TOKSISITAS EKSTRAK SENYAWA BIOAKTIF DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS DAN ANALISIS DNA YANG BERPERAN DALAM BIOSINTESISNYA
MOHAMMAD FADHILLAH
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam Biosintesisnya” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skipsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2014
Mohammad Fadhillah NIM G34090094
ABSTRAK MOHAMMAD FADHILLAH. Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam Biosintesisnya. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI TOHIR. Spons merupakan organisme penghasil banyak senyawa bioaktif yang hidup bersimbiosis dengan banyak mikroorganisme. Mikroorganisme simbion salah satunya berperan sebagai penghasil senyawa bioaktif untuk pertahanan diri spons inangnya. Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons terhadap larva Artemia salina serta analisis keragaman DNA yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif. Uji toksisitas dilakukan dengan metode BSLT yang menghasilkan nilai LC50 sebesar 117.1 µg/mL sampai 620 µg/mL. Fraksionasi ekstrak etil asetat isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 menggunakan teknik kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) menghasilkan fraksi dengan nilai LC50 terbaik yaitu 116.7 µg/mL. Fraksi 38-E dari isolat SAB E-38 menunjukkan peningkatan nilai toksisitas dari ekstrak etil asetatnya, yaitu dari 138.6 µg/mL menjadi 116.7 µg/mL. Isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 memiliki gen penyandi domain KS dari PKS dan domain A dari NRPS dengan homologi 47% hingga 100%. SAB E-40 memiliki homologi yang rendah dan diduga berpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif baru. Kata kunci: bakteri yang berasosiasi dengan spons, NRPS, PKS, toksisitas
ABSTRACT MOHAMMAD FADHILLAH. Toxicity of Sponge-Associated Bacteria Bioactive Compounds Extract and Analysis of DNA that play role in its Biosynthesis. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and DUDI TOHIR. Sponges are organisms that produced many bioactive compounds and live symbiotically with many microorganisms. Symbiont microorganisms act as producers of bioactive compounds for sponge self-defense. This study aims to test the toxicity of the ethyl acetate extract sponge-associated bacteria against Artemia salina larvae and diversity analysis of DNA that play a role in the synthesis of bioactive compounds. BSLT was used as toxicity assay method and obtained LC50 values ranged from 117.1 µg/mL to 620 µg/mL. Fractionation of the ethyl acetate extract for isolates SAB E-35, SAB E-38 and SAB E-40 using preparative thin layer chromatography technique (PTLC) yielded fraction with the best LC50 value 116.7 µg/mL. Fraction 38-E of isolate SAB E-38 showed increase in LC50 value from its etyl acetat extract 138.6 µg/mL to 116.7 µg/mL. Isolates SAB E-35, SAB E-38, and SAB E-40 has gene that encoded the KS domain of PKS and A domain of NRPS with homology percentage from 47% to 100%. SAB E-40 has low homology and expected as potential producer of new bioactive compounds. Keywords: NRPS, PKS, sponge-associated bacteria, toxicity
TOKSISITAS EKSTRAK SENYAWA BIOAKTIF DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS DAN ANALISIS DNA YANG BERPERAN DALAM BIOSINTESISNYA
MOHAMMAD FADHILLAH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi : Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam Biosintesisnya Nama : Mohammad Fadhillah NIM : G34090094
Disetujui oleh
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, M Si Pembimbing I
Drs Dudi Tohir, M S Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Iman Rusmana, M Si Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan rasa syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih pada penelitian ini adalah Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam Biosintesisnya. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, M Si dan Drs Dudi Tohir, MS selaku dosen pembimbing dan Puji Rianti, M Si selaku dosen penguji yang telah memberikan arahan dan bimbingannya dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan rasa terima kasih kepada Pak Eman, Pak Sabur, Issanto, S Si, Effendi, M Si, Rahayu Wangsa Putrie, M Si, dan Annisa Wulan Agus Utami, S Si yang telah banyak membantu dalam pengerjaan dan juga memberikan saran serta masukan untuk penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, dan seluruh keluarga atas dukungannya baik secara moril maupun materil selama penyusunan skripsi ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2014
Mohammad Fadhillah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Ekstraksi Senyawa Bioaktif dan Toksisitasnya
4
Toksisitas Fraksi
6
Amplifikasi Domain KS dan Domain A
7
Analisis Bioinformatika
9
SIMPULAN DAN SARAN
12
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR TABEL 1 2 3 4
Nilai LC50 ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons Nilai LC50 fraksi ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons Persentase homologi sekuen gen penyandi domain A Persentase homologi sekuen gen penyandi domain KS
4 7 9 9
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4
Fraksionasi ekstrak bakteri SAB E-38 menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) Elektroforesis gel agarose 1% domain KS dan domain A yang diamplifikasi dari genom isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A (adenilation) Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS (ketosintase)
6 8 10 11
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3
Perhitungan LC50 isolat SAB E-40 Komposisi medium sea water complete (SWC) 1000 mL Sekuen parsial domain KS dan A
17 18 18
PENDAHULUAN Latar Belakang Spons (Filum : Porifera) merupakan organisme penghasil banyak senyawa bioaktif yang hidupnya bersimbiosis erat dengan banyak mikroorganisme. Wang (2006) melaporkan bahwa spons merupakan inang bagi banyak mikroorganisme dari golongan arkaea, bakteri, fungi, aktinomiset, alga hijau biru, dan mikroalga yang dapat mencapai 40-60% dari biomassa total pada beberapa spons tertentu. Mikroorganisme yang berasosisasi dengan spons memiliki beberapa peran meliputi penyedia nutrien tertentu, menstabilkan rangka spons, memproses limbah metabolisme, dan memproduksi metabolit sekunder (Hentschel et al. 2002). Beberapa mikoorganisme yang diisolasi dari spons dan hewan laut lain dilaporkan memproduksi senyawa bioaktif yang sama dengan inangnya. Senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh mikroorganisme simbion sebagai salah satu bentuk pertahanan bagi hewan invertebrata laut yang tidak memiliki pertahanan secara fisik (Berdy 2005). Saat ini, kemampuan memproduksi metabolit sekuder yang bersifat bioaktif dari mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons mulai banyak dipelajari karena berpotensi untuk bidang biomedis dan farmasi sebagai antiviral, antitumor, antimikrob, dan aktivitas sitotoksik. Lautan merupakan sumber banyak senyawa-senyawa bioaktif yang bermanfaat dalam bidang medis dan farmasi. Salah satu senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai antikanker diisolasi dari ekosisitem laut antara lain peptida pendek linear atau siklik, depsipeptida, poliketida, dan steroid (Simmon et al. 2005). Sebagian besar senyawa tersebut diisolasi dari hewan invertebrata laut misalnya spons, tunicata, bryozoa, dan moluska. Di samping itu, mikroorganisme simbion hewan invertebrata laut juga berpotensi sebagai penghasil senyawasenyawa antikanker. Beberapa penelitian yang melaporkan mikroorganisme simbion memiliki kemampuan sebagai penghasil senyawa antikanker antara lain bakteri yang berasosiasi dengan spons Thonella swinhoei (Piel et al. 2004) dan Pseudomonas piscida dari spons Hymeniacidon perleve (Zheng et al. 2006). Keragaman senyawa bioaktif yang dihasilkan mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons dapat dipelajari salah satunya melalui pendekatan biologi molekuler (Taylor et al. 2007). Pendekatan biologi molekuler mampu mengisolasi gen yang menyandikan biosintesis suatu senyawa bioaktif dan menganalisisnya secara bioinformatik sebagai informasi tambahan dalam penentuan jenis senyawa bioaktif yang dihasilkan (Zhang et al. 2005). Enzim peptida sintase nonribosom (NRPS) dan poliketida sintase (PKS) adalah enzim multidomain yang terlibat dalam biosintesis senyawa bioaktif dari golongan peptida nonribosom dan poliketida pada banyak bakteri, cendawan, dan tanaman. Kedua kelompok metabolit sekunder tersebut banyak yang bermanfaat dalam dunia medis dan farmasi (Cane dan Walsh 1999). Bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dalam penelitian ini diisolasi oleh Abubakar et al. (2011). Beberapa isolat dilaporkan menunjukkan aktivitas antimikrob terhadap beberapa strain patogen manusia. Selanjutnya, Putra (2012) juga menelaah isolat-isolat terbaik tersebut meliputi, konsentrasi hambat minimum dan aktivitas antimikrob ekstrak etil asetatnya serta bioautografi
2 terhadap beberapa bakteri patogen manusia. Isolat-isolat tersebut diberikan kode yaitu sponge-associated bacteria (SAB) antara lain, SAB E-8, SAB E-35, SAB E38, SAB E-40, dan SAB S-43. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak kasar senyawa bioaktif dan hasil fraksionasi dari bakteri yang berasosiasi dengan spons serta analisis sekuens DNA yang berperan dalam biosintesis senyawa tersebut.
METODE Bahan Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp., yaitu SAB E-8, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 (Putra 2012) serta telur Artemia salina. Medium yang digunakan yaitu sea water complete (SWC) dan air laut (Lampiran 2). Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah etil asetat. Alat Alat laboratorium yang digunakan adalah peralatan mikrobiologi pada umumnya, Silica gel 60 GF254 Merck, peralatan KLT Preparatif, Laminar Air Flow Cabinet (Jouan, Prancis), autoklaf, hot plate, dan rotary evaporator Prosedur Ekstraksi Senyawa Bioaktif Isolat bakteri yang digunakan dikulturkan dalam media 1000 mL cair (Lampiran 2). Kultur diinkubasi pada mesin penggoyang (100 rpm, 30 0C) selama tiga hari, kemudian ditambahkan etil asetat 1000 mL dan diaduk selama 2 jam. Lapisan etil asetat pada bagian atas kultur dipisahkan dan kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak kasar. Ekstrak kasar yang didapatkan disimpan pada suhu 5 0C hingga digunakan pada penelitian selanjutnya (Müller et al. 2004). Uji Toksisitas menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Uji BSLT dilakukan terhadap larva A.salina. Penetasan A.salina dilakukan dengan cara memasukkan setengah sendok teh telur ke dalam sistem alat penetas, aerator dan sumber cahaya. Telur diaerasi dengan kuat selama 24-36 jam kemudian. Larva yang digunakan untuk uji toksisitas adalah larva aktif yang berada di daerah yang diberi cahaya. Sebanyak 20 larva dimasukkan dalam tabung uji dan kemudian ekstrak senyawa bioaktif ditambahkan hingga mencapai konsentrasi akhir yaitu, 10 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 750 µg/mL dan kontrol. Setelah 24 jam jumlah larva yang hidup pada setiap
3 konsentrasi dihitung dan dibandingkan dengan kontrol. Persentase kematian larva dihitung dengan rumus : e i e i e i Nilai kematian organisme uji 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari persentase kematian larva udang (y) (Lampiran 1). Analisis probit yang digunakan berdasarkan dari metode Finney dan Stevens (1948). Fraksionasi Ekstrak Kasar Ekstrak kasar yang difraksionasi dipilih berdasarkan nilai LC50 ekstrak kasar terbaik. Fraksionasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Bubuk silica gel dilarutkan dengan akuades dan dibuat menjadi lapisan tipis pada pelat kaca berukuran 20×20 cm. Selanjutnya, ekstrak kasar yang sudah diencerkan dengan etil asetat diteteskan memanjang pada pelat kaca. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam kotak kromatografi yang berisi eluen n-butanol:etil asetat 3:7 (Putra 2012) yang telah dijenuhkan selama satu jam. Setelah senyawa bergerak sampai garis batas atas, pelat dikeluarkan dan dikeringkan. Komponenkomponen senyawa yang terpisah menjadi beberapa fraksi yang berbentuk pita di sepanjang pelat, kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar UV (Zheng et al. 2005). Fraksi-fraksi yang terpisah kemudian diambil dan dikelompokkan. Setelah itu kumpulan fraksi tersebut dilarutkan dengan metanol. Fraksi yang telah telarutkan dengan metanol kemudian disaring untuk memisahkan fraksi senyawa dari silica gel. Fraksi dipekatkan kembali dengan rotary evaporator untuk diuji kembali toksisitasnya menggunakan larva A.salina menggunakan uji BSLT. Isolasi DNA Genom Bakteri dikulturkan pada media SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 mL kultur disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. DNA genom diisolasi dengan mengikuti metode CTAB (Sambrook dan Russell 2001). Amplifikasi gen PKS (Domain KS) dan NRPS (Domain A) Reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen penyandi domain KS dari PKS dan domain A dari NRPS dilakukan dengan metode Schirmer et al. (2005). Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan masing-masing tahap yaitu predenaturasi selama 1 menit dan denaturasi selama 5 menit pada suhu 94 ºC, annealing pada 50 ºC selama 1 menit, polimerisasi pada 72 ºC selama 1 menit, dan postPCR dilakukan pada suhu 72 ºC selama 10 menit. Visualisasi amplikon dilakukan dengan elektroforesis pada agarose 1% (b/v). Isolat yang mempunyai gen penyandi domain ketosintase (KS) menunjukkan terbentuknya pita pada ukuran di sekitar 700 pb, sedangkan domain adenilation (A) berukuran 1000 pb. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi domain KS adalah forward: 5’CSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3’ reverse : 5’-GTSCCSGTSCCRTGSSCYTCSAC-3’ d se ue p i e spesifi u u d i A y i u forward : 5’AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’reverse : 5’-CKRWAICCICKIAIYTTIA-
4 YYTG-3’(Schi e et al. 2005). Selanjutnya, hasil amplifikasi disekuen menggunakan jasa 1st BASE DNA Sequencing Services. Analisis Bioinformatika Sekuen DNA yang didapat (Lampiran 3), kemudian disejajarkan dengan sekuen yang ada di Genbank (NCBI) menggunakan program BlastX sehingga didapatkan beberapa sekuen lain yang memiliki kemiripan terdekat. Setelah itu, sekuen DNA diterjemahkan ke dalam runutan protein menggunakan ExPASY Molecular Biology untuk membuat pohon filogenetik. Pohon filogenetik dibuat dengan perangkat lunak Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi 5.0 (Tamura et al. 2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Senyawa Bioaktif dan Toksisitasnya Uji toksisitas terhadap larva udang merupakan salah satu metode uji bioaktif pada penelitian senyawa bahan alam. BSLT merupakan uji pendahuluan dan digunakan untuk penapisan aktivitas antikanker serta sebagai alternatif metode yang murah untuk uji toksisitas (Hamburger dan Hostettmann 1991). Hasil uji BSLT untuk ekstrak etil asetat bakteri yang digunakan menunjukkan hasil yang beragam seperti tersaji pada Tabel 1. Nilai LC50 yang didapatkan berkisar antara 117.1 µg/mL sampai 620 µg/mL. Menurut Meyer et al. (1982), suatu ekstrak dianggap sangat toksik bila memiliki nilai LC50 di bawah 30 µg/mL, dianggap toksik bila memiliki nilai LC50 30–1000 µg/mL dan dianggap tidak toksik bila nilai LC50 di atas 1000 µg/mL. Semua ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang digunakan bersifat toksik. Ekstrak etil asetat dengan nilai LC50 terbaik yaitu dari isolat SAB E-35, SAB E-38, dan SAB-E 40 selanjutnya dilakukan fraksionasi dan uji BSLT lanjutan. Tabel 1 Nilai LC50 ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons Kode Isolat SAB E-8
Rendemen (% b/v) 0.01
LC50 (µg/mL) 620
SAB E-35
0.02
117.1
SAB E-38
0.02
138.6
SAB E-40
0.01
244.4
SAB S-43
0.02
457
Nilai LC50 adalah nilai rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. salina (nauplii).
Ekstrak bakteri yang didapatkan disajikan dalam hasil perhitungan rendemen (% b/v) pada Tabel 1. Data tersebut memperlihatkan jumlah ekstrak yang didapatkan dari hasil ekstraksi kultur cair bakteri yang berasosiasi dengan
5 spons. Hasil ekstraksi dengan eluen etil asetat 1000 mL dapat menghasilkan 0.10.2 gram. Pada ekstraksi langsung jaringan spons, ekstrak yang diperoleh dapat mencapai 150 gram dari 2 kg spons Jaspis sp. (Tang et al. 2012), 80 gram dari 500 gram spons Jaspis splendes (Ebada et al. 2009). Spons yang digunakan dalam penelitian tersebut diisolasi langsung dari laut. Ekstraksi langsung dari spons memang lebih banyak menghasilkan ekstrak namun sangat membahayakan kelestarian spons tersebut. Solusi permasalahan tersebut antara lain isolasi mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons dan budi daya spons. Budi daya spons ternyata memiliki kelemahan yaitu waktu pertumbuhan yang lama untuk pemanenan ukuran komersial spons yaitu 800 gram selama 2-3 tahun (MacMillan 1999). Oleh karena itu, salah satu cara yang ramah lingkungan adalah dengan mencari potensi senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons. Larva A. salina digunakan sebagai hewan uji karena sifatnya yang peka terhadap bahan uji, waktu siklus hidup yang cepat, mudah dibiakkan dan harganya yang murah. Sifat peka A. salina disebabkan oleh keadaan membran kulitnya yang sangat tipis sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya (Meyer et al.1982). Larva A. salina yang digunakan sebagai hewan uji BSLT yang berumur 24 jam karena pembelahan A. salina pada rentang waktu 0-24 jam mengalami pembelahan sel yang cepat seperti pembelahan sel kanker (Anderson et al. 1991). Beberapa hal yang menentukan keakuratan nilai toksisitas yang didapatkan antara lain, suhu inkubasi telur dan suhu air laut, umur larva yang digunakan, dan salinitas air laut yang digunakan (Sargeloos et al. 1978). Uji BSLT masih relevan dalam penapisan senyawa yang bersifat sitotoksik dan dibuktikan berkorelasi positif dengan hasil uji sitotoksik pada sel kanker (Carballo et al. 2002). Fajarningsih et al. (2006) melaporkan adanya kenaikan nilai toksisitas ekstrak metanol spons Crella papilata dari 19.99 µg/mL terhadap A. salina menjadi 7.6 µg/mL terhadap sel kanker HeLa. Peningkatan nilai toksisitas juga mungkin dapat terjadi untuk ekstrak etil asetat dari bakteri yang digunakan pada penelitian ini. Nilai toksisitas terbaik yang didapatkan dari SAB E-35 yaitu sebesar 117.1 µg/mL. Penelitian lain yang menggunakan ekstrak langsung spons Petrosia sp. dari Bunaken seperti Astuti et al. (2003) menghasilkan LC50 bervariasi antara 48.15 µg/mL sampai 445.7 µg/mL. Pengembangan senyawa bioaktif yang berasal dari spons mengalami hambatan karena memerlukan biomassa spons yang besar untuk mengekstraksi senyawa bioaktif dalam aplikasinya di bidang medis (Proksch et al. 2002). Bakteri yang berasosiasi dengan spons yang menghasilkan senyawa bioaktif diharapkan dapat dijadikan sebagai alternatif untuk permasalahan tersebut. Spons laut hidup bersimbiosis dengan mikroorganisme seperti golongan arkaea, bakteri, fungi, aktinomiset, alga hijau biru, dan mikroalga (Zhang et al. 2005) yang dapat mencapai hingga 40-60% biomassa tubuhnya (Wang 2006). Beberapa penelitian melaporkan keterlibatan mikroorganisme simbion dari beberapa bahan alam yang awalnya diisolasi dari spons inangnya karena beberapa mikroorganisme yang diisolasi dari spons menghasilkan senyawa yang sama dengan hasil isolasi langsung dari spons. Micrococcus sp. memproduksi diketopiperazines yang awalnya dilaporkan dari spons Tedania ignis. Bakteri simbion yang lain, Vibrio sp. menghasilkan brominated biphenyl ethers yang awalnya diisolasi dari spons Dysidea sp. Selain itu, bakteri Vibrio sp. lainnya
6 memproduksi andrimid peptida anti-Bacillus yang awalnya ditemukan dalam ekstrak spons Hytella sp. (Lee et al. 2001). Toksisitas Fraksi Tiga isolat yang memiliki nilai LC50 terendah difraksionasi menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) yaitu, SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 (Gambar 1). Ekstrak etil asetat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E40 berturut-turut menghasilkan 5, 5, dan 6 fraksi (Tabel 2). Semua fraksi tersebut kemudian diuji toksisitas kembali dengan metode BSLT. Fraksi dari SAB E-35 dan SAB E-40 menghasilkan nilai LC50 yang lebih besar dibandingkan nilai LC50 ekstrak etil asetatnya. Nilai LC50 ekstrak etil asetat SAB E-35 adalah 117.15 µg/mL sedangkan nilai LC50 fraksi-fraksinya yaitu, 630 µg/mL, 1148.15 µg/mL dan 3981.07 µg/mL. Selain itu, nilai LC50 ekstrak etil asetat SAB E-40 adalah 244.4 µg/mL sedangkan nilai LC50 fraksi-fraksinya yaitu, 562 µg/mL, 1047.01 µg/mL dan 1202.3 µg/mL. Setiap isolat memiliki fraksi aktif dengan nilai LC50 yang lebih besar dibandingkan ekstrak etil asetatnya, kecuali fraksi 38-E. Satu fraksi dari SAB E-38 yang melebihi keaktifan ekstrak etil asetatnya yaitu 38-E dengan nilai LC50 116.7 µg/mL sedangkan nilai ekstrak etil asetatnya 138.6 µg/mL. Fraksi 38-E Fraksi 38-D Fraksi 38-C
Fraksi 38-B Fraksi 38-A
(a)
(b)
Penetesan ekstrak
Gambar 1 Fraksionasi ekstrak bakteri SAB E-38 menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) (a) Hasil fraksionasi di bawah sinar UV λ 254 nm (b) Ilustrasi hasil fraksionasi di bawah sinar UV λ 254 nm Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan sederhana yang berguna untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh senyawa dalam jumlah banyak. Kromatografi preparatif dipakai untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah yang memadai sehingga komponen itu dapat dicirikan lebih lengkap atau dipakai pada reaksi berikutnya. Pemisahan preparatif merupakan hal yang biasa dalam bidang kimia, biologi, farmasi dan kedokteran (Gritter et al. 1991). Pada penelitian ini, dilakukan teknik KLTP untuk mendapatkan fraksi dalam jumlah banyak untuk digunakan pada uji
7 selanjutnya. Nilai LC50 fraksi jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetatnya yang menurun seperti pada beberapa fraksi SAB E-35 dan SAB E-40 diduga karena kemampuan toksisitasnya merupakan gabungan dari fraksi-fraksi yang terpisah pada saat KLTP. Krisyuninda (2012) juga menemukan fraksi hasil pemisahan KLTP yang tidak toksik dari ekstrak spons Callyspongia. Sp. Fraksi yang tidak toksik adalah fraksi alkaloid yang memiliki nilai LC50 2012.5 µg/mL dan fraksi steroid dengan nilai LC50 1821.05 µg/mL. Tabel 2 Nilai LC50 Fraksi ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons Kode Isolat
LC50 (µg/mL) Ekstrak Etil asetat
SAB E-35
117.1
SAB E-38
138.6
SAB E-40
244.4
Kode Fraksi 35-A 35-B 35-C 35-D 35-E 38-A 38-B 38-C 38-D 38-E 40-A 40-B 40-C 40-D 40-E 40-F
LC50 (µg/mL) 3981.1 1148.2 630 707.9 933.2 116.7 1047.1 1202.3 562
Nilai LC50 adalah nilai rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. salina (nauplii) - : tidak ada larva A. Salina yang mati setelah 24 jam perlakuan
Amplifikasi Domain KS dan Domain A Karakteristik lain bakteri yang berpotensi penghasil senyawa bioaktif adalah adanya gen yang menyandikan enzim poliketida sintase (PKS) dan peptida nonribosom sitetase (NRPS). PKS dan NRPS adalah dua jenis enzim yang terlibat dalam sintesis bahan alam pada banyak bakteri, cendawan, dan tanaman (Cane et al. 1998; Moffit dan Neilan 2003). Kedua enzim tersebut berperan dalam sintesis banyak senyawa bioaktif seperti antibiotik, toksin, siderophore, dan immunosuppressant. Enzim tersebut memiliki ukuran yang besar sekitar 200 sampai 2000 kDa sebagai enzim mutifungsional yang memiki modul-modul dalam membuat suatu senyawa. Beberapa produk poliketida dan peptida nonribosom dalam dunia medis antara lain, antibakteri vancomycin dan erythromycin, immunosuppressant cyclosporin dan rapamycin, serta antitumor bleomycin dan epothilone. Penggunaan domain KS dan A dalam studi keragaman gen PKS dan NRPS disebabkan domain ketosintase (KS) dan domain adenilasi
8 (A) merupakan domain yang ada dalam tiap modul dan memperlihatkan derajat konservasi yang tinggi di antara domain lainnya (Moffitt dan Neilan 2003). Hasil amplifikasi gen penyandi domain A dan domain KS pada isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 menunjukkan semua isolat memiliki gen penyandi kedua domain tersebut (Gambar 2). Keberadaan kedua gen tersebut dalam satu isolat menimbulkan dugaan bahwa kedua gen tersebut membentuk kompleks hibrid atau gabungan antara PKS-NRPS dalam memproduksi senyawa bioaktif seperti yang ditemukan pada biosintesis senyawa antikanker bleomycin pada Streptomyces (Shen et al. 2001). Zhang et al. (2009) juga menemukan gen PKS dan NRPS dalam beberapa isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons dari laut Cina Selatan dan menduga adanya kluster gen hibrid NRPS-PKS pada bakteri tersebut. Selain itu, adanya hibrid NRPS-PKS juga dilaporkan pada Pseudoalteromonas sp. yang diisolasi dari spons Hymeniciadon perleve (Zhu et al. 2009). Meskipun kebanyakan bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki gen penyandi PKS dan NRPS namun pada beberapa kasus ditemukan hanya memiliki PKS atau NRPS saja atau tidak memiliki keduanya. .
M
Domain KS ~ 700 pb
35
38
40
35
38
40
Domain A ~1000 pb
Gambar 2 Elektroforesis gel agarose 1% domain KS dan domain A yang diamplifikasi dari genom isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E40 Enzim PKS dan NRPS disusun oleh tiga domain utama yaitu dua domain berfungsi sebagai katalitik dan satu domain sebagai pembawa (carrier). Domain utama pada PKS antara lain, ketosintase (KS), acyl tranferase (AT), dan acyl carrier protein (ACP) sedangkan pada NRPS kondensasi (C), adenilasi (A), dan peptidyl carrier protein (PCP) (Cane dan Walsh 1999). Hibrid antara PKS dan NRPS terjadi apabila ditemukan domain PKS atau NRPS dalam satu jalur biosintesis yang sama dalam memproduksi senyawa bahan alam yang sama baik poliketida maupun peptida nonribosom. Produk sistem hibrid PKS-NRPS antara lain, pada sintesis antibiotik rapamicin (12 PKS modul dan 1 NRPS modul) (Aparicio et al. 1996) dan sintesis yersiniabactin (3 NRPS modul dan 1 PKS modul) (Gehring et al. 1998). Adanya hibrid PKS-NRPS ini sangat menarik karena akan menambah variasi kombinasi modul biosintesis dalam menghasilkan
9 berbagai senyawa bioaktif karena jumlah dan jenis modul pada PKS maupun NRPS menentukan variasi struktur peptida dan poliketida yang dihasilkannya. Analisis Bioinformatika Analisis BLAST terhadap sekuen parsial gen penyandi domain KS dan domain A memiliki persentase homologi yang berbeda seperti ditunjukkan pada Tabel 3 dan Tabel 4. Beberapa sekuen memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan sekuen referensi di basis data NCBI seperti kemiripan sekuens domain KS isolat SAB E-38 dan SAB E-35 berturut-turut 100% dan 97% pada sekuen yang sama dengan enzim peptida sintetase Bacillus subtilis. Tingkat homologi pada sekuen domain A SAB E-35 juga memiliki kemiripan yang tinggi dengan sekuen hibrid NRPS/PKS dari Bacillus subtilis subsp.subtilis str BSP1 sebesar 99% sedangkan kemiripan sekuen SAB E-38 sebesar 84% dengan enzim beta-keto asil sintase dari Paenibacillus mucilaginosus. Sekuen gen penyandi domain A dan KS dari isolat SAB E-40 memiliki kemiripan yang rendah yaitu berturut-turut 54% dan 47%. Tingkat kemiripan yang rendah tersebut menunjukkan kemungkinan besar senyawa bioaktif yang diproduksi adalah baru. Tabel 3 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain A Isolat Bakteri SAB E-35 SAB E-38
SAB E-40 a
Kemiripan Peptide synthetase [Bacillus subtilis] Peptide synthetase [Bacillus subtilis] Nonribosomal peptide synthetase adenilation domain [Nostoc punctiforme PCC 73102]
Id/Sima (%)
E-value
Score
No. Akses
97/97
6e-170
456
WP017696132.1
100/100
0.0
649
WP017696132.1
58/77
1e-116
352
AAW55330.1
Id : Identity; Sim : Similarity
Tabel 4 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain KS Isolat Bakteri SAB E-35
SAB E-38
SAB E-40 a
Kemiripan Hybrid NRPS/PKS [Bacillus subtilis subsp.subtilis str BSP1] Beta-ketoacyl synthase [Paenibacillus mucilaginosus] Polyketida synthase [Bacillus amyloliquefaciens]
Id : Identity; Sim : Similarity
Id/Sima (%)
E-value
Score
No. Akses
99/98
2e-146
457
YP007209580.1
84/92
1e-118
380
YP004643575.1
47/54
5e-24
76.6
WP003154089.1
10 Genus Bacillus banyak merupakan penghasil senyawa metabolit antimikrob dan sitotoksik. Awalnya genus ini sering ditemukan di darat namun juga dilaporkan diisolasi dari bentos laut dan karang lunak (Kapley et al. 2007) dan spons laut (Hentschel et al. 2001). Paenibacillus adalah genus yang dipisahkan dari Bacillus sejak tahun 1997 yang juga banyak mendiami relung ekologi (Saha et al. 2005), menghasilkan antibiotik (Li et al. 2007), hampir setengah genus ini mempunyai kemampuan antibakteri dan antifungi yang berspektrum luas (Lorentz et al. 2006). Antibiotik yang dihasilkan oleh genus Paenibacillus disusun oleh peptida pendek serta ditemukan gen penyandi PKS dan NRPS (Wu et al. 2011). Beberapa genus sianobakteri atau alga hijau biru juga dilaporkan penghasil senyawa bioaktif antara lain Microcystis, Anabaena, Nostoc, dan Oscillatoria (Namikoshi dan Rinehart 1996). Salah satu senyawa bioaktif asal alga hijau biru yang telah banyak dipelajari adalah hepatotoksin seperti, mikrosistin. Mikrosistin merupakan toksin yang disusun heptapeptida siklik yang tidak disintesis di ribosom melainkan oleh enzim peptida sintetase tersendiri atau NRPS (Neilan et al. 1999). Bacillus subtilis BSn5 65 Bacillus subtilis 37
Bacillus subtilis str. 168 Bacillus subtilis QB928
54 17 61 55 100
Bacillus sp. EGD-AK10 SAB E 35 SAB E 38 Bacillus subtilis1 Bacillus vallismortis Bacillus subtilis str.W23 Streptomyces sp. ATCC 700974 SAB E 40 Cyanothece sp. PCC 7424
100
Nostoc punctiforme PCC 73102
82 90
Anabaena variabilis ATCC 29413
0.1
Gambar 3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A (adenilation) yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining. (Keterangan: Angka 0,1 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 1000 ulangan).
Hasil konstruksi pohon filogenetik domain KS dan A dapat menunjukkan kekerabatan antar isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 dengan beberapa sekuen referensi terdekat hasil analisis BLAST (Gambar 3). Sekuen domain A SAB E-35 dan SAB E-38 berkerabat dekat sekuen domain A dan KS dari Bacillus subtilis dan terdapat dalam satu clade yang sama. Sementara itu, SAB E-40
11 berada di clade yang lain dengan kelompok alga hijau biru. Pada pohon filogenetik domain KS, SAB E-38 berkerabat dengan Paenibacillus mucilagenous dan bakteri laut yang tidak dapat dikulturkan. Sekuens domain KS SAB E-35 berkerabat dengan beberapa sekuen Bacillus subtilis sedangkan domain KS SAB40 terpisah (Gambar 4). Sekuen domain A dari NRPS SAB E-35 dan SAB E-38 memiliki homologi yang tinggi dengan sekuen peptida sintetase dan juga surfaktin sintetase dari Bacillus subtilis. Peptida sintetase (peptide synthetase) merupakan protein multifungsional nonribosom yang mensintesis peptida dengan berat molekul yang kecil dan berasal dari mikroba. Antibiotik dari genus Bacillus banyak terdiri atas polipeptida yang disintesis oleh enzim peptida sintetase nonribosom atau NRPS salah satunya surfaktin (Edward dan Arnold 1977 ; Nakano et al. 1988). Surfaktin merupakan antibiotik lipopeptida yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis. Surfaktin juga merupakan biosurfaktan yang dapat menurunkan tegangan permukaan air dari 72 ke 27 mN/m dan berpotensi untuk diaplikasikan dalam industri seperti industri makanan, farmasi, kosmetik dan bioremediasi limbah oli (Desai dan Banat 1997). Bacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGW 62 polyk etide synthase L Bacillus subtilis 62
Bacillus subtilis PY79 Bacillus subtilis
100
SAB E 35 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1
81
Bacillus amyloliquefaciens IT-45 46 Bacillus amyloliquefaciens 87
Bacillus amyloliquefaciens CAU B946
50 Bacillus amyloliquefaciens Y2 65 Bacillus amyloliquefaciens YAU B9601-Y2
SAB E 40 Streptomyces maritimus 96 69
SAB E 38 Paenibacillus mucilaginosusK02 uncultured marine cyanobacterium
100 85
Leptolyngbya mycoidea LEGE 06118 100 Oscillatoria sp. CCAP 1459/26
0.2
Gambar 4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS (ketosintase) yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining. (Keterangan: Angka 0,2 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance scale) antar profil isolat bakteri Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 1000 ulangan).
12 Sekuen domain A SAB E-40 dan sekuen domain KS SAB E-38 berada dalam satu clade dengan sekuen dari sioanobakteri. Sianobakteri juga merupakan kelompok yang banyak diteliti sebagai penghasil senyawa bioaktif seperti antikanker, antibakteri, antifungi serta inhibitor protease (Moore 1996). Banyak senyawa bioaktif yang dihasilkan termasuk ke dalam golongan peptida atau makrolid dan alkaloid dan sintesis oleh PKS dan atau NRPS (Kehr et al. 2011). Penelitian keragaman gen penghasil senyawa bioaktif terutama PKS dan NRPS juga telah banyak dilakukan. Banyak ditemukan kasus hibrid PKS-NRPS dalam sintesis senyawa bioaktif seperti, Nostopicin dari genus Nostoc dan barbamide dari genus Lyngbya (Fewer et al. 2011; Chang et al. 2002).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak etil asetat isolat SAB E-8, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-43 bersifat toksik berdasarkan nilai LC50 yang berkisar antara 117.1 µg/mL sampai 620 µg/mL. Fraksi 38-E dari isolat SAB E-38 menunjukkan peningkatan nilai toksisitas dari ekstrak etil asetatnya yaitu dari 138.6 µg/mL menjadi 116.7 µg/mL. Isolat-isolat SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40 diketahui memiliki gen penyandi domain A untuk enzim NRPS dan gen penyandi domain KS untuk enzim PKS. Berdasarkan analisis bioinformatika untuk gen penyandi domain A dan KS, SAB E-35 dan SAB E-38 memiliki homologi yang cukup tinggi dengan sekuen referensi yaitu antara 84% sampai 100% sementara SAB E 40 memiliki homologi yang rendah yaitu 54% dan 47% dan sberpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif baru. Saran Nilai LC50 pada uji BSLT dipengaruhi oleh ketepatan pembuatan konsentrasi larutan uji dan umur larva A.salina yang digunakan. Oleh karena itu, perlu dilakukan pembuatan larutan uji yang tepat dan digunakan larva A.salina yang berumur 36-48 jam.
DAFTAR PUSTAKA Abubakar H, Wahyudi AT, Yuhana M. 2011. Skrining bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. sebagai penghasil senyawa antimikroba. Ilmu kelautan. 16:35-40. Anderson JE, Goetz CM, McLaughlin JL, Suffness M. 1991. A blind comparison of simple bench-top bioassay and human tumour cell cytotoxicities as antitumor prescreens. Phytochem Anal. 2:107-111. Aparicio JF, Molnár I, Schwecke T, König A, Haydock SF, Khaw LE, Staunton J, Leadlay PF. 1996. Organization of the biosynthetic gene cluster for
13 rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic domains in the modular polyketide synthase. Gene. 169:9-16. Astuti P, Alam G, Wahyuono S. 2003. Bioactivity screening of sponges collected from Bunaken, Manado by brine shrimp lethality test agains Artemia salina Leach. Majalah Farmasi Indonesia. 14:238-243. Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot. 58:1-26. Cane DE, Walsh CT, Khosla C. 1998. Harnessing the biosynthetic code: combinations, permutations, and mutations. Science. 282:63-68. Cane DE, Walsh CT. 1999. This parallel and convergent universes of poliketide synthetase and nonribosomal peptide synthetase. Chem Biol. 6:319-325. Carballo JL, Hernandez-Inda ZL, Perez P, Gravalos MD. 2002. A comparison between two brine shrimp assay to detect in vitro cytotoxicity in marine natural product (methodology article). BMC Biotechnol. 2:1-5. Chang Z, Flatt P, Gerwick WH, Nguyen VA, Willis CL, Sherman DH. 2002. The barbamide biosynthetic gene cluster : a novel marine cyanobacterial system of mixed polyketide synthase (PKS)-nonribosomal peptide synthetase (NRPS) origin involving an unusual trichloroleucyl strater unit. Gene. 296:235-247. Desai JD, Banat IM. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiol Mol Biol. 61:47-64. Ebada SS, Wray V, Voogd NJ, Deng Z, Lin W, Proksch P. 2009. Two new jaspamide derivatives from the marine sponge Jaspis splendes. Mar Drugs.7:435-444. Edward K, Arnold LD. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus : chemistry, biogenesis and possible functions. Bacteriol Rev. 41(2):449-474. Fajarningsih ND, Januar HI, Nursid M, Wikanta T. 2006. Potensi antitumor ekstrak spons Crella papilata asal taman nasional laut Kepulauan Seribu. J Pascapanen dan Bioteknologi Kelaiutan dan Perikanan. 1(1): 35-42. Fewer DP, Osterholm J, Rouhiainen L, Jokela J, Wahlsten M, Sivonen K. 2011. Nostophycin biosynthesis is directed by a hybrid PKS-NRPS in the toxic cuanobacterium Nostoc sp. 152. J Appl Environ Microbiol. 77(22):8034-8040. Finney DJ, Stevens WL. 1948. A table for the calculation of working probits and weights in probit analysis. Biometrika. 35:191-201. Gehring AM, Mori I, Perry RD, Walsh CT. 1998. The nonribosomal peptide synthetase HMWP2 forms a thiazoline ring during biogenesis of yersiniabactin, an iron-chelating virulence factor of Yersinia pestis. Biochemistry. 37:11637-11650. Gritter RJ, Bobbit JM, Schwarting AE. 1991. Pengantar Kromatografi. Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB. Hamburger M, Hostettmann. 1991. Bioactivity in plant: the link between phytochemistry and medicine. Phytochemistry. 12:3864-3874. Hentschel U, Schimid M, Wagner M, Fieseler L, Gernert C, Hacker J. 2001. Marine sponges as microbial fermenters. FEMS Microbiol Ecol. 55:167–177.
14 Hentschel U, Hopke J, Horn M, Friedrich AB, Wagner M, Hacker J, Moore BS. 2002. Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges from different oceans. Appl Environ Microbiol. 68:4431-4440. Kapley A, Siddiqui S, Misra K, Ahmad SM, Purohitp HJ. 2007. Preliminary analysis of bacterial diversity associated with the porites coral from the Arabian sea. World J Microbiol Biotechnol. 23:923-930. Kehr JC, Picchi DG, Dittmann E. 2011. Natural product biosynthesis in cyanobacteria : a treasure trove of unique enzymes. Beilstein J Org Chem. 7:1622-1635. Krisyunda MP. 2012. Uji toksisitas fraksi spons Callyspongia sp. dengan metode brine shrimp test (BST) dari Pasir Putih Situbondo [skripsi]. Surabaya (ID): Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Lee YK, Lee J, Lee HK. 2001. Microbial symbiosis in marine sponges. J Microbiol. 39:254-264. Li J, Beatty PK, Shah S, Jensen SE. 2007. Use of PCR-targeted metagenesis to distrupt production of fusaricidin-type antifungal antibiotics in Paenibacillus polymyxa. App Environ Microbiol. 73: 3480-3489. Lorentz RH, Artico S, Silveira AB, Einsfeld A, Carcao G. 2006. Evaluation of antimicrobial activity in Paenibacillus spp. starins isolated from natural environmental. Lett Appl Microbiol. 43:541-547. MacMillan SM. 1999. Starting A Succesful Commercial Sponge Aquaculture Farm. Hawaii (US): CTSA Publication. Meyer N, Ferrigni NR, Putnam JE. 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med. 45:31-32. Moffitt MC, Neilan BA. 2003. Evolutionary affiliations within the superfamily of ketosynthases reflect complex pathway associations. J. Mol. Evol. 56:446-457. Moore RE. 1996. Cyclic peptides and depsipeptides from cyanobateria : a review. J Ind Microbiol. 16:782-792. Müller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL, Thakur AN, Batel R. 2004. Oxygencontrolled bacterial growth in the sponge Suberites domuncula: toward a molecular understanding of the symbiotic relationships between sponge and bacteria. Appl Environ Microbiol. 70:2332-2341. Nakano MM, Marahiel MA, Zuber P. 1988. Identification of genetic locus required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 170(12):56-62. Namikoshi M, Rinehart KL. 1996. Bioactive compound produced by cyanobacteria. J Industrial Microbiol. 17:373-384. Neilan BA, Dittmann E, Rouhiainen L, Bass RA, Schaub V, Sivonen K, Borner T. 1999. Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of cyanobacteria. J Bacteriol. 181(13):4089. Piel J, Hui D, Wen G, Butzke D, Platzer M, Fusetani N, Matsunaga S. 2004. Antitumor polyketide biosynthesis by uncultivated bacterial simbiont of the marine sponge Thonella swinhoei. Proc Natl Acad Sci. 101:1622216227. Proksch P, Edrada RA, Ebel R. 2002. Drugs from the sea : current status and microbial implications. Appl Microbiol Biotechnol. 59:125-134.
15 Putra I. 2012. Ekstraksi dan bioaktivitas senyawa antimikrob dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Saha P, Modal AK, Mayilraj S. Krishnamurthi S, Bhattacharya A, Chakrabarti T. 2005. Paenibacillus assamensis sp. nov. A novel bacterium isolated from a warm spring in Assam India. Int J Syst Evol Microbiol. 55:25772581. Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York (US): Gold Spring Harbor Laboratory. Sargeloos P, Van Der Wielen CR, Persoone G. 1978. The use Artemia nauplii for toxicity test - a critical analysis. Ecotoxicol and Environ Safety. 2:249255. Schirmer A, Gadkari R, Reeves CD, Ibrahim F, DeLong EF, Hutchinson CR. 2005. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene cluster in microorganisme associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol. 71:4840-4849. Shen B, L. Du, C. Sanchez, D.J. Edwards, M. Chen, and J.M. Murrell. 2001. The biosynthetic gene cluster for the anticancer drug bleomycin from Streptomyces verticillus ATCC15003 as a model for hybrid peptide– polyketide natural product biosynthesis. J Industrial Microbiology and Biotechnology. 27:378-385. Simmons TL, Andrianasolo E, McPhail K. 2005. Marine natural products as anticancer drugs. Mol Cancer Ther. 4:333-342. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol and Evol. 28:2731-2739. Tang S, Xu R, Lin W, Duan H. 2012. Jaspiferin A and B: two new secondary metabolites from the south China sea sponge Jaspis stellifera. Rec Nat Prod. 6:398-401. Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology. Microbiol Mol Biol Rev. 71:295347. Wang G. 2006. Diversity and biotechnological potential of the spons-associated microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol. 33:545-551. Wu X, Qian C, Fang H, Wen Y, Zhou J, Zhan Z, Ding R, Li O, Gao H. 2011. Paenimacrolidin, a novel macrolide antiviotic from Paenibacillus sp. F6-B70 active against methicillin-resistant Staphyloccus aureus. J Microbial Biotechnol. 4(4):491-502. Zhang L, An R, Wang J, Sun N, Zhang S, Hu J, Kuai J. 2005. Exploring novel bioactive compounds from marine microbes. Current Opinion in Microbiol. 8:276-281. Zhang W, Li Z, Miao X, Zhang F. 2009. The screening of antimicrobial bacteria with diverse novel nonribosomal peptide synthetase (NRPS) genes from South China Sea sponges. J Mar Biotechnol. 11:346-355. Zheng L, H Chen, X Han, X Yan. 2005. Antimicrobial screening and activecompound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated
16 with the sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol. 21:201-206. Zheng L, Yan X, Han X, Chen H, Lin W, Lee FS, Wang X. 2006. Identification of norharman as the cytotoxic compound produced by the sponge (Hymeniacidon perleve)-associated marine bacterium Pseudomonas piscida and its apoptotic effect on cancer cells. Biotechnol Appl Biochem. 44:135-142. Zhu, Peng, Zheng Y, You Y, Yan X, Shao J. 2009. Molecular phylogeny and modular structure of hybrid NRPS/PKS gene fragment of Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-2 isolated from marine sponge Hymeniciadon perleve. J Microbiol Biotechnol. 19(3):229-237.
17 Lampiran 1 Perhitungan LC50 isolat SAB E-40
Konsentrasi (µg/mL)
Log Ulangan Konsentrasi
Larva A.salina
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
0
-
10
1
100
2
250
2.39
500
2.69
750
2.87
Larva mati
% Mortalitas
0 0 0 0 0 0 8 7 5 15 18 10 18 13 15 18 16 15
0 0 0 0 0 0 40 35 30 80 90 50 90 65 75 90 80 75
Probit
Ratarata Probit
0
0
35
4.61
73.3
5.61
76.7
5.71
81.67
5.88
7
Mortalitas Probit
6 5 y = 3.2203x - 2,6905 R² = 0.9231
4 3 2 1 0 0
0,5
Perhitungan LC50 : y = 3.2203x-2,6905 5= 3.2203x-2,6905 x = 2.3881 10x = 244,4 LC50 = 244.4 µg/mL
1
1,5 2 Log 10 Konsentrasi
2,5
3
3,5
18 Lampiran 2 Komposisi medium sea water complete (SWC) 1000 mL Pepton Yeast Extract Gliserol Bacto Agar Air laut Aquades
5 gram 1 gram 3 mL 15 gram (untuk media padat) 750 mL 250 mL
Lampiran 3 Sekuen parsial domain KS dan A >SAB_35_PKS ACCCGGCCCAACACCACTCGCGGTGCTGCTGGACGATTGAGGATGCGG GCTATACGCCAAAGACGTTGGCGAAGCCTAAAGGACGAAATAAAAGG CAGCATGTAGGAGTTTTTGCCGGTGTCATGCACAAGGATTATACATTA GTCGGAGCTGAAGAAGCATCAGCAGAAAACGTGTTTCCTCTCTCGCTC AACTATGCGCAAATCGCCAACCGTGTTTCTTACTTTTGTAATTTCCACG GTCCGAGTATGGCTGTCGATACGGTATGTTCATCCTCTTTGACCGCAGT GCACTTGGCGTTGGAAAGCATACGTCACGGTGAGTGCGATGTTGCGTT AGCAGGCGGAGTGAACCTGTCTTTGCACCCGAATAAATATATGACATA CGGGGTCTGGGATATGTTTTCCACTGACGGGCACTGCCGTACGTTTGG AAAGGATGGGGACGGTTATGTGCCTGCCGAGGGTATAGGCGCGGTTTT ATTAAAGCCTTTGCGCCAGGCGGAGAAAGACGGAGATCGCATTTATGC AGTTATTAAAGGAAGTGCTGTGAATCATGTGGGCACTGTAAGCGGCAT TTCAGTGCCGAGCCCTGTTTCTCAAGCTGATCTGATTGAGACATGCTTG GAGAAAACGGGAATCGACCCGCGGACGAACAGTTATGTCGAAGCCCA CGGCACAGGCACAGAAA >SAB_35_NRPS ACCCTCCCAATTTCGATTGTTCATCTGGAGCCAGCGCGCCACGTCCCCG GTCCGGTACATGCGATCGCCCGGCACGAATGGATCTTGTAAAAACTTC TCTTCCGTTAATTCAGGCAAATGCAAATAGCCTCGGGCCACACCGTCT CCCGCGATATAAAGCTCACCCGCCACGCCTTCAGGCTGCAGCCGGCCT TTTTGATCCAAAATATATAAGCGGTTATTCCCCAGCGCTTTCCCGATCG GCACATACGCGTGATTGAACTGCATTCTCAGGGATAACCGGATGAACA GACGCGTCAACGCACGTTTCAGTCGGCCCGTACACATTAGTCAAACGC GGCGCTGTGCCGGCTTCTTTAAACAGCTTCAGCAGCTTGTCCGCAACA ACAGATGACAGGCCTTCTCCTCCGATCAGCATGTGCTTCAGTTTTAGGC CTTCAAAATCGCCCGCTGCTGCCAGCATTTGCAAATGAGCCGGTGTTC CATCCGTCGCCTCAATGCTGTTTCTCCGATAATATGTAGCAAGGGCGG TCCCGTTCGTCACTGTTTTCTTCGGTACGATATAAAGGGTTTGTCCCAA AAGAAGCGACGCGAAGATCTGCTTCACTGACGCATCAAAGTGGAACG
19 GCGCAAGCAATGCCATCCGCAGGGTTTGGCTGCCGCTTTGGTAAATCG TCTGCTGCAGAGATTCAACCAAATGATGAACCTGGCGATGCTCGATCA TAACGCCTTTCGGACGTCCGGTTGTTCCCGATGTGTAAATAATGTAGG CAAGATTCCGCGCGTTTACATCAGCCTCCGTCATATCGTCTGCACCTTC CGCAATTGCCTGATCTAAGTCAATCAGCTCAGCATCGGCTTCAGGCGC TGCAACCTTCGATTCAGTCAGGATGAAGTCCGCCCCGCAGTCCTCCAA AATATATTGAATCCGCTCTGCAGGAAAAACCCGGATCAATCGGGACGT AAGCCCCCGCCGCCAAA >SAB_38_PKS TGGGAAGTGTTAGAGACTGCTGGGTATGATCCAGAAAAATATCTTGGG CGTATCGGTGTATACGCTGGTGTATTTTCTAGTACGTATCTGTTTAATT TATACAGCAATCCAAGTCTTTATCATTCAGTAGGAGAACTAAATATTC GCCATGGGAATGAAAAGGATTATTTGGCTACTCGGGTATCATATAAAT TAAATCTTAAAGGACCAAGCGTGAGTGTACAGACTTCTTGCTCTACGT CTCTTGTTGCTGTTCACTTTGCAGTCCAGAACTTATTAAGTGGTGAATG TGACATGGCAATCGCTGGTGGGGTGTCAATTATCACACCTCAAAAGAC GGGATACATGTATCAAGAAGGTGGCGTTCTATCACCAGATGGACATTG TCGTCCTTTCGATGCGAAAGCAAAGGGTACAATTTTTGGTAACGGAGT AGGGGCTGTTGTACTTAAGCGACTAGAAGATGCTCGCAAAGATGGTGA CACTATCTTTGCTGTTATTAAAGGAAGCGCAGTTAATAACGATGGTGC AGACAAAGTTGGATTCACTGCACCGAGTGTCAATGGTCAAGCTGAAGT AATCGCTGATGCGATGGCTATGGCGGAAGTCGATCCATTCACGGTAG >SAB_38_NRPS CTGGGATCGCCTCCGTTATTCGATTGTTCATCTGGAGCCAGCGCACCAC GTCTCCGGTCCGGTACATGCGATCGCCCGGCACGAATGGATCTTGTAA AAACTTCTCTTCCGTTAATTCAGGCAAATGTAAATAGCCTCGGCCCAC ACCGTCTCCCGCGATATAAAGCTCGCCCGCCACGCCTTCAGGCTGCAG CCGGCCTTTTTGATCCAAAATATATAAGCGGTTATTCCCCAGCGCTTTC CCGATCGGCACATACGCTGATTGAACTGCATTCTCAGGGATAACCGGA TGAACAGACGCGTCAACGCATGTTTCAGTCGGCCCGTACACATTGGTC AACCGCGGCGCTGTGCCGGCTTCTTTAAACAGCTTGAGCAGCTTGTCC GCAACAACAGATGACAGGCCTTCTCCTCCGATCAGCATGTGCTTCAGT TTTAGGCCTTCAAAATCGCCCGCTGCTACCAGCATTTGCAAATGAGCC GGTGTTCCATCCGTCGCCTCAATGCTGTTTCTCCGATAATATGCAGCAA GGGCGGCCCCGTTCGTCACAGTTTTCTTCGGTACGATATAAAGGGTTT GTCCCAAAAGAAGCGACGCGAAGATCTGCTTCACTGACGCATCGAAGT GGAACGGCGCAAGCAATGCCATCCGCAGGGTTTGGCTGCCGCTTTGAT AAATCGTCTGCTGCAGAGATTCAACCAAATGATGAACCTGGCGATGCT CGATCATAACTCCTTTCGGGCGTCCGGTTGTTCCCGATGTATAAATAAT
20 GTAGGCAAGGTTCCGTGCGTTCACATCTGCATTCAGGCTTTCTTCTGCA CCTTCTGCAATTGCCTGATCTAAGTCAATCAGCTCAGCATCGGCTTCAG GTGCCGCAACCTTCGATTCAGTCAGGATGAAGTCCGCCCCGCAGTCCT CCAAAATATATTGAATGCGCTCAGCAGGAAAACCCGGATCAATCGGG ACATACGCCCCCACCCGCAAAA >SAB_40_PKS CAATTNNGNCTTCGGAATAAGCCTGAGTATCTAGACTGCCTTATGACT TCTGCTTGTGCAGCGGATTCGGGAGGTAATTCCGCTGCTTTCCCGACGT GATCATGCGCTTCCTTTATGACGGCGTAAATGCGGCTCCGTCTTGACG GCGTCTCTCAGACGTTTGACCCCGACGGCCCGACCACTTTCCCCGGAA ACAAACCGTCCCCCGTTTGATCCAACTGAGGGGATCCGGCGGTCGGTG ACATGCTTTCCTACTTTTCTGACGATGGAAAAAAATCCGGGGTGGATT GACTGATTCCCCCCTCCGGCAAGGGCATTTTCAATTTCTTCGTCCCGAA TGCCTTAAATGGCCAAAGAATGGGTGGCAAAGGACTGGAAACTGCTG GTATCAACCGGAATGCTCGGCCCTTGAAATTCACAATAATAGGGACAC TCTGTTGGGAATGAGCGAATAATTATTGCCCACCGCAAATGGACCTGC TTTCTGTTGTTGTTCAATGGCCTGTAAAGAATCGTCGTTATACATGACA CCTGCGCATAAGTCGATGGGATGTAGTTACTCTCCTTTATATCCCGCAT CTTCAAGCGCTTTCCATGATTCTTCCATCAACACCCAGTGTGGCTCATT CCATCACACGCCTGCTAAGATTCCATCGCA >SAB_40_NRPS ATGTCATGTATACGTCAGGCTCAACGGGACTGCCTAAAGGAGTAAGTA TTGTTAACCGCGGTGTGATTCGGCTGGTGAAGGAGACTGATTATGCGG TATTTGATGAGAATCAAACGTTTCTGCAATTAGCTTCTGCCGCTTTTGA CGCTTCTACCTTCGAGATCTGGGGCTGTTTATTGAATGGGGGATGTCTG GCTATAATGCCTCCGGGAATACCGACGGCTGATGATATTGCAGAAGCT GTAAAAAAATATAACATTACGACTCTTTGGCTGACGGCCGGTTTATTTT CTCTAGTAGTTGATCAGCAGTTAGAATCATTAAAAGGGCTTCAGCAAT TATTGGTAGGCGGAGATGTGGTTTCCGTTCCGCATGTTCAAAAAGTAT TAGCACTTGGAAAGGTACAAGTAATTAACGGATATGGGCCGACAGAG GGAACGACCTTTACCTGTTGTTTCCCGGTCCCTCATGATTGGAAAGGC AGTACGCTTCCTATAGGGAGGCCTATTTCTGGTACAGAAATATTCATTT TAGATTCGCAATTAAAACCGGTAGCGCCTGGTATTCCTGGTGAGCTGT TTATTGGCGGAGATGGGCTGGCGCGAGAGTATTGGCGACGGCCTGATT TAACGAAGGAACGGTTTATATCACACCCTTTCAATAATGATCCTTCAG CACGTCTTTATAAAACAGGAGACTTAGTGCGTTATTTAGAAAATGGCG ATGTGGAGTTTATCGG
21
RIWAYAT HIDUP Pe u is di hi d i p s g S hi i S ’ d d Rid y i Ni gsih di Bangka Belitung, 13 Juni 1992. Penulis merupakan anak ke-2 dari tiga bersaudara. Penulis menempuh pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Kelapa Kampit, Belitung Timur dan lulus pada tahun 2009 kemudian melanjutkan kuliah di IPB melalui jalur Beasiswa Utusan Daerah, Kabupaten Belitung Timur. Selama menempuh perkuliahan di IPB, penulis menjadi asisten mata kuliah Botani Umum Sarjana tahun ajaran 2011/2012 dan Diploma IPB pada tahun ajaran 2012/2013, serta mata kuliah Pengantar Genetika Molekuler tahun ajaran 2012/2013. Pengalaman keorganisasian penulis antara lain sebagai Ketua Biro Kesekretariatan BEM TPB IPB Keluarga 46 2009/2010, Staf Departemen Syiar dan Sains Serambi Ruhiyah Mahasiswa FMIPA (SerumG) 2011/2012, Ketua Departemen Class Rohis Management SerumG 2012/2013, serta Ketua Departemen Politik Luar Negeri Kesatuan Aksi Mahasiswa Muslim Indonesia (KAMMI) Komisariat IPB. Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan kegiatan kemahasiswaan seperti, Pesta Sains Nasional Lomba Cepat Tepat Biologi 2011 dan Festival Ilmuwan Muslim 2011 dan 2012. Penulis pernah e u egi s udi p g de g pi “Ke e g d Pe i u R y p Te es i d A b e di Hu Pe didi Gu u g W ”. Pe u is melaksanakan kegiatan praktik lapangan di PT. Steelindo Wahana Perkasa dengan judul “Pe ge d i H d Pe y i T Ke p S i PT. S ee i d W h Pe s ”. Penulis juga aktif dalam kegiatan lomba keilmiahan tingkat nasional maupun internasional. Beberapa prestasi yang pernah diraih antara lain, delegasi IPB dalam seleksi Olimpiade Nasional MIPA tingkat wilayah Jawa Barat 2011, kompetisi biologi sintetik tingkat Asia atau International Genetically Engineered Machine Competition (iGEM) 2012 di Hong Kong University of Science and Technology serta Finalis Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional di Universitas Muhammadiyah Yogyakarta ke-25 pada tahun 2012. Selain itu, penulis juga terpilih sebagai delegasi pemuda Provinsi Kep. Bangka Belitung dalam Pertukaran Pemuda Indonesia Cina 2013 yang diselenggarakan Kementerian Pemuda dan Olah Raga Republik Indonesia dan All China Youth Federation, Cina.
