BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp. : ANALISIS PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB DAN KERAGAMAN GENETIKNYA
HERMAWATY ABUBAKAR
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.: Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juli 2009
Hermawaty Abubakar G351070021
ABSTRACT HERMAWATY ABUBAKAR. Spons (Jaspis sp.) – Associated Bacteria: Antimicrobial Production and Genetic Diversity Analyses. Under Direction of Aris Tri Wahyudi and Munti Yuhana. ABSTRACT Living benthic marine organisms such as sponges are frequently assosiated with bacteria which may produce useful antimicrobial compounds. Genetic diversity of bacteria isolated from marine sponge Jaspis sp. which has capability in producing antibacterial subtances was investigated. As many as 32 isolates (45,71%) and 20 (29,41%) isolates originating from mesohyl and sponge surface respectively, showed the antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Vibrio harveyi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterophatogenic Escherichia coli (EPEC K-11), Candida albicans, and C. tropicalis. Thirty most potential isolates were further studied by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) to asses their genetic diversity. Restriction analysis using enzymes RsaI, HaeIII, and HinfI of the 16S rRNA genes resulted seven phylotipes. The 16S rRNA gene sequence of choosen isolates i.e. SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 and SAB S-43 that showed inhibition of the growth for all microorganism target were identified. The use of a few phenotypic tests for those isolate can be applied to differentiate them. Gram staining technique was used to distinguish Gram negative from Gram positive ones. Isolates designed as SAB E-8, SAB E-35, and SAB E-40 were identified as Gram negative, whereas SAB E-33, SAB E-38, and SAB S-43 were Gram positive. For Gram positive isolates, further test were performed including spora staining and catalase test for Bacillus identification. Based on their 16S rRNA gene sequences, there were 3 isolates closely related to Pseudomonas sp. while the remaining 3 isolates were members of Bacillus group. Keywords: Sponge – Associated Bacteria, ARDRA, 16S rRNA, antimicrobial compounds, genetic diversity
RINGKASAN HERMAWATY ABUBAKAR. Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.: Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya. Dibimbing oleh Aris Tri Wahyudi dan Munti Yuhana. Spons merupakan salah satu komponen biota penyusun terumbu karang yang mempunyai potensi bioaktif yang belum banyak dimanfaatkan. Hewan laut ini mengandung senyawa aktif yang persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan dengan senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan darat. Spons umumnya dapat bertahan hidup di perairan laut yang miskin nutrisi karena adanya assosiasi dengan organisme lain khususnya bakteri. Bakteri banyak ditemukan secara komensal di permukaan dan bagian mesohyl spons. Pola makan spons yang khas yaitu filter feeder (menghisap dan menyaring) dapat memanfaatkan jasad renik disekitarnya sebagai sumber nutrien, diantaranya bakteri yang hidup pada perairan tersebut. Namun seringkali bakteri juga dijumpai hidup dan berkolonisasi dengan memanfaatkan nutrien yang terdapat pada spons tersebut. Produk alami laut sebagai hasil metabolik sekunder kemungkinan dihasilkan oleh kehadiran mikroorganisme pada jaringan spons sebagai simbion, baik simbion intraselluler ataupun ekstraselluler. Senyawa-senyawa organik tersebut dapat ditransport karena adanya kerjasama antara simbion dan inangnya. Kehadiran kedua pasangan simbion ini juga menjadi syarat untuk menghasilkan metabolik sekunder seperti senyawa bioaktif yang bersifat antimikrob. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri (endosimbion dan ektosimbion) penghasil senyawa antimikrob dan menganalisis keragaman genetiknya berdasarkan amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) dan sekuensing gen 16S rRNA. Metode untuk mengisolasi bakteri simbion yang diduga memiliki potensi antimikrob dibagi atas dua metode yaitu untuk mengisolasi bakteri dari permukaan dan bagian mesohyl Jaspis sp. Total jumlah bakteri hasil isolasi dari permukaan dan mesohyl diuji kemampuan antimikrobnya dengan menggunakan bakteri target Escherichia coli, EPEC K-11, Vibrio harveyi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan dua jenis khamir yaitu Candida albicans dan C. tropicalis. Bakteri yang memiliki aktivitas antimikrob dianalisis keragaman genetiknya dengan Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) serta didentifikasi dengan pewarnaan Gram, uji parsial dan sekuensing gen 16S rRNA. Hasil isolasi diperoleh 138 isolat bakteri masing-masing 70 isolat endofit dan 68 isolat surfaces, yang ditandai dengan warna dan bentuk koloni yang berbeda-beda. Berdasarkan hasil pengujian antimikrob, 32 isolat bakteri (45,71%) dari total isolat bakteri endofit mempunyai aktivitas antimikrob. Pada bakteri permukaan, 20 isolat bakteri (29,41%) dari total isolat bakteri permukaan juga memiliki aktivitas antimikrob, yaitu mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji namun tidak satupun isolat surfaces mampu menghambat C. albicans dan C. tropicalis. Isolat bakteri yang berada pada bagian mesohyl dan memiliki aktivitas antimikroba yang baik diduga adalah bakteri yang memiliki bentuk assosiasi dengan spons Jaspis sp. yang
berasosiasi dengan cara vertikal transmisi. Isolat bakteri yang berasal dari permukaan dan memiliki aktivitas antimikrob diduga adalah bakteri yang memiliki kemampuan untuk melindungi spons dari patogen, predator dan biofouler. Meskipun jumlah isolat bakteri yang berasal dari permukaan hampir sama dengan isolat endofit, namun aktivitas antimikrob isolat permukaan lebih rendah dibandingkan isolat endofit. Berdasarkan jumlah isolat yang mempunyai aktivitas antimikrob dan jumlah mikrob target yang dapat dihambat pertumbuhannya, isolat yang berasal dari bagian endofit spons Jaspis sp. lebih banyak dibandingkan isolat yang diisolasi dari permukaan. Bakteri simbion yang berasal dari bagian endofit yaitu mesohyl umumnya memiliki populasi yang berlimpah dan merupakan mikroba spesifik dari spons inangnya. Bakteri simbion yang berasal dari permukaan spons merupakan bakteri yang tidak spesifik dengan inangnya dan memiliki kemiripan dengan komunitas mikrob yang berada di lingkungan perairan dimana spons tersebut berada. Hasil skrening terhadap semua isolat bakteri yang berasal dari endofit dan permukaan menunjukkan ada enam isolat bakteri yang mampu menghambat pertumbuhan semua mikrob target. Enam isolat tersebut terdiri dari lima isolat endofit yaitu SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40 serta satu isolat permukaan yaitu SAB S-43. Berdasarkan hasil uji antagonis terhadap C. albicans dan C. tropicalis, hanya isolat SAB E-33, SAB E-38 dan SAB E-40 yang memperlihatkan aktivitas antagonis yang baik. Kemampuan isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dalam menghambat pertumbuhan mikroba target, merupakan bentuk aktivitas antagonis yang diduga dilakukan dengan menghasilkan kandungan senyawa yang bersifat antimikrobial. Biosintesis senyawa antimikrobial berperan penting dalam proses pelekatan, kolonisasi target hingga kompetisi dalam mendapatkan ruang dan nutrisi dengan mikroba lainnya. Keragaman genetik dilakukan pada 30 isolat yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan ARDRA. Amplifikasi gen 16S rRNA terhadap 30 isolat yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan menggunakan primer spesifik yaitu 63f dan 1387r. Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA menampakkan pita yang berukuran sekitar 1300 pb. Primer 63f dan 1387r yang digunakan merupakan primer untuk gen yang menyandikan gen 16S rRNA yang telah didesain untuk seluruh domain bakteri. Primer ini dapat digunakan pada kultur murni bakteri maupun sampel alami dimana gen 16S rRNAnya sulit untuk diamplifikasi. Hasil pemotongan gen 16S rRNA memperlihatkan pola pita gen 16S rRNA yang beragam dengan jumlah 2-4 pita. Profil pita gen 16S rRNA yang beragam dihasilkan setelah dipotong dengan tiga enzim restriksi yaitu RsaI, HaeII dan HinfI. Ketiga enzim restriksi tersebut memiliki situs dan sifat pemotongan yang berbeda-beda. Enzim HinfI merupakan enzim yang memotong secara sticky end, dengan situs pemotongan 5’…G↓ANTC…3’ dan 3’…CTNA↑G…5’. Enzim restriksi RsaI dan HaeIII ialah enzim restriksi yang memotong secara blunt end. Situs pemotongan pada RsaI yaitu 5’…GT↓AC…3’ dan 3’…CA↑TG…5’, sedangkan HaeIII yaitu 5’…GG↓CC…3’ dan 3’…CC↑GG…5’. Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan data Amplified ribosomal DNA restriction analysis mengelompokkan 30 isolat asal spons Jaspis sp. yang memiliki aktivitas
antimikrob menjadi tujuh filotipe. Pengelompokan ini berdasarkan adanya kesamaan situs pemotongan tiap isolat setelah direstriksi oleh tiga enzim restriksi yang berbeda. Pengujian fisiologis dilakukan dalam dua metode berdasarkan hasil pewarnaan Gram dari ke enam isolat terbaik. Isolat SAB E-8, SAB E-35 dan SAB E40 dari hasil pewarnaan Gram merupakan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif yaitu isolat SAB E-33, SAB E-38 dan SAB S-43. Uji fisiologis tambahan untuk bakteri Gram positif diarahkan ke kelompok Bacillus dengan melakukan uji parsial yang meliputi pewarnaan Gram, endospora dan katalase. Hasil uji parsial menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut adalah kelompok Bacillus, dicirikan oleh sel yang berbentuk batang, pewarnaan Gram positif, terdapat endospora yang terletak pada bagian sentral dan uji katalase positif. BlastN sekuen gen 16S rRNA enam isolat dengan aktivitas mikrob terbaik, terbagi menjadi dua kelompok filogenetik yang berbeda yaitu genus Pseudomonas (50%) dan Bacillus (50%). Isolat SAB E-8, SAB E-35, dan SAB E-40 termasuk dalam kelompok Pseudomonas karena ketiga isolat tersebut masing-masing homolog dengan Pseudomonas sp. HN-07, Pseudomonas sp. LPK2 dan Pseudomonas sp.LD116, dengan tingkat identitas maksimum 97% - 98. Tingkat identitas maksimum 98% - 99% diperoleh dari tingkat homologi isolat SAB E-33, SAB E-38, dan SAB S-43 dengan isolat yang terdapat dalam Gen Bank, yaitu masing-masing Bacillus sp. strain K3, Bacillus pumilus strain 210-50, dan Bacillus sp.E287. Pohon filogenetik yang menggunakan data sekuen parsial gen 16S rRNA isolat dengan aktivitas antimikrob terbaik dan beberapa galur acuan (reference strains) menunjukkan adanya kedekatan hubungan kekerabatan. Pohon filogenetik menunjukkan SAB-35 berdekatan secara evolusi dengan Pseudomonas sp. J451 dengan nilai boostrap 56%. Pohon filogenetik menunjukkan SABS-43 dan SABE-33 memiliki kedekatan kekerabatan dengan Bacillus sp. EGU72 sedangkan SAB E-38 dengan Bacillus sp. D203. Kata kunci : Spons – Asosiasi Bakteri, ARDRA, 16S rRNA, senyawa antimikrob, keragaman genetik
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp. : PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB DAN ANALISIS KERAGAMAN GENETIKNYA
HERMAWATY ABUBAKAR
Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
Judul Penelitian
: Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.: Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya
Nama Mahasiswa
: Hermawaty Abubakar
NRP
: G351070021
Disetujui, Komisi Pembimbing
Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi Ketua
Dr. Munti Yuhana, MSi Anggota
Diketahui, Koordinator Mayor Mikrobiologi
Dr.Ir. Gayuh Rahayu
Tanggal ujian :13 Agustus 2009
An. Dekan Sekolah Pascasarjana Sekretaris Program S2
Dr.Ir. Naresworo Nugroho, M.Sc.
Tanggal lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke Hadirat Allah SWT karena atas segala rahmat dan karuniahNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Topik yang dipilih adalah Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.: Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya, yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2008 sampai Mei 2009. Penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang sebesarbesarnya terutama kepada pembimbing, yaitu Dr. Aris Tri Wahyudi, Msi. dan Dr. Munti Yuhana, Msi. yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran selama penulis menempuh S2. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Dinamella Wahjuningrum, MSi. selaku Penguji Luar Komisi yang telah memberikan koreksi dan arahan untuk perbaikan tesis. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua, Ayahanda H. Abubakar Makkarumpa dan Ibunda Hj. Bunga Matahari, Suami dan kedua Anakku atas keikhlasan, doa dan kasih sayangnya. Tidak lupa kepada saudara dan sahabat khususnya Ari Susilowati, MSi., Rika I. Astuti, MSi., dan Syamsul Bahri, SSi, penulis mengucapkan banyak terima kasih atas bantuan saran, kritik dan kebersamaanya. Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari sempurna, sehingga kritik dan saran sangat diharapkan. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Bogor, Juli 2009 Penulis
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pinrang propinsi Sulawesi Selatan pada tanggal 5 Agustus 1978 dari pasangan H. Abubakar Makkarumpa dan Hj. Bunga Matahari. Penulis merupakan anak ke empat dari enam bersaudara. Tahun 1996 penulis lulus dari SMU Muhammadiyah Pinrang dan pada tahun 1997 lulus seleksi masuk Universitas Hasanuddin Makasar pada jurusan Biologi melalui jalur UMPTN dan lulus tahun 2002. Kesempatan untuk melanjutkan ke program Magister Sains pada mayor Mikrobiologi FMIPA-IPB diperoleh pada tahun 2007. Beasiswa diperoleh dari BPPS Departemen Pendidikan Nasional. Penulis bekerja sebagai tenaga pengajar di Universitas Negeri Papua sejak tahun 2003 sampai sekarang. Pada tahun 2006, penulis menikah dengan Lutfi Amin Mathar dan dikaruniai dua orang putra kembar yang bernama Moch. Rifat Badrani Mathar (Mori) dan Moch. Razan Badrani Mathar (Mora).
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..........................................................................................
xiii
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................
xv
PENDAHULUAN .......................................................................................... Latar Belakang ................................................................................................ Tujuan .............................................................................................................
1 1 3
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. Tinjauan Umum Spons .................................................................................... Asosiasi Spons dengan Bakteri ....................................................................... Potensi Senyawa Bioaktif dari Assosiasi Bakteri dengan Spons ................... Senyawa Antimikrob ....................................................................................... Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) ...........................
4 4 5 7 9 10
MATERI DAN METODE .............................................................................. Waktu dan Tempat .......................................................................................... Bahan ............................................................................................................... Metode Penelitian ............................................................................................ a. Pengambilan Sampel ................................................................................... b. Isolasi Bakteri dari Sampel Spons .............................................................. c. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Bioaktif .......................................... d. Pewarnaan Gram dan Uji Parsial ................................................................ e. Analisis Molekuler Gen 16S rRNA .............................................................
12 12 12 12 14 14 15 16 16
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... Hasil ................................................................................................................ a. Isolasi Bakteri dari Sampel Spons ............................................................... b. Penapisan Bakteri Penghasil senyawa Bioaktif .......................................... c. Pewarnaan Gram dan Uji Parsial ................................................................. d. Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) ..................... e. Analisis Sekuens Gen 16S rRNA ................................................................ Pembahasan ..................................................................................................... a. Isolasi dan Bentuk Asosiasi Spons dengan Bakteri ..................................... b. Isolat Penghasil Senyawa Bioaktif .............................................................. c. Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) ....................... d. Analisis Sekuens Gen 16S rRNA ................................................................
19 19 19 19 24 26 34 37 37 38 41 43
KESIMPULAN ............................................................................................... Kesimpulan .....................................................................................................
46 46
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... LAMPIRAN ....................................................................................................
47 52
DAFTAR TABEL
Halaman 1 2 3 4
Aktivitas antibakteri dan antikhamir isolat-isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. .................................................................................... Aktivitas antibakteri dan antikhamir isolat-isolat bakteri permukaan asal spons Jaspis sp. ............................................................................. Ukuran fragmen DNA gen 16S rRNA yang dipotong dengan beberapa enzim restriksi ……………………………………………... Identitas 6 isolat penghasil senyawa antimikrob terbaik yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. berdasarkan sekuens gen 16S rRNA . …………………….................................................................
21 23 32
35
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 2 3
4
5
6
7
8 9
10
11
12 13 14
Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini ........................ Penampilan spons Jaspis sp., asal perairan sebelah barat Pulau Waigeo, Raja Ampat Papua Barat ........................................................ Penampilan koloni bakteri ektosimbion hasil isolasi dari spons Jaspis sp pada Medium SWC, setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC ...................................................................................................... Penampilan koloni bakteri endosimbion hasil isolasi dari spons Jaspis sp pada Medium SWC, setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC .............................................................................................. Senyawa Antibakteri yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari beberapa isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. terhadap pertumbuhan bakteri a. S. aureus, b. V. harveyii, c. E. coli, d. EPEC-K11, e. P. aeruginosa dan f. S. aureus ……………………. Senyawa Antikhamir yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. SAB E-35 dan SAB E-38 terhadap pertumbuhan khamir a. C. albicans dan b. C. tropicalis ..……………………………………………………………. Senyawa Antibakteri yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari beberapa bakteri permukaan asal spons Jaspis sp. terhadap pertumbuhan a. S. aureus, b. V. harveyii dan c. P. Aeruginosa ............................................................................................ Profil koloni pada media SWC dan hasil pewarnaan bakteri Gram negatif isolat SAB E-35 …………....................................................... Uji parsial genus Bacillus untuk isolat bakteri gram positif (SAB S43); Profil koloni pada media SWC; Pewarnaan Gram; Pewarnaan Spora .......................................................................……….................. Amplifikasi gen 16S rRNA dari beberapa isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik, M: standar ukuran molekul DNA 1kb ladder …………………….......………………………………………. Elektroforesis gel agarose gen 16S rRNA dari beberapa isolat bakteri asal spons Jaspis sp. yang mempunyai aktivitas antimikroba terbaik yang dipotong dengan Enzim RsaI (A), HaeIII (B) dan HinfI (C). M: standar ukuran molekul DNA (1kb ladder) ..................……………… Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. yang dipotong dengan enzim restriksi RsaI ……… Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. yang dipotong dengan enzim restriksi HaeIII ……… Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. yang dipotong dengan enzim restriksi HinfI ………
13 14 20
20
22
22
25
25 25
27
28
29 30 31
15
16
Pohon filogenetik (internode rooted) hubungan kekerabatan antar 33 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dengan aktivitas antimikrob terbaik yang dianalisis dengan ARDRA dan dikonstruksi berdasarkan metode Neighbor-Joining. Angka 10% pada bagian atas pohon menunjukkan skala persentase perbedaan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 100 ulangan ............................................................... Pohon filogenetik berdasarkan hasil sekuensing gen 16S rRNA enam 36 isolat bakteri dengan aktivitas antimikrob terbaik asal spons Jaspis sp.
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 2 3 4 5
Komposisi media SWC (Sea Water Complete) .................................... Profil koloni isolat bakteri endofit ........................................................ Profil koloni isolat bakteri surfaces ...................................................... Sekuen gen 16S RNA enam isolat terbaik ........................................... Hasil perhitungan biner untuk ARDRA .............................................
51 52 54 56 59
PENDAHULUAN Latar Belakang Mikroorganisme laut merupakan sumber senyawa bioaktif baru yang banyak menjadi perhatian sekarang ini. Bakteri penghuni perairan laut yang miskin nutrisi banyak dijumpai hidup dengan cara berasosiasi dengan berbagai organisme laut bentik, seperti spons dan karang. Spons merupakan biota laut yang tersebar pada daerah perairan pantai yang dangkal hingga kedalaman 5,5 km. Tubuh hewan ini terdiri dari jaringan rangka yang disebut spikula. Spikula tersebut mengandung senyawa kimia yaitu kalsium karbonat, silika, serat kolagen dan serat spongin yang lentur (Castro & Huber 2005). Spons adalah hewan berpori yang termasuk filter feeder yaitu hewan yang mengumpulkan nutriennya dengan cara menyaring air laut melalui pori-pori (ostium). Makanan porifera berupa sisa organisme yang telah mati atau mikroorganisme yang berada di kolom air. Menurut Taylor et al. (2007), selain dijadikan sumber protein sel tunggal, mikroorganisme juga
sebagai simbion dari spons karena mikroorganisme
mengkolonisasi tubuh sponge yang berpori-pori sebagai tempat hidup dan berlindung. Hal ini dapat dijumpai sebagai asosiasi antara spons dengan bakteri. Bakteri dapat memberikan kontribusi untuk pertahanan inangnya dengan eksresi antibiotik dan substansi bioaktif lainnya. Secara khusus organisme laut yang sesil seperti spons diperkirakan sangat bergantung pada mekanisme pertahanan simbionnya, yaitu dengan menghasilkan senyawa bioaktif untuk mempertahankan diri terhadap hewanhewan predator dan dari kolonisasi dari mikroorganisme patogenik. Banyak senyawa bioaktif yang diproduksi oleh spons sebagai hasil metabolit sekunder. Produk alami laut sebagai hasil metabolik sekunder kemungkinan dihasilkan oleh kehadiran mikroorganisme pada jaringan spons sebagai simbion, baik simbion intraselluler ataupun ekstraselluler. Senyawa-senyawa organik tersebut dapat ditransport oleh adanya kerjasama antara simbion dan inangnya. Kehadiran pasangan simbion ini menjadi syarat untuk menghasilkan metabolik sekunder. Hubungan ini dapat dilihat dari asosiasi spons dan Eubacteria (Barnes 1994).
2
Jenis senyawa metabolit sekunder yang berhasil diisolasi dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons memperlihatkan kuantitas yang lebih banyak dari mikroorganisme laut lainnya. Hal ini terutama dikarenakan kemudahan dalam kultur massalnya. Jenis senyawa metabolit sekunder dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons sangat bervariasi yaitu dari golongan terpenoid, alkaloid, polyketida, peptida siklik, derivat dari asam lemak dengan berat molekul kecil, heterosklik, hingga brominated pyrroles, (Taylor et al. 2007). Vibrio spp. yang berasosiasi dengan spons Dysidea sp menunjukkan adanya sintesis cytotoksik dan antibakteri tetrabromodiphenyl eter demikian pula pada asosiasi antara Micrococcus dengan Tedania ignis ditemukan adanya aktifitas antimikroba (Kanagasabhapathy et al. 2005). Hasil penelitian Kim et al. (2006); Montalvo et.al 2005; Zhang et al. (2006), Actinomyetes yang bersimbiosis dengan spons Pseudoceratina clavalata, Xestospongia spp., Hymeniacidon perlevis dan Craniella australiensis juga menunjukkan adanya aktifitas antimikrobial. Penemuan spons sebagai penghasil senyawa bioaktif juga telah banyak dipublikasikan tetapi penggunaan produk alami laut yang bersifat antibiotik dan antifungi sebagai hasil metabolit sekunder dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons, lebih menguntungkan dibandingkan dengan mengisolasi dari inangnya. Pertumbuhan spons yang relatif lamban, selanjutnya membawa implikasi pada keterbatasan pasokan biomassa untuk mengekstraksi senyawa metabolit sekundernya. Penggunaan bakteri yang hidupnya berasosiasi dengan spons dalam bentuk simbion lebih baik karena dapat dimurnikan dan dikultur dalam skala laboratorium sehingga tidak perlu mengoleksinya dari alam, dapat diperbanyak dalam waktu yang lebih cepat dan relatif lebih mudah dimanipulasi dengan menggunakan teknologi molekuler. Penggunaan teknik molekuler untuk mengidentifikasi bakteri telah umum dilakukan, salah satunya dengan analisis gen 16S rRNA untuk mengetahui filogeni, penyebaran dan karakteristik bakteri yang bersimbiosis dengan spons. Analisis gen 16S rRNA juga dapat dilanjutkan dengan metode Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Teknik molekuler ini telah banyak digunakan untuk
3
menganalisis komunitas bakteri pada berbagai lingkungan, termasuk spons sebagai simbion dari berbagai bakteri laut.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi
bakteri yang
berasosiasi dengan spons Jaspis sp. (endosimbion dan ektosimbion) penghasil senyawa antimikrob dan menganalisis keragaman genetiknya berdasarkan amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) dan sekuensing gen 16S rRNA.
TINJAUAN PUSTAKA Tinjauan Umum Spons Spons (filum Porifera) adalah hewan multisellular (Metazoa) yang paling tua dan mempunyai struktur yang sangat sederhana. Susunan pada struktur spons tidak sama dengan filum yang lainnya, morfologi spons sangat mempengaruhi aspek biologi spons itu sendiri termasuk interaksinya dengan mikroorganisme (Simpson 1984). Susunan sel-sel spons berbeda pada setiap lapisan strukturnya. Pada permukaan paling luar, atau yang biasa disebut dengan pinacoderm, dibentuk oleh sel-sel epitel yang disebut sebagai pinacocyte. Pori-pori (ostia) pada permukaan luar merupakan saluran yang menembus sampai pada bagian kanal interior. Bagian dalam spons, terdapat sebuah sel-sel berflagella (choanocyte) yang berasal dari sebuah ruang yang disusun oleh choanoderm dimana makanan disimpan. Flagel dari choanocyte akan bergerak untuk memompa air yang akan masuk melalui ostia, choanosyte juga akan menyaring keluar partikel-partikel makanan (termasuk bakteri dan mikroalga) dari air dan akan ditransfer ke mesohyl yang merupakan perluasan lapisan yang berhubungan dengan jaringan. Di dalam mesohyl partikel makanan akan dicerna dengan phagositosis oleh sel-sel spons lainnya yang disebut archaeosyte. Sel-sel totipotensi yang dapat berdiferensiasi menjadi tipe sel spons yang baru juga berada pada mesohyl yang padat dengan komunitas mikroorganisme. Setiapkali choanocyte menyaring air yang masuk, maka air juga akan dikeluarkan dari spons melalui osculum, diperkirakan lebih dari 24.000 liter air yang dipompakan oleh 1 kg spons perhari (Castro & Huber 2005). Pertumbuhan spons juga memiliki tipe yang bermacam-macam dengan warna-warna yang menarik, seperti tipe encrusting, bercabang, cup dan massive dengan ukuran yang hanya beberapa millimeter hingga yang memiliki diameter lebih dari satu meter. Konstruksi struktur spons dibentuk oleh silika dan spikula kalkareus, komponen ini seringkali dibuat sebagai bahan dalam penyusunan taksonominya. Selain spikula dan silika, jaringan kolagen seperti spongin juga
5
memengang peranan dalam menyokong struktur pada spons (Castro & Huber 2005). Spons yang berwarna orange cerah yaitu Jaspis johnstoni adalah spons dengan struktur yang rapuh, lembut dan padat. Spons ini dapat dijumpai pada permukaan karang sehingga dengan mudah dapat dikonsumsi oleh predator. Spons ini mempunyai kandungan senyawa bioaktif yang dapat membunuh predator, hasil penelitian Vanderloos (1997) mengidentifikasi senyawa tersebut adalah Jasplakinolide yang dapat menghambat pertumbuhan sel-sel kanker. Asosiasi Spons dengan Bakteri Interaksi antara spons dan bakteri terjadi dalam banyak bentuk. Untuk spons, mikroba yang berbeda dapat diartikan sebagai sumber makanan, patogen/parasit atau sebagai simbion mutualisme. Bakteri yang berasosiasi dengan spons dapat mencapai 40% dari jaringan spons dengan kepadatan 109 sel bakteri per ml jaringan spons (Hofman et al. 2005). Berdasarkan sekuen 16S rRNA dan Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) hasil sensus oleh Taylor et al. (2007), bakteri yang berassosiasi dengan spons antara lain adalah Acidobacteria,
Actinobacteria,
Deinococcus-Thermus, Planctomycetes,
Bacteroides,
Firmicutes,
Poribacteria,
Chloroflexi,
Gemmatimonadetes,
Proteobacteria,
Cyanobacteria, Nitrospira,
Sphirochaetes
dan
Verrucomicrobia. Sangat jelas keuntungan yang diperoleh spons dari sistem metabolisme simbionnya yaitu bakteri dan mikroba lainnya. Fotosintesis dan fiksasi nitrogen yang dilakukan oleh cyanobakteri kiranya merupakan faktor kunci mengapa spons dapat bertahan dalam kondisi lingkungan peraiaran yang miskin nutrisi (Ariilo et al. 1993). Seperti yang diungkapkan oleh Hoffman et al. (2006), yang menjelaskan bahwa bakteri anaerobik dapat mentransfer asam karboksilat pada spons Geodia baretti. Bakteri metanotropik dapat mensuplemen nutrisi pada spons tanpa proses filter feeding dalam habitat laut yang kaya akan metan (Facelet et al. 1995). Namun, mikroba simbion dapat pula dikonsumsi oleh spons, ini dilaporkan pertamakali pada awal 1970-an, bahwa simbion cyanobakteri ditemukan pada bagian intra dan ekstraseluler dari spons Synecoccus spp. (kelompok Cyanobakteria) juga dijumpai pada sel mesohyl dan bagian sel-sel
6
tertentu dari spons Ircinia virabilis asal Mediterania, yang merupakan sebuah sumber fotosintesis dan pemfiksasi karbon bagi spons (Yahel et al. 2006). Bentuk asosiasi mikroba juga memberikan kontribusi dalam siklus nutrisi bagi kebutuhan spons inangnya. Sumber nutrisi spons berupa mikroalga dan zooplankton terdiri atas berbagai komponen makrokolekul. Mikroalga yang kaya akan karbon dan nitrogen serta zooplankton yang sebagian struktur tubuhnya terdiri atas kitin dapat dengan mudah dipecah oleh bakteri-bakteri pengahsil enzim protease dan kitinase sehingga menjadi molekul yang lebih kecil (Reiswig 1975). Keuntungan lain yang diperoleh oleh spons dari simbionnya yaitu bakteri adalah penambahan struktur yang lebih kaku akibat produksi mukus yang dihasilkan oleh mikroba. Dalam beberapa kasus senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh mikroba simbion potensial digunakan sebagai prekusor untuk metabolisme biosintesis pertahanan spons dari patogen dan predator lainnya. Penelitian
tentang
interaksi
antara
spons
dan
mikroorganisme,
menunjukkan bahwa suatu mikroorganisme akan berasosiasi pada spesies spons tertentu. Hal ini telah dibuktikan melalui pengamatan dengan mikroskop maupun analisa genetik dan studi kultur yang bertujuan untuk isolasi antibiotik dari bakteri yang berasosiasi dengan spons yang berbeda-beda. Suberitas domuncula, misalnya menunjukkan hanya sedikit bakteri yang tampak pada bagian permukaan dalamnya, sementara spons Halichondria panicea
dan Ircinia fascikulata
menunjukkan bakteri yang berlimpah dengan variasi yang bermacam-macam. Ini dapat dilihat dengan mikroskop elektron yang juga menggambarkan tingginya keanekaragaman isolat bakteri dari spons-spons ini (Imhoff & Stohr 2003). Spesies spons yang berasosiasi dengan bakteri spesifik dapat ditunjukkan dengan membandingkan komunitas bakteri yang berasosiasi dengan sampel yang berbeda dari spons Mediteranian yaitu Chondrilla nucula dari laut Adriatic dan laut Liguria. Sekuen DNA klon yang identik ditemukan dalam sampel spons dari lokasi yang berbeda. Menariknya, spons Thetya aurantium menunjukkan dua komunitas bakteri yang diperlihatkan dengan bentuk morfologi yang berbeda dari bagian eksterior dan interior sel, yang dapat dilihat dengan mikroskopik dan diperjelas dengan DGGE dan percobaan cloning gen 16S rRNA. Penemuan ini mendukung asumsi bahwa setidaknya bakteri yang ditemukan pada spons tertentu
7
adalah spesies khusus yang berasosiasi dengan kelompok porifera tersebut serta mempunyai bentuk adaptasi sepanjang proses evolusi pada lingkungan dimana spons berada (Imhoff & Stohr 2003). Kesuksesan usaha dalam mengisolasi mikroorganisme penghasil senyawa bioaktif yang bersimbiosis dengan spons tergantung oleh beberapa faktor. Faktor yang paling signifikan yaitu bahwa mikroba dapat melakukan sistem metabolisme yang berbeda-beda tergantung kondisi lingkungannya. Banyak penelitian yang berhasil mengkultur bakteri yang berasal dari spons pada medium-medium yang sebelumnya dicampur dengan ekstrak dari jaringan spons. Meskipun demikian, bakteri yang dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang diisolasi jumlahnya cukup rendah yaitu berkisar 0,06; 0,1; 0,15 dan 0,7 % dari total bakteri yang dapat dikultur dari spons Candidaspongia flabellata, Rhopaloides odorabile, Aplysinaaerophoba (Burja et al. 1999; Thoms et al. 2003) Kebutuhan nutrisi mikroba yang bersimbiosis dengan spons sangat susah untuk dipenuhi bila dikultur dalam laboratorium. Bagaimanapun, ada beberapa bakteri yang dapat diisolasi tetapi sudah tidak dapat memproduksi senyawasenyawa bioaktif lagi, kemungkinan bakteri-bakteri tersebut mengharuskan adanya perantara sistem metabolisme dari spons sebagai inangnya. Adapula beberapa isolat bakteri yang belum diketahui alasannya berhenti menghasilkan produk-produk senyawa bioaktif setelah dikulturkan beberapa waktu pada media buatan. Ini diduga karena adanya keterlibatan faktor genetik, dimana gen yang menyandikan senyawa bioaktif tersebut hilang karena akibat mutasi atau kehilangan penggerak elemen-elemen genetik yang mensintesis gen-gen tersebut (Proksch et al. 2002). Potensi Senyawa Bioaktif dari Assosiasi Bakteri dengan Spons Spons dianggap sebagai organisme yang potensial karena lebih dari 200 senyawa metabolit baru yang ditemukan setiap tahun, dibandingkan dengan organisme laut lainnya. Spons dianggap sebagai salah sumber substansi natural yang
paling
penting
seperti
antibiotik,
antitumor,
aktivitas
antiviral,
antiplasmodial, dan anti-inflammatory. Ini membuat spons sebagai sumber potensial dari produk baru dunia kedokteran. Bagaimanapun, dalam banyak kasus
8
hal ini tidak bisa membuktikan apakah sel-sel spons atau bakteri yang berasosiasi memproduksi substansi senyawa bioaktif (Blunt et al. 2006). Meskipun awalnya penemuan senyawa bioaktif banyak ditemukan sebagai hasil ekstraksi dari jaringan spons tetapi arah penelitian sekarang ini lebih banyak dieksplorasi pada mikroorganisme yang bersimbiosis dengan spons. Hal tersebut lebih menguntungkan dibandingkan dengan mengisolasi dari inangnya (spons). Menurut West et al. (2002), senyawa makrosiklik lactone yaitu Peluruside A yang diisolasi dari demosphongia Mycale hentscheli di perairan New Zaeland menunjukkan potensi sebagai antikanker dan untuk mendapatkan 2 gram Peluruside A murni dibutuhkan 200 kg ekstrak spons, hal ini tentu saja dapat menghabiskan kekayaan laut bumi ini. Kenyataanya, banyak kasus yang dapat menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi yang memproduksi kandungan senyawa bioaktif dan bukan inangnya. Chondramide D yang dihasilkan oleh deltaproteobacterium Chondromyces crocatus memperlihatkan rumus struktur yang sama dengan senyawa Jaspamide yang berasal dari ekstrak spons Jaspis sp. (Taylor et al. 2007). Spons
yang
bersimbiosis
dengan
Actinomycetes
dari
genus
Micromonospora menghasilkan Manzamine yaitu alkaloid yang berpotensi sebagai antimalaria. Manzamine pertama diisolasi dari mikroba yang berasal dari spons yang tidak hanya berbeda spesies, tetapi juga secara geografis berbeda. Namun perkembangan sekarang, manzamine yang dihasilkan tidak selalu bergantung pada komunitas atau jenis mikrobanya. Manzamine yang diisolasi di Indonesia dihasilkan oleh bakteri yang bersimbiosis dengan spons 01IND 35 dan 01IND 52 (Naglaa et al. 2004). Spons Hyatella sp. yang bersimbiosis dengan Vibrio sp. menghasilkan senyawa peptida yang bersifat antibakterial, sementara itu glycoglycerolipid dihasilkan oleh Halichondria panicea yang bersimbiosis dengan Microbacterium sp. yang berpotensi sebagai anti tumor (Miyashiro & Ikegami 1994; Wicke et al. 2000).
Menurut
Mitova
et
al.
(2003),
sebuah
senyawa
baru
yaitu
Cyclotetrapeptida dan dihasilkan oleh bakteri Pseudomonas sp. (IM1) yang diisolasi dari sebuah spesimen spons Ircinia muscarum dari teluk Naples (Italia). Hasil penelitian Kim et. al., 2006, analisis filogenetik dari sekuen gen ketosynthase
9
(KS) strain Salinispora sp. (actinobacteria) diindikasikan memiliki sekuen gen polyketide synthase (PKS) yang sama dengan Amycolatopsis mediterranei penghasil
Rifamycin
B.
Strains
Salinispora
diisolasi
dari
spons
laut
Pseudoceratina clavata. Pada penelitian lainnya, beberapa golongan Quinolon memiliki aktivitas antimikrobial dan cytotoksin dari Pseudomonas asosiasi dengan Homophinia sp. yang berasal dari lautan pasifik (Burja et al. 1999). Asosiasi antara spons Aplysina aerophoba dan A. cavernicola yang berada di laut Mediterania dengan 27 isolat bakteri yang belum teridentifikasi, menunjukkan bahwa beberapa isolat tersebut berpotensi untuk menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri klinikal yang multiresisten seperti, Staphylococcus aureus dan S. epidermidis (Hentschel et al. 2001). Arah penelitian yang semakin dikembangkan yaitu berfokus pada produksi substansi antibiotik dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons. Bagaimanapun penambahan bakteri resisten menyebabkan beberapa masalah dalam dunia kedokteran dan menguatkan penelitian-penelitian baru untuk mencari kandungan senyawa aktif melawan patogen multiresisten. Senyawa Antimikrob Senyawa antimikroba adalah senyawa yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lain. Kebanyakan senyawa antimikroba yang telah dipergunakan secara luas dikenal dengan nama antibiotik. Target penting dari antibiotik bakteri adalah ribosom (translasi), dinding sel, membran sitoplasma, proses repilikasi DNA dan transkripsi (Madigan et al. 2006). Antibiotik yang menghambat sintesis protein pada tahap inisiasi adalah streptomycin sedangkan puromycin, chloramphenicol, cyckloheximide dan tetracyclin pada tahap elongasi. Antibiotik yang berperan pada transkripsi antara lain rifampin dan streptovaricin yang menghambat sintesis RNA yaitu dengan berikatan dengan sub unit β dari RNA polimerase, sedangkan aktinomycin menghambat sintesis RNA dengan menghentikan proses elongasi RNA. Antibiotik β-lactam seperti penicillin dan cephalosporin berpotensi untuk menghambat sintesis dinding sel salah satunya dengan menghasilkan penicillin binding protein (PBPs), (Madigan et al. 2006).
10
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) Salah satu alternatif untuk mengetahui komposisi komunitas suatu lingkungan yaitu dengan mengembangkan teknik biologi molekular. Teknik ini mencakup penentuan variasi pola pita gen 16S rRNA setelah dipotong dengan beberapa enzim restriksi yang dapat dianalisis pada komunitas prokariot yang dijumpai pada habitat tertentu. Gen 16S rRNA adalah bagian dari DNA prokariot yang dapat ditemukan pada bakteri dan archaea. Gen ini mengkodekan rRNA, dimana rRNA merupakan bagian pembentuk dari ribosom. Huruf ”r” pada rRNA merujuk pada kata ribosomal, sedangkan struktur ribosom terdiri dari dua unit yaitu large subunit (LSU) dan small subunit (SSU). Pada bakteri SSU dikodekan oleh gen 16S rRNA sedangakn LSU dikodekan oleh gen gen 5S rRNA dan 23S rRNA (Snyder & Wendy 2002). Gen 16S rRNA merupakan gen yang sangat stabil, karena susah temutasi meskipun dalam jangka waktu yang lama. Gen 16S RNA mengandung informasi yang dapat dijadikan sebagai biomarker terhadap suatu bakteri. Gen 16S rRNA terdiri dari daerah konservatif yang dapat dijumpai pada semua organisme dan daerah hypervariabel yang unik pada setiap organisme atau organisme yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat yang dapat digunakan untuk identifikasi (Moyer et al. 1994). Analisis filogeni dari komunitas mikroba yang menggunakan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) merupakan sebuah metode sederhana yang didasarkan pada adanya polimorfisme panjang fragmen gen 16S rRNA setelah dipotong dengan enzim restriksi. Istilah polimorfisme adalah hasil pemotongan gen 16S rRNA dari bakteri asal yang berbeda akan memberikan pola fragmen yang berbeda. Panjang fragmen ditentukan melalui proses elektroforesis gel agarose dengan penanda ukuran DNA (DNA marker) sebagai pembanding (Yogiara 2004). Sama halnya hibridisasi dan pelacakan DNA, ARDRA digunakan untuk menganalisis komunitas bakteri pada berbagai lingkungan. Meskipun ARDRA hanya memberikan sedikit atau sama sekali tidak ada informasi mengenai tipe mikroorganisme yang terdapat dalam suatu sampel, namun hasilnya dapat
digunakan
untuk
mengetahui
genotip
secara
cepat
atau
untuk
11
membandingkan suatu komunitas mikroorganisme pada kondisi lingkungan yang berbeda. Pada penelitian Moyer et al. (1994) analisis 16S rRNA menggunakan kombinasi enzim restriksi tetramerik (situs pengenalan 4 basa DNA) untuk menghasilkan suatu pola pita DNA yang emadai sebagai satuan operasional taksonomi (operational taxonomic unit/OTU). Masing-masing OTU akan menjadi ciri dari kelompok 16S rRNA asal bakteri yang hidup dalam komunitas tertentu. Penggunaan enzim restriksi HhaI (isochizomer dengan Hinp1 I), RsaI dan BstUI sebagai enzim yang digunakan dalam studi keragaman mikrob menggunakan ARDRA, karena enzim tersebut dapat menghasilkan pola pita DNA yang relatif lebih beragam.
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA-Institut Pertanian Bogor, yang dimulai bulan Oktober 2008 sampai bulan Mei 2009. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel spons Jaspis sp yang diambil dari perairan sebelah barat pulau Waigeo, Kabupaten Raja Ampat, Papua Barat. Bakteri uji yang digunakan untuk uji produksi senyawa antibakteri terdiri dari bakteri Gram negatif yaitu Escherichia coli (koleksi laboratorium Mikrobiologi, departemen Biologi IPB), EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli) K-11 (koleksi Dr.dr. Sri Budiarti – Departemen Biologi IPB), Vibrio harveyi patogen udang (koleksi Dr. Widanarni – Departemen Budidaya Perikanan IPB), Pseudomonas aeruginosa patogen manusia (koleksi laboratorium Bioteknologi PAU) serta bakteri Gram positif yaitu Staphylococcus aureus patogen manusia (koleksi laboratorium Bioteknologi PAU), Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus (koleksi laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi IPB). Pengujian antikhamir menggunakan Candida albicans dan C. tropicalis patogen manusia (koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Parasitologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia) Metode Penelitian Metode ini meliputi pengambilan sampel, lalu dilanjutkan dengan isolasi bakteri yang berpotensi menghasilkan senyawa antimikrob yang berasal dari permukaan dan mesohyl spons Jaspis sp. Penapisan isolat bakteri yang menghasilkan senyawa antimikrob, yang dilakukan terhadap organisme prokariot (bakteri) dan Eukariotik (khamir). Untuk keragaman genetik isolat bakteri yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) dan dilanjutkan dengan uji fisiologis (pewarnaan Gram dan uji parsial) serta sekuensing gen 16S rRNA untuk identifikasi isolat terbaik. Alur lengkap tahapan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.
13
Pengambilan Sampel spons Jaspis sp.
Isolasi Bakteri dari Sampel Spons
Penapisan Isolat Bakteri Penghasil Senyawa Bioaktif
Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian Aktivitas Antikamir
Uji fisiologis (Pewarnaan Gram dan Uji Parsial)
Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)
Analisis Sekuens 16S rRNA
Gambar 1. Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini.
14
Pengambilan Sampel Sampel spons diambil dari perairan sebelah barat pulau Waigeo, Kabupaten Raja Ampat, Papua Barat, pada kedalaman +10 meter dengan menggunakan alat bantu snorkel dan masker. Pengambilan sampel ini dilakukan secara acak, yaitu dengan menyusuri dasar laut. Sampel spons Jaspis sp. yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 2. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam plastik sampel (Whirl-Pak, Nasco, USA) yang telah diisi dengan oksigen murni, selanjutnya ditempatkan dalam cool box untuk dianalisis secara mikrobiologis di laboratorium.
Gambar 2. Penampilan spons Jaspis sp., asal perairan sebelah barat Pulau Waigeo, Raja Ampat Papua Barat.
Isolasi Bakteri dari Sampel Spons Permukaan sampel spons dibilas dengan air laut steril, sehingga hanya bakteri dengan daya simbiosis yang kuat saja yang akan tersampling (Amstrong et al. 2001). Untuk isolasi bakteri pada bagian dalam jaringan spons diambil dengan cara memisahkan bagian pinacoderm dengan bagian mesohyl. Bagian mesohyl diambil dengan ukuran + 1 x 1 cm, digerus dan diencerkan dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) steril dengan perbandingan 1 : 1 (Kim et al 2006). Selanjutnya dibuat suspensi dari pengenceran 10-1 sampai 10-7. Pada pengenceran 10-5,10-6, dan 10-7 dipipet 0,1 ml secara aseptik dan disebar ke dalam cawan petri yang telah berisi media Sea Water Complete (SWC), kemudian diinkubasi pada suhu 26oC selama 24 - 36 jam dan diamati pertumbuhan koloni bakteri yang
15
tumbuh pada media tersebut. Untuk mengisolasi bakteri dari permukaan luar menggunakan swab steril (Wahl et al. 1994). Swab steril diusapkan pada permukaan luar spons, kemudian dicelupkan ke dalam botol pengenceran yang berisi PBS steril dengan perbandingan 1 : 1. Selanjutnya, dari suspensi tersebut dibuat pengenceran 10-1 sampai 10-7. Pada pengenceran 10-5, 10-6, dan 10-7 dipipet 0,1 ml secara aseptik dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi media SWC, kemudian diinkubasi pada suhu 26oC selama 24 - 36 jam dan diamati pertumbuhan koloni bakterinya. Setiap koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna dan bentuk koloni, serta dimurnikan dengan menggunakan media yang sama. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Bioaktif (Antibakteri dan Antikhamir) Pengujian Aktivitas Antibakteri. Metode ini dilakukan dengan teknik bilayer yaitu, kultur cair bakteri uji yang telah diinkubasi selama 18 jam, diambil sebanyak 1ml lalu dimasukkan ke dalam 100 ml media SWC steril. Campuran antara kultur bakteri dan media SWC sebagai lapisan kedua dituangkan ke dalam cawan petri yang telah berisi dengan media SWC yang telah padat (lapisan pertama). Setelah padat, isolat bakteri yang telah murni digoreskan pada permukaan media yang telah mengandung kultur bakteri uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Senyawa bioaktif antibakteri yang dihasilkan diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni isolat murni. Pengujian Aktivitas Antikhamir. Metode yang dilakukan sama dengan pengujian antibakteri yaitu dengan teknik bilayer. Kultur cair Candida yang telah diinkubasi selama 24 jam, diambil sebanyak 1ml lalu dimasukkan ke dalam 100 ml media PDA (Potato Dextrose Agar) steril. Campuran antara kultur khamir dan media PDA sebagai lapisan kedua dituangkan ke dalam cawan petri yang telah berisi dengan media PDA yang telah padat (lapisan pertama). Setelah padat, isolat yang telah murni digoreskan pada permukaan media yang telah mengandung kultur khamir, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Senyawa bioaktif antibakteri yang dihasilkan diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni isolat yang digoreskan murni maka dapat menghambat pertumbuhan khamir uji.
16
Pewarnaan Gram dan Uji Parsial Karakterisasi tambahan yang dilakukan pada isolat bakteri yang menghasilkan senyawa bioaktif yaitu dengan pewarnaan Gram. Isolat yang menghasilkan Gram positif dilanjutkan dengan identifikasi parsial yang merujuk ke kelompok Bacillus yaitu dengan pewarnaan spora dan uji katalase. Analisis Molekuler Gen 16S rRNA Isolasi Genom. 30 Isolat bakteri yang menunjukkan kemampuan antibakteri dan antikhamir masing-masing ditumbuhkan pada media SWC dan diinkubasi shaker selama 24 jam, dengan komposisi media 5 gr/l bacto pepton, 1 gr/l yeast extract dan 3 ml/l glycerol. Isolat bakteri yang telah ditumbuhkan pada media SWC diambil sebanyak 1,5 ml dan disentrifugasi (18.000xg) selama 10 menit untuk mendapatkan pelet bakteri. Pelet ini digunakan untuk mengekstraksi DNA genom dengan metode standar (Sambrook & Russel 2001). Setelah disentrifugasi supernatannya dibuang dan ditambahkan ke dalamnya buffer Tris-EDTA (TE) sebanyak 250 μl, lalu disentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit. Supernatannya dibuang dan dilakukan resuspensi dengan TE sebanyak 2 kali. Ditambahkan dengan 250 μl TE dan 5 μl lisozym, lalu tabung eppedorf dibolakbalik dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Larutan TE dan lisozym dibuang, kemudian diganti 500 μl SDS 10% dan 10 μl proteinase K lalu tabung dibolakbalik dan diinkubasi selama 37oC selama 60 menit. Larutan SDS dan proteinase K diganti dengan 80 μl NaCl dan 100 μl CTAB 10% lalu diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65oC. Setelah inkubasi larutan sebelumnya diganti dengan 650 μl PCl lalu dikocok kuat dan disentrifugasi 14000 rpm selama 10 menit. Bagian atas atau fase aquosenya dipindahkan ke tabung ependorf baru lalu ditambahkan 650 μl CI dan disentrifugasi 14000 rpm selama 10 menit. Larutan sebelumnya diganti dengan etanol absolut 2X vol; Na asetat 3 M 0,1 vol lalu diinkubasi frezeer selama semalam. Setelah diinkubasi semalam etanol 2X vol; Na asetat 3 M 0,1 vol diganti dengan etanol 70% dingin sebanyak 1 ml lalu disentrifuges 14000 rpm selama 15 menit. Supernatannya dibuang lalu pelet dikering udarakan selama semalam. Setelah dikering udarakan selama semalam pelet ditambahkan dengan ddH2O sebanyak 20 μl.
17
Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR. Amplfikasi gen 16S rRNA digunakan (PCR Perkin Elmer 2400), dengan menggunakan primer 63f (5’CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’)
(Marchesi
dan et
1387r al
1998)
(5’yang
akan
memperbanyak fragmen pada target sekitar 1300 pb. Total volume reaksi yang digunakan adalah 25 μl, terdiri atas 12,5 μl 2x GC Buffer, 4 μl dNTPs, masingmasing 1 μl primer 63f dan 1387r, 0,25 Taq polimerase, 4 μl DNA template dan 2,25 μl aquabidest steril. Kondisi PCR pada pra denaturasi pada suhu 95oC selama 5 menit; untuk siklus 30, denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, anneling pada suhu 54oC selama 30 detik, polimerisasi pada suhu 72oC selama 30 detik dan post PCR pada suhu 72oC selama 7 menit. Produk PCR dapat diketahui dengan elektroforesis pada gel agarose 10% (wt/vol) selama 45 menit pada 70V/cm dengan TAE buffer 1X. Produk PCR selanjutnya dipurifikasi dengan menggunakan kit purifikasi (Promega, USA) sesuai dengan instruksi pemakaian. Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Setiap hasil purifikasi produk PCR gen 16S rRNA dipotong dengan menggunakan empat enzim restriksi yaitu RsaI, HaeIII, dan HinfI (Fermentas, Life Science). Volume reaksi tiap-tiap enzim restriksi terdiri atas 5 μl amplicon (1.5 μg), 2 μl buffer Tango 10X, 2 U/μl enzim restriksi, dan ddH2O hingga volume 20 μl, kemudian diinkubasi selama 3 – 4 jam pada suhu 37oC. Inaktivasi enzim dilakukan dengan menginkubasi pada suhu 65oC selama 20 menit. Produk restriksi selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose 1% (wt/vol) selama 45 menit pada 70V/cm dalam buffer TAE 1X. fragmen-fragmen dari hasil pemotongan pita gen 16S rRNA tiap-tiap isolat dibuat data biner dan dianalisis menggunakan software Treecon pada windows ver1.3b (Van de Peer dan De Watcher 1994). Sekuensing Gen 16S rRNA dan Analisis Filogenetik. Sekuensing gen 16S rRNA dilakukan di PT Charoen Phokpand Indonesia, terhadap enam isolat terpilih (SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43) dengan menggunakan metode dideoksi Sanger. Analisis sekuen gen 16S rRNA dilakukan dengan program BlastN yang terdapat di NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
18
Sekuen gen 16S rRNA disejajarkan dengan menggunakan program clustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw/). Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan program Treecon 1,3b (Van de Peer dan De Watcher 1994).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Isolasi Bakteri dari Sampel Spons Hasil isolasi diperoleh 138 isolat bakteri masing-masing 70 isolat bakteri endofit dan 68 isolat bakteri permukaan, yang ditandai dengan warna dan bentuk koloni yang berbeda-beda (Gambar 3 dan 4). Seluruh isolat tersebut dikumpulkan lalu diamati warna dan morfologi koloninya. Profil koloni isolat endosimbion dan ektosimbion dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2. Pemberian nama isolat berdasarkan asal sampel dimana bakteri-bakteri tersebut diisolasi, SAB E-1 yang berarti Sponge – Assosiated Bacteria Endofit-1 (nomor urut isolat) yaitu bakteri yang diisolasi dari bagian endofit spons, serta SAB S-1 yang berarti Sponge – Assosiated Bacteria Surfaces-1 (nomor urut isolat) yaitu bakteri yang diisolasi dari bagian surfaces (permukaan) spons. Isolat-isolat bakteri endofit dan surface hasil isolasi diduga memiliki aktivitas antimikrob, yang selanjutnya dilakukan uji lanjut untuk mengetahui sifat antimikrobnya. Penapisan Isolat Penghasil Senyawa Bioaktif (Antibakteri dan Antikhamir) Penapisan ini dilakukan secara kualitatif dengan menggunakan dua kelompok mikroorganisme unicelluler target yaitu bakteri (prokariotik) dan khamir (eukariotik). Hasil penapisan menunjukkan beberapa isolat bakteri endofit dapat menghambat pertumbuhan bakteri target dan khamir target sekaligus, meskipun dengan kemampuan yang berbeda-beda. Isolat-isolat tersebut antara lain isolat SAB E-8, SAB E-31, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-36, SAB E37, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB E-41 (Tabel 1). Hasil uji aktivitas antibakteri isolat-isolat tersebut baik terhadap pertumbuhan bakteri uji maupun pertumbuhan khamir uji berupa zona bening yang terbentuk, masing-masing dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6. Pengujian aktivitas antibakteri dan antikhamir yang dilakukan pada isolat bakteri permukaan juga merupakan penapisan awal. Adanya aktivitas antibakteri dan antikhamir ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar goresan isolat bakteri permukaan. Hasil pengujian isolat bakteri permukaan dapat dilihat pada Tabel 2.
20
cm
cm
Gambar 3. Penampilan koloni bakteri ektosimbion hasil isolasi dari spons Jaspis sp pada Medium SWC, setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC.
cm
cm
Gambar 4. Penampilan koloni bakteri endosimbion hasil isolasi dari spons Jaspis sp pada Medium SWC, setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC.
21
Tabel 1. Aktivitas antibakteri dan antikhamir isolat-isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. N o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Isolat SAB E-5 SAB E-7 SAB E-8 SAB E-13 SAB E-14 SAB E-16 SAB E-23 SAB E-25 SAB E-26 SAB E-31 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-35 SAB E-36 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-39 SAB E-40 SAB E-41 SAB E-42 SAB E-43 SAB E-45 SAB E-47 SAB E-49 SAB E-54 SAB E-56 SAB E-57 SAB E-58 SAB E-65 SAB E-66 SAB E-67 SAB E-68
Sa Sa* + ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ + ++ + +++ ++ + + +++ + ++ ++ + ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ + ++ ++
Bakteri Uji Vh# Ec EPEC* ++ + + ++ + ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + ++ + -
Pa* +++ +++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ -
Khamir Uji Cal* Ctro* + + ++ ++ ++ ++ + +++ +++ ++ ++ + +++ +++ ++ +++ + ++ + -
Sa :Staphylococcus aureus; Sa* :Staphylococcus aureus; Vh#: Vibrio harveyii; Ec :Escherichia coli; EPEC* K-11 :Escherichia coli; Pa* :Pseudomonas aeruginosa; Cal* :Candida albicans ; Ctro* :Candida tropicalis; *) : Patogen manusia; #) : Patogen udang: + :1 – 5 mm; ++ :6 – 10 mm ; +++ :11 – 15 mm; - : Tidak dihasilkan senyawa antimikrob.
22
a
c
b 26 13
8
35
40
36
35
36
33
cm
cm
cm
e
d
f 31
40
38
38
37 40
32 36
8
cm
cm
cm
Gambar 5. Senyawa antibakteri yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari beberapa isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. terhadap pertumbuhan bakteri a. S. aureus, b. V. harveyii, c. E. coli, d. EPEC-K11, e. P. aeruginosa dan f. S. aureus.
b
a
38
38
35
35
cm
cm
Gambar 6. Senyawa antikhamir yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. SAB E-35 dan SAB E-38 terhadap pertumbuhan khamir a. C. albicans dan b. C. tropicalis.
23
Tabel 2. Aktivitas antibakteri dan antikhamir isolat-isolat bakteri permukaan asal spons Jaspis sp. N o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Isolat SAB S-6 SAB S-7 SAB S-15 SAB S-21 SAB S-30 SAB S-32 SAB S-34 SAB S-37 SAB S-40 SAB S-41 SAB S-43 SAB S-47 SAB S-52 SAB S-53 SAB S-59 SAB S-60 SAB S-61 SAB S-62 SAB S-65 SAB S-66
Sa Sa* +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ + +++ ++ ++ -
Bakteri Uji Vh# Ec EPEC* +++ + + + + ++ + ++ + ++ + + ++ + + + -
Pa* ++ +++ +++ +++ +++ -
Khamir Uji Cal* Ctro* -
Sa :Staphylococcus aureus; Sa* :Staphylococcus aureus; Vh#: Vibrio harveyii; Ec :Escherichia coli; EPEC* K-11 :Escherichia coli; Pa* :Pseudomonas aeruginosa; Cal* :Candida albicans ; Ctro* :Candida tropicalis; *) : Patogen manusia; #) : Patogen udang: + :1 – 5 mm; ++ :6 – 10 mm ; +++ :11 – 15 mm; - : Tidak dihasilkan senyawa antimikrob
24
Beberapa isolat bakteri permukaan mampu menghambat
beberapa
pertumbuhan bakteri uji namun tidak satupun isolat bakteri permukaan mampu menghambat C. albicans dan C. tropicalis (Tabel 4). Isolat-isolat tersebut adalah SAB S-6, SAB S-15, SAB S-30, SAB S-32, SAB S-41 dan SAB S-43, dimana terdapat zona bening disekitar pertumbuhan isolat-isolat tersebut (Gambar 7). Pada Tabel 2 dan 3 menunjukkan semua isolat bakteri endofit dan permukaan tidak memperlihatkan adanya aktivitas dalam menghambat pertumbuhan terhadap bakteri B. subtillis. Aktivitas antibakteri dari semua isolat bakteri endofit dan permukaan terhadap pertumbuhan bakteri E. coli dan EPEC*-K11, hampir semuanya membutuhkan waktu yang lama hingga terbentuk zona bening. Waktu inkubasi yang dibutuhkan hingga terbentuk zona bening rata-rata adalah 5 x 24 jam. Pewarnaan Gram dan Uji parsial Pewarnaan Gram dan uji parsial dilakukan hanya pada beberapa isolat yang memiliki aktivitas yang baik dalam menghambat pertumbuhan bakteri dan khamir target. Isolat-isolat tersebut adalah SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 karena mampu menghambat minimal lima mikroba uji dengan kemampuan penghambatan yang baik. Pewarnaan Gram menunjukkan isolat SAB E-8, SAB E-35, dan SAB E-40 adalah bakteri kelompok Gram negatif (Gambar 8). Hasil pewarnaan Gram positif pada isolat SAB E-33, SAB E-38, dan SAB S-43 dilanjutkan dengan uji parsial.
25
b
a 6
c 6
41 43
43
43 41 cm
41
15
cm
cm
Gambar 7. Senyawa antibakteri yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari beberapa bakteri permukaan asal spons Jaspis sp. terhadap pertumbuhan a. S. aureus, b. V. harveyii dan c. P. aeruginosa.
a.
b.
cm
(B)
(A)
Gambar 8. A. Profil koloni pada media SWC dan B. Hasil pewarnaan bakteri Gram negatif isolat SAB E-35.
Identifikasi parsial yang mengarahkan isolat yang memiliki gram positif adalah dari kelompok Bacillus meliputi pewarnaan Gram, pewarnaan spora dan uji katalase (Gambar 9). a.
b.
c.
Endospora cm
(A)
(B)
(C)
Gambar 9. Uji parsial genus Bacillus untuk isolat bakteri gram positif (SAB S-43); A. Profil koloni pada media SWC; B. Pewarnaan Gram; C. Pewarnaan Spora.
26
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) Berdasarkan hasil uji antimikroba, diperoleh 30 isolat yang memiliki aktivitas antimikroba yang terdiri dari 24 isolat bakteri endofit dan 6 isolat bakteri yang berasal dari permukaan. Isolat yang terpilih akan digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar bakteri dengan metode ARDRA. Ekstraksi genom seluruh isolat dilanjutkan dengan amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR yang menunjukkan produk PCR gen 16S rRNA sekitar 1300pb (Gambar 10) Gen 16S rRNA hasil amplifikasi PCR didigesti dengan tiga enzim restriksi yaitu RsaI, HaeIII dan HinfI. Hasil restriksi memperlihatkan pola pita gen 16S rRNA (profil) yang beragam dengan jumlah 2 – 4 pita. Hasil restriksi gen 16S rRNA dari beberapa isolat yang dipotong dengan RsaI, HaeIII dan HinfI dapat dilihat pada Gambar 11, sedangkan hasil interpretasi profil pola pemotongan untuk ke 30 isolat dengan ARDRA memperlihatkan lebih banyak variasi pola dan jumlah pita berdasarkan enzim restriksi yang digunakan, yaitu RsaI (Gambar 12), HaeIII (Gambar 13) dan HinfI (Gambar 14). Berdasarkan profil gen 16S rRNA tersebut, dibuat pohon filogenetik untuk melihat kelompok filotipe dari seluruh isolat terbaik. Hasil restriksi gen 16S rRNA dengan tiga enzim restriksi dipadukan dan ditransfer menjadi sebuah hitungan biner (nilai 1 dan 0) berdasarkan keberadaan pita potongan DNA pada ukuran panjang tertentu (Tabel 3). Data biner ini mempermudah dalam pembuatan pohon filogenetik. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program Treecon versi 1.3b (Gambar 15.)
27
8
(pb)
13 16
33 35
38
40
6 15
43 M
(pb)
4000 3500 3000 2500
1300 pb
Gambar 10. Amplifikasi gen 16S rRNA dari beberapa isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik, M: standar ukuran molekul DNA 1kb ladder.
28
(pb)
(A)
(pb)
1500
1500
1000
1000
750
750
500
500
250 (pb)
(B)
M 8 13 16 31 37 47 56 58 59 65 66 6’ 15’ M
RsaI M 8 13 16 31 37 47 56 58 59 65 66 6’ 15’ M
250 (pb)
1500
1500
1000
1000
750
750
500
500
250
250
HaeIII (pb)
(C)
1500
(pb) 1500
1000
1000
750
750
500
500
250
M 8 13 16 31 37 47 56 58 59 65 66 6’ 15’ M
HinfI
250
Gambar 11. Elektroforesis gel agarose gen 16S rRNA dari beberapa isolat bakteri asal spons Jaspis sp. yang mempunyai aktivitas antimikroba terbaik yang dipotong dengan Enzim RsaI (A), HaeIII (B) dan HinfI (C). M: standar ukuran molekul DNA (1kb ladder).
29
SAB E-8 SAB E-13 SAB E-14 SAB E-16 SAB E-23 SAB E-25 SAB E-26 SAB E-31 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-35 SAB E-36 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-40 SAB E-41 SAB E-47 SAB E-54 SAB E-56 SAB E-58 SAB E-59 SAB E-65 SAB E-66 SAB E-67 SAB S-6 SAB S-15 SAB S-30 SAB S-32 SAB S-41 SAB S-43
Gambar 12. Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. yang dipotong dengan enzim restriksi RsaI .
30
SAB E-8 SAB E-13 SAB E-14 SAB E-16 SAB E-23 SAB E-25 SAB E-26 SAB E-31 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-35 SAB E-36 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-40 SAB E-41 SAB E-47 SAB E-54 SAB E-56 SAB E-58 SAB E-59 SAB E-65 SAB E-66 SAB E-67 SAB S-6 SAB S-15 SAB S-30 SAB S-32 SAB S-41 SAB S-43
Gambar 13. Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. yang dipotong dengan enzim restriksi HaeIII.
31
SAB E-8 SAB E-13 SAB E-14 SAB E-16 SAB E-23 SAB E-25 SAB E-26 SAB E-31 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-35 SAB E-36 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-40 SAB E-41 SAB E-47 SAB E-54 SAB E-56 SAB E-58 SAB E-59 SAB E-65 SAB E-66 SAB E-67 SAB S-6 SAB S-15 SAB S-30 SAB S-32 SAB S-41 SAB S-43
Gambar 14. Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. yang dipotong dengan enzim restriksi HinfI.
32
Tabel 3. Ukuran fragmen DNA gen 16S rRNA yang dipotong dengan beberapa enzim restriksi
Isolat SAB E-8 SAB E-13 SAB E-14 SAB E-16 SAB E-23 SAB E-25 SAB E-26 SAB E-31 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-35 SAB E-36 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-40 SAB E-41 SAB E-47 SAB E-54 SAB E-56 SAB E-58 SAB E-59 SAB E-65 SAB E-66 SAB E-67 SAB S-6 SAB S-15 SAB S-30 SAB S-32 SAB S-41 SAB S-43
Ukuran fragmen DNA (pb) yang dipotong dengan enzim restriksi RsaI HaeIII HinfI 520;420;420 630;460;260 600;380;290 520;440;410 640;470;270 600;380;290 600;350;350 640;500;300 950;500 520;440;410 640;470;280 610;390;300 600;350;350 650;500;300 940;500 600;350;350 750;330;200 1020;530 600;350;350 650;500;300 1000;500 540;440;540 650;490;320 610;400;310 540;440;540 650;500;300 950;500 600;350;350 490;350;320;150 600;500;340 550;500;300 550;400;200 800;490 550;500;300 640;490;290 800;490 540;440;540 650;490;320 620;400;310 510;460;460 610;510;330 600;410;350 510;480;430 550;350;250;150 600;400;340 510;480;430 550;350;250;150 600;400;340 540;460;420 650;490;280 620;390;300 510;480;450 550;360;250;150 600;400;350 530;460;410 550;370;320;150 650;500;300 530;450;410 550;370;200;150 650;400;290 530;450;410 550;370;200;150 650;400;290 530;430;430 650;490;320 610;380;290 520;420;420 640;470;280 590;370;270 510;480;430 550;360;250;150 600;400;350 520;420;420 640;470;280 590;370;280 520;420;420 640;470;270 590;370;280 510;460;460 610;500;320 600;400;350 510;460;460 610;500;320 600;400;350 510;450;450 600;500;320 590;400;350 510;450;450 600;500;320 590;400;350
33
Filotipe I
Filotipe II
Filotipe III
Filotipe IV
Filotipe V
Filotipe VI
Filotipe VII Gambar 15. Pohon filogenetik (internode rooted) hubungan kekerabatan antar isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dengan aktivitas antimikrob terbaik yang dianalisis dengan ARDRA dan dikonstruksi berdasarkan metode Neighbor-Joining. Angka 10% pada bagian atas pohon menunjukkan skala persentase perbedaan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 100 ulangan.
34
Hasil konstruksi pohon filogenetik berdasarkan ARDRA menghasilkan tujuh filotipe. Pengelompokan tersebut berdasarkan adanya kesamaan situs pemotongan tiap isolat setelah dipotong dengan tiga enzim restriksi yang berbeda. Filotipe V adalah kelompok yang paling besar yaitu terdiri dari 9 isolat sedangkan filotipe VII hanya terdiri dari satu isolat saja, yaitu isolat SAB E-8. Analisis Sekuens Gen 16S rRNA Analisis ini dilakukan terhadap enam isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik, yaitu SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43. Hasil BlasN menunjukkan tidak ada dominasi spesies dengan identitas maksimum untuk semua isolat berada diatas 97% dan nilai E yang dihasilkan semua isolat pada hasil BlastN bernilai 0 (Tabel 4). Sekuensing gen 16S rRNA menunjukkan keenam isolat terbaik terbagi menjadi dua genus yaitu Pseudomonas (isolat SAB E-8, SAB E-35, SAB E-40 ) dan Bacillus (isolat SAB E-33, SAB E-38, dan SAB S-43). Hasil pohon filogenetik menggunakan data sekuen gen penyandi 16S rRNA isolat dengan aktivitas antimikrob terbaik dan beberapa galur acuan (reference strains) menunjukkan adanya kemiripan. SAB-35 berdekatan secara evolusi dengan Pseudomonas sp. J451, dengan nilai boostrap 56% dan tidak berada dalam satu kelompok dengan isolat lainnya. Lima isolat lainnya berada dalam satu kelompok yang sama, serta memiliki kedekatan dengan beberapa galur acuan yaitu SABS-43 dan SABE-33 dengan Bacillus sp. EGU72 sedangkan
SAB
E-38
dengan
Bacillus
sp.
D203
(Gambar
16).
Tabel 4. Identitas 6 isolat penghasil senyawa antimikrob terbaik yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. berdasarkan sekuens gen 16S rRNA Kode Isolat
Kemiripan
Identitas maksimum
No Akses
SAB E-8
Pseudomonas sp. HN-07
98%
FJ919375.1
SAB E-33
Bacillus sp. strain K3
98%
EU266581.1
SAB E-35
Pseudomonas sp. LPK2
97%
GQ217532.1
SAB E-38
Bacillus pumilus strain 210-50
99%
GQ199752.1
SAB E-40
Pseudomonas sp.LD116
98%
AM913904.1
SAB S-43
Bacillus sp.E287
98%
FJ430065.1
35
P. tunicata U11 P. phenolica Vibrio sp. F-6 Pseudomonas sp. 79 SAB E-35 Pseudomonas sp. J451 Amylocopsis arifamicina DSM4695
Bacillus subtilis 13-2 Bacillus subtilis W51 Bacillus subtilis W102 Pseudomonas sp. D116 Bacillus sp. T050418-863 Bacillus sp. EGU724 SAB S-43 SAB E-33 SAB E-38 Bacillus subtilis D203 Bacillus pumilus BBT84 Bacillus pumilus GSP61AY505512 SAB E-40 SAB E-08
Gambar 16. Pohon filogenetik berdasarkan hasil sekuensing gen 16S rRNA enam isolat bakteri dengan aktivitas antimikrob terbaik asal spons Jaspis sp. yang dikonstruksi berdasarkan metode Neighbor-Joining. Angka 10% pada bagian atas pohon menunjukkan skala persentase perbedaan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 100 replikasi.
36
37
Pembahasan Isolasi dan Bentuk Asosiasi Bakteri dan Spons Spons adalah organisme sesil yang menghasilkan senyawa metabolik untuk mengendalikan predator, kompetitor, organisme fouling, dan mikroba. Namun menariknya, pada beberapa penelitian diketahui bahwa sejumlah senyawa metabolik tersebut dihasilkan oleh mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons inangnya. Penelitian ini merupakan salah satu upaya untuk mengetahui keberadaan dan potensi bakteri yang diisolasi dari spons Jaspis sp. dalam menghambat pertumbuhan beberapa bakteri dan khamir patogen. Penelitian sebelumnya Rachid et al. (2006) berhasil mengisolasi deltaproteobakteri yaitu Chondromyces crocatus yang memiliki struktur kimia yang sama dengan Jaspamide yang dihasilkan oleh spons Jaspis sp. (Zampella et al. 1999). Pada penelitian ini diperoleh 138 isolat bakteri hasil isolasi yang memiliki potensi penghasil senyawa antimikrob yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp., yaitu 70 isolat yang diisolasi pada bagian endofit dan 68 isolat pada bagian permukaan. Bakteri yang berasosiasi dengan spons tersebut dapat berasal dari lingkungan perairan dimana spons berada atau merupakan mikrobial simbion spons pada saat masih tahap larva. Bakteri sebagai simbion dari spons dapat berperan sebagai sumber makanan, patogen atau parasit dan sebagai simbion mutualistik. Salah satu bentuk simbion mutualisme antara bakteri dan spons ditunjukkan dengan adanya produksi senyawa golongan Quinolon yang memiliki aktivitas antimikrobial dan cytotoksin oleh bakteri Pseudomonas sp. yang berasosiasi dengan spons Homophinia sp. yang berasal dari lautan pasifik (Burja et al. 1999). Isolat bakteri dengan aktivitas antimikroba yang berada pada bagian permukaan dan mesohyl (endofit) diduga adalah bakteri yang memiliki bentuk asosiasi dengan spons Jaspis sp. Bentuk asosiasi antara spons dan bakteri dapat terjadi dengan dua cara yaitu transmisi secara horizontal dan vertikal. Transmisi horizontal merupakan bentuk asosiasi spons dengan bakteri yang berada disekitar habitat spons akibat proses filteer feeding. Transmisi vertikal adalah bentuk asosiasi antara bakteri dan spons saat spons berada pada tahap larva. Mekanisme vertikal
38
transmisi diawali saat bakteri mulai berpenetrasi ke dalam oocytes melalui endositosis, saat terjadi pembelahan bakteri akan berada antara blastomer atau didalam vakuola. Pada tahap blastula semua bakteri akan dibawah ke blastocoel, selanjutnya bakteri simbion akan berada pada bagian intraseluler pada tahap larva dan tahap metamorfosis (Ereskovly et al., 2005). Isolat bakteri yang berasal dari permukaan dan memiliki aktivitas antimikrob diduga adalah bakteri yang memiliki kemampuan untuk melindungi spons dari patogen, predator dan biofouler. Menurut Osinga et al. (2001), bakteri simbion pada spons berpotensi untuk menghasilkan produk senyawa kimia seperti antibiotik dan antifungal yang dapat menekan predasi dan terjadinya fouling. Isolat Penghasil Senyawa Bioaktif (Antibakteri dan Antikhamir) Berdasarkan hasil pengujian antimikrob, 32 (45,71%) dari total isolat bakteri endofit mempunyai aktivitas antimikrob. Beberapa isolat bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri dan khamir target dengan baik yaitu isolat SAB E8, SAB E-31, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-36, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB E-41. Pada bakteri permukaan, 20 (29,41%) dari total isolat bakteri permukaan juga memiliki aktivitas antimikrob, yaitu mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji namun tidak satupun isolat bakteri permukaan mampu menghambat C. albicans dan C. tropicalis. Isolat bakteri permukaan yang memiliki aktivitas antimikrob adalah SAB S-6, SAB S-15, SAB S-30, SAB S-32, SAB S-41 dan SAB S-43. Isolat bakteri permukaan dan endofit tersebut menunjukkan aktivitas antimikrob yang baik karena mampu menghambat pertumbuhan minimal tiga mikrob target dengan kemampuan penghambatan yang baik. Meskipun jumlah isolat bakteri yang berasal dari permukaan hampir sama dengan isolat bakteri endofit, namun aktivitas antimikrob isolat bakteri permukaan lebih rendah dibandingkan isolat bakteri endofit. Berdasarkan Tabel 1 dan 2, jumlah isolat yang mempunyai aktivitas antimikrob dan jumlah mikrob target yang dapat dihambat pertumbuhannya, isolat bakteri yang berasal dari bagian endofit spons Jaspis sp. lebih banyak dibandingkan isolat bakteri yang diisolasi dari permukaan.
39
Menurut Magnino et al. (1999) bakteri simbion yang berasal dari bagian endofit yaitu mesohyl umumnya memiliki populasi yang berlimpah dan merupakan mikroba yang spesifik dari spons inangnya karena sebagian besar dari bakteri endofit berasosiasi dengan spons secara transmisi vertikal. Sekitar 75% kelompok bakteria dijumpai pada bagian mesohyl spons antara lain yaitu bakteria heterotropik, bakteri fotosintesis seperti cyanobakteria, dan bakteri non fotosintesis seperti bakteri sulfur. Ketersediaan jumlah dan komponen nutrisi yang lebih bervariasi diduga juga merupakan salah satu faktor mengapa populasi bakteri endofit lebih banyak dibandingkan yang berasal dari
permukaan. Populasi bakteri endofit yang lebih
heterogen memicu terjadinya kompetisi diantara kelompok bakteri yang terdapat pada bagian endofit spons, hal ini menyebabkan bakteri endofit memiliki karakteristik antimikrobial yang berspektrum luas dibandingkan isolat bakteri permukaan. Bakteri simbion yang berasal dari permukaan spons populasinya lebih sedikit diduga karena ketersediaan nutrisi dan membutuhkan daya pertahanan yang lebih tinggi untuk mengatasi predator, kompetitor ataupun biofouler. Bakteri permukaan juga merupakan bakteri yang tidak spesifik dengan inangnya dan memiliki kemiripan dengan komunitas mikrob yang berada di lingkungan perairan dimana spons tersebut berada. Bakteri ini menggunakan signal quorum sensing untuk untuk berinteraksi dengan spons. Kebanyakan bakteri Gram negatif menggunakan acyl homoserine lactone (AHL) sebagai media untuk berkomunikasi dengan bakteri lainnya hingga mencapai kepadatan tertentu hingga dapat berasosiasi dengan organisme eukariot laut seperti spons, (Taylor et al. 2004). Hasil penapisan terhadap semua isolat yang berasal dari endofit dan permukaan menghasilkan ada enam isolat yang mampu menghambat pertumbuhan semua mikrob target yang digunakan dalam uji antibakteri dan antikhamir. Enam isolat tersebut terdiri dari lima isolat bakteri endofit yaitu SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40 serta satu isolat bakteri permukaan yaitu SAB S-43. Bakteri target yang digunakan meliputi bakteri gram negatif dan gram positif. Staphylococcus aureus sebagai bakteri target gram positif terdiri dari dua jenis yaitu yang patogen dan non patogen. S. aureus non patogen mampu dihambat oleh ke enam
40
isolat terbaik dengan aktivitas sedang hingga besar, sedangkan untuk S. aureus pathogen, keenam isolat hanya mampu menghambat dengan aktivitas kecil hingga sedang. Bakteri target gram negatif yang digunakan yaitu Vibrio harveyi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan EPEC K-11. Isolat V. harveyi yang digunakan adalah bakteri patogen pada ikan dan udang, P. aeruginosa dan EPEC K-11 adalah bakteri patogen pada manusia dan E. coli adalah bakteri non patogen. Bakteri laut yang diisolasi dari berbagai organisme seperti spons, bivalvia, makroalga dan sedimen memperlihatkan aktivitas antagonis terhadap beberapa bakteri pathogen seperti S. aureus, P. aeruginosa, Vibrio cholera dan E. coli (Hentcel et al. 2001 ; Jayanth et al. 2002). Pengujian terhadap organisme eukariot dilakukan terhadap khamir Candida albicans dan C. tropicalis. Kedua jenis khamir tersebut merupakan flora normal pada manusia yang dapat dijumpai di kulit, mulut, usus dan membran mukosa. Pertumbuhan yang tidak terkendali dapat menyebabkan kandidiasis pada manusia hingga mengakibatkan kematian. Berdasarkan hasil uji antagonis terhadap C. albicans dan C. tropicalis, isolat SAB E-33, SAB E-38 dan SAB E-40 yang memperlihatkan aktivitas antagonis yang baik. Pseudomonas proteolytica yang diisolasi dari perairan laut sekitar spons menunjukkan aktivitas antagonistik dalam menghambat pertumbuhan C. albicans (Romanengko et al., 2008). Kemampuan isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dalam menghambat pertumbuhan mikroba target, merupakan bentuk aktivitas antagonis yang diduga dilakukan dengan menghasilkan kandungan senyawa yang bersifat antimikrobial. Biosintesis senyawa antimikrobial berperan penting dalam proses pelekatan, kolonisasi target hingga kompetisi dalam mendapatkan ruang dan nutrisi dengan mikroba lainnya (Loong & Farook, 2001; Romanengko et al., 2008). Bakteri-bakteri target yang digunakan pada umumnya patogen terhadap manusia kecuali bakteri Vibrio harveyi yang patogen terhadap udang. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, EPEC K-11 merupakan bakteri-bakteri yang dapat menyebabkan penyakit yang berbahaya. S.aureus menghasilkan koagulase yang dianggap mempunyai potensi menjadi patogen invasif, P. aeruginosa adalah patogen opurtinistik yaitu mampu memanfatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang
41
untuk memulai terjadinya infeksi, EPEC K-11 adalah isolat yang dapat menyebabkan diare pada anak-anak yang berumur di bawah 5 tahun, sedangkan V. harveyi adalah isolat yang menyebabkan penyakit bintik putih pada udang. Candida albicans dan C. tropicalis adalah khamir yang dapat menyebabkan infeksi pada kulit atau selaput lendir bersifat akut atau subakut yang dikenal dengan candidiasis. Beberapa isolat asal spons Jaspis sp. memiliki aktivitas antimikrob yang baik, yaitu mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri dan khamir target. Enam isolat dengan aktivitas antimikrob terbaik adalah SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-43. Keenam isolat tersebut diharapkan dapat menjadi sumber senyawa bioaktif baru yang dapat dikembangkan dalam bidang farmasi dan biomedik. Banyak isolat bakteri baru dengan aktivitas antimikrob yang telah diisolasi dari spons, namun antibiotik baru yang diisolasi dari bakteri laut masih sangat jarang dilaporkan salah satu diantaranya adalah loloatins yang berasal dari Bacillus (Isnansetyo & Yuto 2003). Pengujian fisiologis dilakukan dalam dua metode berdasarkan hasil pewarnaan Gram dari ke enam isolat terbaik. Isolat SAB E-8, SAB E-35 dan SAB E40 dari hasil pewarnaan Gram merupakan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif yaitu isolat SAB E-33, SAB E-38 dan SAB S-43. Uji fisiologis tambahan untuk bakteri Gram positif diarahkan ke kelompok Bacillus dengan melakukan uji parsial yang meliputi pewarnaan Gram, endospora dan katalase. Hasil uji parsial menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut adalah kelompok Bacillus, dicirikan oleh sel yang berbentuk batang, pewarnaan Gram positif, terdapat endospora yang terletak pada bagian sentral dan uji katalase positif. Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) Analisis kekerabatan antara 30 isolat asal spons Jaspis sp. yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan ARDRA. Analisis filogeni dari komunitas mikroba yang menggunakan ARDRA merupakan sebuah metode sederhana yang didasarkan pada hasil pemotongan gen 16S rRNA. Gen 16S RNA mengandung informasi yang dapat dijadikan sebagai biomarker terhadap suatu bakteri. Gen 16S
42
rRNA terdiri dari daerah konservatif yang dapat dijumpai pada semua organisme dan daerah hypervariabel yang unik pada setiap organisme atau organisme yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat (Moyer et al. 1994). Sama halnya hibridisasi dan pelacakan DNA (probing), ARDRA digunakan untuk menganalisis komunitas bakteri pada berbagai lingkungan. Amplifikasi gen 16S rRNA terhadap 30 isolat yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan menggunakan primer spesifik yaitu 63f dan 1387r. Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA menampakkan pita yang berukuran sekitar 1300 pb. Primer 63f dan 1387r yang digunakan merupakan primer untuk gen yang menyandikan 16S rRNA yang telah didesain untuk seluruh domain bakteri. Primer ini dapat digunakan pada kultur murni bakteri maupun sampel alami dimana gen 16S rRNAnya sulit untuk diamplifikasi. Primer 63f dan 1387r cocok digunakan untuk menganalisa keragaman bakteri pada berbagai lingkungan, karena primer ini tidak akan membentuk struktur dupleks dengan ujung 5’ yang dapat dikenali oleh enzim eksonuklease 5’-3’ dan tidak terdapat nukleotida yang terpotong pada ujung 5’ yang mempengaruhi suhu annealing primer (Marchesi et al. 1998). Hasil pemotongan gen 16S rRNA memperlihatkan pola pita gen 16S rRNA yang beragam dengan jumlah pita 2-4. Profil pita gen 16S rRNA yang beragam dihasilkan setelah didigesti dengan tiga enzim restriksi yaitu RsaI, HaeII dan HinfI. Ketiga enzim restriksi tersebut memiliki situs dan sifat pemotongan yang berbedabeda. Enzim HinfI merupakan enzim yang memotong secara sticky end, dengan situs pemotongan 5’…G↓ANTC…3’ dan 3’…CTNA↑G…5’. Enzim restriksi RsaI dan HaeIII ialah enzim restriksi yang memotong secara blunt end. Situs pemotongan pada RsaI yaitu 5’…GT↓AC…3’ dan 3’…CA↑TG…5’, sedangkan HaeIII yaitu 5’…GG↓CC…3’ dan 3’…CC↑GG…5’. Pola hasil pemotongan gen 16S rRNA dapat dijadikan pustaka baku yang dapat digunakan sebagai referensi (Hall et al. 2001) Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan data Amplified ribosomal DNA restriction analysis mengelompokkan 30 isolat asal spons Jaspis sp.yang memiliki aktivitas antimikrob menjadi tujuh filotipe. Pengelompokkan ini berdasarkan adanya kesamaan situs pemotongan tiap isolat setelah direstriksi oleh tiga enzim restriksi
43
yang berbeda. Filotipe I terdiri dari SAB E-40, SAB E-41, SAB E-54 dan SAB E67, filotipe II terdiri dari SAB E-33, SAB S-41 dan SAB S-43, filotipe III terdiri dari SAB E-33, SAB S-30 dan SAB S-32, filotipe IV terdiri dari SAB E-14, SAB E-23, SAB E-25, SAB E-26 dan SAB E-32, filotipe V terdiri dari SAB E-31, SAB E-35, SAB E-36, SAB E-37, SAB E-47, SAB E-56, SAB E-58, SAB E-59 dan SAB E-65, filotipe VI terdiri dari SAB E-13, SAB E-16, SAB E-66, SAB S-6 dan SAB S-15, serta filotipe VII yang terdiri dari isolat SAB E-8. Filotipe V merupakan kelompok yang terbesar karena terdiri atas sembilan isolat, sedangkan filotipe VII adalah kelompok yang terkecil karena hanya terdiri oleh satu isolat. Pada filotipe V tampak beberapa percabangan dengan nilai bootstrap diatas 60% dan dua diantaranya memiliki nilai bootstrap 100%. Hal ini menunjukkan bahwa diatara kesembilan isolat yang masuk ke dalam felotipe V memiliki situs pemotongan yang sama. Berdasarkan pohon filogenetik menggunakan data ARDRA maka dapat diketahui keragaman genetik isolat bakteri yang memiliki aktivitas mikrob asal spons Jaspis sp. Analisis Sekuens Gen 16S rRNA Hasil BlastN sekuen gen 16S rRNA enam isolat dengan aktivitas mikrob terbaik,
terbagi menjadi dua kelompok filogenetik yang berbeda yaitu genus
Pseudomonas (50%) dan Bacillus (50%). Isolat SAB E-8, SAB E-35, dan SAB E-40 termasuk dalam kelompok Pseudomonas karena ketiga isolat tersebut masing-masing homolog dengan Pseudomonas sp. HN-07, Pseudomonas sp. LPK2 dan Pseudomonas sp.LD116, dengan tingkat identitas maksimum 97% - 98%. Pseudomonas termasuk dalam kelas Gammaproteobakteri, dimana anggota genus dari phylum ini sering dijumpai di perairan laut dan hidup berasosiasi dengan organisme laut seperti spons. Pseudomonas sp. PB1 yang diisolasi dari spons Suberitas domuncula yang masih primordial menunjukkan aktivitas antibakteri, yaitu mampu menghambat pertumbuhan bakteri target yang diisolasi dari sekitar habitat spons S. domuncula (Thakur et al. 2001), demikian pula dengan Pseudomonas sp. IM-1 yang berasosiasi dengan spons Ircinia muscarum menghasilkan senyawa cyclopeptida yang bersifat antibakteri dan antifungal (Mitova et al. 2003).
44
Tingkat identitas maksimum 98% - 99% diperoleh dari tingkat homologi isolat SAB E-33, SAB E-38, dan SAB S-43 dengan isolat yang terdapat dalam GenBank, yaitu masing-masing Bacillus sp. strain K3, Bacillus pumilus strain 210-50, dan Bacillus sp.E287. Berdasarkan survey molekuler pada bakteri yang berasosiasi dengan invertebrat laut seperti spons, Bacillus adalah kelompok bakteri gram positif dan low GC yang sering dijumpai. Selama hidup berasosiasi dengan spons, genus ini mampu menghasilkan senyawa metabolik yang bersifat antibakteri seperti pada Bacillus SB8 dan SB17 asosiasi spons mediterania Aplysina aerophoba dan Aplysina cavernicola mampu menghambat pertumbuhan bakteri target Staphylococcus aureus (Hentschel et al. 2001). Pada konstruksi pohon filogenetik digunakan beberapa galur acuan (reference strains) yang bertujuan untuk mengetahui seberapa dekat hubungan kekerabatan antara isolat SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 dengan reference strains berdasarkan hasil sekuensing gen 16S rRNA. Berdasarkan hasil pohon filogenetik yang menggunakan data sekuen parsial gen 16S rRNA isolat dengan aktivitas antimikrob terbaik dan beberapa galur acuan (reference strains) menunjukkan adanya kedekatan hubungan kekerabatan. diduga termasuk dalam kelas Gammaproteobaktei karena berada dalam satu kelompok sendiri bersama beberapa reference strain Gammaproteobakteri yaitu Pseudoalteromonas tunicata U11, P. phenolica, Pseudomonas sp. 79, Pseudomonas sp. J451, Vibrio sp. E-6, dan Actinobacteri Amycolatopsis ryfamicina DSM4695. Pohon filogenetik menunjukkan SAB-35 berdekatan secara evolusi dengan Pseudomonas sp. J451 dengan nilai boostrap 56%. Pseudomonas sp. J451 adalah strain yang diisolasi dari spons yang hidup di perairan laut dalam dan merupakan koleksi the Harbor Branch Oceanographic Marine Microbial Culture Collection (HBMMCC) (Sfanos et al. 2005). Lima isolat lainnya berada dalam satu kelompok yang sama bersama Bacillus subtilis 13-2, B. subtilis W51, B. subtilis W102, Pseudomonas sp. LD116, Bacillus sp. UST050418-863, Bacillus sp. EGU724, Bacillus sp. D203, B. pumilus BBT84, dan B. pumilus GSP61AY505512. Pohon filogenetik menunjukkan SABS-43 dan
45
SABE-33 memiliki kedekatan kekerabatan dengan Bacillus sp. EGU72 sedangkan SAB E-38 dengan Bacillus sp. D203. Bacillus sp. EGU72 adalah strain yang berasal dari sampel air laut pesisir yang diidentifikasi dengan sekuensing gen 16S rRNA secara parsial (Kalia et al. 2007), sedangkan Bacillus sp. D203 diisolasi dari permukaan alga Delisea pulchra dan Ulva australis yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba (Penesyan et al. 2009).
KESIMPULAN
Sebanyak 138 isolat bakteri simbion spons Jaspis sp. yang masing-masing terdiri dari 70 isolat dan 68 isolat permukaan telah berhasil diisolasi. 32 (45,71%) isolat bakteri endofit dan 20 (29,41%) isolat bakteri permukaan dari total isolat menghasilkan senyawa antimikrob terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Vibrio harveyi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan EPEC K-11 serta khamir Candida albicans dan C. tropicalis. Enam isolat terbaik dari lima isolat endofit yaitu yaitu SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40 serta satu isolat permukaan yaitu SAB S-43. Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan data Amplified rDNA restriction analysis mengelompokan 30 isolat asal spons Jaspis sp. yang memiliki aktivitas antimikrob menjadi tujuh filotipe. Hasil BlastN sekuen gen 16S rRNA enam isolat dengan aktivitas anti mikrob terbaik, terbagi menjadi dua kelompok filogenetik yang berbeda yaitu genus Pseudomonas dan Bacillus.
47 DAFTAR PUSTAKA
Amstrong E, Liming Y, Kenneth GB, Phillip CW, Grant B. 2001. The Symbiotic role of marine on living surfaces. Hydrobiologia 461:37–40, 2001. Arillo A, Bavestrello G, Burlando B, Sara M. 1993. Metabolic integration between symbiotic cyanobacteria and sponges:a possible mechanism. Mar Biol 117:159–162. Barnes R. 1994. Invertebrate Zoology, sixth edition. Sounders College Publishing. New York Blunt JW, Copp BR, Munro MH, Notrhcote PT, Prinsep MR 2006. Marine Natural Products. Nat Prod Rep 23:26-78. Burja AM, Webster N, Murphy P, Russel TH. 1999. Microbial symbionts of Great Barrier Reef sponges. Mem Qld Mus 44:63–75. Cappucino GJ, Sherman N, 2001. Microbiology (A Laboratory Manual). Cummings Publishing Company Inc. New York. Castro P, Huber ME. 2005. Marine Biology. Fifth edition. The Mc Graw Hill Companies. Ereskovsky AV, Elizaveta G, Andrey V. 2005. Morphological evidence for vertical transmission of symbiotic bacteria in the viviparous sponge Halisarca dujardini Johnston (Porifera, Demospongiae, Halisarcida). Mar Biol 146:869–875. Falch EA. 1991. Industrial enzyrres developments inproduction and application. Biotech Adv 9:643-658. Fieseler L, Matthias H, Michael W, Ute H. 2004. Discovery of the novel candidate, phylum Poribacteria in marine sponge. Appl Environ Microbiol 70:3724-3732. Fulvio G, Maria VD, Simona DM, Franco Z, Charles DS, Jean EC, Angela Z. 2007. New jaspamide derivatives with antimicrofilament activity from the sponge Jaspis splendans. Tetrahedron 63:5212- 5219. Goday GW. 1990. The Ecology of chitin degradation. in : K.C. Marshal (Ed). Advan Biotechnol 34:715-719. Hall V, Talbot PR, Stubbs SL, Duerden BI. 2001. Identification of Clinical Isolates of Actinomyces Species by Amplified 16S Ribosomal DNA Restriction Analysis. J Clin Microbiol:3555–3562. Hentschel U, Schmid M, Wagner M, Fieseler L, Gernert C, and Hacker J. 2001. Isolation and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the Mediterranean sponges Aplysina aerophoba and Aplysina cavernicola. FEMS Microbiol Ecol 35:305–312.
48 Hoffmann F, Larsen O, Thiel V, Rapp HT, Pape T, Michaelis W, and Reitner J. 2005. An anaerobic world in sponges. J Geomicrobiol 22:1–10. Hoffmann F, Rapp HT, Reitner J. 2006. Monitoring microbial community composition by fluorescence in situ hybridization during cultivation of the marine cold-water sponge Geodia barretti. Mar Biotechnol 8:373–379. Imhoff JF, Stohr R. 2003. Sponge-assosiated bacteria:general overview and special aspect of the diversity of bacteria assosiated with Halichondria panicea. Mar Mol Biotechnol, 1:35-57. Isnansetyo A, Yuto K. MC21-A, a Bactericidal Antibiotic Produced by a New Marine Bacterium, Pseudoalteromonas phenolica sp. nov. O-BC30T, against MethicillinResistant Staphylococcus aureus. Antimic Agent Chemother 47:480–488. Jayanth K., Jeyasekeran G., Jeya SR. 2002. Isolation of marine bacteria, antagonistic to human pathogen. Indian Mar Sci 31:39-41. Kalia VC, Porwal S, Rani A, Sharma R. 2007. 16S partial sequence of marine coastal water sample (Goa). Unpublished. Kanagasabhapathy M, Hideaki S, Kazuhiko N, Kumiko N, Shinichi N, 2005. Inhibitori ativity of surface bacteria isolated from the marine sponge Pseudoceratia purpurea. Microbes Environ 20:178 – 185. Kelman D, Yoel K, Eugene R, Micha I, Ilan I, Yoss IL, 2001. Antimikrobial activity of the reef sponge Amphimedon viridis from the Red sea: Evidence for Selective Toxicity. Aqu Microbiol Eco 24:9 – 16. Kim TK, Hewavitharana AK, Shaw PN, Fuerst JA. 2006.Discovery of a new source of rifamycin antibiotics in marine sponge actinobacteria by phylogenetic prediction. Appl Environ Microbiol 72:2118–2125. Long RA, Farook A. 2001.Antagonistic Interactions among Marine Pelagic Bacteria. Appl Environ Microbiol 67:4975–4983. Naglaa MM, Venkateswara R, Mark TH, Michelle K, Russell TH. 2008. Monitoring Bacterial Diversity of the Marine Sponge Ircinia strobilina upon Transfer into Aquaculture. Appl Environ Microbiol 74:4133–4143. Madigan MT, Martinko, Parker J. 2006. Brock Biology of Microorganisms. Prentice Hall Inc., New York. Magnino G, Anthonio S, Tisza L, Elda G. 1999. Endobiont of coral reef sponge Theonella swinhoie (Porifera, Demosphongia). Invert Biol 18:213-220. Marchesi JR. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-spesific PCR primers that amplify genes coding for bacteria 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 64:795-799.
49 Mitova M, Tommonaro, Giuseppina DR, Salvatore DR. 2003. A Novel cycclopeptide from a bacterium associated with the marine sponge Ircinia muscarum. Z Naturforsch 58: 740-745. Miyashiro A, Ikegami S. 1994. Anti-Bacillus substance in the marine sponge, Hyatella species, produced by an associated Vibrio species bacterium. Microbiology 78:7–16. Moat GA, John WF, Michael PS. 2002. Microbial Physiology, fourth Edition. Wiley-Liss. New York. Mohapatra BR, Bapuji M, Sree A. 2002. Production of Industrial Enzymes (Amylase, Carboxymethylcellulase and Protease) by Bacteria Isolated from Marine Sedentary Organisms. Act Biotechno 23:75 – 84. Montalvo NF, Mohamed NM, Enticknap JJ, Russel TH. 2005. Novel actinobacteria from marine sponges. Antonie van Leeuwenhoek 87:29–36. Moyer CL, Fred CD, David MK. 1994. Estimation of Diversity and Community Structure through Restriction Fragment Length Polymorphism Distribution Analysis of Bacterial 16S rRNA Genes from a Microbial Mat at an Active, Hydrothermal Vent System, Loihi Seamount, Hawaiit. Appl Environ Microbiol 60:871-879. Osinga R, Evelyn A, Grant B, Friederike H, Gabriela SK. 2001. Sponge–microbe associations and their importance for sponge bioprocess engineering. Hydrobiologia 461:55–62. Penesyan A, Marshall JZ, Holmstrom C, Kjelleberg S, Egan S. 2009. Antimicrobial activity observed among cultured marine epiphytic bacteria reflects their potential as a source of new drugs. FEMS Microbiol Ecol 69:113-124. Proksch P, Edrada RA, Ebel R. 2002. Drugs from the seas—current status and microbiological implications. Appl Microbiol Biotechnol 59:125–134. Rachid S,Daniel K, Brigitte K, Irene K, Maren S, Mark ZT, Helmut B, Rolf M. 2006. Molecular and Biochemical Studies of ChondramideFormation—Highly Cytotoxic Natural Products from Chondromyces crocatus Cm c5. Chemistry Biology 14: 667– 681. Reiswig, H. M. 1975. Bacteria as food for temperate-water marine sponges. Can J Zool 53:582–589. Romanengko LA, Naoto T, Masataka U, Natalia IK, Valery VM, 2008. Diversity and antagonistik activity of sea ice bacteria isolated from the sea of Japan. Micro Environ 23:209-214. Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Gold Spring Harbor Laboratory. Sammes D. 1984, Topic in Antibiotic Chemistry Vol. 2, Ellis Horwood Limited, New York.
50 Searle PA, Rowena KR, Tadeusz F. 1996. MolinskiBengazoles C−G from the Sponge Jaspis sp. Synthesis of the Side Chain and Determination of Absolute Configuration. J Org Chem 61:4073–4079. Sfanos K, Harmody D, Dang P, Ledger A, Pomponi S, McCarthy PLJ. 2005. A molecular systematic survey of cultured microbial associates of deep-water marine invertebrates. Syst Appl Microbiol 28:242-264. Simpson, T. L. 1984. The cell biology of sponges. Springer-Verlag, New York, NY. Snyder L, Wendy C. 2002. Molecular Genetics of Bacteria. ASM Press. Washington, D.C. Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M, 2007, Sponge-associated microorganisms:
evolution, ecology, and biotecnological potential. Microbio Mol Bio Rev 2:295347. Taylor MT, Peter JS, Harriet JB, Timothy SC, Rocky N, Staffan K, Peter DS. 2004. Evidence for Acyl Homoserine Lactone Signal Production in Bacteria Associated with Marine Sponges. Appl Microbiol Biotechnol: 4387–4389. Thakur T, Ute H, Anatoli K, Christian TP, Arga CA, Werner EGM, 2003. Antibacterial activity of the sponge Suberites domuncula and its primmorphs: potential basis for epibacterial chemical defense. Aqu Microbial Ecol 31: 77–83. Thoms C, Horn M, Wagner M, Hentschel U, Proksch P. 2003. Monitoring microbial diversity and natural products profiles of the sponge Aplysina cavernicola following transplantation. Mar Biol 142:685–692. Vacelet J, Boury EN, Fiala MA, Fisher CR. 1995. A methanotrophic carnivorous sponge. Nature: 377:296. Vanderloos R. 1997. Sponges wage chemical warfare in the Indo-Pacific. National Cancer Institute (NCI) Bethesda, Maryland. Van de Peer Y, De Wachter R. 1994. Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows Enviroment. Compu Appl Biosci 10: 569-570. West, L. M., P. T. Northcote, and C. N. Battershill. 2000. Peloruside A: a potent cytotoxic macrolide isolated from the New Zealand marine sponge Mycale sp. J Org Chem 65:445–449. Wahl M, Jensen PR, Fenical W.1994. Chemical control of bacterial epibiosis on Ascidians. Mar Ecol Prog Ser 110: 45–57. Wicke C, Huners M, Wray V, Nimtz M, Bilitewski U, Lang S. 2000. Production and structure elucidation of glycoglycerolipids from a marine sponge-associated Microbacterium species. J Nat Prod 63:621–626.
51 Yahel G, Eerkes DI, Leys SP. 2006 Size independen selective filtration of ultraplankton by hexactenellid glass sponges. Aqu Microb Ecol 45:181-1994. Yogiara. 2004. Analisis komunitas bakteri cairan kantung semar (Nepenthes spp.) menggunakan teknik terminal restriction fragment length polymorfism (T-RLFP) dan amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) [Tesis]. Bogor:Pascasarjana, Intitut Pertanian Bogor. Zampella A, Clelia G, Cecile D, Christos R, Maria VD.1999. New Jaspamide Derivatives from the Marine Sponge Jaspis splendans Collected in Vanuatu. J Nat Prod 62: 332–334. Zhang H, Lee YK, Zhang W,. Lee HK 2006. Culturable actinobacteria from the marine sponge Hymeniacidon perleve: isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis. Antonie van Leeuwenhoek 90:159–169.
52
Lampiran 1. Komposisi media SWC (Sea Water Complete)
Komposis untuk 1 liter: Pepton Yeast Extract Glicerol Bacto Agar Air laut bersih Akuades
5 gram 1 gram 3 ml 15 gram 750 ml 250 ml
53
Lampiran 2. Profil koloni isolat bakteri endofit
No Isolat
Warna
Bentuk
Tepi
Elevasi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
Krem Krem Jingga Muda Putih Krem Kuning Tua Krem Krem Krem Kuning Muda Jingga Tua Putih Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Kuning Muda Putih Krem Jingga Muda Krem Krem Krem Kuning Muda Krem Krem Krem Krem Krem Putih Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Jingga Krem Jingga Muda Krem
Irregular Irregular Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Irregular Bulat Irregular Bulat Irregular Bulat Bulat Irregular Irregular Irregular Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Irregular Bulat Irregular Bulat Bulat Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Bulat Bulat
Berlekuk Berlekuk Licin Licin Licin Licin Berlekuk Licin Berlekuk Licin Licin Licin Licin Licin Berlekuk Licin Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Licin Licin Licin Licin Berlekuk Licin Licin Berlekuk Licin Berlekuk Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Berlekuk Licin Licin Licin
Cembung Cembung Cembung Cembung Datar Cembung Datar Datar Cembung Cembung Cembung Cembung Datar Datar Datar Cembung Cembung Datar Datar Datar Cembung Cembung Datar Cembung Datar Datar Cembung Cembung Datar Cembung Cembung Datar Datar Cembung Datar Datar Datar Datar Datar Datar Datar Datar Cembung Cembung Datar Cembung Datar
SAB E-1 SAB E-2 SAB E-3 SAB E-4 SAB E-5 SAB E-6 SAB E-7 SAB E-8 SAB E-9 SAB E-10 SAB E-11 SAB E-12 SAB E-13 SAB E-14 SAB E-15 SAB E-16 SAB E-17 SAB E-18 SAB E-19 SAB E-20 SAB E-21 SAB E-22 SAB E-23 SAB E-24 SAB E-25 SAB E-26 SAB E-27 SAB E-28 SAB E-29 SAB E-30 SAB E-31 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-34 SAB E-35 SAB E-36 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-39 SAB E-40 SAB E-41 SAB E-42 SAB E-43 SAB E-44 SAB E-45 SAB E-46 SAB E-47
54
No Isolat
Warna
Bentuk
Tepi
Elevasi
48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Jingga Kemerahan Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Merah Muda Kuning Muda Krem Krem Krem Krem Merah Muda Krem
Irregular Irregular Irregular Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Irregular Irregular Bulat Irregular Irregular Irregular Bulat Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat
Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Licin Licin Licin Licin Berlekuk Berlekuk Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Licin Licin Berlekuk Licin Licin Licin Licin Licin
Cembung Datar Datar Cembung Cembung Cembung Datar Cembung Datar Datar Datar Datar Datar Cembung Cembung Cembung Cembung Datar Datar Datar Datar Cembung Datar
SAB E-48 SAB E-49 SAB E-50 SAB E-51 SAB E-52 SAB E-53 SAB E-54 SAB E-55 SAB E-56 SAB E-57 SAB E-58 SAB E-59 SAB E-60 SAB E-61 SAB E-62 SAB E-63 SAB E-64 SAB E-65 SAB E-66 SAB E-67 SAB E-68 SAB E-69 SAB E-70
55
Lampiran 3. Profil koloni isolat bakteri surfaces
No Isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
SAB S-1 SAB S-2 SAB S-3 SAB S-4 SAB S-5 SAB S-6 SAB S-7 SAB S-8 SAB S-9 SAB S-10 SAB S-11 SAB S-12 SAB S-13 SAB S-14 SAB S-15 SAB S-16 SAB S-17 SAB S-18 SAB S-19 SAB S-20 SAB S-21 SAB S-22 SAB S-23 SAB S-24 SAB S-25 SAB S-26 SAB S-27 SAB S-28 SAB S-29 SAB S-30 SAB S-31 SAB S-32 SAB S-33 SAB S-34 SAB S-35 SAB S-36 SAB S-37 SAB S-38 SAB S-39 SAB S-40 SAB S-41 SAB S-42 SAB S-43 SAB S-44 SAB S-45 SAB S-46
Warna
Bentuk
Tepi
Elevasi
Putih Putih susu Kuning Transparan Kuning Kuning Putih Kuning Tua Krem Kuning Putih Kuning Transparan Putih Krem Putih Transparan Putih Putih Orange Kuning Krem Krem Krem Krem Putih Putih Putih Putih Transparan Kuning Krem Putih Putih susu Putih Kuning Putih Putih susu Putih Putih susu Putih Krem Krem Putih Putih susu Putih Putih Krem Krem Putih Transparan
Bulat Bulat Irregular Bulat Bulat Irregular Irregular Irregular Bulat Bulat Irregular Bulat Irregular Bulat Irregular Irregular Irregular Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Irregular Irregular Bulat Irregular Irregular Bulat Irregular Irregular Irregular Bulat Irregular Irregular Bulat Bulat Bulat Irregular Irregular Irregular Irregular Bulat Bulat Irregular Bulat
Licin Licin Berlekuk Licin Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Licin Berlekuk Licin Berlekuk Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Licin Licin Licin Licin Licin Berlekuk Berlekuk Licin Berlekuk Berlekuk Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Berlekuk Berlekuk Licin Licin Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Licin Licin Berlekuk Licin
Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cekung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cekung Cembung Cembung Cembung Cembung Cekung Cekung Cekung Cekung Cembung Cembung Cembung Cembung
56
No Isolat 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68
SAB S-47 SAB S-48 SAB S-49 SAB S-50 SAB S-51 SAB S-52 SAB S-53 SAB S-54 SAB S-55 SAB S-56 SAB S-57 SAB S-58 SAB S-59 SAB S-60 SAB S-61 SAB S-62 SAB S-63 SAB S-64 SAB S-65 SAB S-66 SAB S-67 SAB S-68
Warna
Bentuk
Tepi
Elevasi
Putih susu Orange Orange Putih Transparan Putih Orange Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Krem Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih
Bulat Bulat Irregular Irregular Bulat Bulat Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular Irregular
Licin Licin Berlekuk Berlekuk Licin Licin Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk Berlekuk
Cembung Cembung Cekung Cembung Cembung Cembung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung Cekung
57
Lampiran 3. Sekuen gen 16S RNA enam isolat terbaik yaitu SAB E-8, SAB E-31, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-36, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB E-41.
>SAB E-08 GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGA AACCGGGGAGTAATACCGGAGGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAAC ATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGAGACCCGCGGCGCA TTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGC CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAG TCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAA AGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGAGC CTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA AAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTC ANCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAAAGN AGAGTGGAATTCCACGTGAGACGGTGAAATGCGT
>SAB E-33 GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAAC CGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGG ACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCG ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTT TTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAA ATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGA ATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGA AAGCCCCCGGCTCACCGGGGAGGGTCATTGGAACTGGGGAACTTGAG
58
TGCAAAAAAGGAGAGTGNATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAA GATGTGGAGAACCCCAGTGGCGANGCGACTCTCT
>SAB E-35 CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGATAGAGG GGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAATCTCTTAGGA GCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATCGGATGAACCCATATG GGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTA GCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCA AGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCCTAGGGTTGT AAAGTACTTTCAGTCGGGAGGAAGGCGTTGATGCTAATATCATCAACG ATTGACGTTACCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGT AAAGCGCACGCAGGCGGTTGATTAAGTTAGATGTGAAATCCCCGGGC TTAACCTGGGAATGGCATCTAANACTGGTCAGCTAAAGTCTTGTANAG GGGGGTAGAATTCCTGTGTAGCGGTGAAATGC
>SAB E-38 GGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCAT GGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCG CGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGAT GCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGG ACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGC TTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTG GGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCT
59
>SAB E-40 TAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACT GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAAC CGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGG ACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCA ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTT TTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAA TAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAA TTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAAACTGGGGGAACTT GAGTGCAGAAAAAGAAAGTGGAATTCCACGTGT
>SAB S-43 TGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTG AACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG GCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC CGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTC GAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAA CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCG GAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGT GAAAGCCCCCGGCTCACCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACT TGAGTGCAAAAAAGAAAGTGNANTCCCCGTGTA
Lampiran 5. Hasil perhitungan biner untuk ARDRA
89 SAB E-8 00000100010000000000000000100000011000000000100000000000000001000000000100000010000000000 SAB E-13 00000010010000000000000000100001000000010000000100000000000001000000000100000001000000000 SAB E-14 00000000000100000000110000000000000000000000000000000110000000000000000100000001000000100 SAB E-16 00000001000100000000000000010001000000010000000100000000000001000000000000010001000000000 SAB E-23 00000000000100000000110000000000000000000000000000000110000000000000000100000000010001000 SAB E-25 00100000000000000100110000000000000000000000000000000000000000100000000100000000000100001 SAB E-26 00000000000100000000110000000000000000000000000000000110000000000000000100000000010000010 SAB E-31 00000000000000110000000000001000000000011000000001000000000000001000000000010000010000000 SAB E-32 00000000000100000000110000000000000000000000000000000110000000000000000100000000010000100 SAB E-33 10000000000000010001100000000000010000000000000011000100000100000000000100000000000000000 SAB E-35 00100000000100000000000000001000000000000000000001000100000000000110000000000000000010000 SAB E-36 00000000010100000000000000000000000000000000000001100100000000000100000000000001000010000 SAB E-37 00000000000000110000000000001000000000011000000001000000000000001000000000001000010000000
60
SAB E-38 00000000000000000100100000000001000000000000110000000000000110000000000100010000000000000 SAB E-40 10001000000000000001100000001000000010000000000010000000000100000100000100000000000000000 SAB E-41 10001000000000000001100000001000000010000000000010000000000100000100000100000000000000000 SAB E-47 00000001000100000000000000010000010000000000100001000000000000001000000000000100010000000 SAB E-54 10001000000000000000100010001000000000000100000010000000000100000100000100000000000000000 SAB E-56 10000000000100010000000001000001000000000000100000000100000000100100000000000000010000000 SAB E-58 01000000010000000000000001001001000000000100000000000000000000100100000000000000010000000 SAB E-59 01000000010000000000000001001001000000000100000000000000000000100100000000000000010000000 SAB E-65 00000000010000010000000000100000000011000000000001000000000000100000000000010000010000000 SAB E-66 00000011000000000000000001000000011000000000000100000000000001000000010000000001000000000 SAB E-67 10001000000000000000100010001000000010000000000010000000000100000100000100000000000000000 SAB S-6 00000001100000000000000001000000011000000000000100000000000001000000010000000001000000000 SAB S-15 00000011000000000000000001000000011000000000000100000000000001000000010000000001000000000 SAB S-30 00000000000000010000100000001000000000000000110000000100000100000000000100010000000000000 SAB S-31 00000000000000010000100000001000000000000000110000000100000100000000000100010000000000000
61
SAB S-41 00000000000000010000100000001000000000000110000000000100000100000000010100000000000000000 SAB S-43 00000000000000010000100000001000000000000110000000000100000100000000010100000000000000000
62
