Funkční stav cytoplazmy prasečích oocytů s různou meiotickou kompetencí Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat

Funkční stav cytoplazmy prasečích oocytů s různou meiotickou kompetencí Diplomová práce

Vedoucí práce: Ing. Martin Hošek, Ph.D.

Vypracovala: Bc. Lucie Jurčíková

Brno 2010

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Funkční stav cytoplazmy prasečích oocytů s různou meiotickou kompetencí vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU.

dne ................................................................................ podpis diplomanta ........................................................

Děkuji Ing. Michalovi Ješetovi, Ph.D. za ochotu a pomoc při tvorbě této práce a za mnoho času, který obětoval především při zpracovávání vzorků na konfokálním mikroskopu. Dále děkuji i Ing. Marii Machatkové, Csc. za umožnění zpracovávat tuto diplomovou práci v její výzkumné skupině a za poskytnutí veškerého materiálu nutného k analýzám a MVDr. Pavlíně Hulínské za pomoc a cenné rady při práci v laboratoři. Poděkování patří také Doc. Ing. Tomášovi Urbanovi, Ph.D. za poskytnuté konzultace a Mgr. Tomášovi Novotnému za pomoc s jazykovými korekturami a za to že mi byl oporou již během mého studia. Také děkuji vedoucímu diplomové práce Ing. Martinu Hoškovi Ph.D. V neposlední řadě chci také poděkovat mé rodině za podporu a pomoc nejen během psaní této práce, ale po celou dobu mého studia.

ABSTRAKT Funkční stav cytoplazmy prasečích oocytů s různou meiotickou kompetencí.

Pozorování se provádělo na oocytech získaných z poražených prasnic nacházejících se v 5. až 10. dni ovariálního cyklu. Sledován byl vztah mezi úrovní metabolické aktivity oocytů, zjištěné barvením kresylovou modří (BCB), a stanovenými parametry, které zahrnovaly morfologickou kvalitu oocyt-kumulárního komplexu, stádium jaderného zrání, množství aktivních mitochondrií v cytoplasmě, jejich mitochondriální morfologie a lokalizaci. Na základě výsledků bylo zjištěno, že oocyty s nižší morfologickou kvalitou vykazovaly výrazně vyšší metabolickou aktivitu. Dále byl pozorován vztah mezi nízkou aktivitou metabolismu a vyšším zastoupením fáze jaderného zrání GV 1 – 2. U oocytů s nízkou aktivitou metabolismu se také daleko častěji objevovaly klastry mitochondrií v cytoplasmě. Z těchto zjištěných výsledků vyplývá, že metodou vitálního barvení kresylovou modří lze selektovat ooycty, které se navzájem liší morfologickými parametry, úrovní jaderného zrání a mitochondriální morfologií.

Klíčová slova: oocyt, meiotická kompetence, cytoplazmatické zrání, reprodukce prasat

ABSTRACT Function state of porcine oocyte with varied meiotic competence.

The observation was done on oocytes gained from slaughtered sows that were in 5. to 10. day of their ovarial cycle. The relationship between the level of metabolic activity of oocytes colored by cresyl blue (BCB) and observed parameters, that contained morfologic quality of oocyte-cumular complex, nuclear maturation stage, number of active mitochondrias in cytoplasm, their mitochondrial morfology and localization. On the basis of the results, it was estabilished, that oocytes with lower morfologic quality showed distinctively higher metabolic activity. Then the relation between low activity of metabolism and higher representation of nuclear maturation state GV 1-2. Mitochondric cluster also more often appeared in cytoplasm of oocytes with low activity of metabolism. These results show that oocytes, that differ by morfologic

parameters, level of nuclear maturation and by mitochondrial morfology, can be selected by cresyl blue.

Keywords: oocyte, meiotic competence, cytoplazmatic maturation, porcine reproduction

OBSAH 1 2 3

ÚVOD........................................................................................................................8 CÍL PRÁCE .............................................................................................................10 LITERÁRNÍ PŘEHLED .........................................................................................11 3.1 Oogeneze .........................................................................................................11 3.1.1 Fáze množení zárodečných buněk .............................................................11 3.1.2 Růstová fáze...............................................................................................12 3.1.3 Fáze zrání ...................................................................................................13 3.2 Folikulogeneze.................................................................................................15 3.3 Morfologické hodnocení oocyt-kumulárních komplexů .................................16 3.4 Vliv estrálního cyklu na oocyty prasnic ..........................................................17 3.5 Hodnocení jaderného zrání oocytů ..................................................................19 3.5.1 Detekce GV pomocí fluorescenční mikroskopie .......................................19 3.6 Hodnocení cytoplazmatického zrání oocytů....................................................21 3.6.1 Indikace metabolické aktivity oocytu kresylovou modří...........................21 3.6.2 Vztah G6PDH a glutationu, význam glutationu jako antioxidantu ...........22 3.6.3 Detekce aktivních mitochondrií fluorescenční barvou MitoTracker Orange ...................................................................................................................24 4 METODIKA ............................................................................................................26 4.1 Získávání oocytů..............................................................................................26 4.2 Barvení kresylovou modří ...............................................................................26 4.3 Barvení aktivních mitochondrií .......................................................................26 4.4 Zbavení oocytů kumulárních buněk a fixace ...................................................26 4.5 Barvení chromatinu..........................................................................................27 4.5.1 Fluorescenční barva SytoxGreen ...............................................................27 4.5.2 Fluorescenční barva Hoechst 33258 ..........................................................27 4.6 Vizualizace, analýza obrazu ............................................................................28 4.7 Statistická analýza, použité metody prezentace výsledků ...............................31 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE ........................................................................33 5.1 Vliv morfologické třídy oocyt-kumulárních komplexů na úroveň jeho metabolické aktivity.......................................................................................................33 5.2 Vztah mezi úrovní aktivity metabolismu a jaderným zráním..........................34 5.3 Vliv úrovně metabolické aktivity na množství aktivních mitochondrií uvnitř oocytu .........................................................................................................................35 5.4 Vliv úrovně metabolické aktivity oocytů na rozložení aktivních mitochondrií uvnitř oocytu ..................................................................................................................38 5.4.1 Morfologie aktivních mitochondrií............................................................38 5.4.2 Lokalizace aktivních mitochondrií ............................................................39 6 ZÁVĚR ....................................................................................................................41 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .....................................................................43

1

ÚVOD Biotechnologie lze definovat jako jakoukoliv technologickou aplikaci využívající

biologické systémy nebo jejich části pro výrobu nebo modifikaci produktů, či procesů pro specifické užití. Již z této definice je patrno, že se jedná o velice rozmanitou vědní disciplínu. Mezi různorodá odvětví biotechnologie se řadí i biotechnologie používané v zemědělství. Biotechnologie reprodukce živočichů v rámci zemědělské biotechnologie se zabývá ovlivněním reprodukčních pochodů u hospodářských zvířat. Uvedená oblast biotechnologií je významná jak v základním výzkumu pro získávání materiálu, tak i v aplikovaném výzkumu, který umožňuje zefektivnit reprodukci hospodářsky významných zvířat a tím i šlechtitelský pokrok. Dle Říhy et al. (1999) se v minulosti pomocí biotechnologií podařilo zvýšit využití přirozeného potenciálu samců. Cesta dalšího významného zvyšování reprodukčních schopností zvířat tedy nutně musela vést přes hlubší poznávání řízení pohlavního cyklu samic a efektivnější získávání a využívání samičích pohlavních buněk – oocytů. V poslední době se již moderní metody biotechnologií reprodukce zvířat aplikují i v praxi, kde je mimo urychlení genetického pokroku umožněno i udržovat genové rezervy ohrožených plemen. Embrya požadovaného genetického původu, které jsou pro zmíněné účely nutné, lze v současné době získat buď superovulací v rámci programu MOET (Multiple Ovulation and Embryo Transfer) nebo pomocí metody IVP (in vitro production). Metoda IVP pro svou aplikaci vyžaduje odběr ještě neovulovaných oocytů, které je nutno nechat dozrát v laboratorních podmínkách (tato metoda se označuje IVM – in vitro maturation). Odběr vhodných oocytů lze provést dvěma způsoby. Prvním je post mortem a to buď aspirací z větších antrálních folikulů, nebo disekcí a oplachem korové vrstvy. Druhým způsobem je metoda OPU (Ovum Pick Up – transvaginální aspirace) z živých zvířat. Úspěšná aplikace této metody je tedy vždy závislá na množství a kvalitě získaných oocytů. IVP má své nesporné výhody oproti MOET, jako například vyloučení negativního dopadu superovulace na zvířata a relativně široké možnosti využití genetického potenciálu samic s reprodukčními problémy. Avšak je nutno připustit, že díky své náročnosti, vyšším nárokům na chovatele a vyšší ceně je v současné době méně používána než MOET (Ješeta et al., 2009).

8

Jednou z cest, jak více zpřístupnit metodu IVP chovatelům, je zvýšit její efektivnost, která je nižší než u metod superovulace. Největší vliv na výtěžnost IVP má kvalita používaných oocytů. Na základě bližší specifikace energetického metabolismu oocytů lze do budoucna modifikovat zrací podmínky pro jednotlivé subpopulace, a tím podstatně zvýšit procentuelní úspěšnost celé produkce embryí. Dnes běžně používanou metodou, která rozlišuje oocyty různé kvality, je vitální selekce oocytů kresylovou modří (BCB). Oocyty selektované kresylovou modří se významně liší co do vývojového potenciálu, ale nebyl dosud lépe popsán morfologický a funkční stav jejich cytoplazmy. Oocyty, používané pro výzkumnou část této práce, byly izolovány při totální disekci korové vrstvy ovárií ve fázi 5. – 10. den ovariálního cyklu prasnic různého věku a kategorie. Prvním krokem bylo rozdělení oocytů s kumulárními komplexy do morfologických tříd. Vybrané oocyty spadající do jedné ze tří morfologických tříd 1 až 2 (I - II), 3 (III) a 4 (IV) byly dále selektovány za použití vitálního barvení kresylovou modří. Pomocí tohoto testu byly živé oocyty rozděleny do dvou skupin dle rychlosti odbarvení cytoplazmy, což signalizuje stadium cytoplazmatického zrání oocytu. Vznikly tak dvě skupiny, první pro oocyty ponechávající si zbarvení déle než dvě minuty (BCB +) a druhá pro oocyty, které se do dvou minut po vyjmutí z roztoku odbarvily (BCB -). Část oocytů z každé morfologické třídy nebyla vystavena působení roztoku kresylové modři (kontrola). Rozdělené oocyty byly obarveny fluorescenční barvou MitoTracker, afinitní k aktivním mitochondriím, zbaveny kumulárních buněk, fixovány a obarveny fluorescenční barvou vázající se na chromatin. Poslední krok umožnil rozdělit oocyty do skupin dle postupujícího jaderného zrání (GV 1 – 2, 3 – 4, pozdní diakineze – M1, degenerované GV). Stádium GV bylo hodnoceno dle Motlíka et al. (1984) a Sun et al.(2004). Vizualizace GV byla provedena na konfokálním a epifluorescenčním

mikroskopu,

vizualizace

aktivních

mitochondrií

pouze

na

konfokálním mikroskopu. Vyhodnocení morfologie a lokalizace mitochondrií bylo provedeno podle Sun et al. (2001) Torner et al. (2004) a Sturmey et al. (2006).

9

2

CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo sledování vztahu mezi úrovní cytoplazmatického a jaderného

zrání, úrovní cytoplazmatického zrání a morfologickou třídou oocyt-kumulárního komplexu a úrovní cytoplazmatického zrání a kvalitou cytoplazmy, která byla specifikována množstvím

aktivních

mitochondrií

v cytoplazmě oocytu,

jejich

morfologií a lokalizací. Neméně významným účelem této práce bylo optimalizovat všechny použité metody, aby mohly být takto získané poznatky aplikovány ve výzkumné činnosti Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, v.v.i., kde byla tato práce zpracovávána.

10

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Oogeneze Vznik a vývoj pohlavních buněk je základním předpokladem pro uskutečnění rozmnožování savců. Tento proces se u samic nazývá oogeneze. První fáze oogeneze probíhá u savců již ve fetálním období vývoje samice a končí pohlavní dospělostí. Důsledkem tohoto složitě řízeného procesu je vznik jedinečných pohlavních buněk se schopností oplození a následného vzniku nového jedince (Romanovský et al., 1988). Během embryonálního vývoje se zpravidla velice brzy diferencují prapohlavní buňky (primordiální gonocyty) na jiném místě než leží gonáda (Rosypal et al., 2003), u savců ve splanchnopleuře a přilehlém entodermu žloutkového váčku (Sládeček et al., 1986). Tato část prenatálního vývoje se nazývá diferenciace pohlaví a u prasat probíhá kolem 30. dne embryonálního vývoje. Z místa svého vzniku primordiální zárodečné buňky migrují mezenteriem do povrchových struktur primitivních gonád. Zde se integrují do jejich kortexu a společně s podpůrnými buňkami dávají vzniknout zárodečnému epitelu (Romanovský et al., 1988). Vývoj primordiálních gonocytů ve smyslu determinace pohlaví se rozlišuje podle aktivity specifických genů, zejména řídícího sry na chromozomu Y. V jeho přítomnosti zůstávají diferenciace schopné buňky ve dřeni základu gonády pro samčí gamety. Není li přítomen chromozom Y, uplatní se základy vajíček v kůře a vznikne vaječník (Rosypal et al., 2003). V gonádách jsou primordiální gonocyty zdrojem pohlavních buněk, které z nich vznikají množením, růstem a zráním (Sládeček et al., 1986). 3.1.1

Fáze množení zárodečných buněk

Diploidní primordiální zárodečné buňky, lokalizované v zárodečné vrstvě na povrchu gonád, se začínají mitoticky dělit. Tato fáze množení probíhá u savců ještě v prenatálním období vývoje a později se již neopakuje. Mitotickou aktivitou primordiálních gonocytů se vytvářejí provazce diploidních oogonií, které pronikají hlouběji do kortexu ovária. Oddělením jednotlivých oogonií od společného provazce vznikají oocyty prvního řádu (též primární oocyty), které se obklopují vrstvou pregranulózních buněk (Briggs et al., 1999). Vzniká tak primordiální folikul (Hafez et Hafez, 2000), který se nazývá též primární (Reece et al, 1998).

11

K dalšímu dělení oogonií a tvorbě primárních oocytů již nedochází. V době jejich narození je sice již jejich počet konečný, ale je dostatečně velký. Tento počet je druhově rozdílný a u narozených selat samičího pohlaví se pohybuje mezi 60 000 až 100 000. Po narození až do doby dosažení pohlavní dospělosti se již primární oocyty příliš nemění (Jelínek, Koudela et al., 2003). 3.1.2

Růstová fáze

V období pohlavního dospívání vstupují oocyty do růstové fáze, kdy mnohonásobně zvětší jádro a svou cytoplazmu – cytoplazmatický růst. Období růstu je velmi dlouhé, navazuje hned na fázi rozmnožovací a probíhá ve dvou fázích. V první, která se uskutečňuje ještě před narozením samice, dochází u oocytů prvního řádu ke spuštění prvního zracího dělení (Sova et al, 1990). To nastává u prasat od 64. dne prenatálního vývoje (Sládeček et al., 1986). Meiózu lze popsat jako dvě dělení podobná mitóze, která následují ihned za sebou. První zrací dělení je heterotypická část meiózy, tedy ta část, která je odlišná od mitózy. Liší se výrazně delší profází, která zahrnuje jedno přípravné stádium – proleptotene a pět stádií – leptoten, zygoten, pachyten, diploten a diakineze. Buňky se během meiózy dělí dvakrát, ale chromozomy pouze jednou. Z jedné buňky tak vznikají 4 buňky s polovičním počtem chromozomů (Nečas et al., 2000). V proleptoten probíhá příprava na redukční dělení a dokončuje se replikace DNA a jeho nástup je řízen faktorem, který Byskov (1978) označil jako meiotec inducing substance – MIS. Vlastní redukční dělení začíná vstupem buňky do leptoten, které se také označuje jako první stádium první profáze meiózy a trvá 3 – 6 hodin. V tomto stádiu dochází v jádře k optické diferenciaci jednotlivých chromozomů (Nečas et al., 2000). Diploidní chromozomy se stávají viditelné jako dlouhé vláknité útvary, jejichž telomery mohou směřovat k určitému místu jaderné membrány (Sládeček, 1986). Tento útvar se nazývá buket, někdy však zůstává rozložení chaotické. Ve stádiu zygoten dochází ke vzájemné podélné syndesi homologních chromozomů (synaptický komplex), které mezi sebou udržují redukční štěrbinu. Spojení chromozomů je umožněno centrálním synaptonemálním komplexem a vzniklý útvar se nazývá bivalent. V pachyten se začínají spiralizovat chromozomy a oddělují se sesterské chromatidy, které zůstávají spojeny jen v místě centromery. Vzniklá konformace se nazývá teráda.

12

Nesesterské chromatidy bivalentů se vzájemně proplétají, současně dochází k překřížení nesesterských chromatid (crossing over) a výměně části nesené informace (rekombinace). Mezi tetrádami je udržována ekvoční štěrbina. V diploten dochází k rozpadu synaptického komplexu a oddálení homologních chromozomů, které však nadále zůstávají spojeny v místech, kde došlo ke crossing overu, tím se tvoří chiazmata. Tato chiazmatypie může u oocytů obratlovců trvat až několik let. Následně všechny tetrády postupně tloustnou a zkracují se, díky čemuž se jejich překřížení posouvá k telomerám - terminalizace. Všechny tetrády tak postupně nabývají kruhovitého tvaru (Nečas et al., 2000). Sova (1990) shrnuje tento proces jako konjugaci chromozomů a vzájemnou výměnu jejich genového materiálu. Zahájení meiózy a její průběh až do stádia diploten probíhá u většiny vyšších obratlovců v embryonálním vývoji. Pouze u některých druhů, jako je kočka a králík, může tento proces přecházet až do krátkého období post partum (Romanovský et al., 1988). Oocyty se po dokončení diploten dostávají do klidové fáze a pokračují ve zracím dělení až po stimulaci ovulací (Alberts et al., 1998). K první ovulaci dochází u prasniček ve věku 6 až 6,5 měsíců (Říha et al., 2003). Druhá růstová fáze primárního oocytu pokračuje po dlouhém přerušení až v období pohlavního dospívání samice. V této době se původně malé oocyty prvního řádu postupně zvětšují ukládáním žloutkových inkluzí ve své cytoplazmě. Období růstu oocytů je provázeno přeměnou primárních folikulů ve folikuly rostoucí a zralé (Sova et al., 1990). Reece (1998) označuje zralé folikuly jako měchýřkovité, neboli Graafovy folikuly. Od počátku pohlavní dospělosti vstupuje během ovariálního cyklu do fáze růstu vždy několik primárních oocytů. K tomuto periodicky dochází až do ukončení pohlavní aktivity zvířete – menopauza (Marvan et al., 2007). 3.1.3

Fáze zrání

V této fázi oogeneze je plně vzrostlý oocyt v antrálním folikulu přeměněn na vajíčko schopné oplození. V podstatě se jedná o redukci chromozomové výbavy oocytu z diploidního stavu na haploidní, což umožňuje vznik právě diploidní zygoty při splynutí prvojader po oplození. Tato fáze je pokračováním meiózy, která byla dříve zastavena v diploten profáze prvního zracího dělení (profáze I) na konci fáze množení

13

zárodečných buněk (Sládeček, 1986). U fáze zrání lze poměrně přesně rozeznat kroky, kterými musí zrající oocyt úspěšně projít, aby dosáhl schopnosti oplození. 3.1.3.1 Rozpad zárodečného váčku (GVBD – germinal vesicle breakdown) Pro pokračování meiózy je nutný rozpad jaderné membrány jádra oocytu, které je častěji označováno jako zárodečný váček (germinal vesicle - GV). Pokračování meiózy je in vivo navozeno zvýšením hladiny luteinizačního hormonu (LH) a intrafolikulárními signály (Sirard et al., 1998). In vitro postačuje samotná izolace oocytu z folikulu. GV je nejprve dobře viditelný, ohraničený jadernou membránou. Na začátku fáze růstu, kdy pokračuje kondenzace chromatinu, začíná proces GVBD. Nejprve se projevuje mírným vlněním jaderné membrány, které postupně zesiluje. Následně je membrána zcela rozptýlena do membránových dubletů, které se stávají nerozeznatelnou součástí endoplazmatického retikula (Szölösi et al., 1972). 3.1.3.2 Dokončení prvního zracího dělení Přerušené první zrací dělení pokračuje kondenzací chromatinu – diakineze I. Chromatidy bivalentů jsou nadále spojeny v podobě chiasmat, u nichž pokračuje terminalizace. Na konci diakineze jsou úplně spiralizované chromatidy spojeny jen terminálními chiasmaty a nastává GVBD. Toto období je také někdy nazýváno prometafáze. Kondenzace chromozomů bývá intenzivnější než při mitóze. Metafáze prvního zracího dělení (metafáze I) je typická pohybem chromozomů směrem do ekvatoriální roviny buňky - metakineze. Centromery obou bivalentů směřují k opačným pólům dělícího vřeténka a jsou připraveny k rozestupu (Nečas et al., 2000). V anafázi prvního zracího dělení (anafáze I) dochází k rozestupu celých, již rekombinovaných homologních chromozomů. Z tetrád se tak stávají diády (Nečas et al., 2000). Rozdělení dlouhých

chromozomů s vmezeřenými,

neterminalizovanými

chiasmaty trvá déle než u krátkých chromozomů, spojených jen terminálním chiasmatem (Sládeček et al., 1986). Následuje telofáze prvního zracího dělení (telofáze I), která zahrnuje rekonstrukci haploidních dceřiných jader, které však obsahují stejné množství DNA jako při normální mitóze, a cytokinezi. Genetický materiál se před druhým zracím dělením nikdy nereplikuje, nejde tedy o interfázi známou z mitózy ale o tzv. interkinezi (Nečas et al., 2000).

14

3.1.3.3 Druhé zrací dělení Druhé meiotické dělení je svým průběhem prakticky totožné s mitózou, nazývá se proto homotypické. Po interkinezi ihned následuje výrazně kratší profáze (profáze II), než je tomu u prvního zracího dělení. Hapoloidní chromozomy jsou v podobě dyád, každý chromozom je tvořen dvěma chromatidami, spojenými centromerou (Nečas et al., 2000). Metafáze druhého zracího dělení (metafáze II) je typická uspořádáváním chromozomů do ekvatoriální roviny buňky (Sládeček et al., 1986). Oocyty savců blokují meiózu ve stádiu metafáze II. Zastavení meiózy je způsobeno aktivací komplexu cyklinu B s cyklin dependentní kinázou Cdc2 a stabilizací tohoto komplexu (Kishimoto, 2003). Meióza se dokončuje až po další aktivaci, kterou je v přirozených podmínkách oplození. U savců je proces aktivace spuštěn změnou hladiny volných vápníkových iontů v oocytu, kterou způsobuje přítomnost spermie (Swann et Ozil, 1994).

3.2 Folikulogeneze První podoba folikulu se objevuje prenatálně, kdy dochází k obklopení oogonií jednou vrstvou plochých somatických buněk, které se nazývají pregranulózní a formují tak primordiální folikul. Když je v oogoniích zahájena meióza, mění se primordiální folikul na primární a oogonie na oocyt prvního řádu. V období růstu oocytu dochází k intenzivnímu dělení granulózních buněk a tím se přetváří stěna primárního folikulu z jednovrstevné na vícevrstevnou. Folikulární vrstva zvaná granulóza se na povrchu pokrývá hojně prokrveným vazivovým obalem – theca folliculi, která se dělí na vnější - theca folliculi externa a vnitřní – theca foliculi interna. V následujících dnech, kdy končí růst oocytu, intenzivní dělení granulózních buněk dále pokračuje, čímž dochází k růstu celého folikulu. Současně dochází k uvolňování folikulární tekutiny z granulózních buněk do mezibuněčného prostoru granulózy, čímž vzniká dutina zvaná folikulární antrum a folikul se stává sekundárním. Folikuly obsahující antrum se nazývají antrální. U prasete pokračuje růst folikulu ještě krátce po formaci antra. Dalším růstem folikulu a zvětšováním jeho antra vzniká terciální folikul (Graafův folikul) který má již plně formované antrum. Graafův folikul je velký zhruba 15 až 20 mm a je tvořen populací asi 5 000 buněk. Stěna antra folikulu vybíhá dovnitř dutiny jako vejconosný hrbolek – cumulus oophorus a v něm je umístěn oocyt. Komunikace

15

oocytu s kumulárními buňkami probíhá pomocí propustných spojů, nazývaných též gap junction (Hafez et Hafez, 2000). Když folikul dosahuje velikosti 2 – 3 mm, oocyt uvnitř dokončuje svůj růst a zároveň získává schopnost pokračovat v meiose. Prasečí oocyty získané z větších folikulů mají vyšší potenciál dosáhnout metafáze II a po oplození jsou schopné lepšího vývoje v embryo než oocyty izolované z menších folikulů (Shoevers et al., 2007).

3.3 Morfologické hodnocení oocyt-kumulárních komplexů Vzhledem k velikosti oocytu, která se pohybuje okolo 130 µm, je nutné, aby se na jeho zrání podílely kumulární buňky. Jsou to drobné buňky obklopující oocyt v útvaru zvaném kumulus a jejich funkcí je transport výživy do oocytu a zprostředkovávání řady důležitých signálů z oocytu (Říha, 1999). Morfologické vlastnosti kumulárních buněk společně s morfologií cytoplazmy tvoří podstatu morfologického hodnocení celého komplexu kumulus-oocyt. Po izolaci jsou tyto komplexy děleny do morfologických tříd:

1. třída: oocyty s kompletním kumulem tvořeným více než 6 vrstvami kumulárních buněk, středně tmavá, homogenní a jemně granulovaná cytoplazma

2. třída: oocyty s nekompletním, ale kompaktním kumulem, nebo kumulem obsahujícím 3 – 5 vrstev buněk, středně tmavá cytoplazma s ojedinělými nekrotickými body

3. třída: oocyty obklopené pouze coronou radiatou, nebo 1 – 2 vrstvami kumulárních buněk, se středně tmavou až tmavou cytoplazmou, nebo cytoplazmou obsahující více než 5 nekrotických bodů

4. třída: oocyty uchovávající si pouze ojedinělé kumulární buňky, velmi tmavá nebo jinak defektní cytoplazma, nebo oocyty s degenerujícím expandovaným kumulem

16

5. třída: oocyty

bez

přítomnosti

kumulárních

buněk,

kondenzovaná

cytoplazma nebo její zbytky

Pro IVM jsou obecně akceptovatelné oocyty, které svojí morfologií odpovídají prvním třem skupinám (Říha et al., 1999). Pro výzkum v této diplomové práci byly sbírány oocyty spadající do prvních čtyř skupin, aby bylo možno pozorovat rozdíly mezi buňkami používanými pro IVM a nevhodnými. Pátá skupina vybírána nebyla. Oocyty morfologické třídy 1 až 4 jsou na obrázku 1 v přílohách.

3.4 Vliv estrálního cyklu na oocyty prasnic Meiotická a vývojová kompetence oocytů je postupně nabývána s růstem folikulu v průběhu estrálního cyklu. Tyto kompetence jsou dosaženy těsně před ovulací, kdy je oocyt krátce zastaven ve fázi GV 1. Jeho zrání nastává až po ovulaci. U skotu se morfologie, meiotická a vývojová kompetence oocytu mění během růstu, stagnace, dominance a regresivní fáze v obou dvou, nebo třech folikulárních vlnách (Machatková et al., 2008). Obvykle jeden gonadotropin dependentní folikul z poslední folikulární vlny pokračuje v růstu jako dominantní, zatímco ostatní podřízené folikuly atretizují (Říha et al., 1999). Naproti tomu u prasat nikdy nebyl pozorován vývoj oocytů ve vlnách. Folikulogeneze je zde pozorována jako kontinuální růst a atrézie ovariálních folikulů nezávisle na změnách v plazmatické koncentraci FSH a steroidních hormonů, bez přítomnosti dominantních folikulů během luteální fáze. Je možné, že proces selekce a růstu dominantních folikulů, která později vede k atrézii subordinantních folikulů, způsobuje dlouhou periodu estrálního cyklu, především pozdní luteální a časné folikulární fáze. Oocyty, získané od prepubertálních prasniček vykazují nižší meiotickou a vývojovou kompetenci, než jak je tomu u cyklujících prasnic, nižší reprodukční potenciál lze pozorovat i u prasnic po prvním vrhu. Pro užití v IVF a ve šlechtitelských programech byly tedy nejvíce doporučovány oocyty, získané od pubertálních cyklujících prasniček. Vyšší meiotická a vývojová kompetence, pozorovaná u oocytů získaných od prasniček krátce po počátku puberty, se dále zvyšuje s narůstajícím počtem estrálních cyklů.

17

Morfologická kvalita a meiotická kompetence oocytů cyklujících prasniček během estrálního cyklu kolísá, protože folikulární populace přítomná na vaječníku je tvořena normálními i atretickými folikuly. Oocyty bývají obvykle izolovány bez ohledu na stadium estrálního cyklu dárkyně a pocházejí z malých (2 až 4 mm) a středních folikulů (5 až 9 mm), protože tyto jsou v nejvyšší míře zastoupeny na vaječníku. Morfologická kvalita stejně jako meiotická kompetence oocytů pocházejících z malých folikulů je velmi nízká a oocyty izolované z malých folikulů cyklujících pubertálních prasniček vykazují vysokou variabilitu. Průměrný počet oocytů izolovaných z malých oocytů na donorku vzrůstá během luteální fáze, maxima dosahuje v časné folikulární fázi, klesá v období střední folikulární fáze a znovu vzrůstá v pozdní folikulární fázi. Průměrné procentuální zastoupení použitelných oocytů se v průběhu celé luteální či folikulární fáze nemění kromě pozdní luteální fáze, kdy výrazně klesá. Průměrný počet použitelných oocytů z malých folikulů získaných na donorku vzrůstá během luteální fáze, dosahuje vrcholu v časné folikulární fázi a následně klesá. Podobně i průměrné procento zralých oocytů narůstá během luteální fáze a pokleslo během folikulární fáze se statisticky prokazatelnými rozdíly mezi jednotlivými stádii uvnitř obou fází. V porovnání s populací oocytů získávaných z malých folikulů, bývají oocyty izolované ze středních folikulů méně variabilní. Na vaječníku se vyskytují od střední luteální fáze po střední folikulární fázi. Průměrný počet izolovaných oocytů na donorku a průměrné procentuální zastoupení použitelných oocytů se během periody nemění, s výjimkou střední folikulární fáze kdy výrazně klesá. Oocyty izolované z folikulů střední velikosti, navzdory jejich nižšímu počtu, vykazují vyšší morfologickou kvalitu a schopnost dokončit jaderné zrání než oocyty odvozené z malých folikulů. Velikost folikulů, ze kterých jsou oocyty získávány, má prokazatelný vliv na kvalitu těchto oocytů, jejich schopnost maturace, fertilizace a vývoje. Prasečí oocyty mění své množství, morfologickou kvalitu a meiotickou kompetenci v závislosti na stádiu folikulárního vývoje. Období pozdní luteální a časné folikulární fáze lze považovat za nejvhodnější pro získávání morfologicky normálních a meioticky kompetentích oocytů v porovnání s jinými stádii estrálního cyklu (Machatková et al., 2008).

18

3.5 Hodnocení jaderného zrání oocytů Zrání oocytu je dlouhý proces, během kterého oocyty nabývají schopnosti být úspěšně oplozeny. Tento proces je komplexní, avšak je v něm možné rozeznat zvlášť jaderné a cytoplazmatické zrání. Jaderná maturace zahrnuje především segregace chromozomů (Ferreira et al., 2009). Progres jaderného zrání se vizuálně projevuje rozdílnými stádii konformace chromozomů. Na základě tohoto poznatku je rozeznáváno pět fází GV. GV 0 byla popsána až v posledních letech. Je typická pro oocyty izolované z folikulů menších než 1 mm, které obsahují rostoucí oocyty. Rozložení chromatinu bývá u takových oocytů difúzní s vláknitým vzhledem po celé oblasti jádra. Je zde zřetelně patrná jaderná membrána a jadérko. Ve fázi GV 1 je jadérko i nukleolema stále intaktní, ale kondenzovaný chromatin je zformován do podoby prstence nebo podkovy okolo jadérka. Rozložení chromatinu ve fázi GV 2 je podobné rozložení v GV 1, avšak vyskytují se zde již ojedinělé shluky chromatinu v prostoru jádra a v blízkosti jaderné membrány. Chromatin ve fázi GV 3 je ještě více shromážděn ve shlucích nebo pásech rozšířených v celé nukleoplazmě. Ve fázi GV 4 jsou shluky nebo pásy stále přítomny, jaderná membrána je však již méně zřetelná a jadérko mizí úplně (Sun et al., 2004). Fáze GV 1 až 4, uváděné Motlíkem (1984), jsou srovnatelné s fázemi, které uvádí Sun (2004), není zde však uvedena fáze GV 0, která v té době ještě nebyla popsána. Motlíkova práce je však doposud považována za jednu z nejvýznamnějších v oblasti rozložení chromatinu uvnitř GV, protože v roce 1976 společně s Fulkou fáze GV 1 až 4 poprvé popsali. Z těchto důvodů byl i článek Motlíka et al., (1984) použit pro zařazování oocytů, pozorovaných v této práci, do fází GV. 3.5.1

Detekce GV pomocí fluorescenční mikroskopie

Fluorescence umožňuje specificky obarvit pouze určité pozorované struktury. Každá barva je excitována při určité vlnové délce a při jiné, vyšší, emituje. To umožňuje použít více barev na stejný vzorek a pozorovat je odděleně. Barvy se používají buď přímo (Hoechst) – specificky se váží na určitou strukturu (např. DNA), nebo nepřímo (Alexa fluor) – jsou součástí protilátky proti pozorované struktuře. Vyšší specifity lze dosáhnout použitím neznačené primární a značené sekundární protilátky.

19

Nejjednodušší je použití barev, které výrazně více září po navázání. Stačí je tedy jen přidat ke vzorku a bez dalšího promývání pozorovat (Syber Green). 3.5.1.1 Hoechst 33258 Většina malých molekul, které se váží na DNA, jsou výrazně hydrofobní rovinné aromatické sloučeniny. Jednou z nich je Hoechst 33258, archetypální DNA marker, který se váže do malého žlábku DNA. Je známý svou schopností vázat se na krátké úseky DNA bohaté na A a T (adenin/tymin), avšak vyskytuje se i v mnoha modifikacích (Buurma et Haq, 2008). Hoechst patří do fluorochromů, používaných pro zvýraznění DNA při fluorescenční mikroskopii. V praxi se používá především k vizualizaci jaderné a mitochondrální DNA. V buněčném jádře takto můžeme monitorovat kondenzaci DNA a rozlišovat tak stadia buněčného cyklu. Chemicky se jedná o 4-[5-(4-methyl-1-piperazinyl)[2,5´-bi-1Hbenzimidazol]-2´-yl]fenol.trihydrochlorid. Tato fluorescenční barva se používá ve dvou běžných variantách: Hoechst 33258 a Hoechst 33342. Obě tyto varianty jsou excitovány ultrafialovým zářením o vlnové délce okolo 350 nm a obě emitují v emisním maximu 461 nm. Zatímco Hoechst 33258 je použitelný jen na fixované buňky, zatímco Hoechst 33342 lze použít i vitálně. Je to dáno vyšší lipofilitou Hoechstu 33342, který díky této vlastnosti prochází neporušenými biomembránami a je proto na rozdíl od Hoechstu 33258 použitelný například i pro fluorescencí aktivované třídění buněk na průtokovém cytometru (Enzo, 2009). 3.5.1.2 Sytox Green Jedná se o fluorescenční barvivo, silně afinitní k nukleovým kyselinám. Nelze je použít vitálně, protože prostupuje pouze přes porušené membrány buněk. Emisní maximum této barvy se posouvá s degenerací DNA anebo se změnou její topografie. Může tak docházet k záměně s jinou fluorescenční barvou (Lebaron et al., 1998). Sytox Green lze používat jako zelenou kontrastní barvu pro vícebarevnou fluorescenci fixovaných buněk, nebo pro detekci viability buněk. Excituje se při vlnové délce 504 nm a emituje při 511 nm.

20

3.6 Hodnocení cytoplazmatického zrání oocytů Na rozdíl od jaderného zrání je cytoplazmatické zrání oocytu mnohem obtížněji definovatelné. Jedná se o souhru mnoha faktorů, která má ústit ve stav cytoplazmy dovolující oplození oocytu. Tento proces je typický reorganizací buněčných organel, syntézou a ukládáním mRNA, proteinů a transkripčních faktorů, čímž je umožněn průběh zrání oocytu, oplození a časný embryonální vývoj. Cytoplazmatickou maturaci lze rozdělit na tři úrovně: změny v distribuci organel, dynamika cytoskeletu a zrání na molekulární úrovni. Cytoplazmatické zrání oocytu začíná během růstové fáze a je dokončeno při úspěšné progresi embryonálního vývoje, který je tímto umožněn. Ultrastrukturálními analýzami je možné pozorovat rozdílné pozice mitochondrií, ribozomů, endoplazmatického retikula, kortikálních granulí a Golgiho komplexu během přeměny oocytu ze stádia zárodečného váčku do metafáze II. Dynamika mikrotubulů a mikrofilament podporuje pohyb organel a akt chromozomální segregace, nutné pro jaderné zrání. Molekulární maturace, která je ve zmíněné práci charakterizována transkripcí, ukládáním a zpracováním mateřské mRNA, je zapojena do regulace funkce cytoskeletu (Ferreira et al., 2009). Mimo dynamiky vnitrobuněčných organel a cytoskeletu je možné odhalit progresi cytoplazmatického

zrání

sledováním

metabolické

aktivity oocytu

a

aktivity

mitochondrií. 3.6.1

Indikace metabolické aktivity oocytu kresylovou modří

Kresylová modř (Brilliant cresyl blue - BCB) je vitální barvivo, které umožňuje rozlišit u živých oocytů úroveň aktivity jejich metabolismu, což je významným ukazatelem při hodnocení cytoplazmatického zrání oocytů. Výhodou této metody je možnost použití i u oocytů obklopených kumulárními buňkami, které jsou u přežvýkavců a prasat nutné k jejich úspěšnému zrání. Tato metoda byla již v minulosti testována na běžných hospodářských zvířatech, jako je skot (Alm et al., 2005; Bhojwani et al., 2007), prasata (Ishizaki et al., 2009; Wongsrikeao et a.l, 2006), nebo kozy (Kątska-KsiąŜkiewicz et al., 2007). Podstatou této metody je detekce aktivity enzymu glukóza-6-fosfát dehydrogenázy (G6PDH) pomocí barviva kresylové modři (Bhojwani et al., 2007).

21

Jako je tomu u mnoha jiných buněk, oocyt využívá glukózu jako zdroj energie. Tento substrát je metabolizován glykolytickým systémem, který zahrnuje i pentózofosfátový cyklus (Ishizaki et al., 2009). Enzym G6PDH je komponentem pentózofosfátového cyklu a účastní se výroby ribózofosfátového komplexu, který je nutný pro vznik nukleotidů a NADPH. Takto vznikající molekula NAPDH je důležitým donorem vodíku nebo elektronu (Alm et al., 2005). Metoda detekce G6PDH kresylovou modří vychází z poznatku, že rostoucí oocyt má vyšší hladinu i aktivitu tohoto enzymu než oocyt s ukončeným růstem. Tento jev je způsoben výrazně vyšší proteinovou syntézou v nezralých oocytech, než je tomu u zralých. Měření aktivity G6PDH je umožněno schopností tohoto enzymu odbourávat kresylovou modř. Z obarvených oocytů se tedy rychleji odbarvují oocyty nezralé, které jsou ještě ve fázi růstu. Aktivita enzymů G6PDH je nejvyšší u rostoucích oocytů. Po ukončení růstové fáze a spuštění zracího dělení však již jeho hladina prudce klesá, a tím dochází k pozorovatelnému poklesu jeho aktivity (Bhojwani et al., 2007). Důvodem pro využití selekce oocytů podle aktivity jejich G6PDH je prokazatelně vyšší úroveň zrání oocytů do metafáze II a schopnost normálního oplození u oocytů, které si uchovaly zbarvení, než u oocytů, které barvu metabolizovaly, nebo které vůbec selektovány nebyly. Tato selekce nám umožňuje zefektivnit většinu následujících postupů, mezi něž patří například in vitro maturace (Bhojwani et al., 2007), fertilizace a následné dělení embrya a formování blastocysty (Ishizaki et al., 2009). 3.6.2

Vztah G6PDH a glutationu, význam glutationu jako antioxidantu

Glutathion (GSH) je neproteinový tripeptid složený z aminokyselin glutaminu (kyselina glutamová), cysteinu a glycinu. GSH, přesným názvem γ-L-glutamyl-Lcysteinyl-L-glycin, je důležitý buněčný antioxidant, což znamená, že poskytuje elektrony k redukci peroxidů, dále má dopad na transport aminokyselin, syntézu DNA a bílkovin a na redukci disulfidů. Kritickou komponentní aminokyselinou pro vznik GSH je cystein, jehož vychytávání z prostředí zprostředkovávají kumulární buňky oocytu. GSH je rezervoár cysteinu, významnou zásobní funkci má především v období post-fertilizačního vývoje (Gasparrini et al., 2003).

22

Oocyty jsou velice citlivé na působení oxidačních činitelů, takže snižování jejich účinků může být pro oocyty důležité. Ohrožené jsou především oocyty v in vitro prostředí, protože jsou vystaveny výrazně vyšší koncentraci kyslíku, než jak tomu bývá v prostředí in vivo. Hlavní ochranný mechanismus je oxidace a redukce glutathionu, která probíhá díky glutathion peroxidáze a glutathion reduktáze. Glutathion peroxidáza poskytuje elektrony z GSH (redukovaná forma glutathionu) pro oxidované molekuly v cytoplazmě a tím dává vzniknout oxidované formě glutathionu – GSSG. Zásoba buněčného GSH je obnovována redukcí GSSG glutathion reduktázou. Redukce GSSG vyžaduje NADPH, který je produktem činnosti G6PDH (Krisher et al., 2007). Takže nízká aktivita G6PDH v oocytu snižuje hladinu NADPH v oocytu a tím omezuje možnost obnovy glutathionu. Tímto dochází k narušení antioxidačního mechanismu a ke zvýšení nebezpečí toxické oxidace oocytu (Sushil, 1998). V průběhu zrání oocytu a během oplození má GSH specifický význam pro udržení meiotického vřeténka oocytu, které je jinak poškozováno oxidanty, což vede ke vzniku abnormalit při formování zygoty. Dále umožňuje snížení energie potřebné k dekondenzaci chromatinu spermie a tvorbě samčího prvojádra (Zuelke et al., 2003). Yoshida (1993a) ve své práci uvádí, že oocyty kultivované v médiu Waymout MB 752/1, což je médium bohaté na cystein, podporuje formování samčího prvojádra po in vitro fertilizaci. V jiné práci (Yoshida et. al., 1993b) dokazuje, že koncentrace GSH v prasečích oocytech narůstá v souladu s nárůstem koncentrace cysteinu přidávaného do IVM média a zlepšuje tak formování samčího prvojádra. Koncentrace GSH je výrazně vyšší u oocytů v metafázi II než u somatických buněk, srovnatelná je jen s koncentrací GSH v hepatocytech. Hladina glutationu je nejvyšší u zralých oocytů, kde se podílí na ochraně dělícího vřeténka před oxidanty, jejichž účinek by měl za následek jeho rozpad. Krátce po oplození koncentrace GSH klesá. Proměny v koncentraci glutationu lze spojovat s průběhem buněčného cyklu, kdy narůstá během GVBD a kondenzace chromatinu v metafázi I, u zralých ovulujících oocytů zůstává vysoká a krátce po fertilizaci klesá. Nejnižší koncentrace GSH je u buněk v interfázi – během přítomnosti GV a ve stádiu prvojader po oplození. Kolísání hladiny GSH je regulováno stejnými hormonálními faktory jako buněčný cyklus (Luvoni et al., 2006). Úroveň koncentrace glutationu je možné použít jako indikátor zrání oocytů. Jeho

23

množství získané do metafáze II lze považovat za zásobu pro následný vývoj embrya (Zuelke et al., 2003). Glutathion,

obsažený

v cytoplazmě

oocytů,

je

jedním

z

indikátorů

cytoplazmatického zrání oocytů. Termín cytoplazmatické zrání lze vymezit jako schopnost oocytů dokončit in vitro fertilizaci (IVF), nebo embryonální vývoj po IVF a in vitro kultivaci (IVC). Syntéza a kumulace GSH uvnitř oocytu jsou řízeny kumulárními buňkami, které oocyt obklopují. Toto řízení je zprostředkováno komunikací přes vodivé buněčné spoje (nexus) mezi oocytem a jeho kumulárními buňkami, což bylo prokázáno při maturaci a fertilizaci prasečích oocytů, kterým byly částečně nebo úplně odstraněny kumulární buňky. Oocyty s částečně, či úplně odstraněnými kumulárními buňkami prokazovaly nižší intraoocytární hladinu GSH. V závislosti na tom se u těchto oocytů objevilo prokazatelně horší formování prvojádra a později i blastocysty (Maedomari et al., 2007). 3.6.3

Detekce aktivních mitochondrií fluorescenční barvou MitoTracker Orange

MitoTracker Orange je excitován vlnovou délkou 554 nm a emituje ve vlnové délce 576 nm. Důležitou složkou barvy je thiol, který je schopný chemickou reakcí celý komplex navázat na pozorovanou strukturu. Ta je v tomto případě tvořena volnými thiolovými skupinami na povrchu aktivní mitochondriální membrány. MitoTracker je nízkomolekulární látka, která snadno difunduje přes membrány. Buňky, na které byl aplikován MitoTracker Orange, je možné následně fixovat (Invitrogen, 2008). 3.6.3.1 Morfologie aktivních mitochondrií v ooplazmě prasečích oocytů Rozmístění

aktivních

mitochondrií

se

uvnitř

cytoplazmy

oocytu

mění

s postupujícím zráním. Bylo popsáno, že se mitochondrie v průběhu zrání přesouvají z difuzního rozložení pozorovaného u nezralých oocytů do agregované formy, která je typická shlukováním mitochondrií do klastrů a vyskytuje se u oocytů více zralých (Torner et al., 2004). Podstatu těchto klastrů popsal tým vědců z univerzity v Yorku v Anglii jako kumulace mitochondrií v těsné blízkosti žloutkových granul, která jsou endogenním zdrojem tuku. Ten je z převážné části tvořen triglyceridy a je využíván jako substrát β-oxidací a citrátovým cyklem pro vznik ATP v matrix mitochondrií (Sturmey et al., 2006).

24

3.6.3.2 Lokalizace mitochondrií uvnitř oocytů s různou meiotickou kompetencí Sun et al.(2001) pozoroval rozložení mitochondrií u prasečích oocytů izolovaných v různých stádiích získávání meiotické kompetence, u oocytů meioticky kompetentních, zrajících, oplozených a u časných vývojových stádií embrya. Zjistil, že malé folikuly (0,5 – 2 mm) poskytují asi polovinu oocytů s výrazně periferním rozložením (oocyty v růstové fázi) a zbytek oocytů s částečně periferní a centrální lokalizací. V případě velkých folikulů. Akumulace aktivních mitochondrií v periferní vrstvě ooplazmy, okolo GV i uvnitř cytoplasmy bylo charakteristické pro oocyty izolované z velkých folikulů (3 – 6 mm). V průběhu meiotického zrání od GVBD do anafáze I bylo pozorováno nahromadění mitochondrií v perinukleární oblasti. U zralých oocytů byly mitochondrie formovány do větších shluků a přesunuly se dovnitř cytoplazmy. Sturmey (2006) popisuje lokalizaci mitochondrií u nezralých oocytů pravidelně po celé ooplazmě s vyšším množstvím v kortikální oblasti a v okolí GV. U zralých ooyctů uvádí výskyt shluků v centrální oblasti oocytu. Dochází tak ke zhruba pravidelnému rozmístění mitochondriálních klastrů uvnitř ooplazmy.

25

4

METODIKA

4.1 Získávání oocytů Oocyty byly získávány z ovárií prasnic různého věku a kategorie, poražených na jatkách. Ovária byla roztřízena podle stávajícího ovariálního cyklu. Pro tuto studii byly vybrány ovária ve fázi 5. až 10. den po ovulaci, která jsou charakteristická přítomností středně velkých folikulů o rozměru 2 až 4 mm. Poté byla provedena totální disekce korové vrstvy vaječníku. Uvolněné oocyty byly nejprve spláchnuty z ovária oplachovacím médiem, které se skládá z roztoku PBS (phosphate-buffered saline – sůl pufrovaná fosfátem) podle Dulbecca, s přídavkem 1 % bovinního fetálního séra, a zbaveny největších částí ovariální tkáně filtrací přes sítko a jemnou síťku (uhelon o hustotě 99 µm). Poté byly umístěny do izolačního média (E199 s Hepesem + FBS 5 %) a následně vybrány vhodné oocyty kapilárou.

4.2 Barvení kresylovou modří Živé oocyty byly ihned po odebrání barveny po dobu 90 minut v roztoku 35 µM kresylové modři v PBS obohaceného o 0,4 % BSA v atmosféře s 5 % CO2 při 38,5 °C. Vyjmuté oocyty byly po 15 minutách rozděleny na 2 skupiny. Skupina BCB+ zahrnovala oocyty, které si zachovaly zbarvení déle než 2 minuty, druhá, označená BCB-, obsahovala oocyty, které barvu metabolizovaly.

4.3 Barvení aktivních mitochondrií Ihned po rozdělení do skupin byly skupiny oocytů samostatně přeneseny do 200 nM fluorescenční barvy MitoTracker Orange (Invitrogen) ředěné do této koncentrace roztokem PBS + 0,4 % BSA. Zde byly inkubovány po dobu 30 minut při 38,5 °C v prostředí 5 % CO2. Pro určení parametrů mrtvých oocytů byly 4 náhodné oocyty morfologické třídy 1 až 3 ze vzorku vyjmuty a po dobu 30 minut inkubovány v 1 µM roztoku kyanidu (Karbonyl kyanid p-trifluorometoxy fenylhydrezon - FCCP).

4.4

Zbavení oocytů kumulárních buněk a fixace Po absolvování předchozích kroků byly oocyty nejprve inkubovány ve vortexovací

zkumavce v médiu M199 s přidáním kyseliny hyalurinové (1 ml M199 + 1 ml 200 ui 26

kyseliny hyalurinové) po dobu 10 minut při 38,5 °C a atmosférou s 5 % CO2. Poté byly vortexovány při 25 – 30 Hz po dobu 1 minuty. Po vypláchnutí oocytů z vortexovací zkumavky bylo nutno některým oocytům odstranit zbylé kumulární buňky úzkou skleněnou pipetou. Samotné oocyty bez kumulárních buněk byly ihned fixovány v paraformaldehydu (3,7 %, 30 min, 38,5°C a 5 % CO2). Po fixaci byly oocyty uchovány v čistém PBS při teplotě 3 až 8 °C a nejpozději do dvou dnů přenášeny na podložní sklo za současného přidání fluorescenční barvy pro označení chromatinu.

4.5 Barvení chromatinu Po fixaci, při nanášení na podložní sklíčko, byly oocyty rozděleny do dvou skupin. Na oocyty, které byly určeny pro vyhodnocení stavu chromatinu pod epifluorescenčním mikroskopem, byla aplikována fluorescenční barva Hoechst 33258 a na skupinu oocytů, která měla být vyhodnocována pomocí konfokálního mikroskopu, byla použita fluorescenční barva SytoxGreen, protože na používaném konfokálním mikroskopu není laser schopný excitovat ve vlnové délce potřebné pro excitaci barvy Hoechst 33258. Na druhou stranu, barva SytoxGreen je poměrně málo stabilní a brzy se vysvěcuje. Pro vizualizaci chromatinu na epifluorescenčním mikroskopu byla tedy použita stabilnější fluorescenční barva Hoechst 33258.

4.5.1 Fluorescenční barva SytoxGreen Při přípravě preparátu byly oocyty nanášeny na podložní sklíčka s deseti jamkami (Menzel – Gläser 10 well 6,7 mm - teflon – tloušťka vrstvy 100 µm). Na každém sklíčku bylo z metodických důvodů využíváno pouze osm jamek bez krajních dvou. Do každé jamky byla připravena jedna kapka o objemu přibližně 3µl nanášecího pufru s barvou Sytox Green (Invitrogen). Nanášecí pufr tvořil Vecta Shield 1:1 s PBS, do kterého bylo přidáno 10 µg/ml Sytox Green.

4.5.2 Fluorescenční barva Hoechst 33258 Na oocyty, které byly zkoumány pod epifluorescenčním mikroskopem, byla pro barvení chromatinu použita barva Hoechst 33258, protože je stabilnější a nevysvěcuje se tak rychle jako SytoxGreen.

27

Fluorescenční barva smíchaná s ochranným nanášecím pufrem vectashield (10 µg/ml finální koncentrace Hoechstu ve Vecta Shieldu, který byl nejprve namíchán 1:1 s PBS dle De La Fuente et al., 2004) byla nanášena v kapkách o objemu přibližně 3 µl na epoxidová podložní sklíčka s deseti jamkami (Menzel – Gläser 10 well 6,7 mm epoxide – tloušťka vrstvy 20 µm). Na kapky se následně nanášely oocyty s co nejmenším množstvím PBS a to tak, aby byly v jedné jamce maximálně 3, nejčastěji však dva nebo jeden. Preparát byl následně zakryt krycím sklíčkem (Menzel – Gläser, 24 x 50) a po obvodu ošetřen Fixogumem proti vysychání. Tyto preparáty byly vizualizovány na epifluorescenčním mikroskopu. Při získávání výsledků pro tuto práci byl použit Hoechst 33258 od firmy SigmaAldrich Corporation.

4.6 Vizualizace, analýza obrazu Část připravených preparátů byla vizualizována na epifluorescenčním mikroskopu Nicon Eclipse 80i a část na konfokálním mikroskopu Leica TCS SP2. Průběžně připravované preparáty byly buď ihned vyhodnocovány – preparáty na epifluorescenční mikroskop, nebo zamrazovány a později hromadně analyzovány na konfokálním mikroskopu. Na epifluorescenčním mikroskopu byly obarvené preparáty analyzovány za použití fluorescenční kostky UV – 2A s excitačním rozsahem 330 – 380 nm pro vyhodnocení chromatinu obarveného fluorescenční barvou Hoechst 33258. Emitované záření bylo vyhodnocováno okamžitě, nebo snímáno kamerou VDS CDD 1300, řízenou PCI kartou MuTech MV 2500. Fluorescenční barva MitoTracker, aplikovaná na preparáty pro obarvení mitochnodrií, byla pozorována na konfokálním mikroskopu. Excitace ve vlnové délce 561 nm se prováděla helium-neonovým laserem. Sytox Green, fluorescenční barva afinitní k chromatinu, aplikovaná na preparáty určené pro konfokální mikroskopii, byla excitována při vlnové délce 488 nm argo-kryptonovým laserem. Detekce emisního signálu se realizovala spektrálním detekčním systémem Leica TCS SP2 podle emisního spektra dané barvy. Pro MitoTrcker ve vlnové délce 582 – 720 nm a pro Sytox Green v 495 – 530 nm, za použití olejového objektivu zvětšujícího 40 x a za dodatečného zvětšení 1,39 x. Aby bylo možné snímání uvedeným objektivem, byl použit imerzní olej Leica (immersion liquid type F, ne23 = 1,5180, ve = 46).

28

Snímky emitace fluorescenční barvy MitoTracker byly pořizovány ze čtyř vrstev oocytu a to v úrovni oolemy, 10 µm, 20 µm a 30 µm pod oolemou. Pro analýzu obrazu byly využívány obrázky pořízené v rozlišení 512 x 512 pixelů, pro prezentaci v diplomové práci byly některé fotografie pořízeny ve vyšším rozlišení 1024 x 1024 pixelů. Emitace fluorescenční barvy Sytox Green, označující přítomnost chromatinu, byla zaznamenána v příslušné vlnové délce na snímky se stejnou kvalitou jako v předchozím případě (512 x 512 pixelů a 1024 x 1024 pro prezentaci v diplomové práci). Obrázek byl doplněn snímkem ze stejné vrstvy preparátu ve vlnové délce pro MitoTracker, aby mohly být tyto snímky v případě potřeby porovnány, či složeny. Všechny snímky, získané z konfokálního mikroskopu, byly vyhotoveny trojím skenováním dané oblasti pro zvýšení specifity obrazu, s dodatečným zvětšením 1,39 a s otvorem pro průchod laserových paprsků (pinhole – ovlivňuje šířku skenované vrstvy preparátu) nastaveným na průsvit 140 µm. Pro analýzu intenzity emise fluorescenční barvy MitoTracker byly vybrány snímky pořízené ve vrstvě 20 µm pod ooplazmou. Tyto obrázky byly analyzovány v programu NIS-Elements AR 3.00, SP3, Build 468, kde byla zjištěna průměrná intenzita fluorescenčního signálu na skenované ploše. Analýza morfologie a lokalizace mitochondrií byla prováděna optickým vyhodnocením všech pořízených snímků vrstev oocytu a zařazením do skupin. Na základě úrovně morfologie mitochondrií byly všechny oocyty rozděleny do čtyř skupin. První skupina difúzní, která zahrnovala oocyty s rovnoměrným rozmístěním mitochondrií v cytoplazmě. Do skupiny heterogenní morfologie byly zařazeny oocyty s nepravidelným uskupením mitochondrií. Skupina granulární + klastry zahrnovala oocyty s mitochondriemi organizovanými do pravidelných shluků sférického tvaru a různé velikosti. Poslední skupina oocytů s nízkou mitochondriální aktivitou byla tvořena oocyty bez fluorescenčního signálu (viz obrázek 2).

29

1

2

3

4

Obrázek 2: typy morfologie mitochondrií v oocytu. 1. difúzní, 2. granulární + klastry, 3. heterogenní, 4. bez signálu, MitoTracker, konfokální mikroskop, snímkové zvětšení 400x, 20 µm pod oolemou

Pro pozorování lokalizace mitochondrií byly vytvořeny tři skupiny, které obsahovaly rozložení homogenní, periferní a centrální. Dělení na tyto skupiny vychází z již uveřejněných pozorování (Sun et al., 2001, Torner et al., 2004 a Sturmey et al., 2006). Pozorované fáze jaderného zrání byly rozděleny do čtyř skupin a to GV 1 – 2, GV 3 – 4, pozdní diakineze – M1 a degenerované GV (viz obrázek 3 v přílohách). Skupiny GV byly stanoveny podle autorů Motlík et al., 1984, a Sun et al., 2004.

30

1

2

3

4

Obrázek 4: lokalizace aktivních mitochondrií v oocytech, 1. homogenní, 2. periferní, 3. periferní (mitochondriální morfologie - klastry), 4. centrální, MitoTracker, konfokální mikroskop, snímkové zvětšení 400 x.

4.7 Statistická analýza, použité metody prezentace výsledků Všechny analyzované parametry se vztahovaly na metabolickou aktivitu oocytů, která byla zjišťována barvením kresylovou modří. V tomto směru bylo sledováno, v jaké četnosti se vyskytují pozorované parametry uvnitř skupin BCB. V případě porovnávání vztahu morfologické třídy oocyt-kumulárních komplexů a úrovně metabolické aktivity bylo sledováno rozložení četností BCB uvnitř skupin morfologické kvality. Výsledky analýzy intenzity aktivních mitochondrií byly zpracovány procedurou CATMOD (SAS 9.1.4) s metodou výpočtu GLM - zobecněný lineární model s H0 = 31

není statisticky průkazný rozdíl mezi četností pozorovanou a předpovídanou. Pro vyjádření střední hodnoty intenzity fluorescence aktivních mitochondrií byl použit průměrný střední čtverec hodnoty (LSMean) ± střední chyba výběru. Data z analýz vztahu metabolické aktivity oocytu k morfologické kvalitě oocytkumulárního komplexu, stupňům jaderného zrání a k rozložení aktivních mitochondrií byla porovnána statistickou metodou dvoufaktorová ANOVA (Microsoft excel 2007). Pod pojmem opakování je myšleno opakované provedení stejného laboratorního postupu na nově izolovaných oocytech. Laboratorní práce se prováděly vždy nárazově, proto lze jednotlivá opakování jasně časově oddělit.

32

5

VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE

5.1 Vliv morfologické třídy oocyt-kumulárních komplexů na úroveň jeho metabolické aktivity V této první části pokusu byly porovnány relativní podíly oocytů metabolicky méně aktivních oproti oocytům metabolicky více aktivním a to ve vztahu k jejich morfologické třídě. Data byla získána od 167 oocytů ve třech opakováních. U morfologických tříd I – II a III byly zastoupeny převážně oocyty s nižší aktivitou metabolismu. Jinak tomu již bylo v případě morfologické třídy IV, kde se vyskytoval větší podíl metabolicky méně aktivních oocytů. Nebyly však shledány statisticky relevantní rozdíly mezi procentuálním zastoupením skupiny BCB + ani BCB - u jednotlivých morfologických tříd. Jak je patrné v grafu 1, čím lepší byla morfologická kvalita selektovaných oocytů, tím častěji vykazovaly nižší úroveň metabolické aktivity. Což je v souladu s již dřívějšími pozorováními (Ishizaki et al., 2009).

33

Poměr skupin BCB v morfologických třídách 100

BCB +

Procentuální podíl oocytů

BCB -

BCB +

90 80 70

BCB +

60 50 40 BCB -

30 20 10

BCB -

0 I - II

III

IV

morfologická třída

Graf 1: Procentuální zastoupení skupin úrovní metabolické aktivity ve skupinách morfologických tříd. Metabolická aktivita: nízká (BCB +), vysoká (BCB -). Morfologická třída 1 až 2 (I - II), 3 (III) a 4 (IV). Chybové úsečky: směrodatná odchylka mezi opakováními, 3 opakování.

5.2 Vztah mezi úrovní aktivity metabolismu a jaderným zráním Do pozorování vlivu selekce oocytů podle úrovně jejich metabolické aktivity na procentuální rozdělení fází jaderného zrání byly zahrnuty oocyty morfologické třídy 1 až 3 bez ohledu na ni. Z výsledků, získaných z 219 oocytů ve čtyřech opakováních, je patrné, že se u skupiny metabolicky méně aktivních oocytů (BCB +) vyskytuje největší zastoupení oocytů ve fázi GV 1 až 2, naproti tomu oocyty, které jsou více metabolicky aktivní, vykazovaly nejvyšší zastoupení oocytů ve fázi pozdní diakineze až metafáze 1 (skupina značená M1) a vyšší podíl degenerovaných oocytů než jak tomu bylo u skupiny BCB +. Z toho je možné vyvodit, že skupina BCB – obsahovala z velké části oocyty degenerující a apoptické, které mohou mít porušené regulační procesy a jejich jaderné zrání tak probíhá neřízeně a velmi progresivně.

34

Procentuální zastoupení fází GV uvnitř skupin BCB

Procentuální podíl oocytů

120 100 80

a

60

b

40 20

b

a 0 BCB +

GV 1 - 2

BCB -

GV 3 - 4

M1

deg.

Graf 2: Procentuální zastoupení skupin jaderného zrání ve skupinách úrovně metabolické aktivity. Metabolická aktivita: nízká (BCB +), vysoká (BCB -). Skupiny stádií jaderného zrání: GV 1 – 2, GV 3 – 4, pozdní diakineze až M1 (M1), degenerované GV (deg.). Statisticky významné rozdíly (P < 0,05) jsou označeny různými indexy na sloupcích grafu. Chybové úsečky: směrodatná odchylka mezi pozorováními, 4 opakování.

5.3 Vliv

úrovně

metabolické

aktivity

na

množství

aktivních

mitochondrií uvnitř oocytu Do tohoto hodnocení byly zařazeny všechny oocyty běžně používané v metodách IVM, tedy morfologické třídy 1 až 3. Pozorování bylo provedeno ve třech opakováních celkem na 141 oocytech. Při zpracování výsledků byla nejprve zjištěna průměrná intenzita emise fluorescenční barvy MitoTracker po aplikaci na oocyty usmrcené kyanidem, pro zjištění parametrů oocytů ze vzorku, které byly mrtvé před barvením aktivních mitochondrií (viz obrázek 4 v přílohách). Průměrná intenzita naměřená na čtyřech oocytech v jednom opakování byla 47,45 ± 4,75. Bylo tedy vyvozeno, že hodnota průměrné intenzity mrtvých oocytů se pohybuje nad 40. Z vlastních fotografií této skupiny je zase patrné, že dochází k viditelnému obarvení chromatinu uvnitř jádra. Při zpracovávání výsledků byly vynechány oocyty, pohybující se nad uvedenou hodnotou intenzity emise a ty,

35

které vykazovaly viditelné obarvení chromatinu ještě před zmizením jaderné membrány. Všechny tyto oocyty byly z měření vyřazeny. Jak lze vidět v grafu 3, průměrná intenzita emise fluorescenční barvy MitoTracker byla nejvyšší ve skupině oocytů méně metabolicky aktivních (12,15 ± 1,02) a to na hladině významnosti P < 0,0001. Mezi skupinou více metabolicky aktivních oocytů (0,99 ± 2,97) a kontrolou (1,62 ± 1,5) se nevyskytoval rozdíl na žádné hladině významnosti. Je nutno konstatovat, že teoreticky by se u buněk se sníženou metabolickou aktivitou nemělo vyskytovat velké množství aktivních mitochondrií. Tento jev by mohl mít příčinu v tom, že oocyty s nízkou aktivitou metabolismu obsahovaly v době přenosu do fluorescenční barvy MitoTracker nějaké množství kresylové modři. To by mohlo znamenat, že tyto oocyty ještě podstatně pomaleji odbourávaly MitoTracker ze svého systému než tomu bývá za normálních okolností (viz Graf 3, BCB c). Další možností je, že oocyty byly kombinací těchto dvou barev poškozeny a proto neodbourávaly fluorescenční barvu, čemu však nenasvědčuje to, že se u těchto oocytů neobjevily i další znaky mrtvých oocytů jako bylo obarvení chromatinu uvnitř GV. Nicméně měla by se připustit i možnost, že navzdory své nízké metabolické aktivitě tyto oocyty skutečně obsahovaly velké množství aktivních mitochondrií v cytoplazmě. Aby se daly tyto domněnky vyvrátit či potvrdit, bylo by nutné provést ještě další analýzy.

36

Průměrní intenzita aktivních mitochondrií v závislosti na BCB 14 12,15

a

12

LSMean průměrné intenzity aktivních mitochondrií

10

8

6

4

1,62

2 0,99

b

b

0 BCB +

BCB -

BCB c

Graf 3: Různá intenzita fluorescenční barvy MitoTracker u jednotlivých skupin úrovně metabolické aktivity. Metabolická aktivita: nízká (BCB +), vysoká (BCB -), kontrola nevystavená působení BCB (BCB c). Statisticky významné rozdíly (P < 0,0001) jsou označeny odlišnými indexy na sloupcích grafu. Chybové úsečky byly odvozeny ze střední chyby výběru.

37

5.4 Vliv úrovně metabolické aktivity oocytů na rozložení aktivních mitochondrií uvnitř oocytu 5.4.1 Morfologie aktivních mitochondrií Sledování morfologie mitochondrií u oocytu může do jisté míry prozradit postup jeho zrání. Bylo tedy pravděpodobné, že by se tento parametr mohl pohybovat v populaci oocytů v souladu se změnou aktivity metabolismu. Pozorování bylo provedeno na 158 oocytech ve čtyřech opakováních. Z těchto údajů je tedy evidentní, že izolací oocytů 5. až 10. den ovariálního cyklu a následným výběrem dle intenzity metabolismu bylo zjištěno, že oocyty s vyšší úrovní metabolismu (BCB -) mají výrazně vyšší podíl oocytů, jejichž aktivní mitochondrie vytvářejí heterogenní shluky v cytoplazmě. U oocytů s nízkou metabolickou aktivitou (BCB +) je naopak výrazně vyšší podíl oocytů, jejichž mitochondrie jsou rozptýleny difúzně a především poměrně vysoký podíl oocytů (38,02 %) má aktivní mitochondrie organizovány do granulí a klastrů. Tato agregace je typická pro cytoplazmu oocytů, které úspěšně prodělaly cytoplazmatické zrání (Sturmey et al., 2006). Takto vysoký výskyt oocytů s agregací mitochondrií ve skupině BCB + dokumentuje vyšší úroveň cytoplazmatického zrání oproti oocytům BCB -. Ovšem hladina jaderného zrání tomu neodpovídá, oocyty BCB + mají vyšší zastoupení oocytů ve fázi GV 1 – 2 než je tomu u skupiny BCB -. Tyto zjištěné skutečnosti jasně dokumentují, že cytoplazmatické a jaderné zrání probíhá nezávisle na sobě, stejně jako již bylo popsáno (Alvarez et al., 2009).

38

Procentuální zastoupení morfologie mitochondrií 100 90

Procentuální podíl oocytů

80

b

70 60 50 40

a

30

a b

20 10 0 BCB + difuzní

heterogenní

BCB granulární + klastry

nízká mitochondriální aktivita

Graf 4: Procentuální zastoupení skupin morfologie mitochondrií u oocytů s rozdílnou metabolickou aktivitou. Metabolická aktivita: nízká (BCB +), vysoká (BCB -) Morfologie

mitochondrií:

difúzní,

heterogenní,

granulární

+

klastry,

nízká

mitochondriální aktivita. Statisticky významné rozdíly (P < 0,05) jsou označeny různými indexy na sloupcích grafu. Chybové úsečky: směrodatná odchylka mezi opakováními, 4 opakování.

5.4.2 Lokalizace aktivních mitochondrií Při hodnocení lokalizace aktivních mitochondrií byla u oocytů nacházena převážně homogenní lokalizace a to z 90,09 % (± 6,20) a u skupiny s nízkou metabolickou aktivitou z 97,22 % (± 2,27). Analýza byla uskutečněna s daty ze 146 oocytů získaných během čtyř opakování. Rozdíly mezi mitochondriální lokalizací u oocytů s vysokou a nízkou metabolickou aktivitou nebyly statisticky prokazatelné. Sun et al. (2001) v případě velkých folikulů (3 - 6) popisoval výskyt mitochondrií pod plazmatickou membránou i rozptýlené uvnitř cytoplazmy, což odpovídá označení homogenní lokalizace, použité v této práci.

39

Vliv úrovně BCB na poměr lokalizace aktivních mitochondrií 120

procentuální podíl oocytů

100

80

60

40

20

0 BCB +

homogenní

BCB -

periferní

centrální

Graf 5: Procentuální zastoupení oocytů s různou mitochondriální lokalizací ve skupinách s rozdílnou úrovní metabolické aktivity. Metabolická aktivita: nízká (BCB +), vysoká (BCB -). Lokalizace mitochondrií: homogenní, periferní, centrální. Chybové úsečky: směrodatná odchylka mezi opakováními, 4 opakování.

40

6

ZÁVĚR Metoda vitální selekce kresylovou modří se v praxi používá na zjištěšní úrovně

metabolické aktivity oocytu. Princip metody spočívá ve schopnosti oocytu odbourávat kresylovou modř enzymem G6PDH, který je důležitý v energetickém metabolismu buňky a podílí se na tvorbě NAPDH. Aktivita G6PDH v oocytu kolísá během jeho vývoje, kdy oocyty nezralé vykazují vyšší aktivitu tohoto enzymu než jak je tomu u oocytů meioticky kompetentních a zralých. Změna činnosti G6PDH je spojována s progresí cytoplazmatického zrání oocytu a je to jeden ze způsobů výběru oocytů vhodných k IVM a následné produkci embryí. Účelem této práce bylo zjistit některé parametry takto selektovaných oocytů a porovnat rozdíly mezi skupinami málo a více metabolicky aktivních oocytů. Prvním zjišťovaným parametrem byla morfologická kvalita oocyt-kumulárních komplexů. U morfologické kvality 1 až 3 vysoký podíl oocytů vykazoval nízkou úroveň metabolické aktivity. To již neplatilo o oocytech horší kvality, které zahrnovaly větší podíl oocytů s vyšší metabolickou aktivitou. Při vyšetření stavu chromatinu oocytů selektovaných metodou barvení kresylovou modří byl u oocytů metabolicky málo aktivních zjištěn velmi vysoký podíl fáze GV 1 až 2. To znamená, že se tyto oocyty nacházejí na začátku meiotického zrání. Ve skupině s větší metabolickou aktivitou se naproti tomu vyskytovalo nejvíce oocytů ve fázi GV 3 – 4, časné diakineze a metafáze I, tedy s pokročilejším jaderným zráním než jak tomu bylo u oocytů s nízkou aktivitou metabolismu. Skupina s nižší metabolickou aktivitou vykazovala mnohem vyšší zastoupení oocytů s organizací mitochondrií do klastrů, než jak tomu bylo u oocytů s vysokou metabolickou aktivitou, které měly největší podíl heterogenního morfologického uspořádání mitochondrií. U oocytů se sníženou aktivitou metabolismu se vedle klastrů hojně objevovaly i oocyty s neshluklými tedy difúzními mitochondriemi. Měření hladiny mitochondriální aktivity prozradilo velmi vysoký podíl aktivních mitochondrií v cytoplazmě oocytů s nízkou aktivitou metabolismu oproti nízkým hodnotám naměřeným u oocytů s vysokou metabolickou aktivitou a u kontrolních oocytů nebarvených kresylovou modří. Tento trend by se musel prověřit podrobnější analýzou, aby bylo možné zjistit jeho důvody.

41

Ze zjištěných informací vyplývá, že existuje vztah mezi cytoplazmatickým zráním, a sledovanými parametry, kterými je morfologická třída, jaderné zrání a morfologie mitochondrií. Vztah mezi selekcí oocytů kresylovou modří a mitochondriální aktivitou nebo jejich lokalizací nebyl u oocytů izolovaných v této fázi potvrzen. Metodou selekce kresylovou modří je tedy možné selektovat oocyty, které se navzájem liší nejen morfologickými parametry oocyt-kumulárního komplexu a úrovní jaderného zrání, ale také s odlišnou mitochondriální morfologií.

42

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. ALBERTS B., BRAY D., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., WALTER P., 1998, Základy buněčné biologie, přeloženo z anglického originálu Essential Cell Biology, USA, NY: Garland publish, vedoucí překladu Kotyk A., českou verzi vydalo nakladatelství Espero Publishing , Ústí nad Labem, 630 s., ISBN 80-902906-0-4

2. ALM H., TORNER H., LÖHRKE B., VIERGUTZ T., GHONEIM I. M., KANITZ W., 2005, Bovine blastocyst development rate in vitro is influenced by selection of oocytes by brillant cresyl blue staining before IVM as indcator for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity, Theriogenology, 63: 2194 – 2205

3. ALVAREZ G. M., DALVIT G. C., ACHI M. V., MIGUEZ M. S., CETICA P. D., 2009, Immature oocyte quality and maturational competence of porcine cumulus-oocyte complexes subpopulations, Biocell, 33: 167 - 177

4. BHOJWANI S., ALM H., TORNER H., KANITZ W., POEHLAND R., 2007, Selection of developmentally competent oocytes throught brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer, Theriogenology, 67: 341 – 345

5. BRIGGS D., MILLER D., GOSDEN R., 1999, Molecular biology of female gametogenesis, Molecular Biology in Reproductive Medicine, 251 – 266

6. BUURMA N. J., HAQ I, 2008, Calorimetric and spectroscopic studies of Hoechst 33258: self-association and binding to non-cognate DNA, Journal of Molecular Biology, 381: 607 – 621

7. BYSKOV A. G., 1978, The meiosis-inducing interaction between germ cells and rate cells in the fetal mouse gonad, Annales de Biologie Animale Biochemie Biophysique, 19: 327 – 334

43

8. ENZO Life Sciences Inc., poslední aktualizace 2009, Hoechst 33258, [online], http://www.enzolifesciences.com/enz-52402/hoechst-33258-ultra-pure/

9. FERREIRA E. M., VIREQUE A. A., ADONA P. R., MEIRELLES F. V., FERRIANI R. A., NAVARRO P. A. A. S., 2009, Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: Structural and biochemical modifications and acquisition of developmental competence, Theriogenology 71: 836-848

10. GASPARRINI B., SAYOUD H., NEGILIA G., MATOS D. G. de, DONNAY I., ZICARELLI L., 2003, Glutathione synthesis during in vitro maturation of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes: effects of cysteamine on embryo development, Theriogenology, 60: 943 – 952

11. HAFEZ E. S. E., HAFEZ B., 2000, Reproduction in farm animals, Williams and Wikins, Lippincott, 6. vydání, 495 stran, ISBN 0-683-30577-8

12. INVITROGEN Corporation, 2008, MitoTracker mitochondrion-selective probes, [online], http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp07510.pdf

13. ISHIZAKI C., WATANABE H., BHUIYAN M. M. U., FUKUI Y., 2009, Developmental competence of porcine oocytes selected by brilliant cresyl blue and matured individually in a chemically defined culture medium, Theriogenology, 72: 72 – 80

14. JELÍNEK P., KOUDELA K., DOSKOČIL J., ILLEK J., KOTRBÁČEK V., KOVÁŘŮ F., KROUPOVÁ V., KUČERA M., KUDLÁČ E., TRÁVNÍČEK J., VALENT M., 2003, Fyziologie hospodářských zvířat, MZLU v Brně, 414 s., ISBN 80-7157-644-1

44

15. JEŠETA M., MACHATKOVÁ P., HULÍNSKÁ P., 2009, Současné evropské trendy v produkci embryí a využití embryotransferu, Veterinářství, 8: 483 – 486

16. KĄTSKA-KSIĄśKIEWICZ L., OPIELA J., RYŃSKA B., 2007, Effects of oocyte quality, semen donor and embryo co-cultre system on the efficiency of blastocyst production in goats, Theriogenology, 68: 736 – 744

17. KISHIMOTO T., 2003, Cell-cycle control during meiotic maturation, Current Opinion in Cell Biology, 15: 54 – 63

18. KRISHER R. L., BRAD A. M., HERRICK J. R., SPARMAN M. L., SWAIN J. E., 2007, A comparative analysis of metabolism and viability in porcine oocytes during in vitro maturation, Animal Reproduction Science, 98: 72 – 96

19. LEBARON P., CATALA P., PARTHUISOT N., 1998, Effectiveness of Sytox Green stain for bacterial viability assessment, Applied and Environmental Microbiology, 7: 2697-2700

20. LUVONI G. C., CHIGIONI S., PEREGO L., LODDE V., MODINA S., LUCIANO A. M., 2006, Effect of gonadotropins during in vitro maturation of feline oocytes on oocyte–cumulus cells functional coupling and intracellular concentration of glutathione, Animal Reproduction Science, 96: 66 – 78

21. MACHATKOVÁ M., HULÍNSKÁ P., HORÁKOVÁ J., REČKOVÁ Z., HANZALOVÁ K., 2008, Oestrus stage influences the morphology and maturation of porcine oocytes in vitro, Veterinární medicína, 53: 70 – 76

22. MARVAN F., HAMPL A., HLOŽÁNKOVÁ E., KRESAN J., MASSANYI L., VERNEROVÁ E., 2007, Morfologie hospodářských zvířat, Praha, ČZU v Praze, Brázda, 4. vydání, 304 stran, ISBN 978-80-213-1658-4

45

23. MAEDOMARI N., KIKUCHI K., OZAWA M., NOGUCHI J., KANEKO H., OHNUMA K., NAKAI M., SHINO M., NAGAI T., KASHIWAZKI N., 2007, Cytoplasmic glutathione regulated by cumulus cells during porcine oocyte maturation affects fertilization and embryonic development in vitro, Theriogenology, 67: 983 – 993

24. MOTLÍK J., CROZET N., FULKA J., 1984, Meiotic competence in vitro of pig oocytes isolated from early antral follicles, Journals of Reproduction and Fertility, 72: 323 – 328

25. NEČAS O., SVOBODA A., HEJTMÁNEK M., JANISCH R., ČERVINKA M., LENHART K., KOLÁŘ Z., 2000, Obecná biologie pro lékařské fakulty, Jinočany, H & H Vyšehradská, 3. vydání, 554 stran, ISBN 80-86022-46-3

26. REECE V., 1998, Fyziologie domácích zvířat, přel.: Cibulka J., Jílek F., Fučíková A., Grada Publishing, Praha, 456 s., ISBN 80-7169-547-5

27. ROMANOVSKÝ A., ČINČEROVÁ A., ČÍŽEK F., DVOŘÁK P., KAPRÁLEK

F.,

KUBIŠTA

V.,

NEDVÍDEK

J.,

OPATRNÝ

Z.,

PAZOUREK J., PIKÁLEK P., SEFERT J., SLAVÍKOVÁ Z., VÁŇA J., ZÁVADA V., 1988, Obecná biologie, SPN Praha, 695 s.

28. ROSYPAL S., DOŠKAŘ J., FRYNTA D., HOMOLA J., HORÁČEK I., HŮRKA K., KALINA T., KUBIŠTA V., KVAČAK Z., LINC R., LOSOS B., MAZURA I., MLADÁ J., MLADÝ F., NEDVÍDEK J., NOVOTNÝ I., PAVLOVÁ L., PIKÁLEK P., PRÁŠIL K., PSOTA V., ROČEK Z., SLAVÍKOVÁ J., SLAVÍKOVÁ Z., SMRŽ J., ŠAŠEK V., ŠEBÁNEK J., ŠMARDA J., ŠTYS P., ZRZAVÝ J., 2003, Nový přehled biologie, Scienta, Praha, 797 s., ISBN 80-7183-268-5

46

29. ŘÍHA J., MACHATKOVÁ M., PETELÍKOVÁ J., JAKUBEC V., PYTLOUN J., ŠEREDA L., PAVLOK A., 1999, Biotechnologie v chovu a šlechtění hospodářských zvířat, Rapotín, 167 s.

30. ŘÍHA J., PETELÍKOVÁ J., ČEŘOVSKÝ J., BAŽANT J., BOCHENEK M., PYTLOUN J., 2003, Plemenitba hospodářských zvířat, Rapotín, 151 s., ISBN 80-903143-4-1

31. SOVA Z., BUKVAJ J., KOUDELA K., KROUPOVÁ V., PJEŠČAK M., PODANÝ J., 1990, Fyziologie hospodářských zvířat, Státní zemědělské nakladatelství Praha, 472 s., ISBN 80-209-0092-6

32. SHOEVERS E. J., COLENBRANDER B., ROELEN B. A. J., 2007, Developmental stage of the oocyte during antral follicle growth and cumulus investment determines in vitro embryo development of sow oocytes, Theriogenology, 67: 1108 – 1122

33. SIRARD M., RICHARD F. J., MAZERS M., 1998, Controlling meiotic resuption in bovine oocytes, Theriogenology, 49: 483 – 497

34. SLÁDEČEK F., 1986, Rozmnožování a vývoj živočichů: základy vývojové biologie, Academia, Praha, 2. vydání, 478 s., ISBN 21-088-86

35. STURMEY R. G., O’TOOLE P. J., LEESE H. J., 2006, Fluorescence resonance energy transfer analysis of mitochondrial:lipid association in the porcine oocyte, Reproduction 132: 829 – 837

36. SUN X.- S., LIU Y., YUE K.- Z., MA S. - F., TAN J. - H., 2004, Changes in germinal vesicle (GV) chromatin configurations during growth and maturation of porcine oocytes, Molecular Reproduction and Development, 69: 228 – 234

47

37. SUN Q. Y., WU G. M., LAI L., PARK K. W., CABOT R., CHEONG H. T., DAY B. N., PRATHER R. S., SCHATTEN H., 2001, Translocation of active mitochondria during pig oocyte maturation, fertilization and early embryo development in vitro, Reproduction, 122: 155 – 163

38. SUSHIL K. J., 1998, Glutathione and glucose-6-phospate dehydrogenase deficiency can increase protein glycosylation, Free Radical Biology & Medicine, 1: 197 – 201

39. SWANN K., OZIL J. P. , 1994, Dynamics of the calcium signal that triggers mammalian egg activation, International Review of Cytology, 152: 183 – 222

40. SZÖLÖSI D., CALARCO P. G., DONAHUE R. P., 1972, The nuclear envelope: its breakdown and fate in mammalian oogonia and oocytes, The Anatomical Record, 174: 325 – 340

41. TORNER H., BRÜSSOW H. P., ALM H., RATKY J., PÖHLAND R., TUCHSCHERER A., KANITZ W., 2004, Mitochondrial aggregation patterns and activity in porcine oocytes and apoptosis in surrounding cumulus

cells

depends

on

the

stage

of

pre-ovulatory

mutation,

Theriogenology 61: 1675 – 1689

42. WONGSRIKEAO P., OTOI T., YAMASAKI H., AGUNG B., TANIGUCHI M., NAOI H., SHIMIZU R., NAGAI T., 2006, Effects of single and double exposure to brilliantcresyl blue on the selection of porcine oocytes for in vitro production of embryos, Theriogenology, 66: 366 – 372

43. YOSHIDA M., 1993a, Role of glutathione in the maturation and fertilization of pig oocytes in vitro, Molecular Reproduction and Development, 35: 76-81

44. YOSHIDA M., ISHIGAKI K., NAGAI T., CHIKYU M, PURSEL V. G., 1993b, Glutathione Concentracion during Maturation and after Fertilization

48

in Pig Oocytes: Relevance to the Ability of Oocytes to Form Male Pronucleus, Biology of Reproduction, 49: 89 – 94

45. ZUELKE K. A., JEFFAY S. C., ZUCKER R. M., PERREAULT S. D., 2003, Glutathione (GSH) Concentrations Vary With the Cell Cycle in Maturing Hamster Oocytes, Zygotes, and Pre-Implantation Stage Embryos, Molecular Reproduction and Development, 64: 106 – 112

49

PŘÍLOHY

Obrázek 1: oocyty dle morfologické třídy oocyt-kumulárního komplexu – z leva morfologická třída 1, 2, 3 a 4 (Fotografie z archivu VÚVeL, v.v.i.)

A

B

20 µm

C

20 µm

D

20 µm

E

35 µm

F

20 µm

20 µm

Obrázek 3: A až D: GV 1, GV 2, GV 3, GV 4, E: M1 a F: degenerované GV,epifluorescenční mikroskop, Hoechst 33258

Obrázek 4: oocyt po aplikaci FCCP, MitoTracker, konfokální mikroskop, snímkové zvětšení 400x, 20 µm pod oolemou