Genetika: cvičení č. 1-2 DNA, RNA, replikace, transkripce, translace a genetický kód, mutace
KBI/GENE Mgr. Zbyněk Houdek
Témata cvičení 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
DNA, RNA, replikace, transkripce, translace, genetický kód, centrální dogma mol. bio. Mutace – souvislost s gen. kódem (m. neměníci smysl , měnící smysl, tichá, nesmyslná m. , substituce, inzerce …). Mitóza, chromozómy, karyotyp, genomové mutace … Meióza Mendelovy zákony – monohybridismus, generace PF1 F2, úplná a neúplná dominance, štěpné poměry, dihybridismus, polyhybridismus, rozvětvovací metoda. Genové interakce (reciproká interakce, dominantní epistáze, recesivní epistáze, inhibice, komplementarita, kompenzace), letální geny. Dědičnost a pohlaví. Genová vazba. Dědičnost kvantitativních znaků (polygeny, prostředí), heritabilita (míra uplatnění genotypu na znaku). HW zákon – frekvence genotypů a fenotypů. Dědičnost krevních skupin, HLA systém, mnohotný alelismus. Rodokmeny, výpočty prognóz, typy dědičnosti u člověka.
Doporučená lit.: • • • • • • • • •
Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie (1998) Kočárek, E.: Genetika (2008) Kubišta, V.: Buněčné základy životních dějů (1998) Otová, B. a kol.: Lékařská biologie a genetika (I. díl – 2008) Pritchard, D., J. & Korf, B., J.: Základy lékařské genetiky (2007) Reischig, J.: Genetická praktika (1989) Reischig, J.: Obecná genetika. Praktická cvičení (2003) Rosypal, S.: Úvod do molekulární biologie (2003) Rosypal, S. a kol.: Nový přehled biologie (2003)
Genetická informace • Genetická informace je obsažena ve sledu (pořadí) nukleotidů (nukleotidových sekvencí určitých funkčních typů NK).
DNA-deoxyribonukleová kys. • •
•
skládá ze 4 typů deoxyribonukleotidů (adenin – A, guanin – G, thymin – T, cytosin – C). DNA je tvořena 2 vlákny, která jsou spojena ve dvoušroubovici, tak že proti A je navázáno (vodíkové můstky) T a proti G – C. Na povrchu dvoušroubovice DNA se vytvářejí 2 nestejné žlábky (velký a malý), kam se váží bílkoviny. V páteři DNA jsou deoxyribózy, na kterou jsou navázány 2 fosfátové zbytky (1. na 3´C a 2. na 5´C). 1 řetězec DNA má tedy 2 konce, kde 1. začíná 3´C hydroxylem a 2. končí 5´C fosfátem. C-G
• 5´GAATTC 3´ 3´CTTAAG 5´ A-T
Prostorová struktura DNA
RNA-ribonukleová kys. • RNA-ribonukleová kys., která obsahuje A, G, C a U (uracil je chemicky podobný T v DNA). • RNA se v b. vyskytuje jako malý polynukleotidový řetězec.
Přenos genetické informace • Tento proces je zformulován v centrálním dogmatu molekulární biologie, což je postulát, který říká, že přenos je jedině možný z NK do NK nebo z NK do proteinu (Crick 1957/58).
Replikace DNA • • • • • •
•
Replikace (obecně) – tvorba kopií molekul NK zajišťující přenos GI z DNA do DNA a z RNA do RNA. K existujícímu řetězci DNA se na základě komplementarity bází přikládají odpovídající nukleotidy a postupně se spojují v nový řetězec, který je komplementární k původnímu. Vznikají tedy podle staré dvoušroubovice dvě zcela identické dvoušroubovice, z nichž žádná není celá nová, ale obsahuje 1 nový a 1 starý řetězec (semikonzervativní). Tuto reakci katalyzuje enzymový komplex DNA-polymeráza. Replikační komplex – replikon – postupuje po řetězci DNA, dvoušroubovice se rozvíjí a vzniká tzv. replikační vidlička. V každé replikační vidličce se tedy kopírují vedoucí řetězec, který se kopíruje plynule a druhý zpožďující se řetězec, který se kopíruje jako původní nesouvislý soubor fragmentů (Okazakiho fragmenty). V replikačních počátcích se typicky vyskytují sekvence s vysokým obsahem A a T.
Obr. replikace DNA •
Dalším proteinem potřebným při replikaci pro rozvití dvoušroubovice a vytvoření jednořetězcové úseku DNA (za štěpení ATP) je helikáza.
•
Během replikace dochází ve šroubovici ke pnutí, které je uvolňováno topoizomerázou, která pracuje před replikační vidličkou, tak že přeruší jeden z řetězců dvoušroubovice a tím se o jeden závit rozvine a následně se tento přerušený řetězec spojí. RNA-primáza katalyzuje syntézu RNA-primeru, od jehož 3´konce se syntetizuje Okazakiho fragment.
•
Transkripce • • • • • • • • •
Přepisování GI z DNA do RNA jako primárního transkriptu. Dochází při ní k syntéze RNA, která je komplementární k DNA (gen). Geny rozdělujeme na strukturní (jejich přepisem vzniká mRNA) a geny pro RNA proteosyntetického aparátu. Tento přepis je katalyzován enzymovým komplexem RNApolymerázou. RNA polymeráza se váže na DNA v místě promotoru. Dvoušroubovice DNA se rozvine a vznikne transkripční bublina. Přepisem vzniká mRNA, která je jednovláknová. Především na konci molekuly se vytvoří 2 úseky navzájem komplementární, které vytvoří úzkou smyčku, kterou tvoří několik U a tím ukončí transkripci – terminátor. Molekuly tRNA (<100 bází), rRNA (100-1000) mají definovanou i terciární strukturu (také dvoušroubovicové úseky).
•
•
Negativní DNA řetězec (-DNA = kódující vlákno) slouží jako matrice pro syntézu RNA. Pozitivní DNA řetězec (+DNA= templát) – je 2. ř. DNA o stejné sekvenci nukleotidů jako RNA, která je syntetizována na negativním ř. DNA.
Translace • • •
Syntéza molekuly bílkoviny využívající informace obsažené v molekule mRNA. Probíhá na ribozomech (20 x 30 nm), které jsou tvořeny malou a velkou podjednotkou, které se spojují po navázání mRNA ve funkční ribozom. „Překladatel“ z jazyka nukleotidů do jazyka aminokys. je tvořen 2 složkami, 1. je soubor molekul tRNA, které nesou antikodón komplementární s příslušným kodónem mRNA a na 2. konci váže příslušnou aminokys. • 2. složkou je soubor enzymů aminoacyl-tRNA syntetáza, který dovede rozpoznat určitou aminokys. a k ní příslušnou tRNA a spojit je makroergní vazbou. Nukleotidová sekvence obsahuje informaci o primární struktuře proteinu a nazývá se kódující nukleotidová sekvence.
Translace
Genetický kód kód
význam
kód
význam
kód
význam
kód
význam
UUU
Phe
UCU
Ser
UAU
Tyr
UGU
Cys
UUC
Phe
UCC
Ser
UAC
Tyr
UGC
Cys
UUA
Leu
UCA
Ser
UAA
STOP
UGA
STOP
UUG
Leu
UCG
Ser
UAG
STOP
UGG
Trp
CUU
Leu
CCU
Pro
CAU
His
CGU
Arg
CUC
Leu
CCC
Pro
CAC
His
CGC
Arg
CUA
Leu
CCA
Pro
CAA
Gln
CGA
Arg
CUG
Leu
CCG
Pro
CAG
Gln
CGG
Arg
AUU
Ile
ACU
Thr
AAU
Asn
AGU
Ser
AUC
Ile
ACC
Thr
AAC
Asn
AGC
Ser
AUA
Ile
ACA
Thr
AAA
Lys
AGA
Arg
AUG
Met
ACG
Thr
AAG
Lys
AGG
Arg
GUU
Val
GCU
Ala
GAU
Asp
GGU
Gly
GUC
Val
GCC
Ala
GAC
Asp
GGC
Gly
GUA
Val
GCA
Ala
GAA
Glu
GGA
Gly
GUG
Val
GCG
Ala
GAG
Glu
GGG
Gly
- iniciační kodón
- terminační kodón
UGA - někdy slouží pro zařazení selenocysteinu (Sec)
Chemické vlastnosti aminokyselin v proteinech Hydrofóbní nepolární Alanin - Ala Valin - Val Leucin - Leu Prolin - Pro Glycin - Gly Cystein - Cys Selenocystein - Sec
aminokyseliny Fenylalanin - Phe Izoleucin - Ile Tryptofan - Try Methionin - Met tvorba S-S můstků tvorba Se-Se můstků
Hydrofilní polární aminokys. Neutrální
Kyselé
Alkalické
Asparagin - Asn Kys. asparágová Glutamin - Gln - Asp
Arginin - Arg
Serin - Ser
Kys. glutamová
Histidin - His
Threonin - Thr
- Glu
Tyrosin - Tyr
Lysin - Lys
Struktura aminokys. • Aminokyseliny s alifatickým postranním řetězcem Glycin Gly (G), Alanin Ala (A), Valin Val (V), Leucin Leu (L), Isoleucin Ile (I) • S karboxylovou nebo amidovou skupinou na postranním řetězci (kyselé skupiny) Kyselina asparagová Asp (D) , Asparagin Asn (N), Kyselina glutamová Glu (E), Glutamin Gln (Q) • S aminovou skupinou na postranním řetězci (basické skupiny) Arginin Arg (R), Lysin Lys (K) • S aromatickým jádrem nebo hydroxylovou skupinou na postranním řetězci Histidin His (H), Fenylalanin Phe (F), Serin Ser (S), Threonin Thr (T), Tyrozin Tyr (Y), Tryptofan Trp (W) • Se sírou v postranním řetězci Methionin Met (M), Cystein Cys (C) • Iminokyseliny Prolin Pro (P)
Gen • •
• •
Základní jednotka genetické funkce (g. informace) vyznačující se fenotypovým projevem. Formy genu: úsek DNA- nebo RNA- řetězce (jen u RNA-virů), který kóduje primární strukturu polypeptidu jako translačního produktu (strukturní gen). Jako úsek DNA-řetězce přepisovaný do primární struktury tRNA, a dalších druhů RNA, které nejsou určeny k translaci. Jako úsek DNA- nebo RNA-řetězce plnící regulační fci, který je rozeznáván specifickým proteinem signalizujícím zahájení nebo zastavení určitého molekulárního děje (např. transkripce nebo translace).
Alela • Varianta genu o určité unikátní nukleotidové sekvenci. • Dominantní a. svou funkcí potlačuje projev jiné recesivní a. téhož genu. • Standardní a. je alela genu převládájící v přírodní populaci. • Mutantní a. je alela změněná mutací.
Polymerázová řetězová reakce (PCR) • • •
• • •
•
PCR (Polymerase chain reaction) byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii (Saiki a Mullis v roce 1986 Nobelova cena). Jedná se o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Saiki et al., 1988; Schutzbank et al., 1993; White et al., 1992). 1. DNA je nejprve denaturována (95 °C / 15-60 s) na dvě jednovláknové templátové (matricové) molekuly DNA. Nukleotidová sekvence cílové DNA nemusí být známa, ale musí být známé alespoň sekvence krátkých úseků na obou koncích cílové amplifikované DNA. 2. Oligonukleotidové sondy (primery), které hybridizují (obvykle mezi 50°C a 55°C) na obou stranách cílové DNA (annealing ). Nadbytek primerů a přítomnost všech čtyř deoxyribonukleosidtrifosfátů. 3. Primery řídí syntézu nových vláken (70 - 74°C, 30-60 s). Jejich syntézu katalyzuje termostabilní DNA polymeráza (například Taq z bakterie Thermus aquaticus) od 5’ konce ke 3’ konci vždy začínající od primerů. Během prvního cyklu syntéza nového vlákna pokračuje dále až za sledovanou sekvenci, ale následné cykly již amplifikují převážně pouze úsek mezi dvěma vybranými sondami (primery). Počet cyklů se obvykle pohybuje v rozmezí 15 – 30, přičemž se v každém cyklu množství molekul oproti předcházejícímu cyklu zdvojnásobí.
Princip polymerázové řetězové reakce Pomocí PCR můžeme získat jak kopii genomové DNA, cDNA (analyzovaný vzorek může být DNA i RNA). Nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je elektroforéza v agarosovém gelu (barvivo Ethidium bromid). Na úrovni lidské DNA lze např. identifikovat sekvence (mutantní úseky DNA) podmiňující vznik dědičných onemocnění, určovat genetickou identitu jedinců, paternitu neboli rodičovství, prokazovat původ biologického materiálu v soudním lékařství apod. Dále se používá pro identifikaci různých druhů mikroorganizmů (patogenů).
Úkoly: Napište komplementární řetězec k uvedenému řetězci DNA: 5´CGTACGGTTCGATGCACTGTACTGC 3´ 3´GCATGCCAAGCTACGTGACATGACG 5´ Napište vlákno mRNA vzniklé transkripcí molekuly DNA, pokud antikódující řetězec (matrice, negativní) je ten uvedený, ne doplněný: GCAUGCCAAGCUACGUGACAUGACG Najděte iniciační a kodon a ukončení translace na uvedeném vlákně: GCAUGCCAAGCUACGUGACAUGACG Napište pořadí aminokys., které budou v peptidovém řetězci vzniklém translací mRNA: Met, Pro, Ser, Tyr, Val, Thr
Úkoly: Pokud je v daném úseku molekuly DNA 287 A a 351 C, kolik tam bude ostatních bází? Kolik tam bude purinů a kolik pyrimidinů? 287 T, 351 G Purinů (A, G) 638 Pyrimidinů (C, T) 638 Jak bude vypadat úsek vzniklý transkripcí dané části DNA? -2-1+1+2+3+4 AGTGAT ACUA
Mutace • • • • • • •
•
Mutace jsou změny v genotypu organismu oproti normálu. Velká většina mutací je naprosto náhodných, cílená mutageneze se používá téměř výhradně pro vědecké účely. Pravděpodobnost jedné takovéto chyby se pohybuje v řádech asi 10-7 (spontánní mutace). Pravděpodobnost vzniku mutace se zvyšuje působením některých fyzikálních nebo chemických činitelů (mutagenů – záření, silná oxidačního činidla). Genové mutace jsou změny v genetické informaci, které proběhly v jednom genu a nenarušily stavbu chromozómu (změna fenotypové vlastnosti-nádorová onemocnění). Chromozómové mutace vedou ke zlomům a k přestavbám struktury chromozómů (větší skupiny genů, jsou pozorovatelné mikroskopem). Genomové mutace jsou změny v počtu chromozómů (aneuploidie – ztráta nebo nadbytečná přítomnost některých jednotlivých chromozómů – monozomie, trizomie – u čl. Downům syndrom; polyploidie – početní změny sad chromozómů. Organismy jsou do jisté míry schopny mutace v DNA opravit.
Mutace genové • • • • • • • • •
Transice je záměna purinového nukleotidu za purinový a pyrimidinového za pyrimidinový. Transverze je záměna purinového nukleotidu za pyrimidový a naopak. Mutace neměníci smysl (samesense mutation), kdy je i přes mutaci zařazena stejná aminokyselina. Jsou způsobeny substitucemi na třetí pozici kodonu. Tichá mutace (silent mutation) se změnou v kodonu, která se neprojevuje ve funkci polypeptidového řetězce. Mutace měnící smysl (missense mutation), které mění smysl polypeptidového vlákna, které způsobí zařazení odlišné aminokyseliny při proteosyntéze. Nesmyslné mutace (nonsense mutation), které zapříčiní vznik předčasného terminačního kodonu v sekvenci DNA. Výsledkem je zcela nefunkční protein. Substituce je náhrada báze původní sekvence bází jinou. U delece jde o ztrátu jednoho nebo více nukleotidů původní sekvence. Adice (inzerce) -zařazení jednoho nebo více nadbytečných nukleotidových párů.
Úkoly: V 1. řádku je sekvence normální alely, ve 2. ř. je stejná sekvence poškozená mutací. O jakou mutaci se jedná? TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACC TGT TTA ATA CCG GGT TTG ACC substituce TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACC TGT GTA ATA CGG GTT TGA CC delece s posunem čtecího rámce TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACC TGT GTA ATA GGT TTG ACC delece celého tripletu bez posunu čtecího rámce TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACC TGT GTA ATA CCG GGT ATT GAC C inzerce s posunem čtecího rámce
Úkoly: • Původní sekvence: - DNA: GCG TAC CAC TCC AGG TAG AAT + DNA: CGC ATG GTG AGG TCC ATC TTA RNA: CGC AUG GUG AGG UCC AUC UUA Aminokys.: Arg Met Val Arg Ser Ile Leu zač. Mutované sekvence: Del Inz DNA: GGT ACC ACT CCA GGT CAG AAT + DNA: CCA TGG TGA GGT CCA GTC TTA RNA: CCA UGG UGA GGU CCA GUC UUA Aminokys.: Pro Trp stop Gly Pro Val Leu
Opravy mutací • Organismy jsou do jisté míry schopny mutace v DNA opravit: enzymové komplexy k těmto biochemickým reakcím. • Fotoreaktivace – opravy poškození způsobeného UV zářením v 2-řetězcové DNA kovalentní vazby mezi pyrimidiny (tyminy), opravný enzym se aktivuje denním světlem – rozpojení a oprava DNA do původní struktury. • Excisní oprava – vystřižení poškozeného úseku a nahrazením správného úseku DNA (nukleázy, polymerázy a ligázy). • Rekombinační oprava (málo probádaná) – rekombinační výměna poškozených oblastí mezi 2 mol. DNA 1 opravená mol. a 1 mol. s kumulovanými poškozenými oblastmi.
Sekvenování NK •
•
Určení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNA o několika stech bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovy metody (dideo-xynukleotidová, ddNTP reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenování na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid. Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA, označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze syntézou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynukleotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů. Moderní sekvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení terminátorů reakce (ddNTP), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, optimální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specializovaný software.
Jak vlastně Sangerovo sekvenování funguje? • •
•
• • • • •
1. Připrava směsi fragmentů z původní DNA molekuly, které se liší v délce vždy o jediný nukleotid (např. z DNA o délce 100 nukleotidů je nutné generovat řetězce dlouhé 99, 98, 97, 96, 95. Třeba tak, že se DNA vhodným enzymem „nahlodá“ od jednoho konce). Sangerovo vylepšení PCR procedury spočívá v tom, že přimíchal do reakční směsi malé množství modifikovaných dideoxynukleotidů (ochromeny tím, že jim chybí vazebná skupina - po jejich zabudování do řetězce nemá polymeráza kam připojit následující nukleotid je pravděpodobné, že řetězec DNA bude v určité fázi syntézy předčasně ukončen). Takto generované různě dlouhé fragmenty je poté třeba analyzovat. K tomu se používá nejčastěji elektroforéza. Fragmenty DNA nesoucí náboj (obsahují přece kyselinu fosforečnou) migrují směrem k příslušné elektrodě gelovou matricí, která funguje jako molekulové síto. Krátké fragmenty se prodírají gelem rychleji než ty dlouhé, čímž dochází k separaci. Když je DNA separována, zbývá už jen číst sekvenci. Sanger použil další trik flurorescenčního značení. Fluorescenční detektor zaznamenává fluorescenci, jejíž barva je určena jediným terminálním dideoxynukleotidem. A to nejdůležitější - terminální dideoxynukleotid je zabudován do fragmentu na základě komplementarity k původní sekvenované DNA. Příklad: Při separaci vypadne z kolony první fragment označený zeleně (A), pak detekujeme fragment označený červeně (T), modrým (C) a černým (G). Tak lze ze znalosti pořadí (délky) DNA fragmentů a barvy jejich fluorescence bezchybně vyvodit celou původní sekvenci. Jestliže se stejná změna vyskytuje v populaci systematicky ve větší frekvenci než jedno procento, nazývá se to DNA polymorfismus. Prvním hmatatelným výsledkem sekvenování DNA je možnost porovnat individuální DNA vzhledem k průměrné populaci, nebo lépe řečeno, zařadit ji do příslušných genotypů.
