaitu R. Elliptica dan R. ovalis (Suratman, 2008).


8

2.2.3

Distribusi Di Indonesia, spesies ini berasal dari Borneo, Sumatra Utara,

Sumatra Barat dan Sumatra Selatan (Suratman, 2008).

2.2.4

Habitat dan Ekologi Ditemukan di sepanjang tepian sungai atau hutan dataran rendah,

pada ketinggian 40-650 m diatas permukaan laut (Suratman, 2008).

2.2.5

Nama Daerah Ginseng Kuning, Jarum-Jarum Betina, Kayu Kuni, Kayu Kemik

(Minangkabau) (Suratman, 2008).

2.2.6

Kegunaan Hasil dekok dari akar R.elliptica digunakan oleh masyarakat lokal

untuk bermacam kegunaan, termasuk sebagai aprodisiak, nyeri badan, post tonik natal. Dalam penelitian ilmiah diketahui bahwa adanya aktivitas antiplasmodik pada ekstrak diklorometan dari akar R. elliptica yang ditunjukkan dengan kemampuannya menghambat Plasmodium falciparum (Osman, et al., 2010) dan adanya aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol tanaman R. elliptica (Ahmad, et al., 2010).

2.2.7

Kandungan Senyawa Uji fitokimia yang dilakukan menemukan bahwa tumbuhan ini

mengandung 1,2- dimetoksi-6-metil-9,10-antrakuinon

(Osman,

et al., 2010), nordamnakantal, 2-formil-3-hidroksi-9,10-antrakuinon, damnakantal, 1-hidroksi-2-metoksi-6-metil-9,10-antrakuinon, lusidin-ωmetil eter, 3- hidroksi -2-metoksi-6-metil-9,10-antrakuinon, rubiadin , 3hidroksi -2- metil-9,10-antrakuinon, rubiadin-1-metileter dan 3-hidroksi-2hidroksimetil-9,10-antrakuinon (Ismail, et al., 2012).


9

2.3

Antimikroba Antimikroba ialah obat pembasmi mikroba khususnya mikroba

yang merugikan manusia. Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba penyebab infeksi pada manusia ditentukan harus memiliki toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya, obat itu haruslah bersifat sangat toksik untuk mikroba tetapi relatif tidak toksik pada hospes (Setiabudy, 2007). Obat-obat antimikroba efektif dalam pengobatan infeksi karena toksisitas

selektifnya,

kemampuan

mikroorganisme yang menginvasi

obat

tersebut

membunuh

penjamu tanpa merusak sel. Pada

kebanyakan kasus, toksisitas lebih relatif daripada absolut, yang memerlukan kontrol konsentrasi obat secara hati-hati untuk menyerang mikroorganisme sehingga dapat ditolerir oleh tubuh. Terapi antimikroba mempunyai keuntungan dengan adanya perbedaan biokimia yang timbul antara mikroorganisme dan manusia (Mycek, et al., 2001). Antibiotik ialah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba, terutama fungi, yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Banyak antibiotik dewasa ini dibuat secara semi sintetik atau sintetik penuh. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat menghambat

pertumbuhan

mikroba,

dikenal

sebagai

aktivitas

bakteriostatik; dan ada yang bersifat membunuh antimikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal dengan kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM).

Antimikroba

tertentu aktivitasnya

dapat

meningkat

dari

bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM (Setiabudy R, 2007). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam 5 kelompok (Setiabudy R, 2007), yaitu : a. Antimikroba yang mengganggu metabolisme sel mikroba. Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini adalah sulfonamid, trimetropim, asam p-aminosalisilat (PAS) dan sulfon. Mikroba membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya, mikroba


10

mensintesis sendiri asam folat dari asam amino benzoat (PABA) untuk kebutuhan hidupnya. Bila antimikroba menang bersaing dalam pembentukan asam folat, maka terbentuk analog asam folat yang nonfungsional. Akibatnya, kehidupan mikroba akan terganggu. b. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba. Obat yang termasuk kedalam kelompok ini adalah penisilin, sefalosporin, basitrasin, vankomisin, dan sikloserin. c. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba. Obat yang termasuk ke dalam kelompok ini adalah polimiksin, golongan polien, serta berbagai antimikroba kemoteurapetik. Kerusakan membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel mikroba yaitu protein, asam nukleat, nukleotida dan lain-lain. d. Antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba. Obat

yang

termasuk

dalam

golongan

ini

adalah

golongan

aminoglikosida, makrolid, linkomisin, tetrasiklin dan kloramfenikol. Sintesis protein berlangsung di ribosom, dengan bantuan tRNA dan mRNA. Pada bakteri, ribosom terdiri dua unit (30S dan 50S). Misalnya, streptomisin

berikatan

dengan

komponen

ribosom

30S

dan

menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA, akibatnya terbentuk protein yang abnormal dan nonfungsional bagi sel mikroba. e. Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba. Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini adalah rifampisin dan golongan kuinolon.

2.4

Uji Aktivitas Antimikroba Metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi aktivitas

antimikroba dalam produk alam terbagi menjadi tiga kelompok, yaitu metode bioautografi, difusi,dan dilusi. Metode bioautografi dan difusi dikenal sebagai tehnik kualitatif karena metode ini hanya memberikan informasi mengenai ada atau tidaknya aktivitas antimikroba dalam suatu sampel uji. Sedangkan metode dilusi merupakan tehnik kuantitatif yang dapat digunakan untuk mengukur Konsentrasi Hambat Minimum / KHM


11

(Vanden & Vlientink, 1991 dalam Valgas, et al., 2007). Klasifikasi metode uji antimikroba dapat dilihat pada gambar 2. 3.

2.4.1

Metode Difusi Metode difusi sering digunakan untuk uji antimikroba yang rentan

terhadap senyawa murni, senyawa polar ataupun non polar (Steward, et al., 1999 dalam Choma & Grzelak, 2010). Pada prosedur ini, kertas filter cakram (kira-kira berdiameter 6 mm), berisi senyawa uji yang ditempatkan pada permukaan yang sebelumnya telah diinokulasi dengan mikroba uji. Agen antimikroba akan berdifusi ke dalam agar dan menghambat pertumbuhan dari mikroba uji. Cawan petri diinkubasi dan zona inhibisi diukur. Pada metode silinder, silinder dari stainless steel atau porcelin dengan ukuran yang seragam (biasanya 8mm x 6 mm x 10 mm) ditempatkan diatas agar terinokulasi didalam cawan petri, dan diisi dengan sampel dan standar. Setelah diinkubasi, silinder dipindahkan dan zona inhibisi yang terbentuk diukur (Choma & Grzelak, 2010). Pada uji menggunakan hole-plate, beberapa milimiter lubang digali pada permukaan agar yang diinokulasi dan kemudian diisi sampel. Larutan senyawa uji akan berdifusi kedalam medium agar dan menghambat pertumbuhan organisme. Cawan petri dibiarkan pada suhu ruangan untuk proses inkubasi. Kemudian, zona hambat yang terbentuk diukur (Shitandi, et al., 2005 dalam Choma & Grzelak, 2010).


12 Cakram

Metode difusi

Silinder

Hole-plate assay

Klasifikasi metode dalam skrining aktivitas antimikroba

Metode dilusi

Dilusi Agar

Pengenceran Tabung

Kontak Bioauto grafi

Imersi / overlay Langsung

Gambar 2.2 Klasifikasi metode uji antimikroba (Choma & Grzelak, 2010).

2.4.2

Metode Dilusi Metode ini memiliki kemampuan untuk mengukur KHM ( Kadar

Hambat Minimum) dan KBM (Kadar Bunuh Minimum) (Pratiwi, 2008). Dua jenis metode dilusi adalah dilusi agar dan pengenceran tabung (Choma & Grzelak, 2010). Pratiwi (2008) membedakan metode dilusi menjadi dilusi cair (serial dilution) dan dilusi padat. Pada dilusi cair, dibuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji


13

ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM dikultur ulang tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18–24 jam pada suhu 37 0C. Media cair yang terlihat tetap jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008). Metode dilusi padat serupa dengan metode dilusi cair tapi menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikoba uji (Pratiwi, 2008).

2.4.3

Bioautografi Prosedur menggunakan metode bioautografi hampir sama dengan

prosedur pada metode difusi. Perbedaannya bahwa senyawa uji berdifusi ke medium agar dari kromatografi, yang mengandung adsorben atau kertas (Meyers, et al., 1964 dalam Choma & Grzelak, 2010). Bioautografi adalah suatu teknik laboratorium untuk mendeteksi zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran yang kompleks dan matriks (Choma, 2005). Metode bioautografi merupakan metode sederhana yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas antibakteri atau antikapang. Metode ini menggabungkan penggunaan tehnik kromatografi lapis tipis dengan respons dari mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit yang dapat berupa anti bakteri, anti kapang dan anti protozoa (Kusumaningtyas, et al., 2008). Bidang utama yang digunakan dalam bioautografi adalah (Choma, 2005) : a. Mencari zat antibiotik dan anti jamur baru, antitumor, dan senyawa antiprotozoa dengan mempelajari aktivitas biologis zat yang berasal dari tanaman, mikroorganisme atau kimia kombinatorial b. Penyelidikan antibiotik dan senyawa biologis aktif lainnya dalam air limbah, air minum, cairan tubuh, pakan, dan makanan c. Kontrol kualitas obat-obatan antibiotik


14

d. Mencari senyawa antimikroba yang efektif melawan bakteri dan jamur patogen pada tanaman e. Deteksi dan penentuan racun (misalnya, aflatoksin) atau senyawa fototoksik (misalnya, furokumarin). Metode bioautografi dibagi menjadi tiga kategori (Choma, 2005): a. Bioautografi Kontak atau Difusi Agar b. Imersi atau Bioautografi Agar Overlay c. Bioautografi Langsung.

2.4.3.1 Bioautografi kontak atau Difusi Agar Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan lempeng kromatogram hasil eluasi senyawa yang akan diuji di atas media padat yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. Adanya senyawa antimikroba ditandai dengan adanya daerah jernih yang tidak ditumbuhi anti mikroba (Kusumaningtyas, et al., 2008). Pada bioautografi kontak, terjadi difusi senyawa antimikroba dari pelat

atau

kertas

KLT

ke

agar

yang

diinokulasi

bakteri

uji

(Meyers, et al., 1964 dalam Choma, 2005). Kromatogram ditempatkan menghadap ke bawah lapisan agar yang diinokulasi bakteri dan dibiarkan beberapa menit atau beberapa jam untuk memungkinkan difusi. Kromatogram

kemudian

dipindahkan

dan

kemudian

diinkubasi

(Choma, 2005). Zona hambat diamati pada permukaan agar di tempat dimana agen antimikroba menempel dengan agar. Metode ini menyerupai metode cakram. Kelemahan dari bioautografi kontak ini adalah kesulitannya dalam memperoleh kontak yang lengkap antara agar dan lempeng uji serta daya adsorben terhadap permukaan agar (Choma, 2005).

2.4.3.2 Imersi atau Bioautografi Agar Overlay Dalam bioautografi imersi, kromatogram ditutupi dengan media agar cair. Setelah pemadatan, inkubasi dan pewarnaan (biasanya dengan garam tetrazolium), pita penghambatan atau pertumbuhan divisualisasikan


15

(Nicolaus, 1961 dalam Choma, 2005). Terkadang, sebelum proses inkubasi, pelat dibiarkan selama beberapa jam pada suhu rendah untuk memungkinkan difusi. Tehnik agar overlay merupakan gabungan dari bioautografi kontak dan langsung (Choma, 2005). Antimikroba ditransfer dari pelat KLT ke lapisan agar seperti dalam uji kontak tetapi selama inkubasi dan visualisasi lapisan agar tetap berada pada plate seperti dalam bioautografi langsung. Dibandingkan dengan metode bioautografi langsung, kerugian utama dari metode ini adalah sensitivitas yang lebih rendah disebabkan oleh cairan antibakteri dalam lapisan agar. Metode agar overlay biasanya disarankan bila bioautografi langsung mustahil dilakukan (Choma, 2005).

2.4.3.3 Bioautografi Langsung Dalam bioautografi langsung, pelat dicelupkan dalam suspensi mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu yang

cocok atau suspensi

disemprotkan ke pelat (Homans, 1970 dalam Choma, 2005). Pelat diinkubasi dan mikroorganisme tumbuh langsung di atasnya. Oleh karena itu, pemisahan, prakondisi, inkubasi dan visualisasi yang dilakukan langsung di plate. Untuk lokasi dan visualisasi aktivitas antibakteri, garam tetrazolium biasanya digunakan, yang dikonversi oleh adanya aktivitas enzim dehidrogenase pada mikroorganisme hidup mereduksi tetrazolium menjadi zat yang berwarna intens/ ungu, formazan (Choma, 2005). Jika aktivitas antimikroba pada pelat KLT aktif membunuh bakteri, maka tidak terjadi pembentukan warna dan terbentuk zona penghambatan yang berwarna pucat pada latar yang berwarna ungu. Pewarna tetrazolium yang paling

sering

digunakan

adalah

3-{4,5-Dimetiltiazol-2-il}-2,5-

difeniltetrazoliumbromida, disebut MTT (Choma, 2005).

2.5

Kromatografi Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani

Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter


16

dalam kolom gas yang berisi kalsium karbonat (Gandjar & Rohman, 2007). Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fase, salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, dan fase lain sebagai fluida yang mengalir di sepanjang landasan stasioner (Day & Underwood, 2002). Fase stasioner bisa berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase bergerak bisa berupa cairan maupun gas. Empat kategori kromatografi berdasakan fase stasioner dan fase bergerak Tabel 2.1 Tabel 2.1. Rangkuman jenis Kromatografi Fase

PADAT

CAIR

Stasioner Fase

Cair

Gas

Cair

Gas

Kromatografi

Kromatografi

Bergerak Contohcontoh

Kromatografi Kromatografi asli Tswett,

gas-padat,

partisi pada

Gas Cair atau

dengan

atau GSC

kolom silica

GLC

larutan

gel

petroleum eter dan kolom CaCO3 Kromatografi

Kromatografi

pertukaran

Kertas

ion

Menurut Gandjar & Rohman (2007), Kromatografi dapat dibedakan

atas

berbagai

macam

tergantung

pengelompokannya.

Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi : a)kromatografi adsorbsi; b) kromatografi partisi; c) kromatografi pasangan ion; d) kromatografi penukar ion; e) kromatografi eksklusi ukuran; dan f) kromatografi afinitas (Gandjar & Rohman, 2007).


17

Dalam semua tehnik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam laju

perpindahan

yang

berbeda

untuk

larutan

yang

berbeda

(Day & Underwood, 2002).

2.5.1

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan

Schraiber pada tahun 1938. Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar & Rohman, 2007). Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Gandjar & Rohman, 2007). Beberapa keuntungan lain dari kromatografi lapis tipis

adalah

(Gandjar & Rohman, 2007): a. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, flouresensi, atau radiasi dengan sinar ultraviolet c. Dapat

dilakukan

eluasi

secara

menaik

(Ascending),

menurun

(descending) atau dengan cara elusi 2 dimensi. d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Fase diam pada KLT dapat berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau pelat plastik (Gandjar & Rohman, 2007). Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang


18

paling sering digunakan adakah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama dalam KLT adalah adsorpsi dan partisi (Gandjar& Rohman, 2007). Pada fase gerak dalam KLT, sistem yang paling sederhana ialah campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak adalah sebagai berikut (Gandjar & Rohman, 2007) : 1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan tehnik yang sensitif 2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. 3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan. 4. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut solut yang bersifat basa dan asam. Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak

yag

menyebar

dan

pucak

ganda.

Untuk

memperoleh

reprodusibilitas, volume sampel yang akan ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan (Gandjar & Rohman, 2007). Media pemisahannya adalah lapisan kaca dengan ketebalan sekitar 0,1 sampai 0,33 mm zat padat adsorben pada lempeng kaca, plastik, atau aluminium. Lempeng yang paling umum digunakan berukuran 8 x 12 inchi


19

dan zat padat yang umumnya digunakan adalah alumina, gel silika, dan selulosa (Day & Underwood, 2002). Sampel yang biasanya berupa campuran senyawa organik diteteskan di dekat salah satu sisi lempengan dalam bentuk larutan dalam jumlah kecil, biasanya beberapa mikrogram senyawa. Sebuah suntikan hipodermik atau sebuah pipet gelas kecil dapat digunakan. Noda sampel dikeringkan dan kemudian sisi lempengan tersebut dicelupkan ke dalam fase gerak yang sesuai. Pelarut bergerak naik di sepanjang lapisan tipis zat padat di atas lempengan, dan bersamaan dengan pergerakan pelarut tersebut, zat terlarut sampel dibawa dengan laju yang bergantung pada kelarutan zat terlarut tersebut dalam fase bergerak dan interaksinya dengan zat padat. Setelah garis depan pelarut bergerak sekitar 10 cm, lempengan dikeringkan dan noda-noda zat terlarutnya diperiksa seperti pada kromatografi kertas (Day & Underwood, 2002).

2.5.2

Nilai Rf Pemisahan pada kromatografi planar (kromatografi kertas dan

kromatografi lapis tipis) pada umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak ujung fase geraknya. Faktor retardasi solut (Rf) didefinisikan sebai perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh solut terhadap jarak yang ditemput oleh fase gerak (Gandjar & Rohman, 2007). Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (K’) sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan

pada

posisi

titik

awal

di

permukaan

fase

diam

(Gandjar & Rohman, 2007).


20

2.5.3

Kromatografi Kolom Pada kromatografi kolom, berbagai ukuran kolom dapat digunakan,

dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel-sampel tanpa melalui fase diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurangkurangnya sepuluh kali ukuran diameternya. Bahan pengemasnya, suatu adsorben seperti alumina atau mungkin suatu resin pertukaran ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi ke dalam porsi fase bergerak dan dibiarkan diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap berada di atas permukaannya (Day & Underwood, 2002). Laju alir yang diinginkan diperoleh semata-mata dari gravitasi, dengan menyisipkan ujung keluaran kolom itu ke dalam bejana yang, atau dengan memompa cairan melalui ujung atas kolom, laju alir yang lazim dapat sebesar beberapa puluh milimeter per menit dan mungkin lebih cepat jika pemisahan tidak terlalu sulit (Day & Underwood, 2002). Terkadang tidak ada satupun fase bergerak yang cocok dengan elusi dari seluruh komponen sampel. Misalnya dalam adsorpsi, pelarut yang cukup nonpolar mungkin ideal untuk mengelusi beberapa zat terlarut yang kurang polar dimana zat terlarut yang lebih polar kemudian dapat memperlihatkan suatu retensi panjang yang berlebihan. Pada kasus seperti ini, teknik elusi gradien lebih bermanfaat. Komposisi fase gerak diubah secara kontinu dengan membiarkan pelarut yang lebih polar mengalir ke dalam reservoar yang mengandung zat terlarut yang kurang polar, pada saat campuran zat terlarut mengalir ke dalam kolom. Dimana zat terlarut yang lambat akan mengalir lebih cepat dengan meningkatnya kemampuan mengelusi dari campuran pelarut (Day & Underwood, 2002). Kelemahan dari metode ini adalah pengerjaan yang konvensional lebih lambat dan merepotkan namun kolom-kolom yang cukup panjang dapat digunakan dimana kapasitasnya memadai untuk pekerjaan membuat preparat (Day & Underwood, 2002).


21

2.6

Bakteri Gram positif dan negatif Bakteri merupakan sel prokariotik yang uniseluler (sel tunggal)

dengan struktur internal sederhana. Tumbuh pada media laboratoris buatan. Reproduksi aseksual, khasnya dengan pembelahan sel sederhana. Ukuran khas 0,5 – 1,5 μm x 1,0- 3,0 μm. Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti elips, bola, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 1986). Berdasarkan komposisi dinding selnya, bakteri dibagi menjadi dua golongan ; bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Goering, et al., 2008). Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi daripada yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih tipis daripada sel bakteri Gram positif (Pelczar & Chan, 1986). Tabel 2.2. Ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif (Pelczar & Chan, 1986). CIRI

Perbedaan Relatif Gram positif

Gram negatif

Tebal ( 15-80 nm), berlapis

Tipis ( 10-15 nm),

tunggal

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding

Kandungan lipid rendah (1-

Kandungan lipid tinggi

sel

4%) Peptidoglikan ada

(11-22%) Peptidoglikan

sebagai lapisan tunggal,

ada didalam lapisan kaku

komponen utama

sebelah dalam; jumlahnya

merupakan lebih dari 50 %

sedikit, merupakan sekitar

berat kering pada beberapa

10% berat kering

sel bakteri

Tidak ada asam tekoat

Struktur dinding sel

Asam Tekoat Kerentanan

Lebih rentan

Kurang rentan

Relatif rumit pada banyak

Relatif sederhana

Terhadap penisilin Persyaratan nutrisi

spesies Resistensi terhadap

Lebih resisten

Kurang resisten

gangguan fisik


22

2.7

Bakteri Uji

2.7.1

Staphylococcus aureus Staphylococcus merupakan bakteri kokus Gram positif, berdiame-

ter 1 μm (Parija, 2009). Kokusnya tersusun khas seperti setandan anggur yang tidak teratur. Bentuk seperti anggur yang tidak teratur ini tampak bila bakteri ditumbuhkan pada media padat, tetapi biasanya terlihat seperti rantai pendek bila ditumbuhkan pada medium cair. Apusan yang diambil dari nanah menunjukkan keberadaan yang tunggal atau berpasangan, tandanan, atau rantai pendek yang terdiri dari tiga atau empat sel (Parija, 2009). S. aureus menyebabkan penyakit pada berbagai jaringan, menyebarkan toksin, dan merangsang inflamasi. Bakteri ini menempel dan membahayakan kulit, mukosa dan permukaan jaringan. Staphylococcus aureus merupakan patogen primer pada manusia dan hewan, hidup pada kulit, kelenjar kulit dan membran mukus. Kira-kira 35-50 % terdapat pada orang dewasa, 10 % pada perinium dan 5 – 10% pada vagina (Parija, 2009). Bakteri ini juga menyebabkan penyakit toxin-mediated seperti

keracunan

makanan,

toxic

shock syndrome

(TSS),

dan

staphylococcal scalded skin syndrome (Parija, 2009). Determinan utama tehadap patogenitas adalah enzim dan toksin. Enzim yang terkandung yaitu

koagulase

(karakteristik

yang

memperkuat),

hialuronidase,

stapilokinase, nuklease, dan penisillinase. Toksinnya adalah β-hemolysins, leukocidin, enterotoksin, eksfoliatif dan shock syndrome toxin. Bakteri menempati nasofaring dan kulit (Talaro, 2005).

2.7.2

Escherichia coli

Family

: Enterobacteriaceae

Genus

: Escherichia

Species

: E. coli

( Pommerville, 2011)


23

E. coli merupakan bakteri enterik utama. Bertindak sebagai patogen juga sebagai bakteri yang menguntungkan. Dan menyebabkan bermacam penyakit seperti diare, infeksi pada saluran urin (Talaro, 2005). E. coli merupakan bacilus Gram negatif yang berukuran sekitar 1-3 x 0,4-0,7 μm. Basil tersusun secara tunggal atau berpasangan (Parija, 2009). Menurut Parija (2009), E. coli merupakan bakteri aerob dan anaerob fakultatif. Tumbuh pada rentang suhu 10-140 C (suhu optimum 370 C) dan pH 7,2. Bakteri tumbuh pada berbagai media, termasuk Mueller-Hinton Agar, Nutrient Agar, Blood Agar, dan MacConkey Agar. Isolasi utama dapat ditemukan dari Nutrient Agar dan Blood Agar (Parija, 2009). E.coli merupakan bakteri utama pada flora normal usus. Bakteri ini dikenali sebagai bakteri yang sedikit membahayakan dan juga patogen. E.coli menyebabkan penyakit dengan spektrum luas pada manusia. Merupakan penyebab penting penyakit enterik, infeksi saluran urin, neonatal sepsis dan neonatal meningitis. Hemolytic Uremic Syndrome merupakan komplikasi serius terhadap infeksi enterik dengan rantai spesifik E.coli (Parija, 2009).


BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1

Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biosains, Bidang Botani,

Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. Waktu pelaksanaan penelitian dimulai dari bulan April hingga Agustus 2013.

3.2

Alat dan Bahan

3.2.1

Alat Alat –alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: autoklaf

(Hiclave HVE 5.0 Hirayama), cawan petri, jarum ose, lampu bunsen, kolom, kapas steril, pipa kapiler, pinset, pipet mikro, tabung reaksi (pyrex), spatula, shaker incubator, inkubator, vacuum rotary evaporator (Heidolph WB 2000), UV cabinet (CAMAG), chamber, Lamina Air Flow (LAF), 96 microwell titer plate, labu evaporator (pyrex), neraca analitik (and hr-202i), corong pisah, erlenmeyer dan alat-alat gelas lainnya.

3.2.2

Bahan Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah 23 isolat

jamur endofit yang diisolasi dari bagian akar, batang, daun dan biji tumbuhan Rennellia elliptica koleksi Laboratorium Biosains, Bidang Botani, Puslit Biologi LIPI Cibinong (Tabel 3.1) Bakteri uji yang digunakan meliputi bakteri uji Gram positif (Staphylococcus aureus LIPIMC 114), bakteri uji Gram negatif (Escherichia coli LIPIMC 186). Media Potato Dextrose Agar/ PDA (difcoTM), media Potato Dextrose Broth / PDB (difcoTM), media Mueller-Hinton Broth/ MHB (criterion), media Mueller-Hinton Agar / MHA (criterion), media Brain Heart Infussion/

BHI cair (BBLTM), pelat Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) silica gel 60 F254 (Merck), Silika gel 70-230 mesh (Merck),

24


25

sephadex LH-20, pelarut kimia etil asetat, aseton, kloroform, metanol, nheksana, alkohol 96 %, alkohol 70%, aquades, aquades steril, reagen warna p-iodonitrotetrazolium / INT (Sigma), pewarna trypan blue, kristal violet, safranin, larutan iodin, kloramfenikol (Sigma), eritromisin (Sigma), kertas saring, gas nitrogen dan penampak noda serium sulfat. Tabel 3.1. Data 23 isolat jamur endofit dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) No

Asal Isolat

Nama Jamur

No

Asal Isolat

Nama Jamur

1

Akar

GKA ¼

1

Daun

GKD 2

2

GKA 2

2

GKD 3/4

3

GKA 3

3

GKD 5

4

GKA 5

4

GKD 6

5

GKA 6

5

GKD 7

6

GKA 7

6

GKD 8

GKB 1

1

2

GKB 2

2

GKBt 2

3

GKB 3

3

GKBt 3/4

4

GKB 4

4

GKBt 5/6

5

GKB 5

6

GKB 6

7

GKB 7

1

Biji

Batang

GKBt 1


26

3.3

Tahapan Penelitian

1. Skrining bioproduksi metabolit sekunder ekstrak 2. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi 3. Scaling up kultivasi jamur endofit GKBt 2 4. Ekstraksi jamur endofit hasil Scaling Up 5. Isolasi metabolit jamur endofit GKBt 2 6. Penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) 7. Identifikasi jamur endofit GKBt 2

3.4.

Prosedur Kerja

3.4.1

Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder Ekstrak

3.4.1.1 Kultivasi isolat jamur endofit ke dalam medium PDB a. Pembuatan medium kultivasi Medium PDB dibuat sebanyak 750 mL dengan cara mensuspensikan 18 g PDB ke dalam 750 mL aquades. Setelah tercampur, medium dipanaskan hingga larut sempurna, kemudian dituangkan ke dalam 25 tabung uji masing-masing sebanyak 40 mL. Medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. b. Kultivasi isolat jamur endofit Kultivasi isolat jamur endofit dilakukan terhadap 23 isolat jamur endofit yang diisolasi dari bagian akar, biji, daun dan batang tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth). Setiap isolat jamur endofit dinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam masing-masing tabung yang berisi medium PDB steril, kemudian diinkubasi dalam kondisi statis pada suhu kamar selama tiga minggu. Inkubasi juga dilakukan terhadap 1 tabung yang berisi medium PDB steril saja, sebagai kontrol sterilitas media.

3.4.1.2 Ekstraksi isolat jamur endofit Sebanyak dua puluh tiga kultur jamur endofit masing-masing diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat dengan perbandingan pelarut dan kultur jamur 1:1, proses ekstraksi dilakukan sebanyak tiga kali.


27

Ekstraksi juga dilakukan terhadap satu tabung yang berisi medium PDB saja. Hasil ekstraksi dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga didapat ekstrak pekat.

3.4.1.3 Skrining bioproduksi metabolit sekunder ekstrak Sebanyak dua puluh tiga ekstrak etil asetat dari jamur endofit Ginseng Kuning dianalisis metabolit sekundernya dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan eluen diklorometan:metanol (10:1). Ekstrak dilarutkan ke dalam aseton dengan konsentrasi 10 mg/mL, volume penotolan sebanyak 10 µL. Penotolan dilakukan diatas pelat KLT 20x7 cm. Sebagai kontrol pelarut dan medium, ditotolkan pula ekstrak medium PDB dan aseton. Pola kromatogram yang terbentuk dimonitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot dengan pereaksi penampak noda serium sulfat/ Ce(SO4)2.

3.4.2

Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

3.4.2.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Semua alat dan bahan (media) yang akan digunakan untuk uji mikrobiologi disterilisasi dengan proses sterilisasi yang cocok. Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf suhu 121

0

C selama 15 menit.

Sebelumnya, semua alat yang akan disterilisasi dibungkus dengan plastik tahan panas. Untuk pengerjaan uji antibakteri dilakukan di dalam Laminar Air Flow.

3.4.2.2 Pembuatan Medium a. Medium Peremajaan Bakteri Medium Nutrient Agar (NA) NA ditimbang sebanyak 0,23 g dilarutkan dalam 10 mL aquades. Setelah semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut sempurna, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.


28

b. Medium Untuk Suspensi Bakteri. Medium Brain Heart Infussion (BHI) cair BHI ditimbang sebanyak 5,55 g dilarutkan dalam 150 mL aquades. Setelah semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut sempurna, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.

3.4.2.3 Persiapan Inokulum Bakteri uji

yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. a. Identifikasi bakteri uji dengan pewarnaan Gram Kaca objek dan kaca penutup dibersihkan dengan alkohol 70 %, bakteri uji disuspensikan ke dalam aquades steril yang terdapat diatas kaca objek, kemudian diratakan membentuk area apusan dan difiksasi dengan cara melewatkannya di atas api bunsen. Zat warna kristal violet diteteskan ke atas area apusan, dibiarkan selama 60 detik dan dicuci dengan air aquades kemudian dibiarkan beberapa saat. Larutan iodin diteteskan ke atas apusan dan dibiarkan selama 1 menit kemudian dicuci dengan alkohol hingga larutan yang mengalir tidak berwarna lagi dilanjutkan dengan pencucian dengan aquades, dibiarkan beberapa saat. Zat warna safranin diteteskan dan dibiarkan selama 60 detik. Kemudian dicuci dengan akuades, dibiarkan beberapa saat. Preparat ditutup dengan kaca penutup diamati dengan mikroskop cahaya. b. Peremajaan Bakteri Uji Bakteri uji diremajakan pada medium Nutrient Agar (NA) steril. Mikroba uji diinokulasi sebanyak satu ose ke dalam medium NA dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 20 jam. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (LAF). c. Pembuatan Suspensi Bakteri Sebanyak satu ose isolat Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing-masing diinokulasikan kedalam 20 mL medium Brain Heart Infussion (BHI) cair steril. Masing-masing


29

diinkubasi selama 20 jam dalam shaker incubator 100 rpm pada suhu 37 0C. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (LAF)

3.4.2.4 Persiapan Sampel Sebanyak dua puluh tiga ekstrak etil asetat jamur endofit dari Ginseng Kuning masing-masing dilarutkan dengan pelarut aseton sehingga didapat larutan dengan konsentrasi 10 mg/mL. Masing-masing ekstrak jamur, dan kontrol negatif (pelarut aseton dan ekstrak media PDB) ditotolkan sebanyak 10 μL kedalam pelat KLT ukuran 8x8 cm. Kloramfenikol sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 1 mg/mL dalam pelarut metanol ditotolkan sebanyak 10 μL dan 5 μL pada pelat KLT ukuran 4x7 cm.

3.4.2.5 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi Suspensi bakteri uji dibuat dengan mensuspensikan 5 mL inokulum ke dalam 45 mL medium BHI cair (perbandingan medium dan suspensi inokulum 9:1) di dalam cawan petri steril berdiameter 14,5 cm, kemudian suspensi bakteri uji diratakan dengan menggunakan spreader steril. Pelat KLT yang telah ditotolkan sampel, kontrol positif dan kontrol negatif dicelupkan ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri uji. Kemudian, pelat tersebut diletakkan kedalam cawan petri steril yang telah diletakkan kapas basah pada kedua sisi petri. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 20 jam. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (LAF).

3.4.3

Scaling Up bioproduksi jamur endofit GKBt 2

3.4.3.1 Pembuatan medium kultivasi Medium PDB dibuat sebanyak 5 L dengan komposisi 24 gram PDB dalam 1 L aquadest. Setelah semua komponennya larut, medium tersebut dibagi menjadi 15 erlenmeyer yang masing-masingnya diisi 200 mL medium dalam erlenmeyer 500 mL dan 4 erlenmeyer yang berisi 500


30

mL medium dalam erlenmeyer 2 L. Medium disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC.

3.4.3.2 Kultivasi Jamur Endofit Koloni murni jamur GKBt 2 berumur 14 hari yang telah ditumbuhkan pada medium PDA diambil kira-kira seluas 1x1 cm sebanyak 3 blok dan diinokulasi ke dalam medium PDB steril. Kemudian, kultur diinkubasi pada suhu ruang dalam kondisi statis selama tiga minggu. Pengerjaan kultivasi jamur endofit GKBt 2 dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (LAF)

3.4.4

Ekstraksi kultur jamur GKBt 2 Hasil Scaling Up Hasil kultivasi jamur endofit GKBt 2 selanjutnya diekstraksi.

Kultur jamur dipisahkan menjadi media jamur dan biomassa jamur. Media jamur GKBt 2 diekstraksi dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan pelarut dan kultur media 1:1, proses ekstraksi dilakukan sebanyak tiga kali. Jumlah pelarut etil asetat yang digunakan adalah lima liter. Lapisan atas yang merupakan fraksi etil asetat dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Sedangkan biomassa jamur dimaserasi dengan aseton selama semalam, dan dilakukan sebanyak tiga kali. Aseton yang digunakan untuk maserasi berjumlah 3 x 500 mL. Hasil maserasi dievaporasi dengan vacuum rotary evaporator hingga tersisa fraksi air. Fraksi air kemudian dipartisi dengan etil asetat dengan perbandingan pelarut dan fraksi air 1:1, proses ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali. Lapisan atas yang merupakan fraksi etil asetat dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat dilarutkan dengan 100 mL metanol 100% dan dipartisi kembali dengan pelarut n-heksan sebanyak 3 kali. Hasil partisi metanol dan n-heksan masing-masing dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat baik biomassa dan media ditotolkan pada pelat KLT kemudian dielusi dengan eluent diklorometan : metanol (10:1) dan hasilnya diamati dibawah sinar UV


31

254 nm dan 366 nm serta disemprot dengan pereaksi penampak noda serium sulfat/ Ce(SO4)2.

3.4.5

Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat GKBt 2

Kromatografi Kolom Ekstrak etil asetat media GKBt 2 sebanyak 830 mg difraksinasi menggunakan kolom

sephadex

LH-20 dengan

larutan

pengelusi

alkohol 96 %. Fraksi-fraksi yang keluar dari kolom ditampung dalam tabung reaksi dan setiap tabung dimonitor dengan KLT menggunakan eluen diklorometan:metanol (10:1). Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki noda yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapat 15 fraksi. Dari hasil fraksinasi menggunakan fase diam Sephadex LH-20, Fraksi F.5 yang berjumlah 47 mg difraksinasi kembali menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silica gel (70-230 mesh). Fase gerak yang digunakan adalah kloroform:metanol dengan perbandingan masingmasing 10:1, 5:1 dan 0:1. Fraksi – fraksi yang keluar kemudian ditampung dalam tabung reaksi dan setiap tabung dimonitor dengan KLT menggunakan eluen diklorometan: metanol (10:1). Selanjutnya, fraksifraksi yang memiliki bercak noda yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan 10 fraksi.

KLT Preparatif Fraksi F.5.8 sebanyak 9,8 mg dilanjutkan dengan purifikasi menggunakan KLT preparatif. Sebelumnya, larutan fraksi dilarutkan dalam aseton dengan konsentrasi 5 mg/mL dan dioptimasi dengan eluen yang sesuai untuk mendapatkan kondisi optimum untuk preparatif pada pelat KLT. Eluen yang digunakan adalah kloroform : metanol dengan perbandingan 7:1. Bercak noda yang muncul dikerok dengan spatula logam diatas kertas bersih, dibilas dengan aseton dan kemudian disaring. Filtrat


32

dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan dikeringkan dengan gas nitrogen. Kemudian bobot fraksi ditimbang. Uji kemurnian fraksi dilakukan dengan menggunakan KLT dua dimensi. Dimana fraksi tunggal yang didapatkan dielusi menggunakan dua sistem elusi yaitu kloroform: metanol (7:1) dan kloroform: metanol (5:1).

3.4.6

Uji aktivitas antibakteri hasil purifikasi Hasil purifikasi diuji aktivitas antibakterinya dengan menentukan

nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) menggunakan metode mikodilusi cair pada suatu microwellplate yang berjumlah 96 sumuran.

3.4.6.1Persiapan Medium Medium pertumbuhan bakteri uji yang digunakan yaitu medium MHB dan MHA a. Medium MHB (Mueller Hinton Broth) dibuat dua komposisi, yaitu medium MHB 1 dibuat dengan melarutkan 21 g MHB dalam 1 L aquadest dan medium MHB 2 dibuat dengan komposisi dua kali medium MHB 1 (42 g MHB dalam 1 L aquadest). Medium tersebut disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C. b. Medium MHA (Mueller Hinton Agar) dibuat dengan melarutkan 38 g MHA dalam 1 L aquadest. Setelah larut, medium disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C, kemudian dituang dalam cawan petri dan dibiarkan memadat.

3.4.6.2 Persiapan Larutan Uji dan Larutan Kontrol Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi F.5.8 a (4,5 mg) dan F.5.8.b (5 mg). Larutan uji dipersiapkan dengan konsentrasi 1024 μg/mL sebanyak 1 mL menggunakan pelarut etanol 20 %. Pembuatan larutan uji dimulai dengan melarutkan masing-masing fraksi kedalam dalam 1 mL etanol 96%, lalu dipipet sebanyak 1024 µL dari larutan tersebut ke dalam vial dan dipekatkan dengan nitrogen. Kemudian ditambahkan etanol 96%


33

sebanyak 200 µL dan ditambah aquadest sebanyak 800 µL sehingga volume larutan menjadi 1 mL. Kloramfenikol dan eritromisin sebagai kontrol positif dipersiapkan dengan membuat larutan masing-masing dengan konsentrasi 10 mg/mL dalam etanol 96% (larutan stock). Kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 512 µg/mL sebanyak 5 mL, pembuatan larutan kontrol positif dibuat dengan dengan cara menambahkan 4744 µL aquadest ke dalam 256 µL larutan stock di dalam vial.

3.4.6.3 Persiapan Inokulum Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. a. Pembuatan suspensi inokulum Sebanyak masing-masing 1 ose isolat bakteri uji diinokulasikan ke dalam 20 mL medium MHB. Kemudian, diinkubasi selama 20 jam dalam shaker incubator pada suhu 37 0C untuk memperoleh suspensi inokulum. b. Perhitungan jumlah koloni suspensi Suspensi yang didapat diencerkan untuk mempermudah perhitungan koloni, yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi ke dalam 4,95 mL medium MHB. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang sama hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10-4, 10-6, 10-8, dan 10-10. Suspensi dengan pengenceran diinokulasikan sebanyak 100 µL ke dalam medium MHA. Setelah itu diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0C. Koloni yang tumbuh dihitung. Jumlah koloni suspensi

c. Pengenceran suspensi inokulum Setelah diketahui jumlah koloni suspensi, dilanjutkan dengan pengenceran suspensi inokulum untuk mendapatkan jumlah 105 CFU/mL.


34

3.4.6.4 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) 1. Pengenceran Larutan Uji : sumur yang pertama diisi 100 µL medium MHB 2, sumur 2-8 diisi 100 µL medium MHB 1. Pada sumur 1 diisi 100 µL larutan uji dengan konsentrasi 1024 µg/mL. Dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro. Diambil sebanyak 100 µL dan dimasukkan ke dalam sumur 2 dihomogenkan. Dilakukan hal yang sama hingga sumur 8. Pada sumur 8 dibuang sebanyak 100 µL campuran. Kemudian, masing-masing sumur ditambahkan 100 µL inokulum bakteri uji. 2. Pengenceran Larutan kontrol positif : sumur yang pertama diisi 100 µL medium MHB 2, sumur 2-8 diisi 100 µL medium MHB 1. Pada sumur 1 diisi 100 µL larutan kontrol positif dengan konsentrasi 512 µg/mL. Dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro. Diambil sebanyak 100 µL dan dimasukkan ke dalam sumur 2 dihomogenkan. Dilakukan hal yang sama hingga sumur 8. Pada sumur 8 dibuang sebanyak 100 µL campuran. Kemudian, masing-masing sumur ditambahkan 100 µL inokulum bakteri uji. 3. Sumur lain berisi 200 µL broth (kontrol media/kontrol sterilisasi). 4. Sumur lain berisi 100 µL broth dan 100 µL inokulum bakteri uji kemudian dihomogenkan dengan pipet mikro (kontrol pertumbuhan). 5. Sumur lain berisi 100 µL broth, 100 µL pelarut (etanol 20 %), dihomogenkan dengan pipet mikro dan dibuang sebanyak 100 µL campuran. Kemudian ditambahkan 100 µL inokulum bakteri (kontrol pelarut) 6. Microwellplate kemudian diikubasi selama 20 jam pada suhu 37 0C.

3.4.6.5 Penentuan Nilai KHM Nilai KHM ditentukan dengan penambahan reagen warna INT (IodoNitroTetrazolium) konsentrasi 4 mg/mL sebanyak 10 µL, didiamkan selama 60 menit. Adanya aktivitas penghambatan ditunjukkan pada konsentrasi dimana sumur masih mempertahankan kebeningannya. Penentuan nilai KHM dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.


35

3.4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium PDA (Potato Dextrose Agar) Identifikasi jamur endofit GKBt 2 dilakukan secara morfologi mengikuti metode Gandjar (2006) yaitu dengan melakukan pengamatan makroskopis dan mikroskopis. Isolat jamur endofit GKBt 2 diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media PDA dan diinkubasi pada suhu kamar, pengamatan dilakukan pada hari ke 7 hingga hari ke 20. Pada hari ke-20, kira-kira satu ose jamur diambil dan diletakkan diatas kaca objek, diteteskan trypan blue kemudian ditutup dengan kaca penutup, dilakukan pengamatan mikroskopis menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x.


BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.

Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder Secara keseluruhan, sampel isolat jamur endofit yang diisolasi dari

Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) berjumlah 23 isolat yang terdiri dari 6 isolat jamur endofit yang berasal dari akar, 7 isolat jamur endofit yang berasal dari biji, 6 isolat jamur endofit yang berasal dari daun dan 4 isolat jamur endofit yang berasal dari batang (Tabel 4.1). Seluruh isolat tersebut dikultivasi pada medium Potato Dextrose Broth (PDB). Bobot masing-masing ekstrak etil asetat jamur endofit dari tumbuhan Ginseng Kuning ditimbang untuk mengetahui kemampuan masing-masing isolat jamur dalam memproduksi metabolit sekunder. Berdasarkan data yang didapat, diketahui bahwa ekstrak etil asetat dari isolat jamur endofit GKB 3 memiliki bobot ekstrak yang paling besar yaitu 92,1 mg. Hal ini menunjukkan bahwa isolat jamur endofit GKB 3 memiliki kemampuan terbesar dalam memproduksi metabolit sekunder. Sedangkan ekstrak etil asetat dari isolat jamur endofit GKBt 2 memiliki bobot ekstrak yang paling kecil yaitu 11,2 mg. Hal ini menunjukkan bahwa isolat jamur endofit GKBt 2 memiliki kemampuan terkecil dalam memproduksi metabolit sekunder. Tabel 4.1. Bobot 23 ekstrak etil asetat asetat isolat jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth). No

Asal

Nama

Isolat Jamur

Bobot

No

ekstrak

Asal

Nama

Bobot

Isolat

Jamur

Ekstrak

(mg) 1

Akar

(mg)

GKA 1/4

22,7

14

2

GKA 2

33

3

GKA 3

4

GKD 2

25,9

15

GKD 3/4

52,5

27,9

16

GKD 5

28,3

GKA 5

44,7

17

GKD 6

81

5

GKA 6

21,6

18

GKD 7

77,8

6

GKA 7

47,1

19

GKD 8

31,7

36

Daun


37

7

GKB 1

33,7

20

8

GKB 2

48,6

9

GKB 3

10 11 12 13

n

Biji

U

Batang

GKBt 1

64,1

21

GKBt 2

11,2

92,1

22

GKBt ¾

21,4

GKB 4

26,8

23

GKBt 5/6

18,7

GKB 5

18,1

GKB 6

36

GKB 7

11,5

Untuk mengetahui profil bioproduksi metabolit sekunder dari masing-masing ekstrak, maka dilakukan analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan menggunakan eluen diklorometan : metanol perbandingan 10:1 terhadap 23 ekstrak etil asetat jamur endofit. Pola kromatogram yang terbentuk dimonitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot dengan pereaksi penampak noda Ce(SO4)2, hal ini bertujuan untuk memperjelas pengamatan bioproduksi metabolit sekunder ekstrak secara umum (Gambar 4.1).

(a)

(b)


38

(c) Gambar 4.1. Hasil Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder dari 23 ekstrak etil asetat jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) (a) Hasil monitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm (b) Hasil monitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 366 nm (c) Hasil Penyemprotan dengan pereaksi penampak noda Ce(SO4)2. Keterangan Gambar : 1

GKA1/4

6

GKA 7

11

GKB 5

16

GKD 5

21

GKBt 2

2

GKA 2

7

GKB 1

12

GKB 6

17

GKD 6

22

GKBt ¾

3

GKA 3

8

GKB 2

13

GKB 7

18

GKD 7

23

GKBt 5/6

4

GKA 5

9

GKB 3

14

GKD 2

19

GKD 8

PDB

5

GKA 6

10

GKB 4

15

GKD 3/4

20

GKBt 1

Aseton

4.2.

Uji Aktivitas Antibakteri 23 Ekstrak Jamur Endofit Pengujian aktivitas antibakteri pada penelitian ini, dilakukan

terhadap 23 ekstrak etil asetat dengan konsentrasi 10 mg/mL sebanyak 10 µL melawan bakteri uji Staphylococcus aures dan Escherichia coli. Uji aktivitas antibakteri dalam penelitian ini menggunakan metode bioautografi. Bioautografi adalah suatu teknik untuk mendeteksi zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran yang kompleks dan matriks (Choma, 2005). Metode ini menggabungkan penggunaan tehnik kromatografi lapis tipis dengan respons dari UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

39

mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi suatu sampel yang memiliki aktivitas antibakteri (Kusumaningtyas, et al., 2008). Aktivitas antibakteri positif ditunjukkan apabila terbentuk zona hambat berwarna putih di sekitar ekstrak pada latar pelat KLT berwarna merah setelah penyemprotan larutan IodoNitroTetrazolium (INT). Hal ini disebabkan karena terjadinya reaksi enzimatik antara larutan INT dengan bakteri, dimana INT yang awalnya tidak berwarna akan direduksi oleh enzim dehidrogenase yang terdapat pada bakteri sehingga berubah menjadi formazan yang berwarna merah. Hasil uji aktivitas antibakteri larutan ekstrak etil asetat dari jamur endofit ginseng kuning dan kontrol positif/ kloramfenikol dengan menggunakan metode bioautografi ditunjukkan pada Gambar 4.2. Sedangkan untuk mengetahui berapa besar kemampuan antibakteri dari ekstrak maka dilakukan pengukuran diameter zona hambat yang ditunjukkan pada Tabel 4.2.

(a)

(b)


40

(c)

(d)

Gambar 4.2. Hasil Skrining Antibakteri dengan Metode Bioautografi (a) Skrining antibakteri 23 ekstrak etil asetat jamur terhadap bakteri uji Escherichia coli (b) Skrining antibakteri 23 ekstrak etil asetat jamur terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (c) Bioautografi kloramfenikol / kontrol (+) terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (d) Bioautografi kloramfenikol / kontrol (+) terhadap bakteri uji Escherichia coli. Keterangan Gambar 1

GKA1/4

6

GKA 7

11

GKB 5

16

GKD 5

21

GKBt 2

2

GKA 2

7

GKB 1

12

GKB 6

17

GKD 6

22

GKBt ¾

3

GKA 3

8

GKB 2

13

GKB 7

18

GKD 7

23

GKBt 5/6

4

GKA 5

9

GKB 3

14

GKD 2

19

GKD 8

Aseton

5

GKA 6

10

GKB 4

15

GKD 3/4

20

GKBt 1

PDB

Tabel 4.2. Diameter Zona Hambat Hasil Uji Aktivitas Antibakteri No

Ekstrak Jamur Endofit

Bakteri Uji Staphylococcus

Escherichia coli

aureus Diameter

Hambat Diameter

(mm)

Hambat

(mm)

1

GKA ¼

-

-

-

-

2

GKA 2

-

-

-

-

3

GKA 3

-

-

-

-

4

GKA 5

-

-

-

-


41

5

GKA 6

-

-

-

-

6

GKA 7

+

7 mm

+

7 mm

7

GKB 1

+

7 mm

+

7 mm

8

GKB 2

-

-

-

-

9

GKB 3

-

-

-

-

10

GKB 4

+

8 mm

+

8 mm

11

GKB 5

+

10 mm

+

10 mm

12

GKB 6

-

-

-

-

13

GKB 7

+

10 mm

+

10 mm

14

GKD 2

-

-

-

-

15

GKD ¾

-

-

-

-

16

GKD 5

-

-

-

-

17

GKD 6

-

-

-

-

18

GKD 7

-

-

-

-

19

GKD 8

-

-

-

-

20

GKBt 1

-

-

-

-

21

GKBt 2

+

20 mm

+

18 mm

22

GKBt ¾

+

10 mm

+

8 mm

23

GKBt 5/6

-

-

-

-

24

Kloramfenikol

+

25 & 32 mm

+

28 & 33 mm

Ket : (-) Tidak ada aktivitas antibakteri ; (+) Ada aktivitas antibakteri

Dari hasil skrining menggunakan metode bioautografi, diketahui bahwa ekstrak etil asetat jamur GKBt 2 memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar dibandingkan ekstrak yang lain dengan diameter zona hambat 20 mm pada bakteri S. aureus dan 18 mm terhadap bakteri E. coli. Oleh itu, untuk mengetahui senyawa dengan nilai Rf (Retardation

Factor)

mana saja yang aktif sebagai antibakteri, maka dilakukan bioautografi elusi dimana ekstrak etil asetat dari GKBt 2 dielusi dengan konsentrasi 10 mg/mL, volume penotolan 10 µL dan menggunakan eluen diklorometan : metanol (10:1). Hasil bioautografi elusi ditunjukkan pada Gambar 4.3. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

42

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 4.3. Hasil bioautografi elusi ekstrak etil asetat jamur GKBt 2 (a) Hasil monitor KLT ekstrak etil asetat GKBt 2 pada UV 254 nm (b) Hasil monitor KLT ekstrak etil asetat GKBt 2 pada UV 366 nm (c) KLT-Bioautografi ekstrak etil asetat GKBt 2 terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (d) KLT-Bioautografi ekstrak terhadap bakteri Escherichia coli. Berdasarkan

hasil

bioautografi

elusi

terhadap

bakteri

uji

Staphylococcus aureus, diduga bahwa pada ekstrak etil asetat dari jamur endofit GKBt 2, senyawa dengan nilai Rf 0-0,24 tidak aktif sebagai antibakteri, karena tidak terbentuk zona hambat pada perlakuan uji bioautografi antibakteri secara elusi. Sedangkan senyawa dengan nilai Rf 0,25-1 diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri karena tebentuk zona hambat. Sedangkan, hasil bioautografi terhadap bakteri uji Escherichia coli menunjukkan bahwa senyawa dengan nilai Rf 0,18-1 diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri karena tebentuk zona hambat pada hasil pengujian aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi.

4.3.

Scaling Up Kultivasi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium PDB ( Potato Dextrose Broth) Untuk memperbanyak hasil produksi metabolit sekunder dari

jamur endofit GKBt 2, maka dilakukan perbesaran skala kultivasi jamur endofit GKBt 2 pada media. Media yang digunakan adalah sebanyak 5 L UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

43

media Potato Dextrose Broth/PDB steril. Selain itu isolat juga diinokulasikan kedalam media PDA miring dan disimpan sebagai stok kultur. Secara keseluruhan, semua erlenmeyer yang berisi media dan inokulan diinkubasi dalam kondisi yang sama yaitu pada suhu kamar dalam kondisi statis selama 3 minggu. Selama proses Scaling Up, terjadi perubahan warna media dari kuning menjadi merah tua, hal ini menunjukkan bahwa jamur GKBt 2 mampu tumbuh dan menghasilkan metabolit sekunder pada media PDB tersebut.

4.4.

Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scaling Up Ekstraksi kultur jamur GKBt 2 dibagi menjadi dua, yaitu ekstraksi

media jamur dan biomassa jamur. Berat ekstrak etil asetat dari media jamur GKBt 2 yang didapatkan, berwarna merah sebanyak 830 mg dari total 5 L medium PDB. Proses pengekstrakan media dilakukan dengan etil asetat. Etil asetat merupakan pelarut yang bersifat semipolar, dan umum digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi jamur endofit. Ekstrak etil asetat GKBt 2 yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm serta disemprot dengan pereaksi penampak noda Ce(SO4)2. Pola KLT yang terbentuk dari hasil analisis KLT diberikan pada gambar 4.4.a Dari hasil ekstraksi, berat ekstrak etil asetat dari biomassa jamur endofit GKBt 2 sebanyak 1,77 g. Profil KLT dari ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit GKBt 2 dapat dilihat pada gambar 4.4.b. Berdasarkan profil KLT dan tekstur ekstrak yang berminyak, diduga terdapat banyak lemak dari ekstrak etil asetat biomassa jamur GKBt 2. Oleh itu, dilakukan partisi dengan pelarut heksana dan metanol dengan perbandingan 1:1, untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat non polar dengan senyawa-senyawa yang bersifat polar. Profil KLT dengan eluen diklorometan: metanol (10:1) dari hasil partisi dapat dilihat pada gambar 4.4.c dan 4.4.d. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

44

Untuk mengetahui senyawa dengan nilai Rf (Retardation Factor) mana saja yang aktif sebagai antibakteri pada hasil partisi, maka dilakukan bioautografi elusi. Hasil bioautografi elusi ditunjukkan pada Gambar 4.4.e, 4.4.f, 4.4.g, dan 4.4.h

(a) (b) (c) (d)

(e)

(f)

(g)

(h)

Gambar 4.4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ekstrak scalling Up media PDB (a) Profil KLT ekstrak etil asetat media GKBt 2 setelah penyemprotan serium sulfat (b) Profil KLT Ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit GKBt 2 setelah penyemprotan reagen serium sulfat (c) Profil KLT hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit GKBt2 dengan heksana (d) Profil KLT hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit GKBt2 dengan metanol setelah penyemprotan reagen serium sulfat (e) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur GKBt 2 fraksi metanol melawan bakteri S.aureus (f) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur GKBt 2 fraksi Metanol melawan bakteri E.coli (g) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur GKBt 2 fraksi Heksan melawan bakteri S.aureus


45

(h) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur GKBt 2 fraksi Heksan melawan bakteri E.coli.

Dari hasil bioautografi, diketahui bahwa aktivitas senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada ekstrak jamur partisi metanol lebih besar dibandingkan dengan ekstrak jamur hasil partisi menggunakan heksana. Diduga pada ekstrak jamur hasil partisi dengan metanol, senyawa dengan nilai Rf 0,45-1 memiliki aktivitas sebagai antibakteri.

4.5.

Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat Media GKBt 2 Ekstrak

media

GKBt

2

sebanyak

830

mg

difraksinasi

menggunakan kolom sephadex LH-20 dengan larutan pengelusi alkohol 96 %. Hal ini bertujuan untuk memisahkan antara senyawa yang memiliki bobot molekul tinggi dengan senyawa yang bobot molekulnya rendah. Sephadex LH-20 merupakan gel yang umum digunakan dalam isolasi bahan alam untuk senyawa yang bersifat non polar atau semi polar (Sarker, et al., 2006). Dari fraksinasi menggunakan kolom sephadex LH-20 menghasilkan 15 fraksi dengan bobot masing-masing fraksi yaitu 205 mg (F.1), 387 mg (F.2), 58,9 mg (F.3), 40,2 mg (F.4), 47 mg (F.5), 9,7 mg (F.6), 21 mg (F.7), 4,1 mg (F.8), 1,5 mg (F.9), 2,2 (F.10), 22,2 mg (F.11), 1,8 mg (F.12), 1,2 mg (F.13), 0,6 mg (F.14), 15,2 mg (F.15). Fraksi

F.5

yang berjumlah

47

mg

difraksinasi

kembali

menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silica gel (70-230 mesh) yang bertujuan untuk memisahkan senyawa dengan polaritas yang berbeda. Eluen yang digunakan dipilih berdasarkan optimasi kondisi kolom, dengan memilih perbandingan eluen yang memberikan nilai Rf fraksi target sekitar 0,3 yaitu dimulai dari kloroform : metanol perbandingan 10:1. Fraksi yang didapatkan sejumlah 10 fraksi dengan bobot masing-masing fraksi yaitu 3,4 mg (F.5.1), 3,2 mg (F.5.2), 1,7 mg (F.5.3), 2,9 mg (F.5.4), 4,7 mg (F.5.5), 3,5 mg (F.5.6), 0,3 mg (F.5.7), 9,8 mg (F.5.8), 7,3 mg (F.5.9), 10,5 mg (F.5.10). Hasil fraksinasi dapat dilihat pada gambar 4.6 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

46

Gambar 4.5.Hasil fraksinasi F.5 menggunakan kromatografi kolom dengan Fase diam Silica gel 70-230 mesh.

Gambar 4.6. Noda bercak yang muncul pada pelat KLT preparatif setelah dielusi dengan eluen koroform:metanol 7:1

Fraksi F.5.8 sebanyak 9,8 mg dilanjutkan dengan purifikasi menggunakan kromatografi kolom preparatif. Sebelumnya, larutan fraksi dilarutkan dalam aseton dengan konsentrasi 5 mg/mL dan dioptimasi dengan eluen yang sesuai untuk mendapatkan kondisi optimum untuk preparatif pada pelat KLT. Eluen yang digunakan adalah kloroform : metanol dengan perbandingan 7:1. Hasil elusi dapat dilihat pada gambar 4.7 Noda bercak yang muncul dikerok dengan spatula logam diatas kertas bersih, dibilas dengan aseton dan kemudian disaring. Filtrat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

47

dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan dikeringkan dengan gas nitrogen. Dari hasil preparatif, didapat dua fraksi masing-masing F.5.8a yang berupa serbuk berwarna oranye dengan bobot 4,5 mg dan F.5.8b yang berupa serbuk berwarna jingga-merah dengan bobot 5 mg. Kedua fraksi dielusi dengan kloroform : metanol perbandingan 7:1, Fraksi F.5.8.a memiliki nilai Rf sebesar 0, 41 sedangkan fraksi F.5.8.b memiliki nilai Rf sebesar 0,24. Hasil ditunjukkan pada gambar 4.7.

Gambar 4.7. Hasil KLT preparatif fraksi F.5.8. a) Fraksi F.5.8.a b) Fraksi F.5.8.b

Setelah didapatkan fraksi murni, maka dilakukan uji kemurnian fraksi. Uji kemurnian yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan KLT dua dimensi. KLT dua dimensi dilakukan dengan mengaplikasikan satu sampel tunggal pada pelat KLT dan dielusi menggunakan dua proses pengembangan. Pelat KLT awalnya dikembangkan dengan sistem pengembang pertama, dibiarkan kering dan kemudian dilanjutkan elusi dengan menggunakan sistem pengembang kedua (Cazes, 2004). Hasil KLT 2 dimensi terhadap fraksi murni menggunakan eluen Kloroform : Metanol (7:1) dan Kloroform : Metanol (5:1) ditunjukkan pada gambar 4.8


48

(a)

(b)

Gambar 4.8. Hasil KLT 2 dimensi fraksi murni. a) F.5.8.a b) F.5.8.b

4.6.

Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Purifikasi Dari hasil fraksinasi, didapat dua fraksi murni yang dideteksi

dengan kromatografi lapis tipis (KLT) yaitu fraksi F.5.8.a dan F.5.8.b. Kedua fraksi dengan spot tunggal tersebut dilanjutkan dengan melakukan penentuan nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) dengan metode mikrodilusi cair. Metode mikrodilusi cair ini merupakan adaptasi dari metode makrodilusi. Hanya saja pada metode mikrodilusi cair, digunakan pelat plastik microtiter wellplate sehingga memungkinkan penggunaan pelarut dan sampel dalam jumlah yang kecil (Schwalbe, et al., 2007). Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol dan eritromisin. Kloramfenikol merupakan antibakteri spektrum luas yang berkhasiat bakteriostatis terhadap hampir semua bakteri gram positif dan gram negatif (Hoan Tjay, et al., 2002) sedangkan eritromisin merupakan antibiotik yang bersifat bakteriostatis terhadap bakteri terutama bakteri gram positif (Hoan Tjay, et al., 2002). Data hasil uji KHM fraksi murni melawan bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dapat dilihat pada tabel 4.3


49

Tabel 4.3 Data Hasil Uji KHM terhadap bakteri S.aureus dan E.coli No

Larutan Uji

Nilai KHM( µg/mL) S.aureus

E.coli

1

F.5.8a

256

128

2

F.5.8b

256

128

3

Eritromisin

≤1

64

4

Kloramfenikol 4

8

Pada uji KHM, Suspensi bakteri uji yang digunakan berisi koloni bakteri sebanyak 105 CFU/mL, bakteri uji yang dipipet sebanyak 100 µL kedalam masing-masing sumur yang berisi seri pengenceran larutan uji dan media MHB. Inkubasi dilakukan selama 20 jam pada suhu 370C, adanya aktivitas penghambatan antibakteri ditunjukkan pada sumur dimana konsentrasi larutan uji masih mempertahankan kebeningannya pada pengamatan visual. Untuk mempermudah pengamatan, maka digunakan reagen IodoNitroTetrazolium (INT) yang akan tereduksi oleh enzim dehidrogenase pada bakteri menjadi formazan sehingga akan terjadi perubahan warna dari tak berwarna menjadi warna merah. Dari hasil uji KHM, diketahui bahwa terjadinya aktivitas penghambatan antibakteri Staphylococcus aureus dari fraksi F.5.8.a (256 µg/mL) dan F.5.8.b (256 µg/mL). Pada uji KHM terhadap bakteri E.coli, diketahui F.5.8 a dan F.5.8b menghambat pertumbuhan bakteri masing-masing pada konsentrasi 128 µg/mL. Bila dibandingkan dengan hasil uji terhadap larutan kontrol positif, kloramfenikol mampu memberikan nilai KHM sebesar 4 µg/mL terhadap S. aureus dan 8 µg/mL terhadap E.coli. Sedangkan eritromisin memberikan nilai KHM sebesar ≤1 µg/mL terhadap S.aureus dan 64 µg/mL terhadap E. coli. Pada uji KHM digunakan juga kontrol lain berupa GC (Growth Control) yaitu kontrol pertumbuhan yang menunjukkan bahwa bakteri uji dapat tumbuh pada kondisi atau perlakuan uji ditandai dengan larutan GC terlihat keruh atau berwana merah setelah penambahan reagen INT yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

50

menandakan terjadinya pertumbuhan bakteri, SC (Sterility Control) yaitu kontrol sterilitas yang berisi medium saja untuk menjamin bahwa medium atau pelat microtiter yang digunakan steril dan tidak ditumbuhi bakteri, ditandai dengan tidak keruhnya larutan SC sebagai tanda bahwa tidak ada bakteri yang tumbuh dan SoC (Solvent Control/ kontrol pelarut) yang berisi pelarut dan media yang menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan tidak mempengaruhi konsentrasi hambat larutan uji terhadap bakteri artinya larutan SoC terlihat keruh/berwarna merah setelah penambahan reagen INT.

4.7

Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium PDA (Potato Dextrose Agar) Identifikasi jamur GKBt 2 secara makroskopis dilakukan dengan

melihat karakter seperti warna dan permukaan koloni, ada tidaknya garis radial serta ada tidaknya garis konsentris (Gandjar, 1999). Hasil identifikasi jamur secara makroskopis yang diinokulasi pada medium PDA pada hari ke-7 menunjukkan ciri dengan tekstur permukaan seperti kapas, warna krem dengan bagian tengah berwarna hijau tua kecoklatan dan bagian tepi rata, bagian tengah berwarna, miselia tumbuh cepat (fast growing) dan memiliki garis radial dan konsentris sedangkan tampak belakang terlihat koloni berwarna kuning kecoklatan dengan bagian tengah berwarna coklat, memiliki garis radial dan konsentris (Gambar. 4.9 a dan 4.9.d). Terjadi perubahan warna koloni pada hari ke-7, ke-14 hingga ke20. Pada hari ke-14, warna pada tampak belakang koloni menjadi abu-abu –hitam (Gambar 4.9.b dan 4.9.e) sedangkan pada hari ke-20 berwarna hitam (Gambar 4.9.c dan 4.9.f). Sedangkan identifikasi jamur GKBt 2 secara mikroskopis dilakukan dengan melihat karakter hifa (berseptum atau tidak), hifa berwarna, tidak berwarna atau gelap, spora seksual atau spora aseksual. Hasil pengamatan secara mikroskopis menunjukkan bahwa hifa jamur berseptat dan berwarna gelap (hitam keabu-abuan), spora aseksual berbentuk sederhana seperti klamidospora interkalar (Gambar 4.9.h dan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

51

4.9.i). Diduga jamur GKBt 2 merupakan jamur yang berasal dari kelas Hypomycetes family Dematiaceae. Hypomycetes merupakan fungi yang hanya membentuk miselium dan tidak memiliki ascocarp (Gandjar, 2006). Pada fungi kelas Hypomycetes umumnya memiliki miselia steril atau dengan spora yang tidak diproduksi pada acervuli maupun pycnidia (Vashsista,1992). Hifa kapang dematiaceae umumnya berwarna coklat, kehijauan atau kehitaman, hitam kelam atau hitam keabuan (Gandjar, 1999).

(a)

(b)

(c)

(e)

(d)

(f)


52

(g)

(h)

(i)

Gambar.4.9. Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium PDA (a) umur 7 hari / tampak depan (b) umur 14 hari/ tampak depan (c) umur 20 hari/ tampak depan (d) umur 7 hari /tampak belakang e) umur 14 hari/ tampak belakang (f) umur 20 hari/ tampak belakang (g) Pengamatan mikroskopik fungi Dematiaceae pada mikroskop cahaya perbesaran 600x (Lestari, 2008) (h) dan (i) Pengamatan mikroskopik pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x.


BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan

1. Dari hasil skrining aktivitas antibakteri, terdapat ekstrak etil asetat dari isolat jamur endofit yang memiliki aktivitas antibakteri paling besar yaitu ekstrak etil asetat dari isolat jamur GKBt 2 2. Dari hasil fraksinasi dan pemurnian didapatkan dua fraksi murni yaitu fraksi F.5.8a (4,5 mg) dan F.5.8b (5 mg) 3. Hasil uji KHM menunjukkan bahwa F.5.8a dan F.5.8b aktif melawan bakteri uji S. aureus masing-masing sebesar 256 µg/mL sedangkan nilai KHM terhadap bakteri uji E. coli masing-masing sebesar 128 µg/mL. 4. Dari hasil identifikasi, jamur GKBt 2 diduga merupakan jamur kelas Hypomycetes, family Dematiacea.

5.2

Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap fraksinasi dan pemurnian

fraksi lain pada jamur endofit GKBt 2 yang memiliki aktivitas terhadap bakteri uji yang lebih tinggi.

53

UIN Syarif Hdayatullah Jakarta

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, Mahbob, Noor, Z.M., Ismail, N.H., Lajiz, N.H., Shaari, K., 2010. Evaluation of Antioxidant Potential of Medicinal Plants from Malaysian Rubiaceae ( subfamily Rubioideae). African Journal of Biotechnology. Vol 9, No.46, pp. 7948-7954. Casez, 2004. Encyclopedia of Chromatography. USA : University of Toronto and Marcel Dekker.Inc Choma, I., 2005. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis. LCGC Europe, Vol 18, Issue 9, Desember 2005. Diakses pada 5 Januari 2013 pada http://www.chromatographyonline.com Choma, I.M & Grzelak, E.M., 2010. Bioautographic detection in thin-layer chromatography. Journal Of Chromatography A. Poland : Elsevier. Day, R.A., A.L, Underwood. 2002. Analisis kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga. Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar. Gandjar, I., R., A., Samson, K. Van den Tweel-Vewmeulen, A.Oetari, I., Santoso. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. Gandjar, I., W. Sjamsudrizal, dan A. Oetari. 2006. Mikologi :Dasar dan Terapan. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. Hoan tjay, T., Rahardja, K., 2002. Obat-obat penting : khasiat, penggunaan dan efek sampingnya.5th ed. Jakarta : PT Elex Media Komutindo. Ismail, NH., Alias, A., Osman, C.P. 2012. Alkaloids and Antraquinones from Malaysian Flora, Phytochemicals - A Global Perspective of Their

Role

in

Nutrition

and

Health,

Diakses

di

www.intechopen.com pada 20 Februari 2013. Jamal, Y., Praptiwi, Fathoni, A., Agusta, A., 2011. Bioproduksi Flouroglusinol oleh Endofit Coelomicetes AFAS-AF3 yang

54


55

Diisolasi dari Tumbuhan Archangelesia flava L.Merr. Berkas Penelitian Hayati Vol. 16, hal 169-172. Kusumaningtyas, E., Astuti, E., Darmono. 2008. Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam penentuan senyawa anti kapang. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. Vol.6, No.2, hal 75 – 79. Labeda, D., P., 1990. Isolation biotechnologic Organisme From Nature. New York : McGraw- Hill Publishing Company. Lestari. I., D., 2008. “Kajian Awal Potensi Tumbuhan Indigeous dan Keragaman Funginya untuk Revegetasi Lahan Bekas Tambang Timah di Pulau Bangka”. Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor. Liang, H., Xing, Y., Chen, J., Zhang, D., Guo, S., Wang, C. et al., 2012. Antimicrobial activities of endophytic fungi isolated from Ophiopogon japonicus (Liliaceae). BMC Complementary and Alternative Medicine. Beijing. Mardiastuti, Kurniawan, A., Kiranasari, A., Ikaningsih, Kadarsih, R., 2007.

Emerging Resistance Pathogen: Situasi Terkini di Asia,

Eropa, Amerika Serikat, Timur Tengah dan Indonesia. Majalah Kedokteran Indonesia, Vol.57, No.3. Mycek, Mary, J., Harvey, R.A., Champe, P.,C., 2001. Farmakologi : Ulasan Bergambar Edisi 2. Jakarta : Penerbit Widya Medika. Nithya, K. & Muthumary, J., 2011. Bioactive Metabolite Produced By Phomopsis Sp, an Endophytic fungus in Allamanda cathartica Linn. Recent Research in Science and Technology. Vol.3, No.3, p 44-48. Osman, C.P., Ismail, N.H., Ahmad, R., Ahmat, N., Awang, K., Jaafar, F.M., 2010. Anthraquinones with Antiplasmodial Activity from the Roots of Rennellia elliptica Korth. (Rubiaceae). Molecules. Vol. 15, hal : 7218-7226; Parija, C.,S., 2009. Textbook of Microbiology & Immunology. India : El sevier.


56

Pelczar, M.,J., & E.,C.,S., Chan .1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I. Penterjemah: R.S. Hadioetomo et al. Jakarta: UI Press. Pratiwi, S.,T., 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga. Prescott, L.M., JP, Harley, D.A. Klein. 2005. Microbiology, 6th Ed. New York : McGraw-Hill Co Inc. Sarker, D.S., Latif Zahid, Gray, I.A. 2006. Natural Product Isolation, 2nd edition. New Jersey : Humana Press Inc. Schwalbe, R., Steele-Moore, L., Goodwin, A.,C., 2007. Antimicrobial Susceptibility testing Protocols. USA : CRC Press. Setiabudy, R., 2007. Farmakologi Dan Terapi. Ed5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik FKUI, Jakarta : Balai Penerbit FKUI. Species 2000 & ITIS Catalogue of Life. 2010. Indexing The World’s Known

Species.

Diakses

tanggal

5

januari

2013,

di

http://www.catalogueoflife.org/annualchecklist/2010/details/specie s/id/4088607 Strobel, G.A., Daisy, B., 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Vol. 67, No. 4 p. 491–502. American Society for Microbiology. Suratman. 2008. The Indonesian Species of Rennellia Korth. (Rubiaceae). Jurnal Biodiversitas. Vol 9, No. 4, hal 259 – 263. Talaro, K.,P., 2005. Foundation in Microbiology, 5th ed. New York : Mc Graw Hill Higher Education. Valgas, C., de Souza, S.M., Smania, E.F., Smania, A. 2007. Screening Methode To Determine Antibacterial Activity Of Natural Product. Brazilian Journal of Microbiology. Vol 34, p 369-380. Vashista, B.,R., 1992. Botany for Degree Student: Fungi. S.Chand and Company. Zhao, J., Mou, Y., Shan, T., Li, Y., Zhou, L., Wang, M., Wang, J., 2010. Antimicrobial Metabolites from the Endophytic Fungus Pichia guilliermondii Isolated from Paris polyphylla var. Yunnanensis. Jurnal molekul, Vol 15.


57

Zhao, J., Zhou, L., Wang, T., Shan, T., Zhong, L., Liu1, X., dan Gao, X., 2010. Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants. Current research, Technology and education Topics in applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Zuhud, E. A.,M., 2009. Potensi Hutan Tropika Indonesia sebagai Penyangga Bahan Obat Alam untuk Kesehatan Bangsa. Jurnal Bahan Alam Indonesia. Vol. 6, No.6, hal : 227-232.


58 Lampiran 1. Alur Penelitian

Masing-masing 23 isolat jamur endofit yang diisolasi dari akar, batang, daun dan biji Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth)

Kultivasi pada medium PDB

Ekstraksi hasil kultur jamur endofit

Skrining produksi metabolit sekunder ekstrak

Skrining aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

Scalling Up kultivasi Jamur dengan aktivitas antibakteri paling besar

Jamur diiidentifikasi secara morfologi

Ekstraksi hasil scalling Up Jamur endofit

Isolasi metabolit sekunder

F1 F2

F4

F3

Fn F5

Fraksi murni dan aktif

Uji nilai MIC

59 Lampiran 2. Bagan Kerja Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi 23 ekstrak etil asetat jamur endofit dari Ginseng Kuning

Kons. Ekstrak 10 mg/mL dalam aseton Pelat KLT Ditotolkan 10 μL pada pelat KLT ukuran 8 x 8 cm

Diletakkan pada cawan petri yang telah diletakkan kapas steril basah

Dicelupkan pada cawan petri steril yang berisi suspensi bakteri uji

Inkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0C

Disemprotkan INT 4 mg/mL ke permukaan pelat

Terbentuk zona bening pada latar pelat KLT berwarna merah (Aktivitas antibakteri (+) )


60 Lampiran 3. Bagan Kerja Scaling Up dan Ekstraksi Hasil Scaling Up Diinokulasi pada media PDA miring sebagai Stock Culture

Isolat GKBt 2 pada media PDA miring

500 mL x 4 erlemeyer ukuran 2 L

Diinokulasi pada media PDB didalam erlenmeyer

200 mL x 15 erlenmeyer ukuran 500 mL

Diinkubasi 3 minggu pada suhu kamar dengan kondisi statis

Biomassa

Media

Maserasi dengan aseton 3 x

Ekstraksi dg etil asetat 3 x Ekstrak

Ekstrak

Evaporasi ekstrak dengan vacum rotary evaporator

Dipekatkan dengan vacum rotary evaporator

Fraksi air Ekstrak pekat

Ekstraksi dengan etil asetat 3x Ekstrak EtOAc Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator Ekstrak pekat Dilarutkan dengan 100 mL metanol partisi dengan 100 mL heksana 3 x

Ekstak Metanol

Ekstrak pekat

Ekstak Heksana Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

Ekstrak pekat


61 Lampiran 4. Bagan Kerja Fraksinasi Ekstrak media GKBt2 830 mg Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Sephadex LH 20, menggunakan fase gerak Alkohol 96 %

F.1

F.5

F.3 F.2

205 mg

F.4 58,9 mg

387 mg

40,2 mg

47 mg

F.9

F.7

F.6

21 mg

9,7 mg

F.10 F.8 4,1 mg

1,5 mg

F.11 22,2 mg

2,2 mg

F.13 F.12 1,8 mg

F.14 1,2 mg

0,6 mg

F.15

15,2 mg

Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silica 70 – 230 mesh, menggunakan fase gerak kloroform : Metanol (10:1, 5:1, 0:1)

F.5.1

F.5..2

F.5.3

F.5.4

F.5.5

3,4 mg

3,2 mg

1,7 mg

2,9 mg

4,7 mg

F.5.6 3,5 mg

F.5.7 0,3 mg

F.5.8 9,8 mg

F.5.9 7,3 mg

F.5.10 10,5 mg

Purifikasi menggunakan KLT preparatif dengan eluen Kloroform : Metanol 7:1

F.5.8.a 4,5 mg

F.5.8.b 5 mg UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

62 Lampiran 5. Perhitungan Koloni Bakteri 1. Koloni bakteri S.aureus Jumlah koloni suspensi Jumlah koloni suspensi

= 105x106 / 10-1 = 1,05 x 109

Diencerkan menjadi koloni 105 CFU/mL :

2. Koloni Bakteri E.coli Jumlah koloni suspensi = 65x108 / 10-1 = 6,5 x 1010 Diencerkan menjadi koloni 105 CFU/mL : Jumlah koloni suspensi


63 Lampiran 6. Skema Pengenceran Larutan Uji

Kemudian, ditambahkan inokulum bakteri uji kedalam larutan uji masing-masing sumuran 100 µL :


64

Lampiran 7. Hasil Uji MIC

(a)

(b)

(e)

(c)

(f)

a. Fraksi F.5.8.a terhadap S. aureus

(d)

(g) e. Fraksi F.5.8.a terhadap E. coli

b. Fraksi F.5.8.b terhadap S. aureus f . Fraksi F.5.8.b terhadap E. coli c. Eritromisin terhadap S. aureus

g. Kloramfenicol terhadap E.coli

d. Kloramfenikol S. aureus

h. Eritromisin terhadap E. coli

SC = Sterility Control; GC = Growth Control ;SoC = Solvent Control.

(h)

65

Lampiran 8. Gambar hasil pewarnaan gram pada bakteri uji

(a)

(b)

Gambar hasil pewarnaan gram pada pengamatan menggunakan mikroskop cahaya, a. Hasil pewarnaan gram pada bakteri gram positif / S.aureus (perbesaran 40x10) b. Hasil pewarnaan gram pada bakteri gram negatif / E.coli (perbesaran 40x10x10)


66

Lampiran 9. Komposisi Media Media Potato Dextrose Agar / PDA (DifcoTM)

1.

Bahan

Jumlah

Agar-agar

15 g

Seduhan kentang

4g

Dekstrosa

20 g

Air

1L

pH akhir 5,61± 0,2, suhu 250 C

Cara Pembuatan : 39 gram PDA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

2.

Media Potato Dextrose Broth /PDB (DifcoTM) Bahan

Jumlah

Pati kentang

4g

Dekstrosa

20 g

Air

1L 0

pH akhir 5,1± 0,2, suhu 25 C

Cara Pembuatan : 24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit


67

3.

Media Mueller Hinton Broth / MHB (Criterion) Bahan

Jumlah

Asam kasein hidrolisis

17,5 g

Ekstrak sapi

2 g

Pati

1 ,5 g

Air

1L

pH akhir 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara pembuatan: 21 gram MHB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

4.

Media Nutrient Agar /NA (DifcoTM) Bahan

Jumlah

Agar

15 g

Gelatin pepton

5g

Ekstrak daging sapi

3g

Air

1L

pH akhir 7,4 ± 0,2 suhu 25 0C

Cara pembuatan: 23 gram NA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.


68

5.

Media Mueller Hinton Agar /MHA (CriterionTM) Bahan

Jumlah

Asam Kasein Hidrolisat

17,5 g

Ekstrak Daging Sapi

2g

Pati

1,5 g

Agar

17 g

Air

1L


Cara pembuatan: 38 gram MHA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit

6.

Media Brain Heart Infussion/BHI ( BBLTM) Bahan

Jumlah

Brain Heart, Infusion from (solids)

6 g

Peptic Digest of Animal Tissue

6 g

Sodium Klorida

5g

Dekstrosa

3g

Pancreatic Digest of Gelatin

14,5g

Disodium fosfat

2,5


Cara pembuatan: 37 gram BHI disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.


69

Lampiran 10. Gambar Alat-Alat yang Digunakan

Rotary evaporator

Shaker incubator

Oven

Incubator

UV Cabinet

Autoklave

Timbangan digital

Mikroskop cahaya

Laminar air flow


SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN GINSENG KUNING (Rennellia elliptica Korth

Recommend Documents