AKTIVITAS PENGHAMBATAN SENYAWA ANTIMIKROB Streptomyces spp. TERHADAP MIKROB PATOGEN TULAR TANAH SECARA IN VITRO DAN IN PLANTA
NURMAYA PAPUANGAN
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
LEMBAR PERNYATAAN Tidak ada
ABSTRACT NURMAYA PAPUANGAN. The Activity inhibiting of Antimicrobial Compounds of Streptomyces spp. against of Soil Borne Microbial Pathogens based on In Vitro and In Planta Assays. Under the direction of YULIN LESTARI and RASTI SARASWATI. The main problem on horticulture plant cultivation is caused by soil borne microbial pathogens. The use of chemical substances to control the microbial pathogens can cause negative effect on the environment. Biological control is used as an alternative way to solve the problems. Streptomyces spp. is selected as an agent of biological control because of its capability to produce antimicrobial compounds. The research aimed to find local Streptomyces spp. isolates which have growth inhibition potency to various soil borne microbial pathogens based on in vitro and in planta assays. There were 32 local isolates of Streptomyces spp. examined in an in vitro assay using dual culture and Kirby-Bauer methods. Hypersensitivity test of Streptomyces spp. on tobacco plant was conducted to examine their pathogenicity. Amongst the 32 Streptomyces spp. tested, six selected isolates have excellent in vitro inhibiting activity against soil borne microbial pathogens and they did not pathogenic on tobacco plant used for the in planta assay. Their effectiveness in inhibiting Sclerotium rolfsii, in particular, was examined using pepper plant. The glass house experiment was conducted in a Split Plot Design with two factors (Streptomyces spp and application technique) and five replications. As an antibacterial producer, the LSW1, LSW05, PD2-9, LBR02, and PS4-16 isolates of Streptomyces spp. inhibited the growth of Bacillus subtilis (diameter of inhibition zone ranged from 14.5-18.5 mm). Meanwhile, LBR02, SSW02, and PS4-16 inhibited Xantomonas oryzae by producing 19-21 mm inhibition zone, and the LBR02 was capable of inhibiting Xanthomonas axonopodis (7.5 mm). Screening of antifungal producer showed that five isolates (LBR02, LSW1, LSW05, PD2-9, dan PS4-16) strongly inhibited the growth of Rhizoctonia solani (47.8-68.9%) and Fusarium oxysporum (48.8-57.8%). SSW02, LBR02, PD2-9, and PS4-16 moderately inhibited S. rolfsii (21,2531,25%). The in planta test showed that the Streptomyces spp. examined significantly reduced pepper plant diseases severity (P=0,0003). LSW05 and PS416 isolates showed to have profound effect on the plant diseases severity by decreasing of LADKP value by 56,2% and 54,9%, higher pepper seed germination which LSW05 inoculation value by 92,0% to follow by PS4-16 (86,0%) as compared to the control (80,0%). Soil inoculated with Streptomyces spp. showed to be the most effective in controlling the disease as compared with seed coating treatment. The results clearly indicate that local isolates of Streptomyces spp. which are not plant pathogen have capability to be developed further as biocontrol agent for soil borne microbial pathogens. Keywords: antimicrobial compounds, Streptomyces spp. soil borne microbial pathogens, in vitro, in planta.
RINGKASAN NURMAYA PAPUANGAN. Aktivitas Penghambatan Senyawa Antimikrob Streptomyces spp. terhadap Mikrob Patogen Tular Tanah Secara In Vitro dan In Planta. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan RASTI SARASWATI. Sayuran adalah merupakan salah satu komoditas hortikultura yang mempunyai potensi penting dalam pemenuhan gizi, peningkatan kesejahteraan masyarakat, dan perbaikan pendapatan petani. Akan tetapi, dalam usaha budidaya tanaman sayuran ditemui kendala berupa penyakit tanaman yang disebabkan oleh mikrob patogen tular tanah yang dapat menimbulkan resiko kerusakan tanaman dan kehilangan hasil yang cukup tinggi, sehingga menyebabkan kerugian ekonomi di bidang pertanian dan industri hortikultura. Pengendalian dengan cara kimiawi dapat berdampak negatif terhadap lingkungan dan bahkan dapat menimbulkan resistensi patogen. Adanya kekhawatiran dengan penggunaan mikrobisida kimiawi, dan adanya permintaan produk pertanian yang sehat dan aman bagi konsumen, pengendalian hayati menjadi satu pilihan cara mengendalikan mikrob patogen penyebab penyakit tanaman yang perlu untuk dipertimbangkan. Indonesia memiliki keanekragaman mikroorganisme yang cukup tinggi salah satunya adalah Streptomyces yang merupakan kelompok Actinomycetes. Isolat-isolat Streptomyces yang terisolasi dari berbagai daerah di Indonesia diketahui berpotensi menghasilkan senyawa antimikrob yang mampu menghambat dan mengendalikan beberapa jenis mikrob patogen tular tanah dan penyakit yang ditimbulkan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat lokal Streptomyces spp. yang memiliki kemampuan unggul dalam menghambat pertumbuhan mikrob patogen tular tanah melalui uji in vitro terhadap beragam mikrob patogen tular tanah dan in planta terhadap Sclerotium rolfsii salah satu patogen pada tanaman cabai. Uji in vitro kemampuan penghambatan Streptomyces terhadap mikrob patogen tular tanah dilakukan dengan menggunakan isolat Streptomyces secara langsung dan filtrat kultur Streptomyces. Metode uji penghambatan Streptomyces menggunakan sel secara langsung terhadap mikrob patogen tular tanah kelompok bakteri dengan menggunakan teknik cakram agar (agar disc method) dan filtrat kultur Streptomyces diuji aktivitas antibakteri dengan menggunakan metode Kirby-Bauer. Aktivitas antibakteri diindikasikan dengan terbentuknya zona penghambatan (zona bening) dan bioaktivitasnya dievaluasi berdasarkan ukuran diameter zona bening yang terbentuk dikurangi dengan diameter cakram agar isolat Streptomyces. Metode biakan ganda (dual culture) digunakan terhadap mikrob patogen tular tanah kelompok cendawan. Adanya penghambatan pertumbuhan cendawan dideteksi dengan adanya barier antara cendawan dengan Streptomyces. Tingkat penghambatan (∆γ) dihitung dengan cara mengurangi jarak tumbuh miselium cendawan menjahui inokulum Streptomyces spp. (γ◦) dengan jarak tumbuh miselium cendawan yang terhambat oleh inokulum Streptomyces spp. (γ), dengan formulasi (∆γ = γ◦- γ). Persentase penghambatan menggunakan formulasi (%) = [(γ◦- γ ) x 100]/ γ◦. Patogenisitas Streptomyces spp. dikaji melalui uji hipersensitivitas pada tanaman tembakau dengan cara menginfiltrasi filtrat kultur Streptomyces pada daun tanaman tembakau. Uji in planta efektivitas penghambatan terhadap S.
rolfsii khususnya diuji menggunakan tanaman cabai. Percobaan rumah kaca menggunakan Split Plot Design dengan dua faktor yaitu jenis Streptomyces spp. dan cara aplikasi dan diulang sebanyak lima ulangan. Data intensitas penyakit, LADKP, dan persentase perkecambahan dianalisis dengan menggunakan prosedur ANOVA dari program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1. Perbedaan rata-rata antar perlakuan diuji menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf nyata 5%. Pengujian antagonis isolat Streptomyces spp. secara in vitro dengan menggunakan sel secara langsung, menunjukkan sebanyak 17 isolat mampu menghambat mikrob patogen tular tanah dengan aktivitas penghambatan yang beragam dan memiliki spektrum luas. Sebanyak 14 isolat Streptomyces spp. mempunyai aktivitas penghambatan terhadap bakteri dan cendawan patogen tular tanah, dan tiga isolat lainnya hanya mampu menghambat bakteri. Enam isolat dipilih untuk uji selanjutnya karena memiliki aktivitas yang beragam terhadap bakteri dan cendawan patogen tular tanah. Enam isolat tersebut yaitu: SSW02, LBR02, LSW1, LSW05, PS4-16, dan PD2-9. Keenam isolat tersebut mampu menghambat lebih dari satu jenis bakteri dan cendawan dan mampu menghambat kedua-duanya dengan daya hambat yang berbeda. Isolat SSW02, LBR02, LSW1, LSW05, dan PS4-16 mampu menghambat Bacillus subtilis dan B. cereus dengan diameter zona hambat sebesar 7-15 mm, Xanthomonas axonopodis mampu dihambat oleh LBR02, LSW1, LSW05, PS4-16 dan PD2-9 dengan zona hambat sebesar 5-8 mm, Xanthomonas oryzae dihambat oleh keenam isolat Streptomyces spp. Dengan zona hambat 4-11,5 mm dan Ralstonia solanacearum dihambat oleh isoat PD2-9 dan PS4-16 dengan menghasilkan zona hambat sebesar 7-8 mm. Selain mempunyai aktivitas antibakteri, SSW02, LBR02, LSW1, LSW05, dan PS4-16 mempunyai aktivitas penghambatan yang kuat terhadap Rhizoctonia solani dan Fusarium oxysporum dengan persentase penghambatan berturut-turut 46,6% - 62,22% dan 21,0% - 77.7%. Isolat SSW02, LBR02, LSW05, PS4-16, dan PD2-9 mempunyai aktivitas penghambatan terhadap S. rolfsii dengan persentase penghambatan sebesar 11,1% - 84,1%. Enam isolat terpilih digunakan untuk uji selanjutnya dengan menggunakan filtrat kultur. Filtrat kultur keenam isolat Streptomyces spp. yang diujikan masih mampu menghambat mikrob patogen tular tanah dengan aktivitas yang beragam. Filtrat kultur Streptomyces spp. isolat LSW1, LSW05, PD2-9, LBR02, dan PS416 menghambat pertumbuhan B. subtilis dengan diameter zona penghambatan 14,5-18,5 mm. Isolat LBR02, SSW02, dan PS4-16 menghambat X. oryzae dengan menghasilkan diameter zona hambat 19-21 mm, dan LBR02 juga mampu menghambat X. axonopodis diameter zona penghambatan sebesar 7,5 mm. Penapisan antifungi menunjukkan lima isolat yaitu: LBR02, LSW1, LSW05, PD2-9, dan PS4-16 mempunyai penghambatan kuat terhadap pertumbuhan R. solani dengan persentase penghambatan 47,8 – 68,9% dan F. oxysporum sebesar 48,8 – 57,8%. SSW02, LBR02, PD2-9, dan PS4-16 mempunyai daya hambat sedang terhadap S. rolfsii dengan persentase penghambatan sebesar 21,25 31,25%. Uji hipersensitivitas diperlukan untuk mengetahui patogenisitas Sterptomyces spp. terpilih. Hasil uji pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa semua isolat tidak mampu menimbulkan reaksi hipersensitif pada daun tembakau yang mengindikasikan keenam isolat Streptomyces spp. Tidak bersifat patogen pada tanaman.
Berdasarkan hasil uji in planta, Streptomyces spp. Memberi pengaruh yang signifikan (P=0,0003) terhadap intensitas penyakit pada tanaman cabai. Isolat LSW05 dan PS4-16 efektif dalam menekan intensitas penyakit tanaman dengan menurunkan LADKP sebesar 56,2% dan 54,9%, rata-rata persentase perkecambahan benih cabai yang diinokulasi Streptomyces LSW05 lebih tinggi (92,0%) disusul PS4-16 (86,0%) dan campuran isolat (84%) dibandingkan dengan kontrol (80,0%). Inokulasi tanah dengan Streptomyces spp. lebih efektif mengendalikan penyakit dibandingkan dengan seed coating. Hasil ini mengindikasikan bahwa isolat lokal Streptomyces spp. nyata tidak bersifat patogen. Isolat LSW05 dan PS4-16 mempunyai kemampuan sebagai agen pengendali hayati untuk mikrob patogen tular tanah baik secara in vitro maupun in planta. Kata kunci : senyawa antimikrob, Streptomyces spp, mikrob patogen tular tanah, in vitro, in planta
HAK CIPTA Tidak ada
LEMBAR PENGESAHAN Tidak ada
PRAKATA Tidak ada
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................
xvi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
xvi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xvii
PENDAHULUAN ........................................................................................
1
Latar Belakang ........................................................................................
1
Hipotesis .................................................................................................
3
Tujuan Penelitian ....................................................................................
3
Manfaat Penelitian ..................................................................................
4
TINJAUAN PUSTAKA ..............................................................................
5
Mikrob Patogen Tular Tanah .................................................................
5
Upaya Pengendalian ..............................................................................
8
Karakteristik Streptomyces spp. .............................................................
11
Potensi Streptomyces spp. ......................................................................
12
BAHAN DAN METODE ............................................................................
17
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................
17
Bahan ......................................................................................................
17
Metode ...................................................................................................
17
Peremajaan Isolat Streptomyces spp. dan Mikrob Patogen Tular Tanah (Bakteri dan Cendawan) ........................................................
17
Uji In-Vitro Kemampuan Penghambatan Streptomyces spp. terhadap Mikrob Patogen Tular Tanah ............................................
17
Produksi Filtrat Kultur Streptomyces spp. .......................................
18
Uji Anatagonis Filtrat Kultur Streptomyces spp. terhadap Mikrob Patogen Tular Tanah ........................................................................
19
Uji Reaksi Hipersensitivitas Streptomyces spp. pada Tanaman Tembakau .........................................................................................
20
Uji In-Planta Kemampuan Penghambatan Streptomyces spp. terhadap Sclerotium rolfsii ...............................................................
20
xiv
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................
24
Peremajaan Streptomyces spp. ...............................................................
24
Uji In-Vitro Kemampuan Penghambatan Streptomyces spp. terhadap Mikrob Patogen Tular Tanah ..................................................................
25
Uji Antagonis Filtrat Kultur Streptomyces spp. .....................................
27
Uji Reaksi Hipersensitif Streptomyces spp. pada Tanaman Tembakau ...............................................................................................
31
Uji In-Planta Kemampuan Penghamabatan Streptomyces spp. Terhadap Sclerotium sp ..........................................................................
32
SIMPULAN DAN SARAN .........................................................................
39
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
40
LAMPIRAN ..................................................................................................
46
.
xv
DAFTAR TABEL Halaman 1 2
Pemanfaatan mikrob antagonis sebagai agen pengendali hayati mikrob patogen tular tanah ..................................................................................
9
Kriteria keefektifan relatif pengendalian ................................................
23
3 Kemampuan penghambatan Streptomyces spp. terhadap bakteri patogen dengan menggunakan sel secara langsung ................................
26
4 Kemampuan penghambatan Streptomyces spp. terhadap cendawan patogen dengan menggunakan sel secara langsung ................................
26
5 Hasil uji antagonis filtrat kultur enam isolat Streptomyces spp. terhadap bakteri patogen ........................................................................
27
6 Hasil uji antagonis filtrat kultur enam isolat Streptomyces spp. terhadap cendawan patogen ...................................................................
28
7 Pengaruh aplikasi dan keefektifan (%) Streptomyces spp. Terhadap luas area di bawah kurva perkembangan penyakit (LADKP) pada 48 hari setelah tanam benih cabai dalam pot yang diinfestasi dengan Sclerotium rolfsii ........................................................................
34
8 Pengaruh aplikasi Streptomyces spp. terhadap perkecambahan benih cabai yang ditanam dalam pot yang diinfestasi dengan Sclerotium rolfsii .....................................................................................
35
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Morfologi koloni isolat Streptomyces spp. yang ditumbuhkan pada media YMA ..........................................................................................
24
2 Aktivitas penghambatan filtrat kultur enam isolat Streptomyces spp. terhadap kelompok bakteri patogen tular tanah .....................................
29
3 Kemampuan penghambatan aktivitas filtrat enam kultur Streptomyces spp. terhadap Rhyzoctonia solani ...................................................................
30
4 Kemampuan penghambatan aktivitas filtrat enam kultur Streptomyces spp. terhadap Fusarium oxisporum ...............................................................
30
xvi
5 Reaksi hipersensitif filtrat kultur Streptomyces spp. pada daun tanaman tembakau 72 jam setelah inokulasi ........................................................
32
6 Intensitas penyakit pada tanaman cabai berumur 14, 20 dan 48 hst ...............................................................................................
32
7 Intensitas penyakit pada tanaman cabai umur 34, 41, dan 48 hst yang diinokulasi Streptomyces ..............................................................
33
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tabel kemampuan tumbuh isolat Streptomyces spp. hasil peremajaan pada media YMA dan OA ......................................................................
46
2 Tabel kemampuan penghambatan Streptomyces spp. terhadap mikrob patogen tular tanah ..................................................................................
47
3 Penilaian kekuatan daya penghambatan terhadap bakteri patogen .........
48
4 Tabel intensitas penyakit tanaman cabai 34, 41, dan 48 hst ...................
49
xvii
