Glia-neuron interakció aspektusai. Neuron-glia metabolikus együttműködés

Glia-neuron interakció aspektusai Agyi mikrokörnyezet szabályozása

Neuron-glia metabolikus együttműködés

Neurovaszkuláris kapcsoltság

ion, víz homeosztázis szabályozása

glutamát-glutamin ciklus

neurovaszkuláris unit (NvU)

neurotranszmitter homeosztázis szabályozása

asztrocita – neuron laktát sönt

glutathione prekurzor szintézis …. ascorbate

lokális véráramlás gliális szabályozása gliális BBB kontroll

Glia-neuron interakció aspektusai

tripartite synapse neuron  glia szignalizáció neuron/glia szinapszisok glia  neuron szignalizáció, gliotranszmitterek

neuronális hálózatok kontrollja

Neurogenezis Neuronal guidence

Patofiziológiai aspektusok agyi ödéma

glia mint őssejt glia mint őssejt-niche tagja

glia és az axon pathfinding

szinaptogenezis, szinapszis fenntartása, eliminációja

máshol tárgyalva

Szinaptikus működés szabályozása

akut léziók (trauma, stroke) krónikus neurodegeneratív kórképek

neuroimmunológiai reakciók (mikroglia !) remodeling and recovery of neuronal function

Glia-neuron interakció

Metabolikus együttműködés

Agy – metabolikusan legaktívabb szervünk: - a teljes testtömegnek csak 2 %-a, de - de a teljes vérellátás 15%-a - a teljes oxigén felhasználás ~20%-a - a teljes glükóz felhasználás ~25%-ra az agyban történik. Neuronális aktivitás – metabolikus változások – hemodinamikus változások kapcsolatának vizsgálata: Glükóz konzumpció: FDG-PET (FluoroDeoxyGlucose-Positron Emission Tomography (FDG-PET) [18F]-2-FDG

Oxigén konzumpció: oxyhemoglobin deoxyhemoglobin (HbO2/Hb) szint változás mérése: Blood Oxygen Level Dependent-Magnetic Resonance Imaging (BOLD-MRI) [15O]H2O

Bonvento 2002

Vérátáramlás mérése: H2O-PET.



Neuronok energetikai problémái • nincs direkt hozzáférésük vérben szállított tápanyagokhoz -

vérben fő tápanyag: glükóz és albuminhoz kötött zsírsavak pl. tüdő, szív mindkettőt hasznosíthatja, de a BBB az albumint kizárja: agyban glükóz „monodependencia” glükóztól is 4 membrán (2 endotél, 2 asztro) választja el a neuront (kapilláris asztro végtalp borítottsága 99,7% !, lásd később)

• hosszú diffúziós útvonalak -

pl. ATP a sejttestől 1 mm-re 1 óra alatt diffundálna pl. a denritben, miközben ATP turnover másodperces !

• kis méretek (dendrittüske, axonátmérő, stb) okozta metabolikus kihívás (metabolic challenge) -

EPSP (a nagy energiafelhasználók) a felületen történnek: ATP pedig a citoplazmában képződik. Minél vékonyabb egy neuronális nyúlvány, annál nagyobb a felület/térfogat arány: saját energiaellátás annál rosszabb. Asztro nyúlványban ezzel szemben egy nagyságrenddel gyorsabb a diffúzió, mint pl. transzporterek vagy metabolikus enzimek turnovere.

• fluktuáló energiaigény -

mikor egy neuron nyugvó állapotból 10 Hz tüzelésbe kezd, ATP felasználása 7x nő: tehát gyorsan reagáló ATP pótló rendszer kell : másodperceken belül kell új ATP !

• energiaraktározás hiánya

L. Felipe Barros 2013

wiki

Glycolysis and its branches

PPP

PPP Neuronban van glycogen synthase, de inaktív. Ha inaktivitása mutálódik: aberráns neuronális glikogén felhalmozódás: Lafora disease. epilepszia, mental deterioration L. Felipe Barros 2013

HEK : hexokinase PFK: phosphofructokinase PK: pyruvate kinase PDH: pyruvate dehydrogenase GP: glycogen phosphorilase G6PD: glucose-6-posphate dehydrogenase GS: glycogen synthase LDH: lactate dehydrogenase PC: pyruvate carboxylase



Neuronok • evolúciósan sok fajban neuronak egyedül kellett megoldania e sok problémát - de aztán jött az asztro… • neuronok energiaigénye magasabb, mint metabolizálják a glükózt - tenyészetben - szeletben - FACS szerint

asztroé,

de

lassabban

• neuronokban a phosphofructokinase működése funkcionálisan gátolt: pentose phosphate kör aktív: redukáló környezet (oxidatív stressz elleni védelem !) • emiatt viszont neuronokban glikolízis nem effektív : bezzeg asztrocitákban: asztro ATP hiány esetén erőteljes glikolízisbe kezd !! • asztrocitákban viszont pyruvate dehydrogenase foszforlició által tónusosan gátolt: asztro a laktát termelés és export felé van eltolva • asztrociták glikogénből is inkább laktátot állítanak elő

- patkány HC: tanulás során ec. glikogén eredetű laktát szint nő - gliális laktát transzporterek (MCT4 vagy MCT1) kilövése amnéziát okoz, amit Llaktát visszaállít (de a glükóz nem !!) - neuronális laktát transzporter hiánya szintén amnéziához vezet, amit sem a laktát, sem glükóz nem állít helyre

- ex. glükóz csökken, laktát nő az agyban mikor patkány térbeli memória feladatokat csinál - ha laktátot injektáltak HC-ba, memória javult ezen feladatoknál !!! - ha asztrogliális glikogenolízist gátolták, memória romlott - ha neuronális laktáttranszportereket gátolták, memória romlott

GFAP/PAS

NeuN/PAS

Glikogén: Periodic Acid Schiff's Reaction (PAS)



Neuronok

• Lényeg: neuronok a glikolízist „kiszervezik” asztrocitákba. Ennek előnyei neuron számára:

- neuron antioxidáns státusza érintetlen marad - asztro nyúlvány neuron körül sokkal nagyobb téfogatú: jóval több laktát tud itt keletkezni - gap junction hálózaton is tud glükóz/laktát terjedni (bár laktát GJ transzport függ a membrán-potenciáltól, ami az MCT transzporterekre nem igaz) - de ez jó is, mert neuronális aktivitásnál a laktát a közeli asztroban koncentrálódik ! - laktát termelés térben szeparált és független a neuronális működéstől

Glia-neuron interakció Neuroenergetika (alap) GLUT3: neuronális glükóz transzporter

GLUT1: gliális glükóz transzporter

Luc Pellerin et al. 2007, 2010

Asztro: glikogén raktár ! MCT: laktát transzporterTCA cycle (monocarboxylate)

Agyban: glükóz (majdnem) teljes oxidációja (6CO2+6H20) !!

Agyi glikogén: (humán): 0,5-1,5g (0,1% of total brain weight)

Glutamáterg aktiváció: korai fázis

1. Glu ürülés szinapszisban AMPA receptor aktiváció, EPSP, Na+ belépés 2. depolarizációs hullám, fesz. függő Na+ csatornák nyílnak, Na+/K+ ATPáz visszaállítja iongradienst - ami sok energiát használ

3. oxidatív foszforiláció aktiválódik, NADH elhasználódik

5. De: AMPAR aktivációra a neuronális glükóz felvétel csökken

4. Citromsavciklus felpörög - piruvát elhasználódik, nő a glükóz és laktát lebontás 6. főleg laktátot használ az idegsejt !

Glutamáterg aktiváció: késői fázis

GLAST: be: 1 glutamát, 3 Na+, 1 H+ ki: 1 K+

1. A szinaptikus résbe kerülő glutamátot az asztrocita felveszi (GLAST, GLT1 glutamát transzporterek) 2. ez nagy Na+ influxot is jelent, amit Na+/K+ ATPáz állít helyre 3. és aktiválódik a glükóz transzport 4. és a glükóz feldolgozás is a gliában 5. a glikolízis nagy citoplazmás NADH szint növekedést okoz ami segíti piruvát→laktát átalakulást, és a laktát ürülést

Glutamáterg aktiváció: intenzív és hosszútávú stimuláció 1. intenzív glutamate reuptake asztrocitákban, és az ec. glükóz készlet hamar kimerül 2. ilyenkor a gliális glikogén mobilizálódik 3. glikolízis az elsődleges energiatermelési útvonal ilyenkor

- asztro glikogénje lokálisan, saját környezetében hasznosul

4. és a laktát termelődés biztosítja a magas glikolitikus rátát

- a raktározott glikogén 20 perccel növelheti meg az axon funkcióképességi idejét

Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Amiről eddig beszéltünk : Asztrocita – neuron laktát sönt hipotézis (ANLSH)

Astrocyteneuron lactate shuttle Hipotézis !!! arról, hogy a neuronális aktivitás és glükóz felhasználás az asztrociták aerob glikolízisét és a neuronok laktát hasznosítását vonja maga után.

Dienel GA, Cruz N. 2004 Pellerin et al. 2007

A „neurometabolikus community” megosztott: csak glükózt vagy laktátot is használ az agy energiaként !!


Metabolikus együttműködés G protein-coupled receptor GPR81, also known as hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCA1 or HCAR1) = lactate receptor GPR81 has been “deorphanized” recently: 20082009


Metabolikus együttműködés A: electron micrograph showing double immunogold labeling at synapses between parallel fiber terminals (T) and Purkinje cell spines (S). The section was double-labeled with antibodies to GluR2/3 (15-nm gold particles) and to MCT2 (10-nm gold particles). B: the membranes of the Bergmann glia facing the parallel fiber terminals and Purkinje cell spines are labeled with antibody to MCT4 (10-nm gold particles). C: the lactate receptor (10-nm gold, red arrowheads) is at the postsynaptic membrane (black arrowheads). Synapse of a nerve terminal (t) and a dendritic spine (s) is shown. Stratum radiatum, hippocampus CA1.

D and E: the lactate receptor GPR81/HCAR1 (green) is in the pyramidal cell somatodendritic compartment including spines (white arrows in D). Hippocampus CA1. Neurons labeled for MAP2 (red), nuclei with DAPI (blue).

Gundersen 2015



Asztrociták számos olyan metabolikus kulcsenzimet expresszálnak, melyek a neuronokban nem fordulnak elő: • glutamát-glutamin ciklus: GS – glutamin synth(et)ase

lásd korábban

• glikogén mobilizáció: glikogén foszforiláz

lásd Asztrocita – neuron • oxálacetát anaplerotikus szintézise: pyruvát karboxiláz (azokat laktát sönt a reakciókat, amelyek a citromsavciklus köztitermékeit hozzák hipotézis létre, anaplerotikus reakcióknak nevezzük) (ANLSH) • taurine szintézis: cysteine sulfinate decarboxylase • glycin metabolizmus: glycine cleavage system (glycine decarboxylase complex or GCS, több enzim), nagy glycin koncentrációk aktiválják

• neuronális glutathione szintézis prekurzorainak előállítása

lásd később



ROS (reactive oxygen species) – reaktív oxidatív szabadgyökök Hidroxilgyök OH• Szuperoxidgyök O2 –• Nitrogénoxid-gyök NO• Lipidperoxil-gyök LOO• Hidrogén-hiperoxid H2O2 Szuperoxid anion O2Hipoklórossav HOCl Ózon O3 Nitrogén monoxid NO Peroxynitrit ONOO-

ROS káros hatásai:

Pl. stroke esetén:

oxidatív stressz

- DNS károsítás - lipid peroxidáció - fehérje károsítás - enzimek oxidatív inaktiválása http://journals.prous.com/journals/dot/20033901/html/dt390019/images/Kulkarni_f4.gif



Neuronális glutathione szintézis prekurzorainak előállítása asztrocitákban • Glutathione (g-glutamylcysteinylglycine, GSH): szulfhidril (-SH) antioxidáns, antitoxin, enzim kofaktor. GSH nagyon fontos a ROS detoxifikációban !! • a GSH egy tripeptide C10H17N3O6S, mely egy-egy aminosav gyököt tartalmaz az alábbiakból: glutamát, cisztein, glicin A GSH szulfhidril csoportja alkalmas a ROS nem enzimatikus redukálására. A GSH keletkező, oxidált formája két molekulából áll, melyet diszulfid híd tart össze (GSSG).

Glutathione hiány esetén: súlyos károsodások, neuronvesztés !!!!

Glycolysis and its branches

PPP során GSH keletkezik: !!! PPP

PPP Neuronban van glycogen synthase, de inaktív. Ha inaktivitása mutálódik: aberráns neuronális glikogén felhalmozódás: Lafora disease. epilepszia, mental deterioration L. Felipe Barros 2013

HEK : hexokinase PFK: phosphofructokinase PK: pyruvate kinase PDH: pyruvate dehydrogenase GP: glycogen phosphorilase G6PD: glucose-6-posphate dehydrogenase GS: glycogen synthase LDH: lactate dehydrogenase PC: pyruvate carboxylase

Glia-neuron interakció glutamát, cisztein, glicin Glutathione


xCT

Glycine

Asztrociták glycint és glutamátot az EC térből akkumulálnak .

Az ic. cystine cysteine – né redukálódik. Ez a glutamáttal γ-glutamylcysteine – t alkot (γ-GluCys). Ez a dipeptid gylicin inkorporációval tripeptiddé, glutathionná (GSH) alakul .

Hertz, Zielke 2004

A cystine-t cystine/glutamate exchanger (xCT) révén veszik fel.



Glutathione xCT

Hertz, Zielke 2004

Neuron nem képesek a cystine  cystein redukcióra, így gliális glutathione-tól függnek !

A GSH-t a γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT) alakítja át: cysteinylglycine (CysGly) és glutamát keletkezik. A cysteinylglycine-t a neuronális felszínen egy másik ektopeptidáz, az aminopeptidase N (ApN) hasítja: glycine és cysteine keletkezik. Mindkettőt a neuron akkumulálja. A neuronokban újra γ-glutamylcysteine keletkezik cysteine és glutamate felhasználásával (glutamát glutaminból vagy újrafelvételből származik). Végül glycine hozzáadásával elkészül a neuronális glutathione.

Glia-neuron interakció aspektusai Agyi mikrokörnyezet szabályozása

Neuron-glia metabolikus együttműködés


ion, víz homeosztázis szabályozása

glutamát-glutamin ciklus

neurovaszkuláris unit (NvU)

neurotranszmitter homeosztázis szabályozása

asztrocita – neuron laktát sönt

glutathione prekurzor szintézis …. ascorbate

lokális véráramlás gliális szabályozása gliális BBB kontroll

Glia-neuron interakció aspektusai

tripartite synapse neuron  glia szignalizáció neuron/glia szinapszisok glia  neuron szignalizáció, gliotranszmitterek

neuronális hálózatok kontrollja

Neurogenezis Neuronal guidence

Patofiziológiai aspektusok agyi ödéma

glia mint őssejt glia mint őssejt-niche tagja

glia és az axon pathfinding

szinaptogenezis, szinapszis fenntartása, eliminációja

máshol tárgyalva

Szinaptikus működés szabályozása

akut léziók (trauma, stroke) krónikus neurodegeneratív kórképek

neuroimmunológiai reakciók (mikroglia !) remodeling and recovery of neuronal function


Neuron  Glia szignalizáció

Neuron  Glia szignalizáció

Glia  Neuron szignalizáció

2. Neuron/glia szinapszisok !

2. 1.

Gliotranszmisszió

1.

synapses

3.

Tripartite synapse, periszinaptikus asztro végtalp N  G : neurotranszmitter spillover G  N : neurotranszmitter konc. szabályozása circuits

Nem szinaptikus szignál pl. transzendocitózis, egyéb

3. 4.

Neuronális hálózatok Kontrollja

Asztro morfológiai remodelling

5. Viselkedés kontrollja

„Tripartite” szinapszis

„In 1994, Vladimir Parpura and colleagues conducted a set of experiments making an intriguing discovery: cultured astrocytes release glutamate, which leads to Ca2+ elevation of nearby neurons. Later studies demonstrated that this process can be observed in acute brain slices and in vivo. Astrocytes were later shown to release a number of chemical transmitters, including ATP, D-serin, TNF-alpha, and ANP in a process that has recently been termed gliotransmission. Based on the early studies of gliotransmission, the concept of the tripartite synapse was proposed highlighting the role of the astrocyte as a third active element in information processing at the synapse. Although many aspects of this astrocytes-to-neuron communication are still to be elucidated the introduction of molecular genetic tools is shedding light on the neuromodulatory roles of astrocytes on brain function at the level of synapses, circuits, and behavior.” Halassa 2007, 2010


Neuron   Glia glia szignalizáció szignalizáció Glutamaterg szinapszis.

- neuronok stimulációja Ca++ szignalizációt indukál asztrocitákban - asztrociták “érzékelik” a neuronális aktivitás intenzitását: ha a szinaptikus aktivitás nő – nő a glia Ca++ oszcilláció frekvenciája is

- Asztro is rendelkezik “memóriával”, mint neuron: intenzív neuronális aktivitás esetén neuronális EPSP amplitúdója nő (LTP !) ÉS a gliális Ca++ válasz frekvenciája is nő ! Verkhratsky Butt 2007

Glia-neuron interakció Példa 1. Hippocampus

Neuron  Glia szignalizáció 1. N  G : neurotranszmitter spillover Figure 1.5. Hippocampal pathways and their stimulation Signals from the entorhinal cortex (EC) enter the dentate gyrus (DG) via the perforant path (PP). From the DG granule cells information travels to the CA3 pyramidal neurons via the mossy fibers. From the CA3 neurons the signal leaves via the Schaffer collaterals and joins with the commissural fibers (Comm.) from the contralateral CA3 making connections with CA1 pyramidal neurons. Signals leaving CA1 then travel to neurons within the subiculum.

http://www.angelfire.com/yt/yas709neuroscience/hippocampus.htm

A bipolar stimulating electrode was placed on the Schaffer collateral and commissural (comm.) fibers. Recording electrodes placed in the dendritic layer and/or the pyramidal layer of CA1 will record an Excitatory Postsynaptic Potential (EPSP) or a population spike (PS) following stimulation, respectively. EPSP represents the response at the CA3-CA1 synapse and the PS represents the number of pyramidal cells firing and the contribution of the EPSP at that location. The top portion of the figure demonstrates the four layers that the CA1 pyramidal neuron lies within (S. denotes Stratum). The small neuron with a letter “I” represents an inhibitory interneuron. The pathway diagramed in the top portion of the figure corresponds to the recurrent inhibitory loop in area CA1.



Példa 1. Hippocampus

Schaffer-kollaterálisok stimulációja [Ca++] ic növekedést vált ki CA1 stratum radiatum asztrocitákban

1. N  G : neurotranszmitter spillover

- kis szinaptikus aktivitás csak mGluR-t aktivál asztron - nagy szinaptikus aktivitás mGluR-t és AMPAR-t is aktivál - repetitív Ca++ szignálokat csak a nagy-frekvenciájú stimuláció vált - az asztro nyúlványokban a Ca++ válaszok aszinkron természetűek: az asztrociták különböző, relatíve izolált kompertmentumai egyedi vagy néhány szinapszis aktivitását követik

Porter, Porter,McCarthy McCarthy1996 1996


Neuron  Glia szignalizáció 1. N  G : neurotranszmitter spillover

a: stimuláció előtt

b,c: stimuláció után (200 mA, 50 Hz, 2 sec)

[Ca++]ic

Ca++ szenzítív fluoreszcens festékkel töltött asztrociták

d: stimuláció után 28 sec e: GFAP immunfestés azonosítás Porter, Porter,McCarthy McCarthy1996 1996

Glia-neuron interakció Példa 2. Cerebellum

Hoogland 2010 Tanaka 2008

http://oraculartree.com/works/scientific-constructs

BGC: Bergmann glial cells PC: Purkinje cell ml: molecular layer AC: cerebellar astrocytes (velate protoplasmic astrocytes) gcl: granule cell layer wm: white matter



Példa 2. Cerebellum

1. N  G : neurotransz mitter spillover

-parallel rost/Purkinje neuron szinapszisokat Bergmann glia körbeveszi -parallel rost stimulációra Bergmann gliában erősen lokalizált Ca++ válaszok jelennek meg – szignalizációs mikrodomének

“függelék” Bergmann glia főbb nyúlványa

A: kísérleti felállás: parallel rost stimuálció – Bergmann glia Ca++ imaging B: Bergmann glia Oregon green 488 BAPTA-1 Ca++-szenzitív fluorfestékkel feltöltve. Ca++ mérés több régióban C: Bergmann glia mikrodomének sematikus rajza. Több, közel futó parallel rost egy mikrodomént aktiválhat.

Verkhratsky Butt 2007




1. N  G : neurotranszmitter spillover

Neuronális acetilkolin release asztrogliális Ca++ tranzienseket generál

Szeptumból hippocampusba érkező kolinerg afferensek repetitív stimulációja [Ca2]ic oszcillációkat vált ki a stratum oriensben található asztrocitákon, muszkarinikus AchRec-on keresztül. Araque 2002 Tehát asztrociták távoli axonális inputra is reagálhatnak. Példa 4. Hippocampus

GABAerg interneuronok aktiválják asztrocitákat CA1 piramissejteken szinaptizáló GABA-ergic interneuronok repetitív tüzelése [Ca2]ic szint növekedéshez vezet a környező asztrociták egy csoportjában (paired patch-clamp recordings), GABAB receptoron át, extracell Ca++-tól függő módon. Neuronális gátlás is Ca++ növekedést okoz. Kang 1998 Példa 5. Hippocampus Neurotrophin kiváltotta Ca++ szignalizáció asztrocitákban BDNF (amely neuronokból aktivitás-függő módon ürülhet) a TrkB-T1 receptorokon keresztül késleltetett [Ca2]ic növekedést váltott ki CA1 asztrocitákon. Gliális Ca++ válasz késleltetése, időzítése ! Rose 2003 Reviewed in Volterra, Steinhauser 2004



Szinaptikus kapcsolatok idegi sejtek között

2. Neuron/glia szinapszisok

1: klaszikus ‘tripartite’ neuron–neuron szinapszis, periszinaptikus asztrocita végtalpakkal 2: neuron–glia szinapszis (neuron-astroglia; neuron–NG2-glia) 3: asztroglia–neuron szinapszis (?? which are yet to be discovered) 4: asztroglia–asztroglia szinapszis (elektromos szin. (GJ) vagy kémiai szinapszis) 5: astroglia–oligodendroglia szinapszis (asztro preszin. elem) és: asztro és NG2 sejt Ranvier-féle befűződéseknél potenciálisan kialakíthat szinapszist axonokkal

„these neuron-glia synapses exhibit all the hallmarks of ‘classical’ neuron-neuron synapses, including rapid activation, quantized responses, facilitation and depression, and presynaptic inhibition” Bergles 2010 Verhkratsky, Butt, 2007

Glia-neuron interakció Példák


2. Neuron/glia szinapszisok szinapszis-szerű kapcsolatok hipofízis pars intermedia pituicitái és a nucleus arcuatusból érkező axonok között

norepinephrine terminálisok synaptoid kontaktusokkal végződnek szepto-hippocampalis asztrocitákon

Christian Steinhauser szinapszisok végződnek „GluR” sejteken

szinapszisok

NG2+

sejteken !!

2. Neuron/glia szinapszisok Szinapszis szerű struktúrák hGFAP/EGFP+ gliasejtek és neuronok között. (HC, CA1) A: EGFP+ -t denz peroxidáz reakció jelöli. B: EGFP+ gliát fekete nyilak rajzolják ki (immunogold) A, B: inzerteken glia-neuron kontakt területek C, D: szinapszis-szerű struktúrák. Poszt-szinaptikus denzitás (nyílhegy) az EGFP+ glián (ezt körökkel jelölt immungold szemcsék jelölik). Szinaptikus vezikulák vannak preszinaptikusan. (mit): mitokondrium, ER: fekete nyílhegy Jabs 2005


Jabs 2005, Bergles 2010

Legalább kétféle preszinaptikus neuron (glutamaterg CA3 piramissejt és GABAerg interneuronok) innerválják az NG2 sejteket. Ezek posztszinaptikus áramai jól megkülönböztethetőek.

Neuron-NG2 szinaptikus kapcsolat potenciális funkciója: NG2+ sejt myelináló oligodendrogliává való differenciálódásának szabályozása neuronális aktivitás függvényében !

erre már kezd gyűlni némi bizonyíték:


Neuron  Glia szignalizáció 3. Nem szinaptikus szignál pl. transzendocitózis, egyéb

RNS axonális transzportja

Dia az „Axonális transzport” előadásból!!

Gliasejt / axon transzcelluláris transzfer hipotézise Spekulatív modell

Egyelőre: ???

Ribonucleoprotein particles (RNPs)

Asztrocita HC-ban tudja fagocitálni a degenerálódó butont ÉS a leváló „spinule” transzendocitózissal bejuthat gliába. TALÁN fordított irányú kommunikáció is lehetséges ! (Spacek 2004 JNeurosci) Sossin 2006

HEK sejt, purinerg aktiváció (blebbing – sejt nem pusztul el)






2. 1.

Gliotranszmisszió

1.

synapses

3.



3. 4.



5.

behaviour

Viselkedés kontrollja

Glia-neuron kapcsolat Glia-neuron interakció


Neurotranszmitter gyors eltávolítása, szinaptikus hatékonyság megőrzése:

1. G  N : neurotranszmitter konc. szab.

A. Uptake Részleteket lásd korábban:

[Glu]ec koncentráció szabályozása

[GABA]ec koncentráció szabályozása illetve egyéb, szinapszis-típustól (pl. monoaminerg, etc.) függő uptake - amihez megfelelő gliális transzporterek társulnak

B. Kötő-fehérje release: Központi kolinerg szinapszisokban: periszinaptikus asztrociták acetylcholine-kötő fehérjét (AChBP) szintetizálnak és ürítenek a szinaptikus résbe. E fehérje gliális szekréciója intenzív kolinerg stimulációra nő.


Glia  Neuron szignalizáció 2. Gliotranszmisszió

• neuronok által aktivált gliális Ca++ szignalizáció következtében gliotranszmitter (pl. Glu) release asztroból • ez visszahat a neuronműködésre: AMPA/NMDAR-on át direkt posztszinatikus neuronális depolarizációt okozhat ILLETVE preszinaptikus mGluR-t is aktiválhat • gliotranszmitter ATP is lehet: vagy P2 purinreceptorokon át direktben hat vagy adenozinná bomlik, és P1 receptorokon hat

gliális [Ca++]ic ↑: bekövetkezhet még spontán vagy pl. elektromos vagy mechanikus stimulálásra

Glia  Neuron szignalizáció 2. Gliotranszmisszió

Volterra, Meldolesi Nature Rev Neurosci, 2005





2. Gliotransz misszió

Heteroszinaptikus depresszió Feed-forward szinaptikus moduláció

1. Glutamát ürül (1, piros folt) amikor a Schafferkollaterális (S) – CA1 piramissejt (P) szinapszis nagy frekvenciájú tüzelése stimulál egy asztrocitát

2. Az asztrocita erre ATP kibocsátással reagál 3. Ez gyorsan adenozinná alakul (2; kék folt), ami egy másik S-P kapcsolatot a preszinaptikus adenozin A1 receptoron keresztül szupresszálni fog ! tonic suppression of synaptic transmission

Volterra, Meldolesi 2005



Azt, hogy adenozin tonikusan aktiválja az A1 receptorokat a HC-ban, már régóta lehetett tudni (1997-98, Cunha, Dunwiddie).

Hogyan jöttek rá arra, hogy mi az ADENOZIN forrása ?

• transzmembrán domén nélküli synaptobrevin 2 citoplazmatikus doménját kondicionálisan, asztrospecifikus expresszáltatták • → ez így dominánsnegatív inhibitora a SNARE-függő membrán fúziónak: asztroban nincs gliotranszmisszió dnSNARE asztrociták



Glia  Neuron szignalizáció 2. Gliotransz misszió

• Schaffer kollaterális - CA1 szinapszisoknál dnSNARE asztrociták mellett erősebb szinaptikus transzmisszió /aktiváció volt, mint a WT egerekben • farmakológiai vizsgálatok szerint ennek oka az extracelluláris adenozin szint csökkenése: pl. A1 adenozin-receptor blokkoló (DPCPX) növelte a szinaptikus transzmisszót WT egérben, de transzgén egérben nem volt hatása

• azt is kimutatták, hogy dnSNARE overexpresszió valójában nem is a gliális adenozin release-t hanem a gliális ATP release-t zavarja meg (ATPt ektonukleotidázok hidrolizálják)

*

Vagyis: egyértelműen asztrociták mediálják a heteroszinaptikus depressziót itt

adenozin sztori izgalmas folytatása a *-jelölt dián később





Szinaptikus transzmisszió asztrociták általi modulációja Szomszédos piramissejtek excitációja és szinkronizációja – nem direkt módon kapcsolt neuronok asztrociták általi összeköttetése

1.

asztrocita spontán [Ca2+]ic oszcillációt mutat

2.

ez gliális glutamát-releaset triggerel (piros folt)

3.

ezt két piramissejt is érzékeli egy időben

4.

szinkronizált NMDAR-dependens áramok generálódnak

excitatorikus

Fiziológiás körülmények között spontán oszcillációk ritkák (szeletben): kb 2 percenként Volterra, Meldolesi 2005





Szinaptikus transzmisszió asztrociták általi modulációja Feedback moduláció Gátló szinapszis potenciációja GABAerg interneuronok és piramissejtek között 1.

GABA ürül (1; sárga folt) GABAerg interneuronpiramissejt szinapszisban, repetitív tüzelés során

2.

a GABA a szomszédos asztrocitán GABAB receptorokat aktivál

3.

ez az asztrocita glutamát ürítéssel válaszol (2; red spot) mely a GABAerg interneuront éri

4.

ez tovább potencírozza (feedback potenciáció) a GABAerg interneuron általi gátlást (3) (decreases GABA mediated synaptic failures) Volterra, Meldolesi 2005


N  G is

2. Gliotranszmisszió

Példa 4. Hipotalamusz neuroendokrin neuronok szekréciós aktivitásának szabályozása asztrociták által HT GnRH neuroendokrin neuronok eminencia mediana, portális keringés hipofízis, gonadotropin (LH, FSH) szekréció véráram, gonádokban gametogenezis szteroid hormonok ürülése ... feedback... stb ..

Neuroendokrin területeken asztro mGluR és AMPAR sejtmembránban kapcsolatban van erbB receptorokkal (EGF rec. család, ligand pl. TGFa, neuregulin) Diedzic 2003

Sisk, Foster 2004



Példa 4. GnRH neuronok szinaptikus aktivációja glutamát, gliális aktivációja PGE2 által.


1. neuronális Glu release

2. Glu aktiválja asztron mGluR-t, AMPAR-t 3. ez mátrix metalloproteinázokat (MMP/ADAM) aktivál melyek katalizálják a pro-TGFa és a proNRG (pro-neuregulin) ektodomén vedlését (shedding) 4. a szekretált érett TGFa and NRG aktiválja az erbB1/erbB2 and erbB4/erbB2 heterodimereket 5. erbB receptorok serkentik a gliális prosztanoidok (pl. PGE2) morphological szekrécióját - ez posztszinaptikus rearrangement neuronális EP2 recetoron át prosztaglandin (PGE2 receptor alosztály) GnRH release-t indukálhat 5. * emelett TGFa és NRG a HT asztro morfológia változását is indukálják Prevot 2010






2. 1.

Gliotranszmisszió

1.

synapses

3.



3. 4.



5.

behaviour

Viselkedés kontrollja


2-3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling

Asztrociták disztális nyúlványai: neuronnal való kontaktus. A: lamella-szerű asztro nyúlvány neuronális sejttestek között és szinapszis (syn) körül. Organellumok ezekben a nyúlványokban nincsenek. GFAP sincs !! B: GLT-1 immunfestés asztro-nyúlványokat rajzolja körül, neuronális sejttesek negatívak. C: ELMI, GLT-1 lamelláris asztro nyúlványokban pre- és posztszinaptikusan (syn, dend). D-E: , D-serine immunfestés asztro nyúlványokban, (oxitocinerg) neuronok negatívak.

Minden kép: nucleus supraopticus-bol (SON)

SON: hipotalamusz, magnocelluáris neuronok (oxytocin, vasopressin)

Glia-neuron interakció Glia  Neuron szignalizáció Szinaptikus borítottság változása


Már régebben, GFAP festésekből is kiderült, a gliamorfológia változik: - hipotalamusz: nucleus supraopticus (SON), suprachiasmaticus (SCN), arcuatus, preopticus : dehidratáció, cirkadián ritmus, fluktuáló szteroid szintek -hippocampus CA1, vizuális cortex: gazdag szenzoros input esetén ! De disztális glia nyúlványok motilitásának változása neuronális működéssel összhangban még egyértelműbb – sok példa

1. Hypothalamo-neurohypophysial system 2. Basal hypothalamus

6. Cerebellum

3. Suprachiasmatic nucleus

7. Barrel cortex

4. Brain stem 5. Hippocampus

8. Neocortex

Lásd: review of Theodosis 2008

9. Visual cortex

2-3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling asztro

SON első alkalommal vemhes; stb

SON nucleus supraopticus: vajúdás, tejelválasztás alatt OT neuronok glia borítottsága nagyon lecsökken – neuronális felszínek egymás mellé kerülnek: asztro retrakció, OT neuron nagyobbodás

Theodosis 2008

Gyors változás: neuroszekréció indukciója után 1 órával már észlelhető, in vivo mérések szerint

Glia-neuron interakció Glia  Neuron szignalizáció Szinaptikus borítottság változása Nem stimulált: pl. szűz vagy elválasztás utáni patkány Stimulált: laktáló és dehidrált patkányok

2-3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling A hipotalamikus szupraoptikus magban az asztrociták morfológiai plaszticitása a tejelválasztással hozható összefüggésbe 1.

oxytocin-termelő idegsejteken levő szinapszisokról asztrociták visszahúzzák nyúlványaikat laktáció alatt

2.

így a glia kevésbé tudja visszavenni a szinapszisba ömlő glutamátot, és diffúzió is jobb (fekete nyilak) – így a Glu képes távolabb elhelyezkedő mGluR receptorokat aktiválni preszinaptikusan vagy szomszédos GABAerg terminálisokon

3.

ez a neurotranszmitter-ürülés homoés heteroszinaptikus modulációját okozza: más glutamaterg és GABAerg szinapszisok működésének modulációja Theodosis 2008


Glia  Neuron szignalizáció 2-3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling D-serine függő metaplaszticitás Szupraoptikus magban (SON) :

(a) asztrocita-eredetű D-serine el tudja érni az NMDA receptorokat, és segíti az NMDAR mediálta transzmissziót és az LTP kialakulását (b) Ha a glianyúlványok visszahúzódnak, a D-serine nem tud ko-agonistaként működni az NMDA receptorokon, LTD alakul ki inkább (c) Gyors asztrocita (zöld) – nyúlvány mozgás a dendrittüske (piros) körül (sec) Theodosis 2008 Halassa and Haydon rev. 2009

Hipofízisben is vannak (pituicita !) morfológiai változások:


Neurohipofízisben pituicita retrakció (szürke) következik be az axonokról és erekről a neuroszekretoros tevékenység aktivációjának hatására: nagyobb release, könyebb véráramba jutás Theodosis 2008 http://www.auburn.edu/academic/classes/zy/hist0509/html/Lec10Endocrineorgans.html


Glia  Neuron szignalizáció 4. Neuronális Hálózatok kontrollja Philip Haydon

Asztro network ???

Halassa 2007 Reichenbach 2010

A, 3 asztrocita. Különböző neuronális kompartmentumokat más-más asztro kontrollálhat.

B, egyetlen asztro is koordinálhat pl. egy több (20-100 ezer!!) dendritből álló csoportot



adenozin sztori izgalmas folytatása

4. Neuronális Hálózatok kontrollja

*

• dnSNARE transzgén egér: asztrocitában nincs (vezikuláris) gliotranszmisszió • csökkent lassú oszcillációk a szomatoszenzoros kéregben

Representative LFP (local field potential) recording showing slow oscillation activity in the somatosensory cortex

In vivo current-clamp recordings from representative neurons showing slow oscillations in the cortex of WT

• asztro ezt a folyamatot két ponton modulálja: 1. adenozin A1 receptor aktiváció gátlódik (tehát heteroszinaptikus gátlás megszűnik) 2. neuronális NMDAR funkció is csökken (itt a gliális D-serine ürülése csökken) ! Tehát asztrocita eredetű gliotranszmisszió valóban befolyásolja agyi hálózatok működését in vivo



Alvás korai kutatása: vér, CSF transzfer alvó állatból éberbe: sikertelenek – de kiderül, hogy agyban lokálisan termelődő faktorokról van szó: „sleep factors”. Adenozin is egy endogén „sleep factor” (2002, 2003 Porkka-Heiskannen et al):

CSF: cerebrospinal fluid

• ébrenlét – adenozin szint progresszívan nő

NREM (Non-Rapid-Eye-Movement) fázis (vagy lassú hullámú alvás) : lassú oszcillációk

NREM

• alvás alatt – leapad

http://www.holisticonline.com/remedies/sleep/sleep_stages-1-4NREM.htm

4. Neuronális Hálózatok kontrollja

sok Adenozin: - akkumulálódva álmossá tesz, lelassítja a neuronális működést - ér-dilatációt okoz (alvás alatti jobb oxigénellátás)

KV addiktív ! (heroin is a dopamin szintet emeli…)

koffein 6 óra alatt tűnik el a szervezetből

Koffein: - adenozin-receptorhoz köt, melyhez ezáltal az adenozin nem fér hozzá - nagyobb neuronális aktivitás, éberség - a hipofízis a nagyobb neuronális aktivitás hatására adrenalint ürítésre utasítja a mellékvesét - emiatt: pupilla kitágul, gyorsabb szívverés, légutak megnyílnak (asztmások adrenalint kapnak), vérnyomás nő, vércukorszint nő, izmok vérellátása fokozódik, - adenozin-receptor gátlás agyi érkontrakciót is okoz (néhány fejfájás elleni orvosság koffein-tartalmú) - és még.. http://dict.space.4goo.net/dict?q=adenosine

Pl.: migraine pain is caused byvasodilation in the cranial blood vessels



• dnSNARE egereken krónikus EEG mérések (beültetett elektródák) miközben alszanak • csökkent lassú hullámú aktivitás (slow wave activity, SWA) • A1 receptor farmakológiai gátlása hasonlót hullámokat eredményez és • ha A1 receptorokat kiütik előagyi excitatorikus neuronokon (Bjorness 2009) akkor ezekben az egerekben romlik a memória a krónikus alváshiány miatt • dnSNARE egerek rezisztensek a rövidtávú alvásdepriváció okozta kognitív zavarokra Vagyis: asztro eredetű adenozin viselkedési mintázatokba is beleszól !

Purinergic Gliotransmission Contributes to Memory Impairment Following Sleep Loss (A) Novel object recognition (NOR) paradigm: mice are trained to recognize two identical objects and are either left undisturbed or sleep deprived for 6 hr following training. At hour 24, mice are tested for the ability to recognize a novel object replacing one of the familiar objects. (B) SD impairs NOR in wild-type mice. (C) dnSNARE mice are unaffected by the effects of SD on NOR memory

Halassa 2009

dnSNARE : 2005 óta min. 12 cikk, jó újságokban

stb

.. nade …

!!! Vita….

.. és akkor …

there is a need for better genetic models to study astrocyte function.

… in contrast to the prevailing literature, we find that neither receptordriven astrocyte Ca(2+) fluxes nor, by extension, gliotransmission is likely to be a major modulating force on the physiological processes underlying behavior.

Tools for selectively activation of astrocyte signaling in vivo

Optogenetika

Farmakogenetika

Pharmacogenetic Activation of Astrocytic Signaling In Vivo Using DREADDs In 2007, a new family of engineered GPCRs, Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD) were developed GPCRs = G protein coupled receptors DREADDs represent a chemogenetic tool to modulate GPCR signaling in vivo. Introducing two mutations in transmenbrane III and V of muscarinic receptors which create DREADDs receptors that can precisely control the Gq-, Gi-, or Gs-signaling pathways. DREADDs technology has been successfully applied in β-cells, astrocytes, and a variety of neurons to control GPCR signaling in vivo. DREADDs technology has a great potential to be used in drug discovery, gene therapy, and tissue engineering.




Szinaptogenezis

• Néhány hetes tiszta RGC (retinal ganglion cell) vagy gerincvelői motoneuron tenyészet: - alacsony szinaptikus aktivitás, - szinaptikus fehérjék alacsony szintje • Asztroglia + RGC kokultúra: - nagy szinaptikus aktivitás (100 X); - szinapszisszám nő (7X) • 1 héttel asztrociták eltávolítása után a kokultúrákból: - a legtöbb szinapszis eltűnik Ullian EM. Christopherson KS, Barres BA 2004 ACM: asztro “conditioned medium”, asztro tenyészet felülúszója

Thrombospondin (TSP): sejt-sejt és sejt-mátrix adhézió (fibrinogen, fibronectin, laminin, collagen és integrin kötő glikoprotein)

In vitro szinapszis OK

Tenyésztett neuronok közti szinapszisok száma

Neurovaszkuláris kapcsoltság Agyi kapilláris

Perifériás kapilláris

Agyi endotél: TJ kapcsoltság (BBB): makromolekulák paracelluláris transzportja és vérsejtek inváziója gátolt. (de pl. choroid plexusban: fenesztrált endotélum, igaz itt az epitélsejtek között van TJ)

Perifériás kapillárisokban jellemzőek a pinocitotikus granulumok


endotélsejtek közötti tight junction

Agyi kapilláris. endothelial cell (EC) tight junctions (arrows) part of a pericyte (P) astrocytes end-feet (EF) http://www.netterimages.com/image/13431.htm

http://www.pathologyoutlines.com/topic/softtissue3vascnormal.html

Neurovaszkuláris kapcsoltság Serial Section Electron Microscopy and 3D Reconstruction

The capillary surface is completely covered by a perivascular glial sheath. A) This sheath surrounds the capillary and pericyte. A perivascular astrocyte with nucleus (N) and cell body (ascb) embraces (aspve II) the endothelial tube. The pericyte (pe) is seen through discontinuities in the endfoot indexed aspve III. Astrocytic processes (asp) from the endfeet stretch out in different directions. B) Structure in A viewed from the right. All four endfeet (pve I-IV) in the reconstruction is represented together with the pericyte (pe). Part of a probable microglial cell process, indexed as a perivascular cell process (pvcp), is seen peripheral to the glial sheath. C,D) Removal of the pericyte, pve III, and pve IV (structures reconstructed in C) allows the remaining perivascular sheath (pve I and II) to be viewed from the inside (D). The most important feature in C is the six linearly arranged discontinuities of the third endfoot (pveIII). E) Elements reconstructed in D are shown in color and entered into a drawing adapted from Ramon y Cajal (1911).

Neurovaszkuláris kapcsoltság Asztro végtalpak: teljesen körbeölelik kapillárisokat Asztro eredetű faktorok: - (pl. TGFa, GDNF) endotél sejtek közötti TJ kapcsolatot indukálják és - fenntartják az endotél luminális/bazális polarizáltságát (ioncsatorna, AQP, receptorkészlet) - prostaglandin (PGE), nitrogén monoxid (NO) – vazodilatáció - endothelin, ATP - vazokonstrikció - arachidonsav (AA) - vazokonstrikció és/vagy dilatáció Endotélsejtek is jeleznek asztro felé: - LIF (leukemia inhibitory factor) az asztrociták érését segíti Agyi endotél szelektív permeabilitása: (1) adenine-nucleotide binding (ABC) cassette transzporterek (energiaigényesek) melyek xenobiotikumokat exkretálnak (drogok, antibiotikumok, citosztatikumok stb) cytostatics, opioids etc. – nem jutnak át BBB-n) (2) aminosav transzporterek (L1) (3) glükóz transzporterek (GLUT1 type) (4) ion exchangerek, stb.

Neurovaszkuláris kapcsoltság Transzporter rendszerek

(protein szinten ismertek)

BCRP, breast cancer resistance protein (also known as ABC transporter G family member 2); GLUT, solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member; LRP, low-density lipoprotein receptor-related protein family member; MCT, monocarboxylic acid transporter family member; MRP, multidrug resistanceassociated protein family member; OAT, organic anion transporter family member; OATP, organic anion transporter polypeptide family member; Pgp, P-glycoprotein; RAGe, advanced glycosylation end productspecific receptor; RLiP76, Ral-binding protein 1 Neuwelt 2011

Neurovaszkuláris kapcsoltság NVU

Neurovaszkuláris unit (NvU) „extended” NvU: neuronok, asztrociták, mikroglia, endotél pericita, simaizom sejt, vérsejtek: polymorfonukleáris (PMN) sejtek, limfociták, monociták

BBB modell

+ asztro és pericita Cardoso 2010

Neuwelt 2011


Agyi mikrocirkuláció szabályozása

Funkcionális hyperaemia: lokális neuronális aktivitás esetén gyorsan nő a lokális agyi vérellátás 1890, Sherrington - vazodilatáció az aktív neuronokhoz közel, 200-250 um távolságban következik be - sokféle elmélet próbálta magyarázni: lokális neuronális vazoaktív faktor release, lokális innerváció, NO termelés - ma: asztro szerepe egyértelmű ! neuronális aktivitás asztro [Ca++]ic ↑

asztro Ca++ szignalizáció gátlása szétkapcsolja a neuronális aktivitást az értónus szabályozástól !!

arachidonsav (AA) kibocsátása glia végtalpból

e végtalp által körbefogott kis arteriolák tónusának változása

vazodilatáció (blood flow nő): ha AA prosztaglandin-származékká alakul cyclooxygenáz segítségével (ezt aszpirin gátolja) vazokonstrikció: ha AA átalakulás útja 20hydroxyeicosatetraenoic acid (2-HETE) , cytochrome p450 enzim segítségével


David Attwell et al. 2010 Nature Pathways from astrocytes and neurons that regulate blood flow by sending messengers to influence the smooth muscle around the arterioles that supply oxygen and glucose to the cells (shown as the vessel lumen surrounded by endothelial cells and smooth muscle). In neurons, synaptically released glutamate acts on N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) to raise [Ca2+]i, causing neuronal nitric oxide synthase (nNOS) to release NO, which activates smooth muscle guanylate cyclase. This generates cGMP to dilate vessels. Raised [Ca2+]i may also (dashed line) generate arachidonic acid (AA) from phospholipase A2 (PLA2), which is converted by COX2 to prostaglandins (PG) that dilate vessels. Glutamate raises [Ca2+]i in astrocytes by activating metabotropic glutamate receptors (mGluR), generating arachidonic acid and thus three types of metabolite: prostaglandins (by COX1/3, and COX2 in pathological situations) and EETs (by P450 epoxygenase) in astrocytes, which dilate vessels, and 20-HETE (by ω-hydroxylase) in smooth muscle, which constricts vessels. A rise of [Ca2+]i in astrocyte endfeet may activate Ca2+-gated K+ channels (gK(Ca)), releasing K+, which also dilates vessels.



AA membrán foszfolipidekből keletkezik Ca2+-függő és Ca2+-independens lipázok segítségével. Zöld: vazodilátor, Piros: vazokonstriktor, Kék: a megfelelő enzimek lokalizációja. COX, cyclooxygenase; CYP, cytochrome P450 superfamily of enzymes; EET, epoxyeicosatrienoic acid; 20-HETE, 20-hydroxyeicosatetraenoic acid; HPETE, hydroperoxy-eicosatetraenoic acid. David Attwell et al. 2010 Nature



Proximális integráció modellje

‘A’ piális artéria ‘B’ penetráló artéria ‘C’ prekapilláris artéria ‚D’ valódi kapilláris (a, b) neuronális aktiváció helyszínei (a)+(b) a és b szignálok integrációja Piros nyíl: véráramlás Kék nyíl: neuronális aktivitás szignáljainak elvezetődése a kapillárisoktól a proximális artériákig

(1) Asztro végtalp szignáljai szabályozzák lokális arteriolát a simaizomsejtek tónusának változtatásával. A fehér nyilak a perifériáról jövő info integrációját jelzik. Mindig is kérdéses volt, hogy a lokális neuronális tüzelés infoja hogyan jut el a proximális (kezdeti) artériákig, nagyobb erekig a kapillárisoktól: asztro illetve pericita GJ mediálta retrográd info-terjedés erek mentén !! egyelőre ez csak egy hipotézis !!!

(2) A kapilláris véráramlását kisrészt lokális pericitakonstrikció szabályozza, nagyrészt a prekapilláris területről érkező véráram Itoh 2012


Winkler 2011

Periciták

http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/empage/ebv/ebv14.gif

Pericita

http://www.xvivo.net/pericyte-on-capillary/

http://www.urmc.rochester.edu/news/story/index.cfm?id=3040

Glia-neuron interakció aspektusai. Neuron-glia metabolikus együttműködés

Recommend Documents