KARAKTERISASI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp. SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB BERSPEKTRUM LUAS
DEBIE RIZQOH
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ABSTRAK DEBIE RIZQOH. Karakterisasi Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. sebagai Penghasil Senyawa Antimikrob Berspektrum Luas. Di bawah bimbingan ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI TOHIR. Simbiosis antara bakteri dengan spons telah banyak dipelajari saat ini. Bakteri yang berasosiasi dengan spons diketahui menghasilkan berbagai senyawa metabolit sekunder yang mempunyai aktivitas antimikrob. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik bakteri yang berasosiasi dari spons sebagai penghasil senyawa antimikrob berspektrum luas. Delapan isolat bakteri potensial yang telah diisolasi dari spons Jaspis sp. diekstrak menggunakan pelarut nbutanol. Kedelapan isolat tersebut adalah SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-43. Hasil penapisan aktivitas antimikrob dari ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 merupakan bakteri yang memiliki aktivitas antimikrob berspektrum paling luas. SAB E-35 dapat menghambat mikrob indikator seperti Eschericia coli, Enteropathogenic E. coli (EPEC), Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans dan Candida tropicalis. Konsentrasi minimum penghambatan dari isolat ini hanya membutuhkan konsentrasi filtrat 6,25% untuk menghambat beberapa mikrob indikator. Isolat ini juga mempunyai gen penyandi poliketida sintase (PKS) dan nonribosomal peptida sintetase (NRPS). Hasil analisis berdasarkan sekuen gen 16S rRNA SAB E-35 menunjukkan homologi dengan Providencia vermicola (identitas maksimum 99%). Kata kunci: bakteri yang berasosiasi dengan spons, senyawa bioaktif, aktivitas antimikrob.
ABSTRACT DEBIE RIZQOH. Characterization of Sponge-Associated Bacteria from Jaspis sp. Producing Wide Spectrum Antimicrobial Compound. Under direction of ARIS TRI WAHYUDI and DUDI TOHIR. Nowadays, symbiosis between bacteria and sponge has been learned nowaday. Spongeassociated bacteria are known producing various secondary metabolites that have antimicrobial activity. This research purposed to know characteristic sponge-associated bacteria as producer of wide spectrum antimicrobial compound. Eight isolates of potential bacteria that have been isolated from Jaspis sp. was extracted use solvent n-butanol. They are SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40, and SAB S-43. Antimicrobial activity screening of sponge-associated bacteria extracts showed that SAB E-35 is a bacteria having widest spectrum antimicrobial activity. SAB E-35 can inhibit indicator microbes, e.g. E. coli, Enteropathogenic E. coli (EPEC), Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and Candida tropicalis. Minimum inhibitory concentration of this isolate is only 6.25% of filtrates to inhibit some indicator microbe. This isolate also has poliketide sinthase (PKS) and nonribosomal peptide sinthetase (NRPS) gene. Analysis based 16S rRNA sequence of SAB E-35 showed homologous with Providencia vermicola and close relationship with some marine bacteria producing bioactive compound (maximum identity 99%). Key words: sponge-associated bacteria, bioactive compound, antimicrobial activity.
KARAKTERISASI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp. SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB BERSPEKTRUM LUAS
DEBIE RIZQOH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Judul Skripsi Nama NIM
: Karakterisasi Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. sebagai Penghasil Senyawa Antimikrob Berspektrum Luas : Debie Rizqoh : G34070028
Disetujui: Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. NIP. 19630705 199103 1 005
Drs. Dudi Tohir, M.S. NIP. 19571104 198903 1 001
Diketahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Karakterisasi Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp sebagai Penghasil Senyawa Antimikrob Berspektrum Luas” ini dilakukan mulai Oktober 2010 sampai dengan Maret 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai dari proyek penelitian hibah kompetitif “Penelitian Kerjasama Luar Negeri dan Publikasi Internasional 2010/2011” dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang diberikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si. Untuk itu kami mengucapkan terima kasih. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si dan Drs. Dudi Tohir, M. S atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Yonatan Banoet, S.Si., Rika Indri Astuti, M.Si., dan Ari Sulistiowati, M.Si. di Laboratorium Mikrobiologi, serta Pak Eman dan Ibu Nunung dari Laboratorium Kimia Analitik atas bantuan dan saran selama penulis melakukan penelitian ini. Terima kasih juga untuk keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan, serta teman-teman tersayang khususnya di Biologi angkatan 44, Wisma Gunarti dan BEM FMIPA 2009 dan 2010 yang selalu memberikan bantuan, doa, semangat dan kasih sayang. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Juni 2011
Debie Rizqoh
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tegal Propinsi Jawa Tengah pada tanggal 19 Mei 1989 dari pasangan Rozikin dan Lis Rahayu Sri, S.Pd. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara. Penulis lulus dari SMP Negeri 2 Tegal pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 1 Tegal dan lulus tahun 2007. Setelah itu, penulis lulus seleksi masuk jurusan Biologi di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Alga dan Lumut, Ekologi Dasar, Mikrobiologi Dasar, Biologi Cendawan dan Biologi Dasar. Penulis juga pernah menjadi tutor Biologi di B’Expert. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) FMIPA IPB pada tahun kepengurusan 2009 dan 2010 serta menjadi panitia di berbagai kegiatan antara lain Pesta Sains 2010, Lomba Cepat Tepat Biologi 2009, Lomba Karya Cipta Mahasiswa 2009, dan sebagainya. Penulis juga mempunyai beberapa prestasi yaitu mahasiswa berprestasi Biologi bidang akademik tahun 2009, juara 1 pemilihan mahasiswa berprestasi tingkat Departemen Biologi tahun 2011, lolos pendanaan PKM-P dari Dikti pada tahun 2010, dan finalis National Life Science Competition (NALCO) tahun 2011 yang diadakan di Institut Teknologi Bandung.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ...................................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................. viii PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1 Latar Belakang .............................................................................................................. 1 Tujuan........................................................................................................................... 2 BAHAN DAN METODE .............................................................................................................. 2 Waktu dan Tempat ........................................................................................................ 2 Bahan ............................................................................................................................ 2 Metode .......................................................................................................................... 2 Ekstraksi n-butanol ....................................................................................... 2 Bioassay ekstrak kasar senyawa antimikrob .................................................. 2 Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) .............................................. 2 Isolasi Genom ............................................................................................... 2 Deteksi Gen PKS dan NRPS dengan PCR ..................................................... 3 Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR ...................................................... 3 Analisis Sekuen 16S rRNA ........................................................................... 3 Uji Fisiologis dan Uji Gram .......................................................................... 3 HASIL
...................................................................................................................................... 3 Bioassay ekstrak kasar senyawa antimikrob .................................................................. 3 Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ............................................................... 4 Deteksi Gen PKS dan NRPS dengan PCR ..................................................................... 4 Analisis sekuen 16S rRNA ........................................................................................... 6 Uji Fisiologis dan Uji Gram .......................................................................................... 6 Analisis Pohon Filogenetik ............................................................................................ 6
PEMBAHASAN ........................................................................................................................... 7 Aktivitas Senyawa Bioaktif pada Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons ..................... 7 Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ............................................................... 8 Analisis Gen PKS dan NRPS ........................................................................................ 8 Identifikasi Isolat Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons ............................................. 9 SIMPULAN ................................................................................................................................ 10 SARAN .................................................................................................................................... 10 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 10
DAFTAR TABEL Halaman 1 Aktivitas antimikrob isolat SAB asal spons Jaspis sp yang digunakan dalam penelitian ini.. ...... 1 2 Hasil uji antimikrob ekstrak kasar SAB terhadap mikrob indikator. ............................................ 4 3 Hasil Uji MIC isolat bakteri SAB terhadap beberapa mikrob indikator........................................ 5 4 Hasil uji fisiologi isolat SAB E-35 .............................................................................................. 6
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Hasil uji aktivitas ekstrak antimikrob SAB E-8 (a), SAB E-32 (b), SAB E-33 (c), SAB E-37 (d), SAB E-38 (e), SAB E-40 (f), dan SAB E-43 (g) terhadap Bacillus subtilis. ................................. 4 2 Hasil uji aktivitas antimikrob terhadap B. subtilis pada (a) ekstrak SAB E-35, kontrol negatif, dan (b) kontrol positif. ....................................................................................................................... 4 3 Hasil visualisasi PCR gen PKS menunjukkan (berurutan dari kiri ke kanan) isolat SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 mempunyai domain gen PKS. ..................................................................................................................................... 5 4 Hasil visualisasi PCR gen NRPS juga menunjukkan (berurutan dari kiri ke kanan) isolat SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 mempunyai domain gen NRPS....................................................................................................................... 5 5 Hasil uji Gram SAB E-35 dilihat dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10.. ............... 6 6 Pohon filogenetik menunjukkan kekerabatan isolat SAB E-35 dengan beberapa bakteri laut yang menghasilkan senyawa bioaktif. .................................................................................................. 7
viii
PENDAHULUAN Latar Belakang Spons merupakan salah satu komponen komunitas bentik yang penting di lautan. Spons memiliki perkembangan unik dan kesederhanaan struktural yang memisahkan spons dari hewan lain. Spons termasuk dalam Filum Porifera dan Subfilum Parazoa yang hidup sesil dan merupakan organisme pemakan suspensi (Hentschel et al., 2002, Campbell et al. 2003, Taylor et al. 2007). Saat ini spons banyak dikaji oleh para ilmuwan karena spons berasosiasi dengan berbagai macam mikroorganisme. Fungsi simbiosis antara spons dengan mikroorganisme tersebut antara lain untuk pertukaran nutrisi, stabilitas struktur spons, pemrosesan limbah metabolit, dan produksi metabolit sekunder (Hentschel et al. 2002). Keragaman mikroorganisme yang beraso-siasi dengan spons telah banyak diketahui dari sekuen 16S rRNA antara lain dari kelompok Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacteria (Alpha, Beta, Delta, dan Gammaproteobacteria), Spirochaetes, dan Verrucomicrobia (Taylor et al. 2007). Spons dan bakteri yang berasosiasi dengan spons telah diketahui sebagai penghasil berbagai senyawa bioaktif. Senyawa bioaktif tersebut memiliki aktivitas sebagai antimikrob (Hentschel et al. 2001, Thakur et al. 2003, Zheng et al. 2005, Muscholl-Silberhorn et al. 2007), antikanker, antitumor, antiviral (Thakur & Müller 2004, Taylor et al. 2007), antiangiogenik, hemolitik, dan sitotoksik (Thakur et al. 2006). Senyawa bioaktif tersebut umumnya merupakan turunan dari asam amino dan nukleosid, makrolid, porfirin, terpenoid, peroksida alifatik dan sterol
(Thakur & Müller 2004). Perkembangan penemuan senyawa bioaktif saat ini semakin maju seiring dengan perkembangan dalam bidang biologi molekular yang dikenal dengan metagenomik (Taylor et al. 2007). Metagenomik memungkinkan potensi organisme yang memproduksi senyawa bioaktif dapat diketahui dengan menganalisis suatu fragmen genom atau gen. Beberapa penelitian saat ini menggunakan deteksi gen poliketida sintase (PKS) dan nonribosomal peptida sintetase (NRPS) (Schirmer et al. 2005, Pfeifer & Khosla 2001, Neilan et al. 1999, Komaki et al. 2008). Kedua gen tersebut memproduksi kompleks multienzim yang berperan dalam pembentukan berbagai macam senyawa bioaktif (Lee et al. 2005, Schirmer et al. 2005, Taylor et al. 2007). Berbagai penelitian memperlihatkan bahwa substansi antimikrob telah diisolasi dari berbagai bakteri yang berasosiasi dengan spons (Hentschel et al. 2001, Taylor et al. 2007, Webster et al. 2001). Pada penelitian sebelumnya, Abubakar (2009) melaporkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. atau sponge-associated bacteria (SAB), dapat menghasilkan senyawa antimikrob. Delapan isolat terbaik, SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43, mampu menghambat Staphylococcus aureus nonpatogen, S. aureus patogen, Vibrio harveyi, Escherichia coli, EPEC (Enteropathogenic E. coli), Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, dan C. tropicalis (Tabel 1). Pengujian awal juga menunjukkan bahwa kedelapan isolat tersebut memiliki aktivitas terhadap Bacillus subtilis. Aktivitas antimikrob dapat berfungsi apabila mencapai konsentrasi tertentu yang disebut konsentrasi hambatan minimum (KHB) atau Minimum inhibitory concentration (MIC).
Tabel 1 Aktivitas antimikrob isolat SAB asal spons Jaspis sp yang digunakan dalam penelitian ini. Hasil Uji Antimikrob * * * * E. B. S. P. C. C. * coli subtilis EPEC aureus aeruginosa albicans tropicalis 1 SAB E-8 + + + ++ +++ + + 2 SAB E-32 ++ + ++ + ++ ++ + 3 SAB E-33 ++ + ++ + +++ +++ 4 SAB E-35 + ++ ++ ++ +++ ++ ++ 5 SAB E-37 ++ + +++ + +++ + 6 SAB E-38 ++ + +++ ++ +++ +++ +++ 7 SAB E-40 ++ + ++ ++ +++ +++ + 8 SAB S-43 + +++ + + +++ Keterangan: + :ukuran zona hambat 0.5-5 mm; ++ :5.1-10 mm; +++ : 10.1-15 mm; *: patogen. No.
Kode Isolat
2
Meskipun aktivitas antimikrob pada isolatisolat tersebut telah diketahui, namun pengujian aktivitas ekstrak dari senyawa antimikrob tersebut belum diketahui. Konsentrasi minimum penghambatan senyawa antimikrob, deteksi gen senyawa bioaktif dan identifikasi isolat potensial juga perlu dikaji lebih lanjut.
dalam 500 ml media SWC cair. Kultur diinkubasi pada shaker (100 rpm, 30 ºC) selama tiga hari. Setelah itu kultur ditambahkan 150 ml n-butanol dan diin-kubasi pada suhu 40 ºC selama 24 jam, distirer selama 20 menit, dan dievaporasi. Ekstrak yang dihasilkan disimpan pada suhu 5 ºC untuk pemakaian selanjutnya (Muller et al. 2004).
Tujuan Penelitian ini bertujuan mengetahui karakteristik bakteri yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil senyawa antimikrob berspektrum luas.
Bioassay ekstrak kasar senyawa antimikrob. Mikrob indikator dikultur selama 24 jam. Sebanyak 1% kultur mikrob indikator dicampurkan ke media NA dan PDA semi padat lalu dituangkan di cawan. Ekstrak kasar senyawa antimikrob yang telah dilarutkan dengan etil asetat (100 mg/ml) diteteskan ke kertas cakram masing-masing sebanyak 100 µl kemudian diletakkan di permukaan media agar semipadat tersebut. Cawan uji diinkubasi selama 24 jam. Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2010 hingga Maret 2011 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik dari bakteri yang berasosiasi dengan spons hasil penelitian terdahulu yaitu SAB E8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 (Abubakar 2009). Mikrob indikator yang digunakan untuk uji antagonis adalah E. coli, B. subtilis, EPEC, S. aureus, P. aureus, C. albicans dan C. tropicalis. Media yang digunakan yaitu SWC (Sea Water Complex), NB (Nutrient Broth), NA (Nutrient Agar), PDB (Potato Dextrose Broth) dan PDA (Potato Dextrose Agar). Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-butanol. Untuk isolasi genom digunakan bahan TrisEDTA (Ethylene Diamine Tetra Acid), lisozim, SDS (Sodium dodecyl sulfate), proteinase K, NaCl 5M, CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), PCI (Phenol Chloroform Isoamylalchohol), CI (Chloroform Isoamyl-alchohol), sodium asetat, etanol absolut, etanol 70% dan aqua bidestilata. Untuk PCR (Polymerase Chain Reaction) digunakan buffer, Kit-PCR (TAKARA La Taq), primer spesifik (for-ward dan reverse), Alat-alat labora-torium yang digunakan adalah vorteks, laminar (Jouan, Perancis), autoklaf, hot plate, mikroskop, pipet mikro, cawan, tabung, serta peralatan umum yang digunakan di laboratorium. Metode Ekstraksi senyawa bioaktif menggunakan n-butanol. Isolat SAB dikulturkan ke
Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Isolat bakteri SAB dikulturkan dalam medium SWC lalu diinkubasi selama tiga hari di suhu ruang. Mikrob target diremajakan kembali dalam media NB untuk E. coli, EPEC, S. aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa atau dalam media PDB untuk C. albicans dan C. tropicalis. Mikrob target tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Isolat bakteri SAB penghasil antimikrob yang telah diinkubasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 30 menit. Filtrat dari hasil sentrifugasi dimasukkan kedalam 5 tabung reaksi dengan konsentrasi yang berbeda-beda masingmasing 6.25%, 12.5%, 25%, 50%, dan 100%. Selain kelima konsentrasi tersebut, dibuat juga kontrol yang tidak diberi filtrat bakteri. Setelah itu, masing-masing tabung diisi dengan 1 ml bakteri target. Biakan uji MIC tersebut lalu diinkubasi selama 24 jam. Kemudian diamati kekeruhan masing-masing biakan di dalam tabung reaksi dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. MIC ditentukan berdasarkan kekeruhan biakan dibandingkan dengan kontrol. Isolasi Genom. Isolat bakteri dikultur-kan dalam media kaldu SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 ml kultur disentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit. DNA genom bakteri diekstrak dengan mengikuti metode CTAB (Sambrook & Russell 2001).
3
Deteksi Gen Penyandi PKS dan NRPS dengan PCR. Reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan mengikuti metode Schirmer et al. (2005). Reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan masing-masing tahap yaitu predenaturasi selama 1 menit dan denaturasi selama 30 detik pada suhu 94 ºC, annealing 50 ºC selama 30 detik, polimerisasi 75 ºC selama 1 menit 10 detik, dan post PCR dilakukan pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Visualisasi amplikon PKS dan NRPS dilakukan melalui elektroforesis. Isolat yang mempunyai gen penyandi domain keto-sintase (KS) dari PKS menunjukkan terbentuknya pita pada ukuran di sekitar 700 pasang basa (basa pair) (Gambar 3), sedangkan pada deteksi gen penyandi domain adenilase (A) dari NRPS ditunjuk-kan dengan munculnya pita di sekitar ukuran 1 000 bp. Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR. Amplifikasi gen ini dilakukan terhadap isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik. Amplifikasi gen dilaku-kan dengan mencampurkan 12.5 bufer PCR GC II, 4 µl dNTPs (2.5 mM/dNTP), 1 µl primer 63 f (CAGGCCTAACACATGC-AAGTC), 1 µl primer 1387 r (GGGCGGWGTGTACAAGGC), 4 µl DNA cetakan, dan 0.25 µl Taq DNA polymerase (TAKARA) dan 2.25 µl ddH2O. Ampli-fikasi dilakukan dalam mesin PCR (Perkin-Elmer, USA) sebanyak 30 siklus. Tahap amplifikasi yang diatur yaitu predenaturasi 5 menit dan denaturasi 1 menit pada suhu 94 ºC, annealing 1 menit pada suhu 55 ºC, serta polimerisasi 1 menit dan post PCR 2 menit pada suhu 72 ºC. Visualisasi amplikon 16S rRNA dilakukan melalui elektroforesis. Hasil amplifikasi gen PCR ini kemudian disekuen di 1 st BASE PTE Ltd, Singapura. Analisis Sekuen 16S rRNA. Sekuen DNA bakteri dianalisis untuk mengidentifikasi bakteri SAB. Identifikasi spesies dilakukan dengan analisis homologi sekuen menggunakan program Blast-N dari situs NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Setelah diketahui spesies bakteri SAB selanjutnya
dianalisis kekerabatannya dengan membuat pohon filogenetik. Sekuen gen 16S rRNA disejajarkan dengan menggunakan program clustal W (www.ebi.ac.uk/clustalw/). Pohon filogene-tik dikonstruksi dengan program Treecon 1,3b (Peer & Watcher 1994). Uji Fisiologis dan Uji Gram. Isolat diremajakan ke media agar miring selama 24 jam. Pada uji fisiologis, seluruh isolat yang tumbuh di agar miring dipindahkan ke dalam larutan garam fisiologis 10 ml kemudian divorteks hingga larut dan larutan garam fisiologis mencapai kekeruhan 80%. Setelah itu, uji fisiologis dilakukan dengan meneteskan larutan bakteri uji masing-masing 200 µl ke dalam kit uji (Microgen GN-ID A-B Panel). Reaksi fisiologis yang diuji yaitu lisin, ornitin, H2S, glukosa, manitol, xilosa, ONPG, indol, urease, Voges Proskauer, sitrat, TDA, gelatin, malonat, inositol, sorbitol, ramnosa, sukrosa, laktosa, arabinosa, adonitol, rafinosa, salicin, arginin, nitrat dan oksidase. Motilitas bakteri diamati dengan pengamatan miroskop. Uji Gram dilakukan dengan metode pewarnaan Gram standar. HASIL Bioassay Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob. Ekstraksi menghasilkan ekstrak kasar senyawa antimikrob. Ekstrak tersebut diuji aktivitasnya terhadap beberapa mikrob indikator dan sebagian besar menghasilkan aktivitas antimikrob terhadap mikrob indikator (Tabel 2). Aktivitas senyawa bioaktif antimikrob ditunjukkan dengan adanya zona bening (Gambar 1). Sehingga kontrol negatif yang tidak memiliki aktivitas antimikrob tidak akan membentuk zona bening dan kontrol positif (ampisilin) akan menghasilkan zona bening (Gambar 2). Hasil bioassay menunjukkan bahwa semua ekstrak kasar senyawa antimikrob mempunyai aktivitas positif terhadap E. coli, EPEC, B. subtilis, dan P. aeruginosa. Ekstrak kasar terbaik yang mempunyai spektrum aktifitas terhadap semua mikrob uji adalah isolat SAB E-35.
4
Tabel 2 Hasil uji antimikrob ekstrak kasar SAB terhadap mikrob indikator. No.
Kode Isolat
E. coli
B. subtilis
Hasil Uji Antimikrob * * S. P. aureus aeruginosa
*
EPEC
*
*
C. albicans
C. tropicalis
1
SAB E-8
+
+
++
-
+
+
-
2
SAB E-32
+
+
+
-
+
-
-
3
SAB E-33
+
+
+
-
+
-
-
4
SAB E-35
+++
+
++
++
+++
+
+
5
SAB E-37
+
+
++
-
+
-
-
6
SAB E-38
+
+
+
-
+
-
-
7
SAB E-40
++
+
+
-
+
-
-
8
SAB S-43
++
++
++
+
+++
-
-
Keterangan: + :ukuran zona hambat 0.5-5 mm; ++ :5.1-10 mm; +++ : 10.1-15 mm; *: patogen.
b
a
e
d
c f
g
Gambar 1 Hasil uji aktivitas ekstrak antimikrob SAB E-8 (a), SAB E-32 (b), SAB E-33 (c), SAB E-37 (d), SAB E-38 (e), SAB E-40 (f), dan SAB E-43 (g) terhadap Bacillus subtilis.
(a)
(b)
Gambar 2 Hasil uji aktivitas antimikrob terhadap B. subtilis pada (a) ekstrak SAB E-35, kontrol negatif, dan (b) kontrol positif. Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Hasil uji MIC menunjukkan kosentrasi minimum penghambatan yang berbeda-beda pada setiap isolat (Tabel 3). Nilai maksimum penghambatan terbaik ditunjukkan pada persentase terkecil yaitu 6.25%. Berdasarkan uji MIC, semua isolat potensial hanya dapat menghambat pertumbuhan mikrob target atau bakteriostatik.
Deteksi Gen Penyandi PKS dan NRPS dengan PCR. Hasil deteksi gen penyandi PKS dan NRPS menunjukkan bahwa semua isolat SAB yang diteliti mempunyai kedua gen tersebut (Gambar 3 dan 4). Isolat terbaik, SAB E-35, kembali menunjukkan konsistensinya dengan menunjukkan adanya gen PKS dan NRPS.
5
Tabel 3 Hasil Uji MIC isolat bakteri SAB terhadap beberapa mikrob indikator. Mikrob Uji
MIC (%) SAB E- SAB E35 37
SAB E8
SAB E32
SAB E33
E. coli
6.25%
6.25%
6.25%
12.5%
100%
100%
25%
12.5%
EPEC
100%
50%
25%
100%
100%
100%
12.5%
50%
S. aureus
100%
50%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
P. aeruginosa
6.25%
25%
6.25%
50%
6.25%
100%
6.25%
50%
B. subtilis
12.5%
25%
12.5%
6.25%
100%
25%
100%
100%
C. albicans
100%
100%
6.25%
6.25%
100%
100%
50%
100%
100% Bs/Fs
100% Bs/Fs
100% Bs/Fs
6.25% Bs/Fs
50% Bs/Fs
50% Bs/Fs
50% Bs/Fs
100% Bs/Fs
C. tropicalis
SAB E38
SAB E40
SAB S43
Keterangan: Bs: Bakteriostatik, Fs: Fungistatik. 8
32
33
35
37
38
40
43
M
10 000 bp
1 000 bp 700 bp
500 bp
Gambar 3 Hasil visualisasi PCR gen PKS menunjukkan (berurutan dari kiri ke kanan) isolat SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 mempunyai domain gen PKS. 8
32
33
35
37
38
40
43
M
10 000 bp
1000 bp
1 000 bp 500 bp
Gambar 4 Hasil visualisasi PCR gen NRPS juga menunjukkan (berurutan dari kiri ke kanan) isolat SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 mempunyai domain gen NRPS.
76
Analisis Sekuen 16S rRNA. Isolat dengan aktivitas terbaik (SAB E-35) dilakukan identifikasi dengan analisis homologi sekuen 16S rRNA. Hasil analisis menunjukkan bahwa SAB E-35 memiliki kemiripan terbesar dengan genus Providencia, terutama spesies P. vermicola dengan identitas maksimum sebesar 99% dan nilai E sama dengan 0. Uji Fisiologis dan Uji Gram. Hasil uji fisiologis SAB E-35 ditunjukkan pada Tabel 4. Reaksi positif menunjukkan bahwa bakteri melakukan reaksi yang melibatkan atau menghasilkan senyawa-senyawa yang diuji. Hasil tersebut menunjukkan bahwa SAB E-35 merupakan bakteri motil yang dapat melakukan reaksi oksidasi. Beberapa reaksi fisiologis lain memperlihatkan hasil yang berbeda-beda. Hasil pengamatan uji Gram menunjukkan sel bakteri berwarna merah sehingga diketahui SAB E-35 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil (Gambar 5). Analisis Pohon Filogenetik. Konstruksi pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 mempunyai kekerabatan yang dekat dengan beberapa bakteri laut penghasil senyawa bioaktif (Gambar 6).
Tabel 4 Hasil uji fisiologis isolat SAB E-35. Reaksi Oksidase Motilitas Nitrat Lisin Ornitin H2 S Glukosa Manitol Xilosa ONPG Indol Urease V.P. Sitrat TDA Gelatin Malonat Inositol Sorbitol Rhamnosa Sukrosa Laktosa Arabinosa Adonitol Rafinosa Salicin Arginin
Hasil + + + + + + + + + + + + + + + + + +
10 µm
Gambar 5 Hasil uji Gram SAB E-35 dilihat dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10.
7
Gambar 6 Pohon filogenetik menunjukkan kekerabatan isolat SAB E-35 dengan beberapa bakteri laut yang menghasilkan senyawa bioaktif. (Keterangan: Angka 0,1 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 100 ulangan). PEMBAHASAN Aktivitas Senyawa Bioaktif pada Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya (Abubakar 2009), dilaporkan bahwa beberapa bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. mempunyai aktivitas antimikrob. Mikrob indikator yang dihambat antara lain S. aureus, E. coli, EPEC, P. aeruginosa, B. subtilis, C. albicans dan C. tropicalis. Dari hasil penapisan tersebut, pada penelitian ini dipilih delapan isolat dengan spektrum penghambatan terluas yaitu SAB E-8, SAB E32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E38, SAB E-40 dan SAB S-43 (Tabel 1). Hasil penapisan awal menunjukkan bahwa SAB E8, SAB E-32, SAB E-35, SAB E38, dan SAB E-40 mepunyai aktivitas antimikrob terhadap semua mikrob indikator. SAB E-33 hampir menghambat semua mikrob indikator kecuali P. aeruginosa. SAB E-37 tidak dapat menghambat C. tropicalis. SAB S-43 mempunyai aktivitas antimikrob terhadap E. coli, EPEC, P. aeruginosa, S. aureus dan B. subtilis. Penelitian ini melanjutkan hasil penelitian tersebut dengan melakukan penapisan aktivitas antimikrob ekstrak kasar yang dihasilkan dari ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari delapan isolat pilihan tersebut. Ekstrak kasar SAB E-8, SAB E-32, SAB E33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, dan SAB S-43 menunjukkan aktifitas antimikrob dengan spektrum penghambatan yang berbeda-beda (Tabel 2). Semua ekstrak kasar
SAB dapat menghambat E. coli, B. subtilis, EPEC, dan P. aeruginosa. S. aureus dapat dihambat oleh ekstrak kasar SAB E-35 dan SAB E-43. C. albicans dihambat oleh ekstrak kasar SAB E-8 dan SAB E-35. C. tropicalis hanya dihambat oleh SAB E-35. Dari hasil tersebut, ekstrak SAB E-35 menunjukkan aktivitas terbaik karena memiliki aktivitas antimikrob terhadap semua mikrob indikator. Hasil penapisan ekstrak kasar isolat SAB menunjukkan beberapa perbedaan dengan hasil penapisan awal. Beberapa ekstrak kasar isolat SAB tidak menghasilkan aktivitas positif terhadap mikrob indikator yang pada saat penapisan awal dapat dihambat oleh isolat SAB. Dari lima isolat yang dapat menghambat semua mikrob indikator pada penapisan awal, yaitu SAB E-8, SAB E-32, SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40, hanya terdapat satu ekstrak kasar isolat yaitu SAB E35 yang dapat menghambat semua mikrob indikator. Ekstrak kasar SAB E-8 tidak dapat menghambat S. aureus dan C. tropicalis. Ekstrak kasar SAB E-32, SAB E-33, SAB E37, SAB E-38 dan SAB E-40 tidak dapat menghambat S. aureus, C. albicans dan C. tropicalis. Sedangkan ekstrak kasar SAB S-43 menghasilkan aktivitas yang sama dengan hasil penapisan awal. Selain perbedaan spektrum penghambatan, ukuran zona hambat yang dihasilkan oleh ektrak kasar SAB juga cenderung lebih kecil dibandingkan dengan isolatnya. Umumnya ekstrak kasar SAB hanya menghasilkan ukuran zona hambat dari 0.5-5 mm. Namun beberapa ekstrak kasar SAB bisa
8
menghasilkan ukuran zona hambat lebih besar yaitu SAB E-35 dan SAB E-43. Ekstrak kasar SAB E-35 menghambat paling kuat terhadap E. coli dan P. aeruginosa dan ekstrak kasar SAB E-43 menghambat paling kuat terhadap P. aeruginosa. Perbedaan antara hasil penapisan isolat SAB dan ekstrak kasar SAB disebabkan oleh beberapa hal. Pelarut yang digunakan pada saat ekstraksi, yaitu n-butanol, tidak dapat menjerat seluruh senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh isolat SAB sehingga hanya sebagian saja yang terekstraksi. Selain itu, zat-zat pengotor yang terkandung dalam ekstrak dapat menghambat aktivitas dari senyawa antimikrob murni. Kemampuan berbagai ekstrak kasar isolat SAB dalam menghambat berbagai mikrob indikator disebabkan oleh senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh isolat SAB. Senyawa bioaktif merupakan suatu senyawa metabolit sekunder yang dapat berinteraksi dengan senyawa kimia atau molekul target dari organisme hidup yang lain (Bérdy 2005). Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan spons seperti genus Alteromonas, Pseudomonas, Bacillus dan Flavobacterium memiliki aktifitas antimikrob terhadap E. coli, S. aureus, B. subtilis, Agrobacterium tumefaciens dan Saccharomyces cereviciae (Zheng et al. 2005). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar senyawa antimikrob dari bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki aktivitas terhadap E. coli, EPEC, B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans, dan C. tropicalis. Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Hasil uji MIC menunjukkan bahwa berbagai isolat SAB memiliki konsentrasi minimum penghambatan yang berbeda-beda (Tabel 3). SAB E-8 menghambat paling kuat terhadap E. coli dan P. aeruginosa, SAB E-32 terhadap E.coli, SAB E-33 terhadap E. coli, P. aeruginosa, dan C. albicans, SAB E-35 terhadap B. subtilis, C. albicans dan C. tropicalis, SAB E-37 terhadap P. aeruginosa, dan SAB E-40 terhadap P. aeruginosa. SAB E-38 meng-hambat paling kuat terhadap B. subtilis dan SAB S-43 terhadap E.coli. Konsentrasi MIC ini dikonfirmasi kembali dengan melakukan plating untuk mengetahui jenis aktivitas antimikrob. Hasil konfirmasi MIC menunjukkan bahwa semua filtrat isolat SAB memiliki aktivitas menghambat bakteri (bakteriostatik) dan cendawan (fungistatik) karena masih terdapat
mikrob indikator yang tumbuh saat dikonfirmasi. Kemampuan penghambatan suatu antibiotik disebabkan oleh senyawa bioaktif yang dihasilkan memiliki suatu mekanisme tertentu dalam menghambat pertumbuhan mikrob. Contoh mekanisme penghambatan yang dikenal yaitu kelompok antibiotik β-laktam dan glikopeptida yang menghambat sintesis peptidoglikan pada dinding sel bakteri. Selain itu, terdapat antibiotik yang dapat menghambat sintesis RNA karena berikatan dengan sub unit β dari RNA polimerase seperti pada antibiotik rifampisin (Madigan et al. 2006). Analisis Gen Penyandi PKS dan NRPS. Karakteristik lain bakteri potensial penghasil senyawa bioaktif potensial adalah adanya Poliketida sintase (PKS) dan nonribosomal peptida sintetase (NRPS). PKS dan NRPS merupakan kompleks multienzim dan multidomain yang terlibat dalam biosintesis senyawa poliketida dan nonribosomal peptida (Kealey et al. 1998, Pfeifer & Khosla 2001, Ansari et al. 2004, Tanovic 2008). Senyawa metabolit sekunder tersebut merupakan senyawa yang berperan sebagai prekursor dalam produksi senyawa bioaktif seperti antimikrob, antifungal, antiparasit, antitumor, antikanker, antiinflamasi dan agen imunosupresan (Pfeifer & Khosla 2001, Ansari et al. 2004). Nonribosomal peptida disintesis oleh kondensasi monomer asam amino. Poliketida dibuat dari penambahan dua unit karbon ketida secara berulang yang berasal dari monomer asil-koenzim A, kemudian setiap unit disusun menjadi polimer linier berupa poliketida (Tanovic et al. 2008). Hasil deteksi gen PKS menunjukkan bahwa semua isolat SAB positif menyandikan gen domain enzim ketosintase (Gambar 3). Ketosintase merupakan salah satu jenis enzim berperan dalam sintesis poliketida (Schirmer et al. 2005). Senyawa poliketida dikenal sebagai suatu kelompok produk alam yang banyak dimanfaatkan dalam pengobatan manusia dan hewan (Kealey et al. 1998). Dalam biosintesis poliketida, beberapa enzim dalam cluster PKS yang berperan yaitu ketosintase (KS), acyl carrier protein (ACP), ketoreduktase (KR), dehidratase (DH), dan enoylreduktase (ER) (Pfeifer & Khosla 2001). Beberapa contoh senyawa antibiotilk yang dihasilkan melalui biosintesis poliketida yaitu eritromicin A, avermicin (Marsden et al. 1998), actinorhodin, doxorubicin, epotilon A, asam 6metilsalisilat, dan lovastin (Pfeifer & Khosla
9
2001). Menurut Schirmer et al. (2005), bakteri yang berasosiasi dengan spons diketahui memproduksi banyak senyawa bioaktif termasuk diantaranya adalah poliketida, seperti pada komunitas mikrob yang berasosiasi dengan spons Discodermia dissoluta yang mempunyai keragaman tinggi dan beberapa kelompok dengan domain PKS ketosintase yang spesifik. Fieseler et al. (2007) juga mengemukaan adanya keragaman gen PKS pada berbagai jenis mikrob yang berasosiasi dengan spons dari berbagai jenis spons yang berasal dari beberapa belahan dunia. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa spons Jaspis sp. pun memiliki keragaman bakteri yang memiliki gen PKS. Gen domain ketosintase pada isolat SAB E-35 berhasil diisolasi. Kemudian hasil identifikasi sekuen dengan program Blast-x diketahui bahwa sekuen PKS tersebut termasuk PKS tipe I dengan maksimum identitas sebesar 98%. Selain itu, deteksi gen NRPS juga menunjukkan hasil positif pada semua isolat SAB yang diuji (Gambar 4). Nonribosomal peptida sintetase merupakan suatu multimodular enzim yang berperan dalam pembentukan peptida yang tidak disintesis di ribosom. Beberapa enzim modular yang bertanggungjawab dalam pembentukn peptida nonribosomal antara lain adenilase (A), peptidyl carrier protein (PCP), dan thioesterase (TE) (Tanovic et al. 2008). Pada beberapa mikrob laut khususnya Cyanobacteria, NRPS meng-hasilkan beberapa senyawa bioaktif antara lain anabaenopeptins, microginins, mikro-sistins, cyanopeptolin, dan aeruginosins (Rounge et al. 2009). Berdasarkan hasil deteksi gen PKS dan NRPS, semua isolat SAB yang meng-hasilkan senyawa antimikrob mempunyai kedua gen tersebut. Keberadaan kedua gen PKS dan NRPS pada isolat SAB menimbulkan dugaan bahwa kedua gen tersebut membentuk kompleks hibrid seperti yang ditemukan pada beberapa kasus (Maiya et al. 2007, Bergman et al. 2007). PKS dan NRPS disintesis oleh suatu megasintesis polifungsional (200-2000 kDa) dibagi dalam unit-unit fungsional diulang dikenal sebagai modul, yang masingmasing bertanggung jawab untuk tahap diskrit panjang rantai poliketida atau polipeptida. Dalam setiap modul secara independen dilipat domain protein yang bertanggung jawab untuk beberapa kombinasi karakteristik modifikasi gugus fungsional pada setiap siklus panjang rantai biosintesis. Umumnya modul mega-
protein bertanggung jawab terhadap masingmasing jenis biosintesis untuk poliketida dan polipeptida. Namun ditemukan juga sistem hibrid PKS-NRPS, seperti pada sintasis rapamicin (12 PKS modul dan 1 NRPS modul) dan sintesis yersiniabactin (3 NRPS modul dan 1 PKS modul). Keberadaan hibrid PKS-NRPS fungsional menunjukkan bahwa protein NRPS akan berubah menjadi homodimerik juga (Cane & Walsh 1999). Adanya hibrid PKS-NRPS ini sangat menarik karena akan menambah variasi kombinasi modul biosintesis dalam menghasilkan berbagai senyawa bioaktif. Identifikasi Isolat Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons. Hasil bioassay menunjukkan bahwa aktivitas terbaik adalah isolat SAB E-35. Hasil MIC memper-lihatkan isolat tersebut dapat menghambat tiga mikrob indikator pada konsentrasi yang sangat kecil. SAB E-35 juga terdeteksi memiliki gen PKS dan NRPS. Oleh karena itu, isolat bakteri SAB E-35 didentifikasi lebih lanjut dengan analisis genetik berdasarkan gen 16S rDNA. Hasil Blast-N menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 mempunyai homologi terbesar dengan spesies Providencia vermicola strain AR_PSBH1 (identitas maksimum 99%, nilai E 0,0). Providencia vermicola merupakan bakteri mempunyai sel Gram negatif, ukurannya 2.14-5.0 x 0.57-0.71 µm. Koloni sirkular, diameter 1.8-2.2 mm, bersinar, liat, cembung, buram, dengan kecoklatan di bagian tengah dan tepian bening. Negatif pada reaksi oksidase, positif untuk katalase, urease dan reduksi nitrat dan dapat menfermentasi Dglukosa. Pertumbuhan sampai suhu 41 ºC. Karakteristik biokimia khusus yaitu pada produksi asam dari L-arabinosa, 2ketoglukonat, serta pemanfaat-an L-eritritol, asam D-glukosamin, dan asam D-glukoronat. (Somvanshi et al. 2006). Hasil identifikasi fisiologis (Tabel 4) menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 merupakan organisme motil yang positif melakukan reaksi oksidase. Reaksi lain yang memperlihatkan hasil yang positif yaitu nitrat, ornitin, glukosa, manitol, ONPG, urease, Voges-Proskauer, TDA, gelatin, inositol, sorbitol, sukrosa, arabinosa, rafinosa, salicin dan arginin. Sebaliknya reaksi negatif terlihat pada reaksi lisin, H2S, xilosa, indol, sitrat, malonat, ramnosa, laktosa, dan adonitol. Hasil pengamatan uji Gram menunjukkan bahwa SAB E-35 termasuk bakteri Gram negatif berbentuk basil.
10
Beberapa karakteristik morfologi dan fisiologi pada SAB E-35 sama dengan Providencia vermicola. Keduanya merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil. Namun terdapat beberapa perbedaan fisiologi yang ditemukan diantara keduanya antara lain pada reaksi oksidase, sitrat, sukrosa, adonitol dan sorbitol dan salicin bila dibandingkan dengan spesies P. vermicola yang didefinisikan Somvanshi et al. (2006). Perbedaan yang lain yaitu P. vermicola diisolasi dari nematode entomopatogen Steinernema thermophilum fase juvenil yang bisa menginfeksi jaringan hidup. Perbedaan tersebut mengindikasi bahwa spesies SAB E-35 kemungkinan adalah spesies yang berbeda dari P. vermicola. Meskipun hasil uji fisiologis menunjukkan banyak perbedaan dengan P. vermicola, namun hasil identifikasi genetik dengan menggunakan gen 16S rDNA menunjukkan homologi yang besar mencapai 99% dengan beberapa strain dari genus Providencia (Tabel 5). Selain itu penampakan morfologi menunjukkan ciri yang sama dengan genus Providencia yang lain yaitu selnya basil dan Gram negatif (Somvanshi et al. 2006). Providencia merupakan anggota Enterobacteriaceae yang spesiesnya dikenal sebagai patogen (O’Hara et al. 2000). Namun, apabila dilihat dari ciri-ciri fisiologis, SAB E-35 kembali ditemukan beberapa perbedaan dengan genus Providencia secara umum. Menurut O’Hara et al. (2000), ciri umun reaksi biokimia pada genus Providencia antara lain positif pada reaksi penggunaan sitrat dan fermentasi manosa, negatif pada reaksi pencairan gelatin (22 ºC), produksi H2S, serta dekarboksilasi lisin dan ornitin. Sedangkan hasil uji fisiologis isolat SAB E-35 menunjukkan reaksi negatif pada reaksi sitrat, positif pada reaksi gelatin dan ornitin. Oleh karena itu, perlu identifikasi lebih lanjut untuk menentukan identitas isolat SAB E-35. Selain diidentifiksi sekuen gen 16S rDNA dan uji fisiologis, analisis pohon filogenetik juga telah dilakukan. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan membandingkan sekuen gen 16S rDNA isolate SAB E-35 dengan reference strain dari bakteri-bakteri laut yang telah diketahui menghasilkan senyawa bioaktif (Gambar 6). Reference strain yang digunakan antara lain Pseudoaltermonas tunicata (Rao et al. 2005), Pseudomonas phenolica (Isnansetyo & Kamei 2003), Marinomonas mediterranea (LucasElío 2006), Spingomonas mollusco-rum (Romanenko et al. 2007), Hallobacillus salinus (Teasdale et al. 2009), Bacillus
licheniformis (Yan et al. 2003), Amycolatopsis mediterranei (Kim et al. 2006), serta Streptomyces (Sunaryanto et al. 2010). Dari semua reference strain yang dianalisis, terlihat bahwa SAB E-35 mempunyai kekerabatan paling dekat dengan kelompok Pseudoalteromonas dan Marinomonas mediterranea. Ada dua spesies Pseudoalteromonas yang digunakan sebagai reference strain yaitu P. tunicata dan P. phenolica. P. tunicata adalah bakteri Gammaproteobakteria gram negatif berpigmen hijau yang membentuk koloni pada permukaan organisme laut salah satunya Ulva lactuca, memproduksi senyawa antibakteri yang efektif terhadap gram positif dan gram negatif (Rao et al. 2005). P. phenolica juga menghasilkan antibiotik bakterisidal terhadap methicilin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) (Isnansetyo & Kamei 2003). Sedangkan Marinomonas mediterranea menghasilkan senyawa bioaktif marinocin, suatu protein antibakteri yang disintesis oleh bakteri laut melanogenik. Senyawa antibiotik ini aktif menghambat pada kondisi aerobik maupun anaerobik (Lucas-Elio et al. 2006). SIMPULAN Isolat SAB E-35 merupakan bakteri penghasil senyawa antimikrob berspektrum luas. Hasil penapisan isolat dan ekstrak kasar isolat SAB E-35 menunjukkan aktivitas antimikrob terhadap E. coli, B. subtilis, EPEC, S. aureus, P. aureus, C. albicans dan C. tropicalis. Isolat ini hanya membutuhkan konsentrasi kecil (6.25%) dari senyawa antimikrob yang dihasilkannya untuk menghambat beberapa mikrob. Isolat ini juga terdeteksi mempunyai gen PKS dan NRPS. Hasil analisis genetik berdasarkan gen pengkode 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat tersebut mempunyai homologi paling tinggi dengan Providencia vermicola. DAFTAR PUSTAKA Abubakar H. 2009. Bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp.: Analisis penghasil senyawa antimikrob dan keragaman genetiknya. [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Ansari MZ, Yadav G, Gokhale RS, Mohanty D. 2004. NRPS-PKS: a knowledge-based resource for analysis of NRPS/PKS
11
megasynthases. Nucl Acids Rev 32: 405413. Bérdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot 58: 1–26. Bergmann SB, Schümann J, Scherlach K, Lange C, Brakhage AA, Hertweck. 2007. Genomic-driven discovery of PKS-NRPS hybrid metabolites from Aspergillus nidulans. Nat Chem Biol 3: 213-217. Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2003. Biologi. Jakarta: Erlangga.
Kim TK, Hewavitharana AK, Shaw PN, Fuerst JA. 2006. Discovery of a new source of rifamycin antibiotics in marine sponge Actinobacteria by phylogenetic prediction. Appl Environ Microbiol 72: 2118-2125. Komaki H, Fudou R, Shibata D, Ojika M, Nakajima D, et al. 2008. PCR detection of type I polyketide synthase genes in Myxobacteria. Appl Environ Microbiol 74: 5571-5574.
Cane DE, Walsh CT. 1999. The parallel and convergent universes of polyketide synthases and nonribosomal peptide synthetases. Chem Biol 6: 319-325.
Lee B, Kroken S, Chou DYT, Robbertse B, Yoder OC, et al. 2005. Functional analysis of all nonribosomal peptide synthetases in Cochliobolus heterostrophus reveals a factor, NPS6, involved in virulence and resistance to oxidative stress. Eukaryot cell 4: 545-555.
Fieseler L, Hentschel U, Hrvatin S, Grozdanov L, Butzke D, et al. 2007. Widespread occurrence and genomic context of unusually small polyketide sinthase genes in microbial consortia associated with marine sponges. Appl Env Microbiol 73: 2144-2155.
Lucas-Elío P, Gómez D, Solano F, SanchezArnat A. 2006. The antimicrobial activity of marinocine, synthesized by Marinomonas mediterranea, is due to Hydrogen peroxide generated by its lysine oxidase activity. J Bacteriol 188: 24932501.
Hentschel U, Hopke J, Horn M, Hacker J, Friedrich AB, et al. 2002. Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges from different oceans. Appl Environ Microbiol 68: 4431– 4440.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 1997. Brock Biology of Microorganism. Ed ke-8. Prentice Hall International, Inc.
Hentschel U, Schmid M, Wagner M, Fieseler L, Gernert C, et. al. 2001. Isolation and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the Mediterranean sponges Aplysina aerophoba and Aplysina cavernicola. FEMS Microbiol Ecol 35 : 305-312. Isnansetyo A, Kamei Y. 2003. MC21-A, a Bactericidal Antibiotic Produced by a New Marine Bacterium, Pseudoalteromonas phenolica sp. nov. O-BC30, against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agent Chemother 47: 480-488. Kealey JT, Liu L, Santi DV, Betlach MC, Barr PJ. 1998. Production of a polyketide natural product in nonpolyketide producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci 95: 505-509.
Maiya S, Grundmann A, Xiang L, Shu-Ming L, Turner G. Identification of a hybrid PKS/NRPS required for pseurotin A biosynthesis in the human pathogen Aspergillus fumigatus. Chem Bio Chem 8: 1-9. Marsden AFA, Wilkinson B, Cortés J, Dunster NJ, Staunton J, et al. 1998. Polyketide synthase engineering broader specificity into an antibiotic-poducing. Science 279: 199-202. Müller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL, Thakur AN, Batel R, et al. 2004. Oxygencontrolled Bacterial Growth in the Sponge Suberites domuncula: toward a Molecular Understanding of the symbiotic relationships between sponge and bacteria. Appl Environ Microbiol 70: 2332-2341. Muscholl-Silberhorn A, Thiel V, Imhoff JF. 2007. Abundance and bioactivity of cultured sponge-associated bacteria from
12
the mediterranean sea. Microb Ecol 55: 94-106.
marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol 71: 4840-4849.
Neilan B, Dittmann E, Schaub V, Rouhiainen L, Sivonen K, et al. 1999. Nonribosomal Peptide synthesis and toxigenicity of Cyanobacteria. J Bacteriol 181: 40894097.
Somvanshi VS, Lang E, Straübler B, Ganguly S, Schumann P, et al. 2006. Providencia vermicola sp. nov., isolated from infective juveniles of the entomopathogenic nematode Steinernema thermophilum. Int J Syst Evol Microbiol 56: 629–633.
O’Hara CM, Brenner FW, Miller JM. 2000. Classification, identification and clinical significance of Proteus, Providencia, dan Morganella. Clin Microbiol Rev 13: 534546.
Sunaryanto R, Marwoto B, Irawadi TT, Mas’ud ZA, Hartoto L. 2010. Isolation and characterization of antimicrobial subtance from marine Sreptomyces sp. Microbiol Indones 4: 84-89.
Peer Y van de, Wachter R. 1994. Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees from the Microsoft Windows Environment. Compu Appl Biosci 10: 569570.
Tanovic A, Samel SA, Essen LO, Marahiel MA. 2008. Peptide synthetase crystal structure of the termination module of a nonribosomal. Science 321: 659-663.
Pfeifer BA, Khosla C. 2001. Biosynthesis of polyketides in heterologous hosts. Microbiol Mol Biol Rev 65: 106-118.
Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Sponge-associated microorgan-isms: evolution, ecology, and biotech-nological potential. Microbiol Mol Biol Rev 71: 295–347.
Rao D, Webb JS, Kjelleberg S. 2005. Competitive interactions in mixed-species biofilms containing the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicate. Appl Environ Microbiol 71: 1729-1736. Romanenko LA, Tanaka N, Uchino M, Kalinovskaya NI, Mikhailov VV, et al. 2007. Sphingomonas molluscorum sp. nov., a novel marine isolate with antimicrobial activity. Int J Sys Evol Microbiol 57: 358-363. Rounge TB, Rohrlack T, Nederbragt AJ, Kristensen T, Jakobsen KS. A genomewide analysis of nonribosomal peptide synthetase gene clusters and their peptides 12 in a Planktothrix rubescens strain. Bio Med Cent Genom 10: 396-407.
Teasdale ME, Liu J, Wallace J, Akhlaghi F, Rowley DC. 2009. Secondary metabolites produced by the marine bacterium Halobacillus salinus that inhibit quorum sensing-controlled phenotypes in Gramnegative bacteria. Appl Environ Microbiol 75: 567-572. Thakur AN, Thakur NL, Indap MM, Pandit RA, Datar VV, Müller WEG. 2006. Antiangiogenik, antimicrobial, and citotoxic potential of sponge-associated bacteria. Mar Biotech 7: 245-252. Thakur NL, Hentschel U, Krasko A, Pabel CT, Anil AC, Werner EG, Müller WEG. 2003. Antibacterial activity of the sponge Suberites domuncula and its primmorphs: potential basis for epibacterial chemical defense. Aquat Microb Ecol 31: 77–83.
Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Gold Spring Harbor Laboratory.
Thakur NL, Müller WEG, Biotechnological potential of sponges. Cur Sci 86: 1506-1512.
Schirmer A, Gadkari R, Reeves CD, Ibrahim F, Delong EF, Hutchinson CR. 2005. Metagenomic analysis reveal diverse polyketide synthase gene cluster in microorganisms associated with the
Webster NS, Wilson KJ, Blackall LL, Hill RT. 2007. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile. Appl Environ Microbiol 67: 434–444.
2004. marine
13
Yan L, Boyd KG, Adams DR, Burgess JG. 2003. Biofilm-specific cross-species induction of antimicrobial compounds in Bacilli. Appl Environ Microbiol 69: 37193727.
Zheng L, Han X, Chen H, Lin W, Yan X. 2005. Marine bacteria associated with marine microorganisms: the potential antimicrobial resources. Ann Microbiol 55: 119-124.
