Genová vazba Jednou ze základních podmínek platnosti Mendelových zákonů je lokalizace genů, které podmiňují různé vlastnosti na různých chromozómech. Toto pravidlo umožňuje volnou kombinovatelnost genů nezávisle na sobě. Ve skutečnosti u různých organismů počet genů mnohonásobně převyšuje počet chromozómů charakteristický pro daný druh. Z toho vyplývá, že geny jsou uloženy společně na témže chromozómu a volná kombinovatelnost mnoha genů je omezena. Geny lokalizované na témže chromozómu tvoří vazbovou skupinu a mezi geny působí genová vazba. Historie objevení genové vazby V první dekádě 20. století W. Bateson a R.C. Punnett zkoumali štěpné poměry u dihybrida hrachoru vonného pro dva znaky: barvu květu (purpurová a červená) a tvar pylového zrna (oválný a kulatý). Po zkřížení dvou homozygotů PPLL x ppll, první filiální generace (PpLl) byla uniformní (květy purpurové a oválná pylová zrna). Po samosprášení v F2 generaci nezískali štěpný poměr dihybrida pro volnou kombinovatelnost 9 : 3 : 3 : 1, jak předpokládali, ale mnohem větší počet jedinců mělo fenotyp shodný s rodiči a méně jedinců se vyštěpilo s rekombinovaným fenotypem (296 : 19 : 27 : 85 v porovnání s teoretickým štěpným poměrem 240,2 : 80,1 : 80,1 : 26,7). Bateson a Punnett si tento jev vysvětlili jako fyzické spojení dvou dominantních nebo dvou recesivních alel u rodičů, a proto ho nazvali coupling. Při sledování kombinace barvy květu a typu pavézy naopak více potomků mělo vždy jeden znak dominantní a druhý znak recesivní, proto se domnívali, že zde naopak existuje odpor ke kombinaci dvou shodných genů (buď dominantních nebo recesivních). Tento vztah označili termínem repulsion.
Obr. č. 1: Thomas Hunt Morgan
Bateson tuto teorii později zamítá a odlišné štěpné poměry, které ve svých pokusech s Punnettem zjistili, přisoudil genové vazbě, kterou exaktně vysvětlil T. H. Morgan v roce 1926. Pravidla o genové vazbě vznikla zajímavým způsobem, když Morgan jako velký odpůrce chromozómové teorie se záměrem vyloučit spojení mezi chromozómy a dědičností, svými pokusy naopak chromozómovou teorii potvrdil. Americký biolog prováděl rozsáhlé pokusy s Drosophilou melanogaster a zjistil, že u ovocné mušky existují čtyři skupiny genů, které uvnitř skupiny se buď nerekombinují nebo se rekombinují omezeně, zatímco geny patřící do různých skupin genů se rekombinují volně. Počet vazbových skupin byl shodný s počtem chromozómů a tato shoda byla tak nápadná, že nebylo možné dál odmítat chromozómovou teorii. Morgan ve svých pokusech, podobně jako jeho předchůdci, napočítal vždy více jedinců s fenotypem shodným s rodiči a méně rekombinantů. Potvrdil možnost existence obou jevů coupling a repulsion. Své závěry shrnul v Morganových zákonech dědičnosti:
92
1) Geny jsou lokalizované v chromozómech a jejich uspořádání je lineární. 2) Geny jednoho chromozómu tvoří vazbovou skupinu a organismus má tolik vazbových skupin, kolik má párů homologických chromozómů. 3) Mezi geny homologického páru chromozómu může probíhat genová výměna, jejíž frekvence je přímo úměrná vzdálenosti genů. Nezměněné chromozómy jsou často nazývány rodičovské chromozomální typy nebo také nerekombinanty, zatímco nové kombinace jsou nazývány nerodičovské chromozomální typy neboli rekombinanty. Nové chromozomální typy jsou vytvářeny prostřednictvím crossingoveru (rekombinací) mezi homologními chromozómy. Vazba úplná a vazba neúplná Jestliže se v potomstvu polyhybrida objevují pouze sestavy rodičovské a neobjevují se žádné rekombinované sestavy gametické ani fenotypové, mezi geny je vazba úplná. Naopak tvoří-li se v potomstvu rekombinované gametické sestavy, ale v menší frekvenci než původní rodičovské, pak je vazba neúplná. Příčinou úplné vazby je neschopnost záměny části homologních chromozómů, na nichž jsou lokalizované oba nealelické geny. V průběhu heterotypického dělení meiózy v pachytene nedochází ke crossing-overu a nesesterské chromatidy si nevymění homologní úseky chromozómové hmoty a nevznikají rekombinované gamety. Pohlavní buňky v F1 generaci obsahují mateřský nebo otcovský chromozóm. Hybridní jedinec může mít uloženy na jednom z homologních chromozómů dominantní alely obou genů ( např. A, B) a na druhém párovém chromozómu alely recesivní (a, b). V tomto případě se jedná o vazbovou fázi cis, která odpovídá původnímu označení coupling. Hybridní jedinec může mít ale i na jednom z párových chromozómů střídavě dominantní a recesivní alelu (A, b, resp. a, B), vazba je ve vazbové fázi trans. Pro genetický zápis se používají zlomky, aby bylo možné rozlišit vazbovou fázi, která je důležitá i pro stanovení štěpných poměrů v F2 generaci. Podstatou neúplné vazby je cytologický mechanismus crossing-overu, který naruší úplnou vazbu vloh a mezi homologními chromozómy dojde k výměně segmentů mezi nesesterskými chromatidami. Poprvé na vznik chiasmat mezi homologickými chromozómy upozornil v roce 1909 Jansen a v roce 1926 Morgan toto překřížení označil crossing-over. V závislosti na některých faktorech (např. délka chromozómu, lokalizace genu vzhledem k centoméře) může dojít ke crossing-overu jedenkrát (jednoduchý crossing-over) nebo dvakrát (dvojitý crossingover) - viz obr. č. 2a, b. Frekvence crossing-overu závisí na vzdálenosti dvou nebo více genů na chromozómu. Čím bude větší vzdálenost genů na chromozómu, tím ve větší frekvenci bude vznikat crossing-over a proto bude vznikat i větší procento rekombinací. Při malé vzdálenosti genů k překřížení mezi geny nedochází a nevznikají žádné rekombinace. Alfred Stutervant, Morganův student navrhnul využít rekombinační údaje k sestavení genetické mapy, tzn. lineárně uspořádat geny na chromozómech. Společně s Morganem jako měřítko vzdálenosti zvolili frekvence rekombinovaných gamet (potomstva) ze zpětného testovacího křížení nebo z jiných křížení. Pozdější studie skutečně ukázaly, že genetická vzdálenost takto statisticky měřená je významně podobná vzdálenostem měřeným cytologicky a biochemicky. Proto vzdálenost vloh na chromozómu měříme podle % překřížení mezi vlohami. 1% překřížení odpovídá 1%
93
rekombinací (crossing-over) a současně 1 cM (centimorganu) – jednotka nazvaná podle Morgana. Síla vazby byla pojmenována Morganovo číslo a značí se písmenem - p. Obr č. 2: a) Jednoduchý crossing-over – výměna nesesterských chromatid
A
A
a
a
B
B
b
b
A
A
a
a
B
b
B
b
b) Dvojitý crossing-over
A
A
a
a
A
A
a
a
B
B
b
b
B
b
B
b
C
C
c
c
C
C
c
c
Morganovo číslo vyjadřuje podíl rekombinovaných gamet na celkovém počtu jedinců. Pro výpočet štěpného poměru v F2 generaci, za předpokladu, že mezi geny je vazba, je nutné znát štěpný poměr gamet, který se bude odlišovat od štěpného poměru při volné kombinovatelnosti (1 : 1 : 1 : 1). K tomu slouží tzv. Batesonovo číslo, které nám udává kolikrát častěji se vyštěpí původní rodičovské gamety než rekombinované. Hodnoty Morganova čísla (síly vazby) se pohybují v rozmezí 0 – 50 cM (%). Rozmezí se odhadne z maximálně možného počtu rekombinací 50 %, kdy mezi geny je již volná kombinovatelnost. Štěpný poměr je 1 : 1 : 1 : 1. Chromozómové mapy Chromozómová mapa vyjadřuje lokalizaci a vzájemnou polohu genů na chromozómu. Chromozómová mapa lze sestavit pomocí tradičních poměrně pracných metod, v současnosti ale převažují molekulárně biologické postupy, které umožňují analýzu genových vazeb za 94
použití fragmentů DNA (analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů – RFLP). O této metodě a dalších bude pojednáno později. Při sestavování chromozómové mapy prvním krokem je přiřadit gen určitému chromozómu v karyotypu. K tomu se využívá analýza aneuploidních jedinců (např. monozomiků 2n-1, nulizomiků 2n-2 a trizomiků 2n+1) a studium vztahu mezi cytologicky zjistitelnými chromozómovými aberacemi a změnami vazbových poměrů. V chromozómové analýze se využívají např. i tzv. telotrizomici, kteří mají pouze jedno rameno chromozómu navíc. Pomocí trizomika zjistíme, který chromozóm nese příslušný gen a telotrizomik může tuto informaci doplnit o údaj, na kterém rameni je gen lokalizován. Druhou možností pro přiřazení genu na chromozóm je využití chromozómové aberace nejčastěji delece. U této mutace bude chybět gen na chromozómu. Jestliže byl dominantní a na homologním chromozómu se nachází recesivní znak, po mutaci se projeví fenotypově recesivní znak, změní se štěpný poměr. Pomocí cytologických studií je možné zjistit lokalizaci genu, protože současně s vyštěpením recesivního genu, nastane porucha v párování chromozómu. Proti chybějícímu genu se objeví na chromozómu smyčka, která je viditelná v optickém mikroskopu. Pak je možné příslušný gen přiřadit určitému chromozómu. Pořadí a relativní vzdálenost genů na chromozómu určujeme pomocí dvoubodového nebo tříbodového testu. Postup je založen na sérii dihybridních křížení nebo častěji trihybridních křížení, což je metoda přesnější. Při dihybridním křížení (dvoubodový test) při každém křížení stanovujeme pouze vzdálenost dvou genů. Význam genové vazby Vazba vloh lokalizovaných na jednom chromozómu podmiňuje společnou dědičnost znaků a vlastností, které jsou determinovány zmíněnými geny. Zvláštní význam má vazba mezi polygeny, geny podmiňujícími kvantitativní znaky, u nichž lze obtížně určit jednotlivé fenotypové kategorie a major-geny (geny velkého účinku), které podmiňují dobře pozorovatelné a rozlišitelné varianty kvalitativních znaků. Tyto majorgeny markerují přítomnost některých polygenů, které mnohdy determinují významné hospodářské vlastnosti. Proto se označují jako geny markery. Geny markery se využívají rovněž pro zjišťování přítomnosti genů determinující znaky nebo vlastnosti, které se projevují v pozdějším stádiu ontogenetického vývoje. V poslední době jsou při studiu vazby využívány DNA markery. Na počátku 80. let byly objeveny první kodominantní RFLP (restriction fragment length polymorpism – polymorfismus délky restrikčních fragmentů) markery, které jsou ve vazbě s mnoha kvantitativními vlastnostmi. Následovaly různé techniky založené na PCR (polymerase chain reaction – polymerázová řetězová reakce), mezi nimi dominantní RAPD (random amplified polymorphic DNA – náhodně amplifikovaná polymorfní DNA) markery a perspektivní multilokusová markerovací technika AFLP (amplified fragment length polymorphism – polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů), kdy při fragmentační analýze jsou získávána sekvenační data, která představují, molekulární markery. Velmi často se uvedené markery využívají k identifikaci genů rezistence k chorobám. Eukaryotické genomy jsou bohaté na tandemové repetice DNA označované jako mikrosatelity, patřících do technik VNTR (variability of number tandem repeats – variabilita počtu tandemových repetic). Mikrosatelitový polymorfismus se začal extenzivně využívat jako genetický marker u savců a později také často u rostlin. I když jsou mikrosatelity náhodně roztroušeny v genomu, jsou často ve vazbě s jinými geny. Vazba byla pozorována i u lidí a u pohlavních chromozómů různých organizmů.
95
Úplná nebo velmi silná vazba může působit negativně, zvláště ve šlechtitelském procesu, neboť nám znemožňuje získání nových rekombinací v potomstvu po hybridizaci. Rekombinované gamety mohou vzniknout pouze prostřednictvím crossing-overu, který mezi geny umístěnými těsně nebo velmi blízko u sebe vůbec nevzniká nebo ve velmi malé frekvenci. V evolučním procesu se může vazba uplatnit jako silně pozitivní faktor. Některé příznivé geny se mohou pomocí translokací (viz. kapitola Mutace) přenést do jedné vazbové skupiny, kde vytváří vazbu s jiným příznivým genem. Pak vznikají polygenní bloky, které podmiňují kombinaci znaků a vlastností, které se dědí společně. Pokud má tato vlastnost adaptační hodnotu a zajišťuje adaptabilitu, upevňuje se zmíněný mechanismus přirozeným výběrem a vazba v tomto případě zajišťuje uchování optimální skladby genů. Vazba se chová jako konzervativní faktor, který uchovává stávající kombinaci vloh.
96
