Volume IX No.2
.TRANSTORMASI
GTINETIK LIMA VARIETAS KEDELAT MBNGG 1JNA KAN AG ROBACTE R I U M Setyo Dwi (.ltomo
.lurusalr tludidaya Peftanian [:'akultas peftaniarr []rriv.ersitas [,ampung, Jl. S. Brodjonegoro I Randar Lampung 35145 T'e I p. 0 72 I 7 8 I 8 2 0, e-m a i I : s{u-tqn-o_2_QQflC}yahaa. caln
ABSTRACT AGROBACTERIUM-MEDIATED TRANSFORMATTON OF FIVE SOYBEAN CULTIVARS. rh; ,,bin(th" of this study u'a,s to evaluate lhe efficienc'y qf Agrohac'terium-macliuted tronformation u,sing explctnts e/ fit.e soybean cultivars. The 'study v,u.s conclucted in the Plunt T'run,sfitrmutirn (lore Re,seurch iariiity, (ente*f BiotechnoloEy, University oJ'Nehra,ska, Lincoln, Nehrq,ska. IJSA from .luly December 2003. Experiments u,ere arranged in randomized block design,s utith 5-10 replit:ulion.t, 1 explants n,ithin each experimeitul ttnir. Three strain's of Agrobacterium lume.fetciens were used, i.e., ('5BCl, l:ItAt0l, antl NT'1,4-Ory5. Explanls were cotyledonary nodes o.f cultiyurs Jttya lYifa-y,u, Krakatuu, ,\lamet, -l-umpomrr,s, ancl Vttili;;. C1l.t,le' onorl:-1n7n explants, prepared from germinated seeds, wera inoculated wilh Agrohacteriunt, incubuletl in co-cultivation mediafor 3 days, wa,sheel, cultured in media of shoot-initiution, shooi-elongation, ancl rooting .ftr l, l-6, and 2 weeks respectively- The mediq r1f shoot initictlion and alongation contained herbicicle glufosinale as the selecting agent. At 3l ddys after inoculation, ,shoot.g were producecl front e-xplanls ol'all ./ive cultivars evaluatetl. The proportion of explants producing ,shoot,s rungecl fiom -ll9l, (cultitur.Ia),il 14irya) to z6% (cullivar slanet). Transgenic soyheans were produced from all ,/ive cultivar,s evuluutetl tt,iti t:f/ic:ieicy rangecl.frgn 2.6%) lo 6.5%. Tiansgenic soybean,s were onll'prorluc'ed.from erpluntl; inoc:ulatecl with l:,HAl(jl orit wft+f,ry)S, not v,ith c58C1. Key wo rds : A gr o h qc t e r i um,
G Iy c i n e.
-yy
gt,_g91e t i c
e ng i n e c
PENDAHTiLTIAN
kotileclon dianrhil clari
Rekayasa genetika atau transfbrnrasi genetik kedelai yang efisien dapat berkontribusi positif dalam proses perakitan varietas unggul kedelai. Varietas unggul kedelai yang telah dihasilkan melalui transformasi genetik antara lain memiliki sifat tahan terhadap hama ulat ordo Lepitloptera (Parrot et al., 1994: Stewart lr. et ul., 1996) dan mengandung lemak tidak jenuh yang tinggi (Mazur et a1.,1999).
Tanaman kedelai transgenik hasil rekayasa
dapat diperoleh menggunakan biolistik
Agrobacterium. Transformasi genetik
dan keclelai
menggunakan biolistik (microprojectile bomhardment) berhasil dilakukan menggunakan eksplan embrio somatik dan pucuk tunas (.sfutol apices'); sedangkan transformasi menggunakan
Agrobacterium berhasil dilakLlkan
r ing
terutarna
nrenggunakan eksplan buku koti ledon
Kedelai transgenik berhasil diperoleh dari transformasi menggunakan Agrobacteritrm setelah ditempuh jalur organogenesis untuk meregenerasikan tanaman transgenik dari eksplan buku kotiledon (Hinchee et al. , lqBS). Buku
btji
kedelai yang telah
dikccarnhahkan selanra 4 - l0 hari pada media agar. I:lksplan diincrkulasi dengan Agrobuc,terium strain
nopalin yang mengandung Ti-plasnrid yang membawa kaset gen nptll sebagai marka. Eksplan
selanjutnya dikulturkan pada media 85 yang rrrengandung 5 pM BAP. 'l'unas transgenik diseleksi
dengan cara dikulturkan pada media mengandung antibiotik kanamisin 200
Penraniangan
-
yang
300 rng/|.
tunas dicapai dengan cara
rnengkulturkan pada media mengandung BAp lebih rendah. ['linchee et ul. (1988) melaporkan efisiensi
transfbrmasi berkisar 0.3 2.2%. prosedur transformasi Hinchee et ol. ( 1988) tersebut kemtrdian dimodiflkasi oleh t)i et al. (1996) dan 'l-ownsend dan 'l-homas (1996)" Modifikasi meliputi penambahan 100 pM asetosiringon (Stachel et al., 1985) untuk menginduksi virulensi Agrobacterium selama inokulasi dan ko-kultivasi, memperpendek periode perkecambahan. dan pelukaan sebelum inokulasi pada buku lempat tumbuh tunas aksilar yang berguna untuk mencegah munculnya tunas
aksilar dan merangsang terbentuknya tunas adventif rnajemuk. Thomas Clemente (data tidak dipublikasi) memodifikasi persiapan eksplan. yaitu
Jurnal Agrotropika IX(2) :95- t 0 I,Desemher 2004
95
utomo : Transformosi generik *edetoi menggunokon Agrohuererium memisahkan kotiledon dari kecarnbah dcngan cara membawa kronrosonr C,5B (nopoline) dan Ti_ memotong hipokotil 5 mm di bawah kotiledon" Plasmid pElIAl0l (L.,l,..sttct:itttrmopine\; NTL4_ Menggunakan silet skalpel, poros embrio dibuang Cry5 mernbarva kromosorn N'fl. (nopolina) dan .Ii_ dan pelukaan dilakukan dengan cara menrbrmt 7-li plasmid cltr.t,sopine.- sedangkan CSSC I membaw.a irisan paralel dengan poros. Zhang et al. (1999) clan kromosom C.511 (nopaline) dan Ti-plasmid pMp90 Clemente et al. (2000) memodifikasi media seleksi. (nopctline). Percobaan I dan lll menggunakan strain yaitu menggunakan herbisida sebagai pengganti N1't,4 Cry5, sedangkan percobaan Ii-menggunakan antibiotik. strain C58C I . Percobaan menggunakan rancangan Dengan menggunakan prosedur Hinclree e/ a/. kelompok yang rerdiri dari 5_10 ulangin. 1"ul (1988) beserta modifikasinya, Olhoft et al. (20021 Setiap satuan percobaan terdiri dari 4 eksplan y*ang melaporkan efisiensi transformasi yang paling tinggi dikulturkan pada media dalam cawan petri l0 x i yang pemah dilaporkan untuk kedelai yaitu 16,40/0. cnl. Prosedur transformasi buku kotiledon tersebut paling Prosedur transformasi meliputi tahaptahap banyak digunakan di laboratorium-laboratorium sterilisasi b'ji. pengecambahan hrji, penyiapan milik pemerintah di Amerika Serikat. eksplan dan inokulasi. kultur dalam media Transformasi genetik genotipe kedelai kokultivasi, pencucian eksplan, kultur dalanr media nasional menggunakan Agrobacterium dilaporkan inisiasi tunas. subkultur dalam lnedia pemanjangan oleh Triadiati (1994), Gustian (ZOOZ), dan pardal tunas, dan subkultur dalam media pengakaian (2000). Triadiati (1994) mengevaluasi 100 genotipe (Zhang et al., 1999; Clemente er al., 2000). kedelai yang mencakup I I varietas unggul nasional. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan cara menaruh Menggunakan strain Agrobacterium LBA4404 yang satu lapis biji kedelai pada dasar cawan petri terbuka diinokulasikan pada kotiledon dan diseleksi pada yang ditempatkan dalam desikator" Desikator media yang mengandung kanamisin, Triadiati (1994) ditempatkan di dalam lemari asanr. Cas klorin mendapatkan kalus transgenik eksplan mutan M-24 diproduksi di dalam desikator dengan cara yang mengekspresikan GUS. Walaupun tidak menambahkan tetes demi tetes 3,3 ml 12 N HCI ke didukung data analisis molekuler (pCR atau rygyukaan dinding bagian dalam gelas piala berisi hibridisasi Southern), Gustian (Z0OZ) melaporkan 100 ml chlorox atau sunklin. peJikatoi kemudian kecambah atau plantlet kedelai yang tahan ditutup dan dibiarkan dalam lernari asam selama 4g kanamisin atau membav/a gen coat protein (Cp) dari .iam. eksplan embrio somatik yang diinokulasi B'ji yang telah disterilisasi kemudian Agrobacteriunr dan diseleksi pada media dikecambahkan dalam media pengecanrbahan mengandung kanamisin. Terdapat kesulitan untuk berupa media 85 Gamborg (Gamboig it ol., tO6g1 mendapatkan tanaman transgenik dari emhrio dengan pFl 5.8 yang mengandung 2% sukrosa dan somatik transgenik. penelitian ini bertujuan dipadatkan dengan 0,8%o agar. H4eaia dituang dalam mengevaluasi efisiensi transformasi genetik lirna cawan petri 100 x 25 nrm. Sebanyak l0 *15 biji varietas kedelai menggunakan Agrobacterium dikecambahkan clalam satu .u*rn petri dan menggunakan prosedur Zhang et al. (1999) dan diinkubasi 5-6 hari pada suhu 24 C dan lg16 jam Clemente et al. (2000). terang/gelap. Setelah berkecambah, eksilan
BAHAN DAN METODB
Penelitian dilaksanakan
di Plant Transformation Core Research F-acility, Center of Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln,
dipersiapkan untuk diinokulasi dengan Agrohactbrium. Pertama, kecambah yung terkontaminasi dibuang dan dipilih kecambah yan[ hijau dan sehat. Kecambah dipisahkan dari uku.nyl dengan cara memotong horizontal hipokotil 3-4 mm
di
bawah buku kotiledon. Selanjuinya kecambah dibelah vertikal di antara dua kotiledon sehingga diperoleh dua eksplan buku kotiledon. pucuk poros enrbrio di atas buku kotiledon dibuang. Terakhir, dibuat 7-12 goresan sepanjang 3_4 mm sejajar dengan poros embrio pada buku kotilidon menggunakan pisau skalpel no. 15. Agrobac:terium untuk inokulasi eksplan ditrrmbuhkan selama l2-14 -iant dalarn media cair yang mengandung antibiotik. kemudian dipeletkan pelapor GUS (beta-glucuronitlose). Ilt{A l0l dengan cara sentrifilgasi 2500-3000 RpM selama l0 96 Jurnal Agrotropika IX(2):95- I 0 I,Desemher 2A04
Nebraska, Amerika Serikat (PTCRF-UNL) pada bulan Juli * Desember 200j. Sumber eksplan yang digunakan adalah biji kedelai masak varietas .lava Wijaya, Krakatau, Slamet, Tampomas, dan Wilis. Tiga strain Agrobacterium digunakan untuk inokulasi eksplan, yaitu CsgCl, EHAl0l. dan NTL4-Cry5. Tiga strain tersebut membawa vektor tlansformasi pPTN289 yang mengandung gen toleransi terhadap herbisida glufosinat dan g"n
[(
!a
(l in LN
m n
rg
: rp m
ia ia !n
n ).
rh La
fr in ra
ie
si
n
't n m
lt tn m
ji m m m
n g
; n h n r{
r.
tr {l n
utomo : Transformasi genetik kertetai menggunokan Agrtthacrerium menit' Pelet disuspensikan dengan kojagung bcrdasarkan analisis T"d,., Southern. kultivasi cair agar diperoleh suspensi dengan vang-crirnaksud tunas adarahhibridisasi bakal cabang yang kepadatan optik oD666 0'7-l'0' Ekspian yang teiah telah mernbentuk > r craun triforiat. Tunas ad,entif dipersiapkan diinokulasi dengan cara merendanr dapat dibedakan crengarr tunas aksirar. Tunas aksirar dalam cawan petri berisi suspensi Agrohacteriunr tlirentut r;";;; tn-,rfir,rg (tanpa merarui fase karus) selama 30 menit dan digoyang-goyang setiap 5-lo Jrri meristem ,k;ir;;. Karerra tanpa merarui fase menit' Selanjutnya eksplan ditaruh pada kertas ialus. tunas ur.r;iu, ,rauh terbentuk 7 HSI berupa saring steril yang dibentangkan pada metlia kotunas tunggar yang tumb*h cepat. Sebariknya. tunas kultivasi padat' 4 eksplan per botol kultur dan arjventif JI.r,"nrr?' Ju.i karus yang berasar dari diinkubasi selama 3 hari ' Eksplan buku kotiledo, ieristem aksirar
ditempatkan telungkup (permukaan yang
datarladaksial menghadap ke bawah) paoa klrtas saring' Ruang inkubasi atau ruang tumbuh unttrk
yang dicacah.
pencacahan
bertLrjuan menghind'ari terbentuknya tunas aksilar irn *"rungsang terbentuknya tunas adventif. Tunas tlansgenik*prrtaiif adarah tunas yang menunjukkan
seluruh percobaan bersuhu 24 c, 1816 janr .*ur.ri positif asai histokimia GLIS pada hari' Sumber cahaya ruangtunrtuh pt,t,-,ngan crnun dalam (.refferson e/ ar., r9g7). Jika dua berupa lampu TI- berintelrsitas 1000 lux' Eksplan irnur rtu, ranaman transgenik berasar dari ekspran kemudian dicuci dengan media pencuci dan ylng berbeda. dapat dipastikan dua tunas atau disubkultur pada media inisiasi tunas yang tanaman transgenik tersebut independen mengandung antibiotika (ticar' cefotaxime,- dai independen) atau berasal dari dua ii.rn.ror*un vancomycin untuk membunuh Agrobacterium) dan t.jraiun t.unrf,rr*iJ 1)ang berbeda. herbisida glufosinar (Zhang et it., tg99). Media inisiasi tuias adatah medi-a Bs (Gamborg er dirakuk# x1",*?]l5l,r,l:.Jf['"i,.,jf_1j], iy,i; 1968) yang nrengandung I mg/l BAP' Eksplan o-nu*u, transgenik putatif. Samper sebanyak I-3 ditempatkan condongdengan sudut 1200, permukaan lir,nugan darn diinkubasi (selama l6 jam 37 bagian rraran,- rarutan s'-h,o,,o-t-,r,ro,o-i-ina,ut-s-c) ill]r.d"" terang/gelap per
ut..
vans seterah dua minggu pada media inisiasi, katus pada permukaan bawah eksplan :l*'jil'.,ff;*[lli",:;
dipotong' dan bagian atas eksplan yang meliputi 'bakai tunas adventif dipindahkan ke media inisiasi segar' Dua minggu kemudian jaringan kotiledon (menguning) dibuang, bagian dasar eksplan yang U"rri,,girngun dengan media dipotong' dan jaiingan yi'ng "L.p.t"n berdiferensiasi menghasilkan iunas atau bakal tunaf adventif pada buku kotiledon dipindahkan ke media pemanjangan tunas' Komposisi media pemanjanga, tunas hampir sama dengan media inisiasi- tuias kecuali I mgll BAP diganti dengan I mgll IAA, I mg/l GA1' dan I mg/l zeatin ribtsicla: serta tidak mengandung antibiotika ticar' ccfotaxime, dan vancomycin Tunas yang mempunyai lebih dari 3 daun dikulturkan ke media pengakaran' T'unas yang telah berakhr fungsional diakJimatisasi ke medif
tanah.
f::r::;#, ";:J:"r;:i? lr""rfi::, ,l#;r;li1l,f.
digunakan sebagai Lort.ol negatif. Reaksi positif oreriwarna biru pada jaringan daun.
iiiun;r*u,
Anarisis hibridisasi Southern (Southern, 1975) dirakukan terhadap 6 tanaman transgenik pu*,if R_, DNA ;;;.ik total diekstrak dari 1,0_ ij gram. ourn -yung terah membuka penuh -"rggrnukrn pror"du. [)ellaporta er al. (19g3). ixa rrn pg) dipotong dengan enzim restriksi. ;iibridisasi ,r;;ggrr"kun peracak
p"ir"ut
Qtrohe)GUsprus.
.ua;.rai?ir aip".ol"tr melalui prosedur ,.rai.,:, primecr ,rvrrnrrli, (prime IT' Ir, Stratagene, cat *roo:ts, r.. l"iir, Carifornia. usA) untuk ,r"nginro.porasikan iCrp yang mengandung 32p .ra;*trif.. Hib;id;.r;iailukukun dalam inkubator
bersuhu 65 C dalam la.utan 0.5 MNa2Hpoa, pH 7.2, 1;r" 1*tu1Sf)S serama r+;a*. Firter dicuci dua kari
propors.i ll^;^jf:f}r:;f,i,X,#i! ,#J;,;,t'n[*
variaber yang.diamati meriputi r) eksplan yang menghasilkan tunas adventir paaa :t k"iigo dilakukan dalam larutan 40 mMNa2Hpoq. HSI; 2) Jumlah dan proporsi tunas yang tumbul, pH i-;. vr(*tu)SDS pada suhu 65 C serama 15 menit. pada rnedia mengandung glufosinai l0 sig,r"r rarri.aktif dari pita I)NA pada '"-lu"'u minggu; 3) Jumlah dan pr.forsi tunas indeperrden firter dideteksi ;ru",, cara menginkubasi dengan firm sinar X "-"r yang mengepskresikan GUS (Jefferson et al.^ l9g7). dan 4) Integrasi gen GUS ke dalam genom tanaman
ir'
n Ir
Jurnol Agrotropika IX(2):95_ I 0l,Desemher 2004
97
: Trcnsformcsi geneiik kedelai menl4gunokan Agrohacteriunt HASIL DAN PEMBA}IASAN cliperoleh dari cksplan yang diinokulasi dengan strain EHA l0l nraupun NTL4-Cry5 (Tabel 2). Utomo
Salah satu indikator pendukung keberhasilan transfonnasi genetik adalah terbenluknya trrnas
'['unas tersehut turrrbuh pada medium seleksi yang
adventif yang muncul dari eksplan yang dikulturkan pada media seleksi mengandung glufosinat (-fabel 1). Tunas adventif dihasilkan atau terbentuk dari eksplan buku kotiledon lima varietas kedelai yang dievaluasi" Proporsi eksplan yang membentuk tunas adventif (PEMT) berkisar dari 3lo/o (pada varietas Jaya Wrjaya) sampai dengan 76Yo (pada varictas
(menunjukkan warna biru pada.iaringan daun) dalam
rnengandurrg glLrfbsinat
asai lristokimia GtjS (Garnbar
dari eksplan yang diinokulasi Et{Al0l berkisar 2,6 - 6$% (Tabel 2)" proporsi eksplan yang
menghasilkan tunas trangenik dari eksplan varietas Slamet yang diinokulasi NTL4-Cry5 sebesar 3,3o/o,
lebih rendah daripada yang diinokulasi EHAl0l
(4.6%\. Eflsiensi tersebut lebih rendah daripada efisiensi sebesar l6"4Yo yang dilaporkan oleh Olhoft et al. (2002). DisimpLrlkan bahwa prosedur yang sering digurrakan untuk transformasi genetik kedelai
kelompok kernasakan (nutturiry* group) IV-V ternyata cukup efisien untuk transformasi genetik lima varietas yang tennasuk kelompok kemasakan XII. Prosedur yang digunakan dalam penelitian ini lelah digunakan dalam transformasi gerretik yang menghasilkan tarraman kedelai transgenik dari varietas A3231 (7,hanget u|.,1999: Clemente et al..
dan l0%. Dapat disimpulkan bahwa media dan prosedur regenerasi yang digunakan dalanr penelitian ini (Zhang et ul., 1999; Clemente er rrl..
2000) relatif optimal atau sesuai unluk meregenerasikan tunas dari eksplan varietas Jaya Wijaya, Krakatau, Slamet. Tampomas. dan Wilis. Lima varietas tersebut termasuk kelonrpok
2000).
kemasakan (maturity group) XII; sedangkan prosedur regenerasi tersebut dioptimasi untuk genotipe kedelai kelompok kemasakan lV - V. Tunas adventif yang dilaporkan pada T'abel I sudah mengalami proses seleksi yaitu ditumbuhkan pada media yang ntengandung glulosinal sclatna 4 minggu. Pada awal proses seleksi, jumlah tunas adventif yang terbentuk .iauh lebih banyak daripa
f)ari tiga percobaan yang dilakukan, diperoleh 27 tunas transgenik independen (Tabel 2). Tunas transgenik tersebut berhasil diakarkan. Konfirmasi integrasi gen (iUS ditunjukkan oleh autoradiogram sebagai hasil dari analisis hibridisasi Southem (Garnbar I sebelalr kanan). Jumlah kopi gen GUS yang terintegrasi relatif rendah yaitu berkisar antara I sampai 4. Data Southern pada transformasi genetik kedelai menggunakan Agrobacterium pada kedelai (Z.hang et ul.. 1999) danjagung (Frame el ul.. 2002) .iuga rnenunjukkan junrlah kopi gen terirrtegrasi berkisar antara I sampai 4.
non-transgenik mati dalam media seleksi: sebaliknya tunas adventif transgenik tumbuh terus. Tunas dan plantlet transgenik berhasil
Proporsi eksplan yang membentuk tunas adventif (PEM]-) dari eksplan dari eksplan buku kotiledon enam varietas kedelai pada 3l hari setelah irrokulasi (HSI). Pada 3l HSI, ekspian telah dikulturkan pada media yang mengandung 5 rng/r glurosirrat selarna 4 rninggu
Varietas kedelai Jaya Wijaya Krakatau Slamet Tampomas
Wilis BNTo.o5
Ket.
:
*)
Percobaan I Percobaan Il (Strain NTL4 (strarn (St N I 4gyr*___ Cry5) G1r9gL!'l8c-II .--------"------- v, 31 b-,
Percobaan III
Nilai tengah
_G!e!r|!lla-cry5)
varietas
34 ab
16a
48a
64 ab
l0 ab 26h
34
2t
Dua nilai tengah dalarn satu kolom yang
ctiikutiE;ilf
uji I-SD pada oc :0,05 **) Varietas Krakatau tidak diikutkan clalam Percobaan I 98
sebelalr kiri).
antara
ekplan yang responsif dalam regenerasi in vitro via organogenesis menggunakan eksplan kotiledon tua dan muda varietas Wilis berturut-turut sebesar 4l-q6
1'
I
positif
Proporsi eksplan yang menghasilkan tunas trangenik
Slamet). PEMT varietas Slamet dan -lampornas cenderung lebih tinggi daripada Jaya Wiiaya dan Wilis. Pardal et al. (1997) nrelaporkan proporsi
Tabel
dan bereaksi
tio 62 ab -58
ab
44h
3l 53
62 44 45
23
.r;,,s;ffiiArk hti*d, nvata berdasarkan
Jurnul Agrotropikn IX(2):95- l0l ,De sember 2004
Utomo : Trunsfornrusi genetik kedekd menggunilron Agrob*cteriunt
Tabel 2. Jumlah beserta proporsi tunas yang tumtruh pada media mengandung glufosinat selama 10 minggu: dan jumlah beserta proporsi tunas independen yang mengepskresikan GUS dan tumbuh pada media y'ang mengandungglufosinat. DatapadaTabel2inimerupakanhasilrangkumantigapercobaan.
Varietas kedelai
Strain
A
gr
ob
ac t er iu
nt
vektor transfonnasi
I
Jurrlali eksplan yang
diinokulasi
Jumlah dan proporst
Jumlah dan proporsi tunas yang tumbuh pada media mengandung glufosinat selama 10 rninggu
tr"rnas independen yang
nrengepskresikan GUS dan tumbuh pada media
mengandung glufosinat
Jaya Wijaya
EHAl0l / pPTN289
73
4 (5,5%)
4 (5,5%)
Krakatau
EHA101 / pPTN289
1q1
5 (2,6%)
5 (2,6%)
Slamet
EHA10l / pPTN289
174
t7 (10,5%)
Slamet
NTL4-Cry5 / pPTN289
60
2 (3,3%)
2 (3,3%)
Tampomas
EHAI0l / pPTN289
193
5 (2,6%)
5 (2,6%)
Wilis
EHA10l / pPTN289
46
5
I
(4,6%)
3 (6,5%)
(10p%)
-k' L/f
E6 -xgl{ 3 E 6'6'a
S -r S fr F6. *Y -E e "G .A' 6' F X:;+ t+rllllll \-
EEEEE*MME
=X N t\
\,:, Vt
rA
rA
ftz.ltt
Probe- GUSplus Gambar
I. A: potongan daun kedelai; GtJS (beta-glucuronidase)
terekspre,si pada daun sebelah kanan (warna biru
jika dicetak berwarna, sebaliknya GUS tidak terekspresi pada dann nontransgenik var. Krakatau (sebelah kiri).
B:
autodiogram analisis Southern potongan darur yang diambil dari enam transforman independen. Lajur + adalair kontrol positif yaitu vektor pFTN289 yang dilinierkan. Lajur (Tampomas) WT dan (ay9) WT adalah non-transgenil< (v,ilcf types), tidak menunjukkan pita DNA. Hibridisasi menggunakan pelacak (probe) GUSplus. Lajur 4-l (Tampomas), 2-l (Jay9), 2-2(Jay9), berturut-turut aclalah tanaman transgenik dari eksplan var, Tampomas dan Jaya Wrjaya. Lajur 5-2 (EW), 5-1 (EW), dan 5-3 (EW) adalah tanaman transgenik dari eksplan var. Willis yang diinokulasiAgrobacterium strain EHA10l "
I urnol Ag rotrop ik a IX(2) : 9 5 - I 0 l,Des
e
mb
e
r 2 0 {,14
utomo
:
Transformasi genetik *ederai menggunuknn Agrohacterium
KESTMPTILAN
I)ascasarjanrr
Proporsi eksplan buku kotiledon kedelai yang menghasilkan tunas berkisar dari 310lo (r,arietas Jaya
Wtjaya) sampai
76%o (varietas
Slamet).
Kedelai
transgenik berhasil diperoleh dari lima varietas yang dievaluasi dengan efisiensi berkisar antara 2,6%o sampai 6,50lo (cukup efisien). Kedelai transgenik hanya diperoleh dari eksplan yang diinokulasi strain EHA l0l dan NTI-4-Cry5, bukan dari C58C l.
UCAPAN TBRIMA KASIH Penelitian ini dilaksanakan ketika penulis sebagai peneliti tamu di Plunt 'fransforruotion Crtra Research l'acitity, Univer.sity of Nebruska-Lincnln I
(PTCRF-UNL), [.incoln. Nebraska. Amerika Serikat. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Thomas E. Clemente (Direktur PTCRF-UNI-
dan Shirley Sato atas dukungan dana,
)
bantuan
teknis, dan fasilitas untuk penelitian.
Clemente, T., B. J. LaValle, A. R. Howe. D. C_-. Ward, R. J. Rozman, P. E. Hunter, D. L. Broyles, D. S. Kasten, and M.A. Hinchee. 2000. Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Apyobocterium-mediated transfonnation. Crop Sci. 40:197-803. Dellaporta, S.L., J. Wood, and J,B. FIicks. 19g3. A plant DNA minipreparation: Version il. plant Mol. Biol. Reptr. 1:19-21. Di, R., V. Purchell, G. B. Collins, and S. A. Ghabrial. 1996. Production of trasgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gelre. plant Ce ll Rep. l5:746-750. Frame, B. R., H. Shou, R. K. Chikwantba, Z. Zhang, C. Xiang, T.M.. Fonger. S. Ellen, K. pegg, ts. Li, D.S. Nettleton, D. pei, and K. Wang. 2002. Agrobacterium tumefacrers-Mediated 'Iransformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector System. plant Physiol. 129:13-22. Gamborg, O.L., R.A. Miller, and K. Ojima. l96g. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell. Res. 50:15 l_ 58.
Gustian. 2002. Transformasi Genetik Bantuan Agrobacterium
dan
dengan Regenerasi
Tanaman Transgenik pada Kedelai (Glyc:ine Merr). Progranr
mca L.
Hinchee M.A.W.. [).W.L'onrror-Ward . C.A. Newell. R.E,. McDonrrell, S..1. Sato. C.S. Casser. D.A. Fischhoff. D.B. Re. I{."f. Fraley, and R.B. [-{orsclr. 1988. production ol transgenic soybean plants using A gro b oc t e r ium_mediated DNA transfer. Bio/T'echn ol. 6:9 I 5 -922 Jefferson R.A.. T.A. Kavanagh., and M.V. Bevan. 1987. GtJS fusions: B-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMB0 J.;6:390 I -3907.
Mazur. B, E. Krebbers, and S. Tingey. 1999. Gene discovery and product development for grain quality traits. Scien ce 2g5:372-37 5. Olholt'. P.M.. I-.U. trlagel, C.M. Donovan, and D.A. Scrmers. 2002. Frfficient soyhean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary method. Pardal, S. J., A.Sisharmini. E. Listanto. dan M.
I{erman. 2000. Regenerasi tanaman kedelai hasil transfonnasi dengan GUS dan proteinase inhibitor (pinlt). Prosiding Ekspose Hasil
DAFTAR PUSTAKA
I
lnstitul perlanian Bogor. I l0
Iralarnan.
Penelitian Bioteknologi pertanian. Balitbang, Deptan.
Pardal, S.J., D.R. []ntari,
A. Sisharmini, D.Riyadi. dan M.Flerman. 1997. Regenerasi kedelai secara in vitro, halantan 27-39. Dalam S. Moeljopawiro, M. Herman, S. Saono. I. Mariska. B. Purwantara, dan H. Kasim (eds.). Prosiding Seminar Bioteknologi pertanian Indonesia. Surabaya l2-14 Maret lgg7.
Perhimpunan Bioteknologi
pertanian
lndonesia, Bogor.
Parrott, W.A., J.N All. M.J. Adang, M.A. Bailey. H.R. Boerma, and C.N. Stewart. lgg4. Recovery and evaluation of soybean plants transgenic for a Bac.illu,s thuringiensis var. kurstaki insecricidal gene. In Vitro plant 30P:144-149. Southern. E.M. 1915. Detection of specific sequences among DNA fragments separated bl gel electrophoresis. J. Mol. Biol.;9g:503_5 I 7. Stachel. S.E., E. Messns. M. Van Montagu, and p. Zambryski. 1985. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells
that activate T-DNA transfer
in
Agrobacterium tume.fucien,s. Nature 3lg:624_ 629.
Stewart, Jr., C.N., M.J. Adang, J.N. All, H.R. Roerma, G. Cardineau. D. Tucker, and W.A. Parrott. 1996. Genetic transformation. recovery, and characterization of fertile sovbean transgenic fbr synthetic Bacillus
Jurnal Agrotropika IX(2) :95- I 0 I,Desemher 2004
: Transforntasi thuringiensis CryA c gene. Plant Utomo
ltr
il.
{
genetih kedelai menggunakan Agrobacterium Physiol.
112:12l-129. Townsend, J.A. and L. A. Thonras. 1996. lVlcthod of A gr ob a c I e r i u m-mediated tran s lormat on o f' cultured soybean cells. U. S. Paterrt 5 563 055. Date issued: 8 October 1996. Tridiati. 1994. T'ransformasi Beberapa Varietas darr i
B
ic 3d
Galur Kedelai dengan
Menggunakan
,,lgrohucterium tumertrc.iens. Tesis Master. Prograrn Pascasariana Institut Pertanian Bogor. l8 hal. Zhang.2.. A. Xing, P. Staswick. l'. Clernente. 1999. -['he use o{'glufosinate as a selective agent in Agrchacterium-medialed transformation of soybean. I'lant Cell 'l'issue Organ Cult. 56:3746.
ne rin
I
5€ o
di. lai S"
I. ;.
1.
;an
)an
)i nts ar.
mt
rk t1 P. ratr :l
[' irr
,R,
It
;I Ius
Iurnal Agrotropiko IX(2):95- I 0 l,Desemher 2004
t01
