Vliv oxidu dusnatého na meiotickou kompetenci prasečích oocytů

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra veterinárních disciplín

Vliv oxidu dusnatého na meiotickou kompetenci prasečích oocytů DISERTAČNÍ PRÁCE

Autor. Ing. Hana Tichovská Školitel: prof. Mgr. Ing. Markéta Sedmíková, Ph.D. Školitel specialista: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Praha 2011

Prohlášení

Prohlašuji, ţe jsem doktorskou práci na téma: ,,Vliv oxidu dusnatého na meiotickou kompetenci prasečích oocytů“ vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţené bibliografii.

V Praze dne:

Podpis autora práce:

Poděkování

Ráda bych touto cestou poděkovala své školitelce prof. Mgr. Ing. Markétě Sedmíkové, Ph.D, za její cenné připomínky při laboratorní práci i publikování výsledků, které byly velmi inspirativní, za trpělivost a ochotu při vedení mé disertační práce. Dále děkuji za moţnost provádění experimentů v nových laboratořích a moţnost získávání nových poznatků na zahraničních stáţích. Dále bych ráda poděkovala doc. Ing. Evě Chmelíkové, Ph.D. za vedení mé práce v laboratoři a pomoc při zvládnutí náročné metodiky izolace a kultivace rostoucích oocytů i dalších metod a zpracování výsledků. Mé díky patří také všem pracovníkům KVD za vytvoření přátelského kolektivu a dobrého pracovního prostředí. Mnohokrát také děkuji celé mé rodině za podporu ve studiu.

Abstract Reproductive biotechnology such as in vitro fertilization, the creation of transgenic animals or cloning by nuclear transfer depends on the use of fully grown, meiotically competent oocytes capable of completing meiotic maturation by reaching the stage of metaphase II. However, there exists only a limited quantity of these oocytes in the ovaries of females. In view of their limited number, growing oocytes without meiotic competence represent a possible source. The mechanisms controlling the acquisition of meiotic competence, however, are still not completely clear. A gas with a short half-life, nitric oxide (NO) can fulfill a regulatory role in this period. NO is synthesized from L-arginine by the enzyme Nitric Oxide Synthase (NOS), which occurs in a wide range of mammalian cells in multiple isoforms. Three most frequent neuronal (nNOS), inducible (iNOS) and endothelial NOS (eNOS) were detected in growing and fully-grown porcine oocytes. The objective of this study was to ascertain the role of NO in the growth phase of pig oocytes and its influence on the acquisition of meiotic competence with the help of NOS inhibitors, NO donors and their combinations. We demonstrated that the selective competitive iNOS inhibitor aminoguanidine and also the non-selective NOS inhibitor L-NAME block meiotic maturation of oocytes with partial or even full meiotic competence at the very beginning. NOS inhibitors influence even competent oocytes in the first stage of meiotic metaphase. However, blockage is less effective than at the beginning of meiotic maturation. The number of parthenogenetically activated competent oocytes greatly increased in a pure medium after inhibitor reversion. A large quantity of NO externally added to the in vitro cultivation environment disrupts the viability of oocytes. The effectiveness of the inhibitor can be reversed in oocytes by an NO donor in a very low concentration. However, the donor is not capable of pushing the oocytes farther than beyond the first stage of meiotic metaphase. The experiments confirmed the connection of NO with the growth period and the acquisition of meiotic competence. However, it is evident from the experiments that NO is not the only stimulus controlling the growth period.

Key words: oocytes, nitric oxide, pig, meiotic competence

Abstrakt Reprodukční biotechnologie jako je in-vitro oplození, transgeneze nebo klonování jedinců závisí na dostupnosti plně vyvinutých meioticky kompetentních oocytů, které jsou schopny dosáhnout druhé meiotické metafáze. Těchto oocytů je ovšem ve vaječníku samice omezené mnoţství. Slibným zdrojem oocytů pro biotechnologie by proto mohly být rostoucí oocyty s omezenou meiotickou kompetencí, kterých je ve vaječníku velké mnoţství. Mechanismus kontrolující zisk meiotické kompetence však dosud není plně znám. Při růstu a zisku meiotické kompetence oocytů by mohla hrát regulační roli malá plynná molekula s krátkým poločasem rozpadu – molekula oxidu dusnatého (NO). NO je syntetizován z L-Argininu pomocí enzymu syntázy oxidu dusnatého (NOS), která se vyskytuje v různých tkáních savců v několika izoformách. V rostoucích a také v plně kompetentních oocytech prasete byly nalezeny 3 izoformy NOS: nervová (nNOS) endoteliální (eNOS) a indukovatelná (iNOS) NOS. Cílem této práce bylo zjistit úlohu NO během růstové fáze oocytů a jeho vliv na získání meiotické kompetence pomocí inhibitorů NOS a NO donoru. V této práci jsme ukázali, ţe selektivní iNOS inhibitor aminoguanidin a neselektivní NOS inhibitor L-NAME blokují meiotické zrání oocytů s částečnou i s plnou meiotickou kompetencí. Inhibitor NOS ovlivnil také přechod mezi první a druhou meiotickou metafází. Nicméně jeho působení bylo mnohem slabší, neţ na počátku meiotického zrání. Účinek inhibitoru byl reverzibilní, po přemístění oocytů do čistého média došlo ke zvýšení počtu partenogeneticky aktivovaných oocytů. Vysoké koncentrace NO dodaného do kultivačního média sníţily ţivotaschopnost oocytů. Efekt inhibitoru byl zvrácen pouţitím nízkých koncentrací donoru, nicméně donor nebyl schopen posunout oocyty do stadia metafáze II. Tyto experimenty potvrdily zapojení NO do zisku meiotické kompetence, je však jasné, ţe NO není jediným faktorem kontrolující růstovou periodu oocytů.

Klíčová slova: oocyty, oxid dusnatý, prase, meiotická kompetence

Obsah Úvod

1

1 Literární přehled

2

1.1 Oogeneze 1.1.1 Fáze mnoţení zárodečných buněk 1.1.2 Růst oocytů 1.1.3 Zisk meiotické kompetence 1.1.4 Meiotické zrání 1.1.5 Regulace meiotického zrání

2 3 5 9 11 14

1.2 Oxid dusnatý 1.2.1 Stavba NO- syntázy 1.2.2 Izoformy NO- syntázy 1.2.3 Aktivita a regulace NO-syntáz 1.2.4 Vlastnosti oxidu dusnatého 1.2.5 Inhibitory NO- syntáz a donory NO

20 21 22 23 25 27

1.3 Vliv NO- syntáz a NO na reprodukci samic 1.3.1 Lokalizace NO-syntáz ve vaječníku samic 1.3.2 Úloha NO v meiotickém zrání savčích oocytů 1.3.3 Mechanizmy působení NO během meiotického zrání oocytů

29 29 32 34

2 Cíl práce:

38

3 Materiál a metody

39

4 Experimentální schéma

41

5 Výsledky

43

6 Diskuze

58

7 Závěr

65

8 Seznam použitých zkratek

66

Seznam použité literatury

69

Příloha

83

Úvod V chovu hospodářských zvířat se v posledních letech vyuţívá ve zvýšené míře reprodukčních biotechnologií jako je inseminace, in vitro oplození, transfer embryí, klonování a tvorba transgenních jedinců. U prasete tyto techniky stále naráţejí na některé problémy. U tohoto druhu je obtíţné mraţení inseminačních dávek a embryí a také klonování má velmi nízkou účinnost. Zvýšení efektivity těchto technik je důleţité zejména proto, ţe prase je nejen významným hospodářským zvířetem, ale je často vyuţíváno také jako modelový druh pro humánní medicínu a xenotransplantace. Většina biotechnologických metod je limitována počtem zralých samičích buněk ve vaječníku - oocytů. Ve vaječníku se ovšem kromě omezeného mnoţství zralých oocytů nachází také velké mnoţství vyvíjejících se rostoucích oocytů. Cestou k získání vyššího počtu zralých oocytů mohou být techniky zvýšující vývojovou schopnost rostoucích oocytů, nebo metody růstu oocytů in vitro. Pro zlepšení těchto metod je nutné objasnit signální kaskády řídící vývoj samičích pohlavních buněk. Růst a zrání oocytů ovlivňuje řada molekul, mezi něţ pravděpodobně patří také malá plynná molekula oxidu dusnatého. Oxid dusnatý je důleţitou signální molekulou, která je syntetizovaná v různých ţivočišnýchtkáních. Za objev vasodilatačního účinku NO v kardiovaskulárním systému byla v roce 1998 udělana Nobelova cena za fyziologii. Tento plyn s krátkým poločasem rozpadu se účastní také různorodých procesů v reprodukci. Řada studií prokázala, ţe je syntetizován v reprodukční soustavě samic laboratorních hlodavců a významě se podílí na regulaci vývoje samičích pohlavních buněk, oocytů.

1

1 Literární přehled 1.1 Oogeneze Oogeneze savců je proces, během něhoţ se z primordiálních zárodečných buněk (PGC, Primordial Germ Cells) vyvíjí zralá vajíčka (oocyty), která jsou oplození schopná. Během svého vývoje musí zárodečná buňka zredukovat svůj genetický materiál, coţ se děje v průběhu redukčního dělení - meiózy. Meióza je zahájena v embryonálním období samice, je však záhy pozastavena a nastupuje první meiotický blok. Oocyt je uvolněn z tohoto bloku teprve v době puberty samice. Meióza je znovuzahájena, ale během ovulace je opět pozastavena v takzvaném druhém meiotickém bloku. Druhý meiotický blok je fyziologicky prolomen aktivací spermií a poté můţe být meióza dokončena. Oogeneze probíhá ve třech fázích: mnoţení zárodečných buněk, jejich růst a zrání. Do fáze růstu vstupují skupiny oocytů postupně a není dán přesný okamţik počátku jejich růstu. (Wassarman, 1988).

Obr. 1: Průběh oogeneze savců. PGC - primordiální zárodečné buňky, GVBD rozpad zárodečného váčku. Podle: Wassarman, (1988), Picton et al. (1998)

2

1.1.1 Fáze množení zárodečných buněk

Primordiální zárodečné buňky Samičí pohlavní buňky - oocyty pocházejí z malého počtu kmenových buněk (PGC - primordiální zárodečné buňky). Tyto buňky se vytváří ve splanchnopleuře a přilehlém entodermu ţloutkového váčku z nediferenciovaných buněk epiblastu jiţ během gastrulace embrya. Poté primordiální zárodečné buňky aktivně migrují do zadní části embrya, kde se nakonec usídlí v místě vznikající pohlavní lišty na mezonefros. Během migrace do pohlavní lišty se primordiální zárodečné buňky několikanásobně dělí mitózou (Byskov, 1982, Freeman, 2003). U prasete se tyto buňky nachází v pohlavní liště jiţ 24. den embryonálního vývoje (Bielanska - Osuchowska, 2006). Na přeměně buněk epiblastu v PGC se podílí řada faktorů, například transformační růstový faktor TGF β (Transforming Growth Factor) a morfogenické faktory BMP-4, BMP-8b, BMP-2 (Bone Morphogenetic Proteins) (Ying a Zhao., 2001). Migraci PGC do zárodečné rýhy ovlivňuje především c-Kit ligand, který je produkován somatickými buňkami v místech, kudy migrují PGC. Na počátku utváření celé gonády se podílí také steroidogenní

faktor

SF-1,

který

pravděpodobně

reguluje

aromatázu

a hydroxylázu ve vaječníku (Logan et al., 2003).

Oogonie a oocyty Primordiální zárodečné buňky usídlené v zárodečné liště se kolem 40. dne fetálního vývoje prasete zanořují do kůry a přeměňují se tak na oogonie (Picton et al., 1998). Oogonie jsou buňky kulovitého tvaru obsahující hyaloplazmu s volnými polyribozomy a mitochondriemi, které jsou koncentrované blízko jádra. Mitochondrie oogonií jsou kulovité s úzkými kristami, jádro obsahuje nukleoplazmu s krátkými segmenty heterochromatinu. Oogonie se stále mitoticky dělí. Ve vaječníku se začnou oogonie shlukovat do skupin ve kterých jsou propojeny pomocí intracelulárních cytoplazmatických můstků. Kolem oogonií se shlukují buňky pocházející z mezonefros. Jakmile jsou oogonie obklopeny těmito buňkami, zahajují replikaci DNA a vstupují do meiózy. Během vstupu do meiózy se přeruší cytoplazmatické můstky a oogonie se dále označují jako oocyty (Wassarman, 1988, Bielanska - Osuchowska, 2006).

3

Během počáteční fáze meiózy (profáze) oocyty prochází fázemi leptotene, zygotene, pachytene a diplotene, kdy je jejich meióza pozastavena (Picton et al., 1998). Ve stádiu pachytene probíhá crossing-over a rekombinace genů. Ve stádiu diplotene jsou na chromozómech viditelná chiasmata, která jsou výsledkem crossing – overu. Kolem doby porodu jsou oocyty u většiny savců ve stádiu rozptýlené diplotene a dictyate. Krátce po porodu se většina oocytů nachází ve stádiu dictyate ve kterém je meióza oocytu zastavena po dobu růstu oocytu, dokud nedojde k jejímu opětovnému zahájení. Stimulem pro znovuzahájení zrání oocytu je vzestup hladiny hypofyzárních hormonů během puberty samice (Wasserman, 1988). Během přeměny oogonie v oocyt se postupně mění ultrastruktura organel v cytoplazmě. Mitochondrie se začínají prodluţovat a hladké endoplazmatické retikulum vytváří malé mnoţství dlouhých cisteren. Celkově se zvyšuje počet mitochondrií, endoplazmatického retikula, membránových struktur a lyzozómů. Během těchto prvních stádií meiózy mnoho oocytů atreticky zaniká (Wasserman, 1988, Bielanska Osuchowska, 2006). K regulaci procesu utváření oocytů z oogonií je dostupno pouze omezené mnoţství informací. Vaječníky ovce, skotu, králíka a morčete produkují v tuto dobu malé mnoţství estrogenů. Jakmile oogonie vstoupí do meiózy, klesá mnoţství syntetizovaných estrogenů (Garrett a Guthire, 1999). C-Kit ligand, který se účastnil vývoje PGC, je v tomto období přítomen v somatických buňkách povrchu ovaria. C-Kit ligand se společně s růstovým faktorem IGF-I (Insulin-like Growth Factor) účastní na zahájení meiózy u myší (McNatty et al., 2000). Do regulace velikosti oocytu je zapojen také transkripční faktor AhR (Aryl-Hydrocarbon Receptor) (Logan et al., 2003). Podle dříve obecně uznávaného dogmatu se zárodečné buňky mnoţí pouze v období prenatálního vývoje samice. Toto dogma ovšem vyvrátili Johnson et al. (2004), kteří potvrdili, ţe nejen vaječníky mladých, ale i dospělých samic myší obsahují mitoticky aktivní zárodečné buňky slouţící jako zásoba za oocyty, které podlehly atrézii. Ve své další práci tento tým ukázal, ţe zdrojem zárodečných buněk myši můţe být extragonadální tkáň jako je kostní dřeň či krevní buňky (Johnson et al., 2005). Také některé další vědecké týmy prokázaly, ţe zdrojem zárodečných buněk můţe být kůţe u prasete (Dyce et al., 2006; Dyce a Li, 2006) a buňky slinivky břišní u potkana (Danner et al., 2007). Zou et al. (2009) rovněţ potvrdili Johnsonovu teorii, kdyţ vytvořili zárodečnou linii z buněk dospělých myší. 4

1.1.2 Růst oocytů Během fáze růstu oocyt syntetizuje důleţité molekuly pro svůj další vývoj a zvětšuje svou velikost. Kolem oocytu se postupně shlukují somatické buňky tvořící obal - folikul, který hraje významnou roli ve vývoji vlastního oocytu (Motlík a Fulka, 1986). Během celé fáze růstu se u myší zvyšuje syntéza RNA aţ 200x oproti somatickým buňkám. Oocyt s dokončeným růstem obsahuje 60–65% rRNA, 20-25% tRNA, 10–15% mRNA a jiţ ve 2/3 růstu obsahuje oocyt téměř konečné mnoţství RNA. Plně meioticky kompetentní oocyt myší obsahuje také asi 50x více proteinů neţ somatická buňka. Mezi proteiny které rostoucí oocyt syntetizuje, patří: glykoproteiny vrstvy zona pellucida (5–10%), laktát dehydrogenáza (2–5 %), tubulin (1,5–2%), ribosomální proteiny (1,5%), mitochondriální proteiny (1-2%), aktin (1%), histony (0,3%), kalmodulin (0,3%), dále kreatin kináza důleţitá pro udrţování ATP a glukóza–6–fosfát dehydrogenáza potřebná pro produkci NADPH (Wassarman, 1988). Utváření primordiálního folikulu Po zastavení meiózy je oocyt obklopen jednou vrstvou somatických buněk, které se nyní nazývají pregranulózní buňky (Picton et al., 1998). Tyto buňky mohou mít dvojí původ. Vznikají buď z epitelových buněk povrchu vaječníku nebo z buněk pocházejících z mezonefros (Sawyer et al., 2002). Oocyt je spojen s okolními buňkami pomocí desmozómů a mezibuněčných spojů gap junctions. Spojení s ostatními buňkami je velmi důleţité pro transport malých molekul (< 1 kDa). Endoplazmatické retikulum je jiţ pokryto na několika místech ribozomy a je spojeno s jadernou membránou. Mitochondrie mohou mít protáhlý i kulovitý tvar a jsou v kontaktu s endoplazmatickým retikulem. Blízko jádra jsou přítomná lipidová granula a mnoţství membránových váčků. Stále se zvětšuje velikost oocytu a zvyšuje se počet organel. V tomto stádiu byly v jádru sledovány 1 - 2 jadérka. Chromozómy se nachází ve stádiu diplotene, coţ umoţňuje transkripci RNA a translaci důleţitých proteinů (Wasserman, 1988, Bielanska - Osuchowska, 2006). Z původního počtu zárodečných buněk do této fáze u prasat dospěje pouze asi 40%. Při narození samice prasete je vyvinuto pouze 500 000 oocytů (Guthrie a Garrett, 2001). Zahájení tvorby primordiálního folikulu je u myší řízeno faktorem Fig-α. (Soyal et al., 2000).

5

Utváření primárního folikulu Později se ploché pregranulózní buňky, které obklopují oocyt, mění v buňky kubického tvaru. Jádro oocytu je umístěno centrálně a blízko jaderné membrány můţeme pozorovat krátké kompaktní bivalenty chromozómů. Blízko jaderné membrány se nachází také denzní granula. Okolo jádra je jiţ jen málo endoplazmatických retikul s průměrem 0,3 μm, zatímco počet mitochondrií se stále zvyšuje (Bielanska - Osuchowska, 2006). Vývoj primárního folikulu je řízen rovnováhou mezi inhibičními a stimulačními faktory. V jadérku dochází k expresi proteinů retinoblastu a onkogenu myc, které stimulují produkci inhibičních faktorů bránících proliferaci granulózních buněk (Picton et al., 1998). Dalším faktorem se stejnou funkcí je Antimülerův hormon AMH z rodiny růstových faktorů (Durlinger et al., 2002). Do regulace vývoje primárního folikulu jsou zapojeny i další faktory z této rodiny: BMP (Bone Morfologic Factor) a růstový diferenciační faktor GDF-9 (Growth Differentiation Factor) (Van der Hurk et al., 2000). U skotu (Hulshof et al., 1997) a myší (Zhao et al., 2001) byl nalezen v oocytu a granulózních buňkách další faktor activin A, který pravděpodobně kontroluje zahájení vývoje primárního folikulu. U skotu (Wandji et al., 1996), kozy (Silva et al., 2004) a myši (Eppig a O´Brien, 1996) byl nalezen epidermální růstový faktor (EGF), který podporuje utváření primárního folikulu. Pro růst raného folikulu jsou nezbytné i faktory WT-1 (Wilms Tumor Protein) a SF-1 (Steroidogenetic Factor) (Logan et al., 2003). SF-1 faktor je lokalizován v granulózních buňkách a pravděpodobně stimuluje expresi antimülerova hormonu AMH (Sadovski a Dorn, 2000). Vývoj primárního folikulu není přímo závislý na folikulostimulačním hormonu FSH (Meduri et al., 2002). Tvorba folikulu obklopeného více vrstvami Jakmile se kolem oocytu vytvoří dvě a více vrstev granulózních buněk, je utvořen sekundární čili preantrální folikul. V tomto období oocyt prochází intenzivním růstem, granulózní buňky proliferují a vrstvu granulózních buněk začínají obklopovat buňky thékální vrstvy (tvořící vrstvy theca foliculi externa a interna). Tyto folikuly dosahují u prasat velikosti 300 μm a oocyt prasete dosahuje 90 μm (Van den Hurk et al., 1997). Během růstu získávají oocyty postupně meiotickou kompetenci, coţ je schopnost znovuzahájit a plně dokončit meiózu. Probíhá syntéza nových proteinů, intenzivní mnoţení organel a přeorganizování organel jiţ vzniklých. Během této fáze se zvyšuje

6

počet ribozómů, mitochondrií a jiných organel. Akumulují se membránové váčky, granula glykogenu, proteinů, lipidů a multivesikulární tělíska (Bielanska - Osuchowska, 2006). Jednou z důleţitých změn během růstové fáze je vytvoření glykoproteinové vrstvy na povrchu oocytu, která se nazývá zona pellucida (ZP). Jiţ v počátcích růstu můţeme pozorovat základy vrstvy zona pellucida jako oblasti jemných filament mezi oocytem a kumulárními buňkami. Tato membrána se utváří jako ochrana oocytu ze tří druhů glykoproteinů ZP1, ZP2 a ZP3. Glykoprotein ZP3 hraje později roli jako primární vazebný receptor pro spermii a vazbou spermie na tento receptor je spuštěna akrozomální reakce. ZP2 funguje jako sekundární receptor spermie a ZP1 funguje jako propojovací článek ZP2 a ZP3 (Picton et al., 1998). Pro expresi těchto glykoprotinů je potřebný faktor FIG–α. (Soyal et al., 2000). Během dalšího růstu folikulu začínají mezi vrstvami theca folliculi prorůstat krevní kapiláry, kterými jsou do folikulu transportovány endokrinní faktory. Mnoho experimentů ukázalo, ţe pro vývoj tohoto stádia oocytu jsou důleţité gonadotropiny. Receptory pro luteinizační hormon (LH) byly nalezeny u raných folikulů potkanů. Inzulin a luteinizační hormon přiváděný do kapilár théky má vliv na utváření androgenů v théce. Ty se poté dostávají do granulózních buněk, kde navozují vznik receptorů pro folikulostimulační hormon (FSH) (van den Hurk et al., 2000). Dalším endokrinním faktorem ovlivňujícím vývoj sekundárního folikulu je gonadotropní hormon (GH). Nervový růstový faktor NGF (Nerve Growth factor) a VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide) také stimulují vývoj raného folikulu. Sekundární folikul neprodukuje estrogeny, protoţe mu chybí enzym aromatáza, která přeměňuje androgeny na estrogeny, ale vývoj folikulu ovlivňují estrogeny z jiných zdrojů (Zhao et al., 2000). Na růstu sekundárního folikulu se podílí také mnoho jiných faktorů (Antimülerův hormon, růstový diferenciační faktor, Kit ligand). Antimülerův hormon produkovaný granulózními buňkami sekundárního folikulu modifikuje růst pomocí sniţování citlivosti k folikulostimulačnímu hormonu (Durlinger et al., 2002). Růstový faktor GDF-9 produkovaný taktéţ granulózními buňkami kontroluje biologickou aktivitu aktivinu a inhibinu (Dong et al., 1996). Oba dva faktory růstový faktor GDF-9 a protein BMP-15 kontrolují utváření kit ligandu KL v granulózních buňkách, růstový faktor GDF-9 působí jako

inhibitor

a

protein

BMP-15

jako

(Otsuka a Shimasaki, 2002).

7

aktivátor

exprese

kit

ligandu

KL

Mezi další faktory zasahující do vývoje sekundárního folikulu u domestikovaných zvířat patří růstové faktory epidermální růstový faktor EGF (Epidermal Growth Factor), transformační růstový faktor TGF (Transforming Growth Factor), IGF (Insulin Growth Factor), FGF-2, FGF-7 (Fibroblast Growth Factors) a aktivin. Při jejich nedostatku podléhá folikul apoptóze (van den Hurk et al., 2000). U prasete byla objevena EGF mRNA i EGF peptid a také jejich receptory. mRNA růstového faktoru TGFβ je exprimována u prasete v thékálních buňkách. Tento faktor inhibuje růst folikulu neboť je inhibitorem mitózy granulózních buněk u prasat (Singh et al., 1995). V případě IGF-I a aktivinu A byla popsán jejich stimulační efekt na proliferaci granulózních buněk. IGF-I zvyšuje pravděpodobnost přeţití thékálních buněk a aktivin-A iniciuje utváření antra. IGF-I je schopný stimulovat syntézu receptorů pro FSH. FGF-2

je lokalizován

v thékálních buňkách člověka a granulózních buňkách skotu. U křečka má mitogenní efekt, ale nemá vliv na steroidogenezi. Je také moţným faktorem regulujícím vývoj krevních kapilár během folikulogeneze (Garrett a Guthire, 1999). Na vývoji sekundárního folikulu se podílí i některé faktory, které byly zapojeny i do dřívějšího vývoje folikulu. Patří mezi ně například SF-1 a WT-1. SF-1 je syntetizován v granulózních a thékálních buňkách a reguluje utváření AMH (Logan et al., 2003). WT-1 je exprimován hlavně v granulózních buňkách (Sadovski a Dorn, 2000). Utváření antrálního folikulu a výběr dominantních folikulů Vznik Graafova (antrálního) folikulu je závislý na působení hormonů a začíná při dosaţení puberty. Jak bylo popsáno výše, mezi thékálními buňkami postupně začnou prorůstat krevní kapiláry, které pronikají aţ do theca interna těsně u bazální membrány. Na buňkách theca interna se formují receptory pro LH a na granulózních buňkách se formují receptory pro FSH a estrogeny. V období hormonálního řízení jsou pod vlivm LH produkovány buňkami vrstvy theca interna androgeny. Androgeny difundují z theca interna do granulózních buněk. Pod vlivem FSH přeměňují granulózní buňky androgeny na estrogeny. Produkované estrogeny vyvolávají růst a dělení granulózních buněk a spolu s FSH stimulují granulózní buňky k tvorbě sekretů, které způsobí separaci granulózních buněk a vytváří se dutina nazývaná antrum (Wasserman, 1988). V antrálních folikulech můţeme rozdělit kumulární buňky na dvě skupiny: 1) Kumulární buňky, které obklopují oocyt a jsou s ním spojeny pomocí mezibuněčných spojů gap-junctions, tvoří vrstvu označovanou jako corona radiata. 2) Kumulární buňky 8

lemující folikulární stěnu se nazývají murální. Během zvětšování dutiny se oocyt dostává do excentrické pozice – nachází se nyní na tzv. vejconosném hrbolku. Folikul se vlivem produkce folikulární tekutiny vyklenuje nad povrch vaječníku a vzniká tak velký Graafův folikul schopný ovulace, který představuje poslední stádium vývoje folikulu (Wasserman, 1988). U prasete se vyvíjí v cyklu více neţ 50 folikulů. U prepubertálních prasniček se na vaječníku nachází 70% primordiálních folikulů, 3% primarních, 30% sekundárních a velmi malé mnoţství terciálních folikulů a ţádná ţlutá tělíska. Během poklesu hladiny FSH nastává u prasete vývoj několika dominantních folikulů. Tyto velké folikuly produkují velká mnoţství estradiolu a inhibinu a jsou schopny ovulace. Ostatní folikuly většinou podléhají atrézii. Výběr folikulů určených k ovulaci je u prepubertálních prasniček závislý na hormonálním řízení. Během 2 týdnů před pubertou se zvyšuje hladina pulzů luteinizačního hormonu a estradiolu, zatímco hladina kortikosteroidů klesá na polovinu. U cyklujících prasnic má na výběr folikulů vliv především ţluté tělísko. Během estrálního cyklu se mění poměr atretických a zdravých oocytů. Například během 5. - 12. dne estrálního cyklu prasete ja aţ 77 % velkých folikulů jiţ atretických. Zdá se, ţe sníţení genové transkripce a exprese aromatázy s následným sníţením hladiny estrogenu ve folikulu mohou být prvním krokem vedoucím k atrezii folikulů (Knox, 2005).

1.1.3 Zisk meiotické kompetence Tímto pojmem označujeme schopnost oocytu znovuzahájit a dokončit meiotické zrání. Meiotická kompetence oocytu závisí na velikosti oocytu a jeho folikulu. Během fáze růstu dochází v oocytu k intenzivní transkripci, translaci a syntéze nových organel, které tvoří zásobu pro následující meiotické zrání a preimplantační vývoj embrya a tyto změny souvisí se ziskem meiotické kompetence. Oocyty na začátku svého růstu nejsou schopny zahájit zrání, jsou zcela meioticky nekompetentní. Později, v dalších fázích růstu jsou sice schopny zrání zahájit, nikoliv však jej zcela dokončit (jsou částečně meioticky kompetentní). Teprve oocyty s ukončeným růstem mají plně vyvinutou kompetenci a jsou schopny dosáhnout stádia metafáze II (Motlík et al, 1984). Známkou nabytí meiotické kompetence je u velké části savců vytvoření antra ve folikulu a kompetence oocytu je dána také jeho velikostí. Oocyty prasat o velikosti oocytu menším neţ 100 m z folikulů o velikosti 0,4 – 0,8 mm mají omezenou nebo nemají ţádnou meiotickou kompetenci. Oocyty prasete o velikosti 110 m z folikulů o průměru 1–1,5 mm po vyjmutí z folikulu vstupují do meiózy, procházejí rozpadem zárodečného váčku a většina z nich dosáhne 9

stádia metafáze I, kde je jejich vývoj pozastaven - mají tudíţ částečnou meiotickou kompetenci. Prasečí oocyty nabývají meiotickou kompetenci okolo 14 dní po utvoření antra ve folikulech větších neţ 3 mm (Motlík et al. 1984, Morbeck et al. 1992, Hunter, 2000). Plně dorostlé prasečí oocyty o velikosti 120

m jsou jiţ zcela meioticky

kompetentní a po 48 hodinové kultivaci v in vitro podmínkách dosahují stádia metafáze II (Motlík et al., 1984, Petr et al., 1994). Dosaţení plné meiotické kompetence je na biochemické úrovni charakterizováno hromaděním neaktivního komplexu p34cdc2/cyklin B označovaného jako pre-MPF. Po vytvoření folikulárního antra se jiţ pre-MPF nehromadí, vyvíjí se schopnost tento komplex aktivovat (Kanayama et al., 2002). Podrobnější popis regulace meiotického zrání je popsán v samostatné kapitole této práce. Jakmile oocyt dosáhne své plné velikosti a meiotické kompetence, čeká na signál ve formě náhlého zvýšení hladiny luteinizačního hormonu (LH-peak). Dochází ke znovuzahájení meiózy a ovulaci (Wasserman, 1988). Vaječník savců obsahuje velké mnoţství oocytů bez nebo s částečnou meoitickou kompetencí. Jen malý počet oocytů dosáhne své finální velikosti a je ovulováno. Metody kultivace rostoucích oocytů (in vitro růst) jsou velmi důleţité pro studium regulace růstu oocytů. Oocyty dorostlé in vitro by mohly být nadějným zdrojem oocytů vyuţitelných pro reprodukční biotechnologie nebo výzkum v oblasti humánní reprodukce. Doposud bylo vyvinuto několik systémů pro in vitro růst oocytů. Tyto metody jsou zaloţeny především na kultivaci buď celých orgánů (Eppig a O´Brien 1996), kultivací folikulů (Hirao et al., 1994), nebo kultivaci oocytů na gelu (Huanmin a Yong, 2000) a membránách (Shen et al. 2007). Menší pozornost byla v minulosti věnována kultivaci samostatných komplexů oocytů a kumulárních buněk. Tímto způsobem se jiţ podařilo zvýšit meiotickou kompetenci rostoucích oocytů prasete. Oocyty s částečnou meiotickou kompetencí kultivované s kalcium ionoforem dosáhly stádia MII a posléze byly partenogeneticky aktivovány, přičemţ více neţ polovina oocytů byla aktivována (Sedmíková et al., 2003). Meiotická kompetence rostoucích prasečích oocytů byla zvýšena také kultivací oocytů s inhibitorem kalcium dependentní ATPázy (Petr et al., 1999) a s inhibitorem histon deacetylázy (Petr et al., 2009). Studium dalších molekul zapojených do růstové periody by mohlo také pomoci zvýšit meiotickou kompetenci rostoucích oocytů.

10

1.1.4 Meiotické zrání Meiotické zrání je proces, při němţ oocyt prochází ze stádia diplotene I do stádia druhé meiotické metafáze (MII) (Wassarman,1988). V rostoucích a dominantních folikulech, zůstávají oocyty zastaveny ve stádiu diplotene první meiotické profáze, která je srovnatelná s G2 fází buněčného cyklu somatických buněk. Ve fyziologických podmínkách (in vivo) začíná fáze zrání během puberty samice (u prasat asi 48 hodin před ovulací). Fyziologickým stimulem pro znovuzahájení meiózy je zvýšená pulzační hladina luteinizačního hormonu (LH). Při znovuzahájení meiózy hraje nezbytnou roli komunikace oocytu s okolními somatickými buňkami. Jelikoţ oocyt sám o sobě nemá receptory pro gonadotropiny, hormonální signál působí přes granulózní buňky které mají na svém povrchu tyto receptory (Lawrence et al., 1980). Kontakt mezi oocytem a okolními buňkami je zajišťován mezibuněčnými spoji gap junctions. Přes tyto spoje mohou procházet malé signální molekuly. Krátce po zvýšení hladiny LH nastává narušení spojů mezi oocytem a kumulárními buňkami, které jsou dále drţeny poblíţ pomocí kyseliny hyaluronové. Tento jev se nazývá expanze kumulu (Wassarman,1988). Po prasknutí folikulu dochází k ovulaci. Meiotické zrání probíhá právě v době mezi LH vlnou a ovulací (Van der Hurk et al., 2000). U většiny savců jsou oocyty ovulovány ve stádiu metafáze II. Během sestupu vejcovodem je meióza v tomto stádiu opět pozastavena, jedná se o takzvaný druhý meiotický blok. Pokračování meiózy a její dokončení je moţné jen po tzv. aktivačním stimulu. Ten za normálních okolností zajistí oocytu průnik spermie při oplození, in vitro můţe být vyvolán partenogenetickou aktivací, například ionty vápníku. Pro meiotické zrání je důleţité nejen přeskupení chromozómů (jaderné zrání), ale také změny v cytoplazmě (cytoplazmatické zrání) (Hunter, 2000). Jaderné zrání Při kultivaci oocytů in vitro trvá jaderné zrání u prasete 44 - 48 hodin a oocyt během něj prochází dvěma meiotickými děleními (M-fáze), mezi nimiţ se nereplikuje DNA (S fáze). Oocyt poté zůstává zastaven ve druhé meiotické metafázi (MII). Před znovuzahájením meiózy se jádro oocytu nachází ve stádiu zárodečného váčku (GV - Germinal Vesicle). Toto stádium je charakteristické kompaktní jadernou membránou a jadérkem obklopeným rozptýleným chromatinem. Chromatin v tomto stádiu utváří kruh nebo útvar podobný koňské podkově (Motlík a Fulka, 1976, Wassarman, 11

1988). U prasete ke znovuzahájení meiózy dochází 12 - 20 hodin od počátku kultivace oocytů in vitro (Motlík a Fulka., 1976, Motlík a Fulka, 1986). Na počátku znovuzahájení meiózy I můţeme sledovat rozpad jaderné membrány (GVBD, Germinal Vesicle Breakdown). Proces GVBD začne nepatrným vlněním jaderné membrány, při kterém mizí jaderné póry. Během GVBD postupně mizí také jadérko. Na konci GVBD je jiţ jaderná membrána zcela rozptýlena (Wassarman, 1988). Během GVBD můţeme u prasete charakterizovat 4 stádia GV1 – GV4 Ve stádiu GV1 můţeme pozorovat chromozomy uspořádané do tvaru koňské podkovy. Dále se ve stádiu GV 2 objevují na jaderné membráně shluky chromatinu. Ve stádiu GVIII je chromatin jiţ zkondenzovaný a v mikroskopu ho můţeme pozorovat jako síť filament rozprostřených po jádře. Ve stádiu GV4 se jiţ nedá rozeznat jadérko a jaderná membrána je rozptýlena. (Lucas et al., 2002). Na konci GVBD je kondenzovaný chromatin seskupen do shluku, a toto stádium se nazývá diakineze. Stádium diakineze trvá u prasete necelou hodinu (Wehrend a Mainecke, 2001). Stádium GVBD je dokončeno u prasete asi za 24 hodin. Oocyt poté prochází stádiem metafáze I, pro kterou je charakteristické utvoření bivalentů, a která u prasete probíhá mezi 24. – 33. hodinou (Wehrend a Mainecke, 2001) od počátku kultivace in vitro. Chromozómy jsou přesunuty do ekvatoriální roviny a jsou spojeny metafázním vřeténkem (Kubišta, 1998). Poté oocyt vstupuje do stádia anafáze I, charakteristického prodluţováním a oddělením párových chromozómů k pólům. U prasete tato fáze in vitro probíhá mezi 30. – 33. hodinou. Mezi 33. – 34. hodinou kultivace in vitro poté oocyt vstoupí do telofáze I, kdy je dokončeno oddělení chromozómů a první meióza (Kanagawa et al., 1991). Mezi meiózou I a meiózou II probíhá jen krátká interfáze nazývaná interkineze. Během této periody neprobíhá syntéza DNA (Kishimoto, 2003). Po velmi krátké interfázi následuje profáze II, která je na rozdíl od profáze I rychlá a není tak komplikovaná. Obecně je profáze II podobná jako profáze u mitotického dělení. Posledním stádiem meiotického zrání je stádium druhé meiotické metafáze (MII). Toto stádium nastává u prasete mezi 34. – 48. hodinou kultivace in vitro (Kanagawa et el., 1991) a vyznačuje se vyloučením poloviny genetické informace v podobě prvního pólového tělíska. V prvním pólovém tělísku je však zřídka nalezeno vřeténko a chromozómy pólového tělíska v pozdní telofázi degenerují (Wassarman, 1988). V metafázi II je meiotické dělení podruhé zastaveno (Kubišta, 1998).

12

Obr. 2: Znázornění stádií meiotického jaderného zrání podle Motlík a Fulka (1976) GV1-GV4 rozpad zárodečného váčku, DI- diakineze, MI- metafáze I, Ana- I anafáze I, Telo- telofáze I, MII- metafáze II. Cytoplazmatické zrání Pro následující oplození a další embryonální vývoj je nutné, aby také cytoplasma oocytu dostatečně vyzrála. Vývoj kvalitního zralého oocytu je závislý na redistribuci organel, cytoskeletu, transkripční aktivitě oocytu a obsahu takzvaných cytoplazmatických faktorů. Kumulární buňky oocytu produkují některé molekuly, které kontrolují nejen jaderné, ale také cytoplazmatické zrání (Cha a Chian, 1998). Mezi dobrě zjistitelné biologické markery cytoplazmatického zrání patří glutathionin a ATP, jejichţ koncentrace během

meiotického

zrání

stoupá

(Luciano

et

al.,

2005).

Dalšími

markery

cytoplasmatického zrání jsou enzymy kataláza, superoxid dismutáza a glutathion peroxidáza (Cetica et al., 2001) Z organel jsou důleţité zejména redistribuce mitochondrií a cytoskeletu (Stojkovic et al., 1999). Mitochondrie se v době GVBD seskupují kolem jádra, poté se při vydělení prvního pólového tělíska dočasně rozptýlí a následně se opět seskupí v druhé metafázi (MII) (Van Blerkom a Bell, 1986). Kolem zárodečného váčku (GV) se vytváří kruh Golgiho aparátu. Golgiho aparát je lokalizován také v blízkosti výběţků kumulárních buněk a poblíţ něho jsou lokalizována kortikální granula. Kortikální granula jsou specifické organely oocytu odvozené od Golgiho aparátu obsahující glykosaminoglykany, 13

proteiny a enzymy. Během zrání, asi kolem 18. hodiny kultivace, migrují k plazmatické membráně. Exocytóza kortikálních granul zabraňuje polyspermii při oplození (Moricard a Moricard, 1975). Redistribuce organel je důleţitá zejména pro proteosyntézu v oocytu. Po té co je znovuzahájena meióza neprobíhá jiţ téměř ţádná exprese genů. Nasyntetizovaná mRNA je chráněna před degradací a velké mnoţství RNA je během zrání uskladněno jako deadenylované transkripty spojené s proteiny (Moor a Dai, 2001). Do aktivace takto inaktivní RNA jsou zapojeny různé mechanizmy jako fosforylace translačních faktorů, ribozómové podjednotky, defosforylace polymerázy a především polyadenylace mRNA (Colgan et al., 1996).

1.1.5 Regulace meiotického zrání Podobně jako je řízen buněčný cyklus somatických buněk, tak je také meióza řízena mnoha faktory. Meiózu savců řídí různé molekuly jako cykliny, na cyklinech závislé kinázy, fosfatázy a signální molekuly, které jsou většinou propojeny ve sloţité signální kaskády. Znovuzahájení meiózy a výstup z prvního meiotického bloku je závislý především na sníţení hladiny cyklického adenosin monofosfátu cAMP (Cho et al., 1974). Cyklické nukleotidy cAMP a cGMP Pro znovuzahájení meiózy je nutné, aby se sníţila hladina cyklického adenosin monofosfátu (cAMP) v oocytu. Cyklický AMP je syntetizován jak oocytem, tak i folikulárními buňkami a do oocytu se dostává především pomocí mezibuněčných spojů tzv. gap junctions (Cho et al., 1974). Po uvolnění oocytu z prostředí folikulu dojde k poklesu cAMP, který je produkován folikulárními buňkami, můţe tedy dojít k znovuzahájení meiózy. Cyklický AMP je syntetizován enzymem adenylát cyklázou (AC), která je aktivována G-proteiny. K poklesu hladiny cAMP můţe dojít například po vyřazení jednoho ze tří podjednotek tzv. trimerních G-proteinů, Gs proteinu (Mehlmann et al., 2002). Koncentraci cAMP můţe zvyšovat cyklický guanosinmonofosfát (cGMP), čímţ se inhibuje spontánní zrání (Ratner., 1976). cGMP vzniká pomocí enzymu rozpustné guanylát cyklázy (sGC), která katalyzuje přeměnu guanosin trifosfátu (GTP) na cGMP. cGMP můţe mít v buňkách různé cíle, jako jsou iontové kanály, proteinkináza G, nebo fosfodiesterázy. Koncentrace cGMP klesá průběţně se zráním oocytů a tím jim dovolí 14

zahájit meiózu. Bylo zjištěno, ţe cGMP udrţuje blok meiotického zastavení dvěma způsoby: 1) Aktivuje cGMP-dependentní kinázu v oocytu 2) Inhibuje oocytovou cAMP fosfodiesterázu v oocytu a tím udrţuje vysokou hladinu cAMP (Ratner et al., 1976, Hubbard et al., 1982, Tornell et al., 1990, Vaccari et al., 2009). Několik prací ovšem uvádí, ţe pro znovuzahájení meiózy je nutné naopak zvýšení hladiny cGMP (Tornell et al., 1984, Hubbard a Price., 1988). Pro znovuzahájení meiózy jsou nutné také fosfodiesterázy (PDE). Tyto enzymy hydrolyzují cAMP na AMP, čímţ klesá hladina cAMP a můţe dojít k zahájení meiózy (Bornslaeger et al., 1986). V oocytech savců je hlavní fosfodiesterázou PDE-3A, v granulózních buňkách je to pak PDE-4B (Masciarelli et al., 2004, Vaccari et al., 2009). V oocytech můţe být cílovou molekulou pro cAMP proteinkináza A (PKA), jejíţ aktivita je nutná k udrţení bloku meiózy. cAMP se naváţe na regulační podjednotku komplexu neaktivní proteinkinázy A a tím enzym aktivuje. Aktivní proteinkináza A poté fosforyluje proteiny nutné k udrţení prvního meiotického bloku (Bornslaeger et al., 1986) (obr. 3). neaktivní

aktivní

adenylyl cykláza plasmatická membrána

GTP P

ATP

cAMP

fosfodiesteráza cAMP-PDE

4 cAMP ATP

C C

proteiny

AMP

C

R

cAMP R cAMP

C

R

R

proteinkináza A neaktivní komplex

cAMP cAMP

Obr. 3.: Model působení cAMP, podle Bornslaeger et al., (1986) Vápníkové ionty (Ca2+) Vápníkové ionty jsou významné intracelulární signální molekuly. V prasečích oocytech bylo nejvíce iontů vápníků nalezeno v karyoplazmě, vakuolách, mitochondriích a na povrchu lipidových granul (Petr et al., 2001). Vápník se do cytosolu dostává především přes 2 signální kaskády – dráhu vyuţívající inositol 1,4,5 trifosfátové (IP3) receptory (IP3R) a dráhu vyuţívající ryanodinové receptory - RyR (Petr et al., 2002). Vápníkové ionty jsou transportovány z cytoplazmy do lumenu zásobních organel pomocí ATPázových SERCA pump (Pozzan et al., 1994). Vápník byl nalezen jiţ v nezralých oocytech, jeho receptory jsou však méně citlivé ke stimulaci (Shiraishi et al., 1995). Vápenaté ionty hrají roli především v časné fázi výstupu z bloku v profázi I (Wassarmann, 1988). Rozinek et al. (2003) potvrdili význam vápníku pro znovuzahájení meiotického 15

zrání také pro oocyty prasete. Stimulace LH vlnou způsobí aktivaci fosfolipázy C (PLC) a tím krátký počáteční vzrůst hladiny vápníkových iontů, coţ vede k produkci inositoltrifosfátu. Podle Homova modelu modifikují vápníkové ionty například cykliny které jsou nezbytně nutné pro buněčný cyklus (Homa, 1995). Jedním z cílových proteinů vápníkových iontů, je kalmodulin dependentní protein kináza (CaMKII), jejíţ aktivita závisí na frekvenci oscilaci vápníkových iontů. Tato kináza u ţáby rodu Xenopus fosforyluje metaphase promoting factor - MPF (Lorca et al., 1993). Cyklin dependentní kinázy Buněčný cyklus jak somatických, tak i pohlavních buněk je řízen především cyklin dependentními kinázami (CDK) (Maller a Krebs, 1980, Wu a Gerhart 1980) Tyto kinázy katalyzují přenos fosfátové skupiny z adenozintrifosfátu (ATP) na postranní řetězec aminokyseliny v cílovém proteinu. Cyklin dependentní kinázy jsou v buňce přítomny po celý buněčný cyklus a jejich aktivita tedy musí být regulována jejich regulační podjednotkou – cyklinem (Alberts et al., 1998). Cyklin reguluje rychlost reakce i substrátovou specifitu odpovídající kinázy (Hagting et al., 1999). Řízení meiózy je zaloţeno především na změnách koncentrace cyklinů, která je zajišťována degradací ubikvitin dependentní proteolýzou. Molekuly cyklinů obsahují na svém N-konci specifickou sekvenci tzv. destrukční box, na který jsou v případě nutnosti navázány molekuly ubikvitinu, které molekulu označí k následné degradaci v proteozómech. Roli v rozeznání cyklinu hraje ubikvitin ligáza APC (Anaphase-Promoting Complex) (Hagting et al., 1999).

Metaphase promoting factor (MPF) Důleţitou molekulou regulující meiózu je MPF (Metaphase Promoting Factor). MPF je komplex skládající se ze dvou odlišných podjednotek: katalytické cyklin dependentní kinázy (CDK1, p34 cdc2) a regulační podjednotky - cyklinu B. MPF se účastní zahájení a řízení meiózy savců. Cílovými proteiny pro MPF jsou velké proteinové komplexy důleţité pro svinutí DNA během meiózy a proteiny jaderné membrány, které jsou-li fosforylovány, můţe dojít k rozpadu jaderné membrány. Katalytická podjednotka p34cdc2 (CDK1) například fosforyluje laminy jaderné membrány, čímţ navodí rozpad jaderné membrány (Jones, 2004).

16

Regulace MPF probíhá zejména pomocí degradace cyklinu B. Degradace cyklinu B umoţní, aby fosfatázy defosforylovaly své substráty, a tím dojde k dekondenzaci chromatinu, obnovení jaderné membrány a vezikulárních organel. Aktivita MPF je řízena také její fosforylací a defosforylací pomocí kináz. MPF je regulována pomocí Wee1/Myt1 kináz, které fosforylují p34 cdc2 (CDK1) a tím ji inhibují na Thr 14 a Tyr 15 a cdc25 fosfatázou, která defosforyluje p34 cdc2 (CDK1) na stejném místě. Pro aktivaci CDK v MPF je tudíţ nutná zvýšená aktivita cdc25 fosfatázy a sníţená aktivita Wee/Myt kináz (Jones, 2004). V nezralém meioticky nekompetentním oocytu je mnoţství podjednotek p34cdc2 (CDK1) a cyklinu B podobné jako u oocytu s ukončenou růstovou periodou. Rostoucí oocyt však obsahuje fosforylovanou p34 cdc2 (CDK1), která není schopna aktivovat MPF, dokud není růst dokončen (Kishimoto, 2003). Nutnou podmínkou pro znovuzahájení meiózy je zvýšení koncentrace p34 cdc2 (CDK1) a zejména syntéza cyklinu B. Aktivace p34 cdc2 (CDK1) probíhá defosforylací pomocí cdc25 fosfatázy, přičemţ cdc25 fosfatáza je regulována kinázou Plk (polo-like kinase). Aktivace MPF vyţaduje aktivní protein syntézu a fosforylaci některých proteinů, která předchází GVBD (Stojkovic et al., 1999). Aktivita MPF narůstá krátce před GVBD a kondenzací chromozómů, zatímco sníţení její aktivity umoţňuje přechod z metafáze do anafáze (Stojkovic et al., 1999). U oocytů zastavených v metafázi II se aktivita MPF zvyšuje a dosahuje nejvyšší hladiny. Inaktivace MPF a degradace cyklinu B souvisí s přechodem oocytu z metafáze II do anafáze II a telofáze II (Sun a Nagai, 2003). Průběh aktivity MPF během meiotického zrání znázorňuje obrázek. 5. Mitogeny-aktivované protein kinázy (MAPK) Tato skupina protein kináz hraje klíčovou roli v regulaci meiózy pomocí fosforylace proteinů na serinových nebo threoninových zbytcích. V savčích oocytech byly nalezeny dvě formy těchto extracelulárně regulovaných kináz: ERK1 (p44) a ERK2 (p42). Tyto dvě formy jsou v literatuře běţně popisovány jako klasické MAPK. Klasická MAPK (dále jen MAPK) je zapojena do tvorby a dynamiky mikrotubulů. Bylo zjištěno, ţe MAP kináza přenáší signál pro zahájení meiózy z cytoplazmy do jádra (Stojkovic et al., 1999). MAP kináza můţe fosforylovat různé cíle, které jsou často podobné s cíli MPF. MAP kináza také můţe fosforylovat inhibiční kinázy, které fosforylují části MPF (Inoue et al., 1995). 17

MAP kináza například fosforyluje proteiny které udrţují chromatin v kondenzovaném stavu, coţ je důleţité v době přechodu z první metafáze do druhé, kdy aktivita MAP kinázy na rozdíl od MPF neklesá a je tak zabráněno přechodu oocytu do interfáze (Dekel et al., 1995). MAP kináza také fosforyluje proteiny jaderné laminy a tím zabraňuje tvorbě jaderné membrány (Murray a Hunt, 1993). U myší bylo zjištěno, ţe jiţ na počátku růstové periody oocytu jsou přítomny dvě MAPK: ERK1 (p44) a ERK2 (p42). Během nabývání meiotické kompetence dochází v částečně kompetentním oocytu k fosforylaci těchto MAPK (Harrouk a Clarke, 1995). U prasat bylo také popsáno, ţe zralé oocyty s ukončeným růstem, získané z folikulů o velikosti 4.0-6.0 mm jsou schopny aktivovat cdc2 a MAPK, kdeţto rostoucí oocyty získané z folikulů 0.5-0.7 mm nebyly schopny aktivovat cdc2 kinázu a kaskádu MAPK1 ačkoliv mají nasyntetizovaný cyklin B1. Oocyty z folikulů o velikosti 1.0-1.5 mm jiţ některé dokáţí aktivovat p34cdc2 (CDK1), ale nejsou schopnyplně aktivovat kaskádu vedoucí k aktivaci MEK. Během závěrečné fáze růstu oocyty získají schopnost aktivovat tuto p34cdc2 (CDK1) kinázu a tím získávají plnou meiotickou kompetenci (Kanayama et al., 2002). Během G2/M fáze se část MAP kináz přesouvá do zárodečného váčku (Meinecke a Krischek, 2003). MAP kináza je aktivována pomocí Mos (aktivní katalytický komponent cytostatického faktoru CSF) a Plk1 (polo-like kináza1), které jsou ovšem v nezralém oocytu neaktivní (Sun a Nagai, 2003). MAP kináza je aktivována v době, kdy probíhá rozpad zárodečného váčku (GVBD). U myši se MAP kináza aktivuje následně aţ po aktivaci MPF (Stojkovic et al., 1999). U prasete se názory na dobu aktivace MPF liší. Bylo popsáno, ţe dochází k současné aktivaci MPF a MAP kinázy (Motlik et al., 1998). V odlišné studii ovšem bylo popsáno, ţe dochází nejdříve k aktivaci MPF a poté k aktivaci MAPK (Inoue, 1995). Nejvíce autorů zastává názor, ţe nejdříve dochází k aktivaci MAPK a poté MPF (Wehrend a Maeinecke 2001, Sugiura et al., 2005). Výsledky studií jsou odlišné pravděpodobně z důvodu velké heterogenity prasečích oocytů a odlišným způsobům kultivace. U prasete mají MAP kináza a P90rsk důleţitou roli v zastavení meiózy II. Jestliţe byla aktivita MAP kinázy/ P90rsk inhibována, byl blok v meióze II uvolněn a oocyty vstoupily do interfáze (Stojkovic et al., 1999). MAPK zůstává vysoce aktivní v průběhu zrání savčích oocytů a její aktivita klesá aţ po aktivaci. Průběh aktivity MAPK a MPF během meiotického zrání je znázorněn na obrázku 4. 18

Společné zapojení faktorů do znovuzahájení meiotického zrání je znázorněno na obrázku 5.

Obr.

4.:

Aktivita

MAPK

a

MPF

během

meiotického

zrání

savců

(podle Fan a Sun., 2004)

Obr. 5: Model zapojení molekul cAMP, MAPK (ERK1/2), MPF a do znovuzahájení zrání u savců. Podle tohoto modelu se na udrţení prvního meiotického bloku podílí cyklický adenosin monofosfát (cAMP). Ke sníţení hladiny cAMP můţe dojít po přerušení mezibuněčných spojů nebo pomocí proteindiesteráz PDE3. Pokud je v oocytu přítomna vysoká hledina cAMP, ten aktivuje proteinkinázu A (PKA) která posléze blokuje cyklindependentní kinázu cdc25B, která je nutná pro znovuzahájení zrání. Pro aktivaci MPF je tedy nutné sníţení aktivity PKA a aktivace cdc25B pomocí ERK1/2 a polo-like kinázami Plk/Akt. Schéma je znázorněno podle Liang et al., (2007).

19

Cytostatický faktor CSF Oocyty zastavené v druhé meiotické metafázi jsou zastaveny ve druhém meiotickém bloku pomocí skupiny molekul nazývané cytostatický faktor (CSF). Cytostatický faktor je přítomen v cytoplasmě ovulovaných oocytů, kde brání degradaci cyklinu B, který je nutný pro udrţení aktivity MPF. Důleţitým cytostatickým faktorem je Mos protein, který je potřebný pro stimulaci aktivity MAP kinázy a systém Mos/MAP kináza pravděpodobně slouţí k aktivaci a stabilizaci MPF (Stojkovic et al., 1999). K výstupu z druhého meiotického bloku můţe dojít aţ po sníţení aktivity MPF. Mos protein fosforyluje MEK1 kinázu a tím zvyšuje aktivitu MAPK. Mezi další molekuly CSF patří například SAC (Spindle Assembly Checkpoint) proteiny které jsou důleţité pro zastavení buněk v metafázi pomocí inhibice Anaphase Promoting komplexu (APC). Je-li tento komplex aktivován, dochází k degradaci cyklinu B a výstupu z druhého meiotického bloku (Sagata, 1997).

1.2

Oxid dusnatý

V současné době jsou intenzivně studovány malé plynné molekuly (takzvané gasotransmittery) jako významné signální molekuly v buňkách. Gasotransmittery jsou syntetizovány v buňkách enzymy a jejich syntéza je přísně regulována. Snadno prostupují přes plasmatickou membránu a mohou mít mnoho autokrinních, endokrinních i parakrinních efektů (Wang, 2004). Mezi gasotransmittery patří také oxid dusnatý. Za objev vazodilatační funkce oxidu dusnatého v kardiovaskulárním systému byla v roce 1998 udělena Nobelova cena za fyziologii. Po tomto objevu se oxid dusnatý dostal do popředí výzkumů i v ostatních oblastech fyziologie a medicíny. Řada vědeckých týmů v současnosti zdůrazňuje důleţitou funkci oxidu dusnatého v oblasti reprodukce samic (Jablonka-Shariff a Olson, 1997, Sengoku et al., 2001; Bu et al., 2003). Oxid

dusnatý

je

v buňkách

syntetizován

enzymem

NO-syntázou

(NOS,

EC 1.14.13.39) (Nathan a Xie, 1994). NOS katalyzuje přeměnu aminokyseliny L-agininu na L- citrullin, přičemţ vzniká také molekula oxidu dusnatého. K reakci je nutný jako substrát nikotinamidadenin-dinukleotid fosfát (NADPH) a kyslík. Schéma reakce vzniku oxidu dusnatého je znázorněna na obrázku 6 (Stuehr et al., 1999).

20

GTP

FAD

N

NO syntáza BH 4

FMN

Vytvoření dimeru NOS N2H

+

NH 2

+

N

0,5H+ 0,5 NADP

OH

+

NH

BH+4

Fe N

H

NH 2 N +

H

CaM

N

NH

0,5 NADPH

O

NH2

+

NH + NO

NH3+

O2

O-

H 2O NH 3+

O

L - Arginin

O

-

O2

O-

H2O NH 3+

O

N-Hydroxyarginin

O

L - Citrullin + NO

Obr. 6. Syntéza oxidu dusnatého (Stuehr et al., 1999).

1.2.1 Stavba NO- syntázy NO-syntázy jsou homodimery obsahující vazebná místa pro NADPH (nikotinamidadenindinukleotid

fosfát),

FMN

(flavinmononukleotid),

FAD

(flavinadenindinukleotid) a kalmodulin (CaM) (Hemmens a Mayer, 1998; Boggs et al., 2000).

Součástí

NOS

jsou

také

pevně

vázané

kofaktory

tetrahydrobiopterin

(HB4 = 6R-5,6,7,8 tetrahydrobiopterin) a hemová skupina (protophorfirin IX). NOS monomeru se skládá z oxidační domény leţící na aminokonci a redukční domény leţící na karboxylovém konci. Na redukční doméně se nachází vazebná místa pro redukční kofaktory NADPH, FMN, FAD a kalmodulin. Oxidační doména pevně váţe tetrahydrobiopterin a thiolátovouhemovou skupinu, která je reakčním centrem pro oxidační reakce. Kalmodulin aktivuje funkce NOS a ovlivňuje průtok elektronů enzymem (Stuehr et al, 1999). Molekulová hmotnost monomeru se v závislosti na izoformě pohybuje se mezi 110 a 160 kDa (Hemmens a Mayer, 1998).

21

2+

Ca

CaM

FMN

FAD

Hem

Obr. 7.: Model syntázy oxidu dusnatého.BH4- tetrahydrobiopterin, L-Arg – L-arginin, CaM – kalmodulin, FMN – flavinmononukleotid, FAD - flavinadenindinukleotid, NADPH – nikotinamidadenindinucleotid fosfatáza (Stuehr et al., 1999).

1.2.2 Izoformy NO- syntázy Enzym NO- syntáza se v buňkách vyskytuje ve třech základních izoformách. Jednotlivé izoformy jsou produkty různých genů s různou lokalizací, regulací, katalytickými účinky a různou citlivostí k inhibitorům (Murad, 1999; Furchgott, 1999; Ignarro, 1999). 1) Nervová NO-syntáza (známá jako nNOS, typ I, NOS-I a NOS-1), byla poprvé nalezena v nervové tkáni (Bredt et al., 1990). Později byl její výskyt prokázán také v kosterní svalovině, beta buňkách Langerhansových ostrůvků slinivky břišní, hypofýze, dřeni nadledvin a ledvinových nefronech, samčích pohlavních orgánech a dalších tkáních (Dixit a Parvizi, 2001). Gen pro nNOS je u člověka uloţen na 12. chromosomu. Monomer proteinu má hmotnost 131 kDa. Tato isoforma syntetizuje pouze malé mnoţství oxidu dusnatého. Je exprimována konstitutivně (jako konstitutivní jsou označovány enzymy, které jsou v buňce trvale přítomny ve víceméně stálé koncentraci) a je aktivována vzestupem hladiny vnitrobuněčného vápníku. Ion Ca2+ se váţe na kalmodulin a komplex kalmodulin/Ca2+ aktivuje nNOS (Janssens et al., 1992). 2) Endoteliální NO-syntáza (eNOS, typ III, NOS-III, NOS-3) byla poprvé objevena v endotelových buňkách cév (Bredt et al., 1990, Alderton, 2001). eNOS byla detekována taktéţ ve folikulech vaječníků savců (Jablonka - Shariff a Olson, 1997). U samců savců byla nalezena v Leydigových, Sertoliho a endoteliálních buňkách a také ve spermatidách (Ambrosino et al., 2003). Je závislá na zvýšení hladiny vápníku, stejně jako isoforma 22

nNOS (je kalcium a kalmodulin dependentní). Endoteliální NO-syntáza také syntetizuje jen malé mnoţství oxidu dusnatého po krátkou dobu. eNOS je většinou spojena s endoteliálními buněčnými membránami. Tato isoforma je u člověka kódována genem umístěným na chromosomu 7. Protein má velikost 133 kDa (Janssens et al., 1992). 3) Indukovatelná NO-syntáza (známá jako iNOS, typ II, NOS-II, NOS-2). Tato izoforma byla poprvé nalezena v myších makrofázích. Je ale exprimována celou řadou buněk včetně hepatocytů, buněk hladké svaloviny, fibroblastů, buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní, epiteliálních buněk, neutrofilních granulocytů, chondrocytů, keratinocytů a buněk respiračního epitelu (Nathan a Xie, 1994). iNOS byla detekována také ve folikulu vaječníků savců. iNOS zajišťuje stálou produkci oxidu dusnatého po dlouhou dobu (Jablonka -Shariff a Olson, 1997). Na rozdíl od nNOS a eNOS vţdy obsahuje pevně vázaný kalmodulin s vápníkem. Tato isoforma je tedy regulována na úrovni transkripce (Alderton, 2001). U člověka je iNOS produkována genem lokalizovaném na chromosomu 17. Protein má molekulovou hmotnost 133 kDa (Dixit a Parvizi, 2001). Mimo tyto izoformy byly objeveny různé varianty sestřihů izoforem: nNOS se 160 kDa, nNOS-

se 136 kDa, nNOS- se 125 kDa a existují také iNOS vzniklé

sestřihem (Alderon et al., 2001).

1.2.3 Aktivita a regulace NO-syntáz Pro aktivaci všech tří izoforem je nezbytné utvoření funkčního enzymu dimerizací. Aktivita NOS je ovlivňována vápníkem/ kalmodulinem, fosforylací, interakcí s jinými proteiny, řízenou degradací NOS a zpětnou vazbou oxidem dusnatým. nNOS a eNOS jsou konstitutivní enzymy, jeţ jsou buňkami produkovány stále, nezávisle na podmínkách prostředí. Produkují pouze malá mnoţství NO. iNOS je produkována v závislosti na stimulu, jeţ představují nejčastěji endotoxiny a proinflamační cytokiny. iNOS produkuje na rozdíl od konstitutivních izoforem větší mnoţství oxidu dusnatého (Ignarro, 1999; Hattori et al., 2000). Produkce oxidu dusnatého je u nNOS a eNOS regulována vazbou proteinu kalmodulinu, který je aktivován zvýšením hladiny intracelulárního vápníku. iNOS je nezávislá na mnoţství vápníku a kalmodulinu (Bian a Murad, 2003). Na rozdíl od konstitutivních NOS obsahuje velice pevně navázaný kalmodulin, proto je iNOS aktivita 23

označována jako Ca2+ independentní (Suschek et al., 1993). Kalmodulin mění svou konformaci po navázání vápníku, coţ mu umoţňuje navázat se na kalmodulindependentní izoformu NOS (Alberts et al., 1998). Fosforylovaný kalmodulin je pro aktivaci NOS neúčinný, proto musí být defosforylován (Greif et al., 2004). Vazba kalmodulinu zvyšuje rychlost transferu elektronů z NADPH do redukční domény (Alderton, 2001). Také fosforylace a defosforylace hrají roli v regulaci aktivity všech 3 enzymů NOS. Aktivaci eNOS ovlivňuje fosforylace na zbytcích Thr 495 and Ser 1177. Do fosforylace těchto zbytků jsou zapojeny proteinkinázy Akt, proteinkináza A (PKA), proteinkináza C (PKC), MAPK. Defosforylaci zajišťují dvě proteinfosfatázy PP1 a PP2A. Pokud je eNOS fosforylována na Ser 1177, eNOS je aktivována, kdeţto fosforylace Thr 495 sniţuje její aktivitu. Dále fosforylace na Ser 1117 pomocí CaM-dependentní kinázy (CaM-KII) vedla ke zvýšení aktivity eNOS (Fleming et al., 2001), zatímco fosforylace nNOS na Serinu 847 pomocí (CaM-KII) vede ke sníţení aktivity NOS enzymu (Alderton, 2001). Také v další studii bylo zjištěno, ţe proteinkináza A fosforyluje Ser na eNOS a tím se stimuluje vyšší produkce NO. Fosforylace NOS proteinkinázou C na Thr 495 a proteinkinázou A významně sniţuje jejich aktivitu (Bredt et Snyder, 1992). Dále bylo zjištěno, ţe zvýšená fosforylace tyrozinů na eNOS sníţila aktivitu eNOS o 50%. (Cardena et al., 1996). Nejnovější výzkumy rakovinných buněk ukazují, ţe na fosforylaci iNOS by se mohla podílet Src kináza a mohla by tak regulovat její aktivitu pomocí stabilizace dimeru NOS (Tyryshkin et al., 2010). Vzniklý, nebo dodaný NO můţe sám o sobě inhibovat produkci NO přes narušení vazby proteinového komplexu NFk-B, který zajišťuje transkripci s promotorem na iNOS genu. NO můţe také interagovat s hemovým ţelezem v nNOS a tato inhibice můţe být zvrácena pomocí tetrahydrobiopterinu (Griscavage et al. 1994). Reversibilní inhibici eNOS pomocí NO potvrdil také Ravichandran et al, (1995) a Vaziri a Wang, (1999). NOS interaguje s dalšími proteiny, které mohou ovlivnit jeho aktivitu. Součástí nNOS je vazebné místo pro vazbu PIN (Protein Inhibitor of NOS). Úloha PIN v regulaci NOS ovšem není zcela jasná, pravděpodobně reguluje NOS v závislosti na koncentraci (Jaffrey a Snyder, 1996). Heat-shock protein 90 (Hsp90) pravděpodobně reguluje aktivitu NOS pomocí allosterického efektu (Chan et al., 2006). Regulace lokalizace eNOS je řízena především myristoylací a palmitoylací a také proteinem Caveolinem. Studie publikovaná Tianem et al., 2010 ukázala, ţe Caveolin-1 můţe stimulovat aktivitu eNOS 24

v odpověď na oxidativní stres. Důleţitým kontrolním bodem pro regulaci NOS je udrţení stability její mRNA a regulace její degradace (Nathan a Xie, 1994). Na degradaci NOS izoforem se pravděpodobně podílí tři mechanizmy – dráha zahrnující proteázu kalpain, systém ubikvitin - proteazóm a regulace hsp90 chaperony (Osawa et al., 2003).

1.2.4 Vlastnosti oxidu dusnatého Oxid dusnatý je volný radikál, jehoţ biologický poločas rozpadu je jen několik sekund (~5 s) (Garthwaite, 1991). NO snadno proniká skrz biomembrány a je hydrofobní (Kupková a Beneš, 2004). Odstraněním nepárového elektronu z NO vzniká nitrosoniový ion NO+ naopak redukcí NO vzniká nitroxylový ion NO- Z biologického hlediska jsou důleţité zejména reakce NO s kyslíkem a s ionty transitních kovů (Brune a Lapetina, 1995). Oxid dusnatý reaguje s O2 za vzniku oxidu dusičitého NO2, který můţe dimerizovat do formy N2O4, který jiţ nemá charakter radikálu. Vyšší koncentrace NO2 nebo jeho dimeru způsobují poškození epiteliálních buněk dýchacích cest (Kupková a Beneš, 2004). Reakcí N2O4 s vodou se tvoří stabilní produkty nitrity (NO2-) a nitráty (NO3-) (Dixit a Parvizi, 2001). Nitráty a nitrity mohou v organismu reagovat například s oxyhemoglobinem. Reakcí NO2 s oxidem dusnatým vzniká oxid dusitý, který můţe nitrosylovat proteiny. Nitrosylace je jednou z rozšířených modifikací bílkovin v organismu (Stamler et al., 1994). Nitroso-thioly také slouţí jako efektní nosiče oxidu dusnatého (Furchgott a Zawadski, 1980). Při rozkladu oxidu dusnatého vznikají dusitany, které se v přítomnosti hemoproteinů oxidují aţ na dusičnany (Kupková a Beneš, 2004). Těchto reakcí se vyuţívá při nepřímém stanovení NO, protoţe dusitany a dusičnany se na rozdíl od NO dají spektrofotometricky stanovit. Další reakcí je reakce NO se superoxidem (O2•), při níţ vzniká toxický peroxodusitan (OONO-), který můţe oxidovat SH skupiny bílkovin. Peroxodusitan můţe způsobovat poškození DNA a apoptózu, čehoţ vyuţívají makrofágy při obraně organismu. Reakcí NO s kyslíkovými radikály se tvoří další toxické radikály, které způsobují poškození tkáně a účastní se tak chronického i akutního zánětu (Clementi et al., 1998). Nejdůleţitější biologické funkce NO jsou znázorněny na obrázku 8.

25

Obr. 8.: Základní dráhy působení radikálu oxidu dusnatého v biologických systémech. Podle Stamler et al. (1997). Reakce NO s rozpustnou guanylátcyklázou Častým cílovým proteinem pro oxid dusnatý je rozpustná guanylát cykláza (sCG) (Ignarro et al., 1987; Murad, 1994). NO se v guanylát cykláze váţe na hemové ţelezo a cysteinový zbytek v blízkosti hemové skupiny. Interakce NO s hemovým ţelezem má za následek uvolnění transaxiálního ligandu – histidinu, coţ vede k enzymové aktivaci guanylát cyklázy. Guanylát cykláza v buňkách například přeměňuje guanosintrifosfát (GTP) na cyklický guanosinmonofosfát (cGMP). cGMP sniţuje vnitrobuněčnou koncentraci Ca2+. Sníţení koncentrace Ca2+ má za následek například uvolnění hladkého svalstva. NO se pomocí aktivace cGMP účastní také přenosu nervového signálu. Působením glutamátu na NMDA receptor se zvyšuje koncentrace Ca2+. Zvýšení koncentrace vápníkových iontů aktivuje nNOS, a vzniklý NO způsobí vzestup hladiny cGMP a zpětnou difúzi oxidu dusnatého do presynaptického neuronu. Pomocí cGMP se tak NO pravděpodobně účastní tvorby paměťové stopy v centrální nervové soustavě (Eu et al., 2000). cGMP jako cílová molekula pro NO se účastní také na zvýšení hladiny cAMP, důleţitého faktoru v meiotickém zrání oocytů (Sun a Nagai, 2003). Reakce NO s dalšími hemoproteiny NO často reaguje také s dalšími hemoproteiny. Oxid dusnatý produkovaný stimulovanými makrofágy difunduje do okolních tkání, kde reaguje s Fe-S a hemovými centry enzymů. Nejvíce hemových skupin je dostupných uvnitř mitochondriální akonitasy 26

(Drapier a Hibbs, 1996). Vazbou na tyto hemové proteiny se sníţí tvorba NADH, který je nutný pro řízení oxidativní fosforylace. NO a peroxonitrit také inhibují komplexy dýchacího řetězce. NO také inhibuje ribonukleotid reduktásy, coţ vede k inhibici DNA syntézy (Clementi et al., 1998).

S- Nitrosylace Nitrosylace je jednou z rozšířených modifikací proteinů. Sloučeniny NO jako N2O3, N2O4 a ONOO- mohou snadno reagovat s thioly v aminokyselinách, peptidech a proteinech a mohou je nitrosylovat. Nitrosylace modifikuje například iontové kanály, kinázy, proteolytické enzymy, transkripční faktory.(Mc Donald a Moss, 1994, Stamler 1994). Přes kaskádu nitrosylace oxid dusantý reguluje například apoptózu a receptory spojené s G-proteiny (Kokkola et al., 2005)

1.2.5 Inhibitory NO- syntáz a donory NO Při studiu funkcí oxidu dusnatého v organizmu se často pouţívá metod farmakologické inhibice enzymu NOS a kultivace buněk s donory NO.

Inhibitory NOS Aktivita NOS můţe být regulována pomocí mnoha farmaceutických inhibitorů. První skupinou často pouţívaných inhibitorů ve výzkumu úlohy NO v ţivotních dějích jsou takzvané kompetitivní inhibitory. Tyto inhibitory inhibují reakci katalyzovanou NOS obsazením vazebného místo pro substrát NOS - L-arginin (Rees et al., 1989; 1990). Mezi pouţívané deriváty argininu patří NG-monometyl-L-arginin (L-NMMA), N-omega-nitroL-arginin (L-NA) a N-omega-nitro-L-arginin metylester (L-NAME). Tyto inhibitory inhibují nespecificky všechny tři izoformy NOS. Jejich nespornou výhodou je existence neúčinných D-konformerů, které je moţno při experimentech vyuţít jako negativní kontrolu. Nevýhodou těchto inhibitorů je ţe obsahují alkoholové, aminové nebo karboxylové skupiny, které mohou nespecificky reagovat i s jinými hemovými proteiny v buňkách (Peterson et al., 1992). Druhým typem inhibitorů jsou akompetivní inhibitory, které inhibují základní mechanizmus vzniku NO a vyţadují NADPH a substrát. Inhibitor se naváţe na enzym a způsobí konformační změny nebo kovaletní změny enzymu. Do této skupiny patří iNOS 27

specifický inhibitor aminoguanidin (AG) společně s acetamidovými inhibitory (L-NIO, L-NIL, GW273629). Pro inaktivaci NOS aminoguanidinem (AG) je nutná současná přítomnost Ca2+, kalmodulinu, NADPH, tetrahydrobiopterinu a kyslíku (Wolff a Lubeskie, 1995). Aminoguanidin je mnohem slabší inhibitor konstitutivních izoforem, pouţívá se zejména pro inhibici iNOS. Efekt aminoguanidinu lze zvrátit pouţitím NO donoru (Yamauchi et al., 1997).

Donory NO Syntetické S-nitrosothioly patří mezi často pouţívané donory oxidu dusnatého. Ve studiích zaměřených na reprodukce samic je nejvíce pouţíván donor SNAP (S-nitroso-Nacetylpenicillamine) a SNP (sodium nitroprusside). SNAP uvolňuje NO ve fyziologických podmínkách (Nishio et al., 1996). SNAP je pouţíván jako vazodilatátor, neboť působí svou produkcí NO stimulačně na produkci cGMP. Na rozdíl od toho ovšem vyšší koncentrace SNAP (1 mM) indukují apoptózu buněk přes jinou neţ cGMP dráhu (Shen et al., 1998). Poločas rozpadu tohoto donoru je přibliţně 5 hodin při 37⁰ C (Iggnaro et al., 1981). SNP uvolňuje spontálně NO a NO- po rozpuštění ve vodě (Navaza et al., 1989). Nicméně při degradaci SNP vznikají i dva biologicky aktivní produkty, kyanidy a volné ionty ţeleza. Poločas rozpadu tohoto donoru jsou 2 minuty, ovšem metabolity se uvolňují ještě několik dní (Coppens et al., 2002). Oba tyto donory byly také vyuţity jako aktivační stimuly při studiu partenogenetické aktivace pomocí oxidu dusnatého V této studiizjištěno, ţe SNAP je mnohem efektivnější pro aktivaci oocytů neţ SNP (Petr et al., 2005).

28

1.3

Vliv NO- syntáz a NO na reprodukci samic

1.3.1 Lokalizace NO-syntáz ve vaječníku samic

eNOS eNOS byla detekována ve vaječníku potkana (Zackrisson et al., 1996, Tao et al., 1997, Jablonka-Shariff a Olson, 1997). Tato izoforma byla nalezena v buňkách théky, v ovariálním stroma a nástěnných granulózních buňkách časných antráních folikulů potkana a po ovulaci uvnitř buněk ţlutého tělíska (Jablonka- Shariff a Olson, 1997). Nejnovější studie ukazuje, ţe všechny tři izoformy NOS jsou ve vaječníku přítomny jiţ u právě narozených mláďat potkanů. U jednodenních mláďat se nacházejí především v oocytech a s postupným růstem folikulů se objevují také v granulózních a thékálních buňkách. Nejvyšší aktivita NOS a produkce NO byla zaznamenána 7. – 10. den, kdy probíhá puberta potkanů (Zhang et al., 2011). eNOS byla nalezena také v myších oocytech (Mitchell et al., 2004, Jablonka- Shariff a Olson, 1997) a granulózních buňkách dospělých i prepubertálních myší (Mitchell et al., 2004). U skotu byla detekována eNOS v nezralých rostoucích oocytech, její mnoţství se během zrání oocytů sniţovalo (Tesfaye et al. 2006). eNOS byla těmito autory nalezena také v embryích skotu. Pires et al. (2009) detekovali eNOS v oocytech z primárních, sekundárních i terciálních folikulů skotu a v oocytech během zrání. eNOS byla nalezena především v cytoplazmě oocytů, granulózních a thékálních buňkách, kdeţto v oblasti jádra oocytů nebyl zaznamenán ţádný signál. Tito autoři v oocytech nalezli také mRNA pro eNOS, mnoţství mRNA se sniţovalo během zrání oocytů (Pires et al., 2009). U prasete byly nalezeny všechny tři izoformy NOS ve vaječníku a to i během vývoje folikulů. eNOS je exprimována uvnitř velkých folikulů (Takesue et al., 2003, Tao et al., 2004) o velikosti 7 - 10 mm. Tato izoforma byla nalezena v oocytech, endoteliálních buňkách, thékálních buňkách, kumulárních buňkách (Tao et al., 2004). Později byla nalezena také v oocytech a granulózních buňkách jiţ během utváření folikulu s jednou vrstvou kumulárních buněk (Kim et al., 2005). V oocytech z malých folikulů o velikosti 1 - 3 mm prokázal expresi eNOS a přítomnost eNOS mRNA Hattori et al, (2000). Ve folikulech o průměru 7 mm bylo nalezeno větší mnoţství eNOS neţ ve folikulech s průměrem 2 mm. V této práci ovšem autoři nesledovali velikost oocytů, tudíţ ani vztah exprese k meiotické kompetenci oocytů (Takesue et al., 2003). Dále tito autoři prokázali, 29

ţe oocyty získané z folikulů o velikosti 3 - 6 mm produkují po 15 hodinách kultivace malá mnoţství NO. Vztah exprese NOS k meiotické kompetenci byl sledován v práci Chmelíkové et al. 2009. V této práci bylo zjištěno, ţe jak mRNA pro eNOS, tak vlastní eNOS přítomna ve všech sledovaných velikostních kategoriích rostoucích oocytů prasete a v kumulárních buňkách oocytů větších neţ 90 µm. V oocytech o velikosti 80 µm bylo znatelné, ţe v oblasti jádra se nachází více eNOS neţ v oblasti cytoplazmy. V částečně meioticky kompetentním oocytu pak byly nalezeny shluky eNOS v cytoplazmě. U prasete byla tato izoforma nalezena také v oocytech a kumulárních buňkách ve stádiích GV, MI a MII během meiotického zrání oocytů in vitro. Nejvyšší koncentrace eNOS byla nalezena u oocytů ve stádiu GV a s meiotickým zráním klesala (Chmelíková et al., 2010)

iNOS Také iNOS byla nalezena ve vaječníku savců. Tato izoforma byla stejně jako eNOS nalezena ve vaječníku potkana (Zackrisson et al., 1996, Van Voohris et al, 1995, Tao et al., 1997, Jablonka-Shariff a Olson, 1997). Byla nalezena především v théce časných antrálních folikulů, ovariálním stroma a buňkách ţlutého tělíska (Jablonka- Shariff a Olson, 1997, Van Voohris et al, 1995). mRNA pro iNOS byla nalezena v granulózních buňkách preantrálního folikulu potkana (Van Voohris et al, 1995). Mitchell et al. (2004) detekovali tuto izoformu v oocytech myší v théce a ooplazmě oocytů. V granulózních buňkách byla nalezena mRNA pro iNOS ovšem signál proteinu iNOS v granulózních buňkách byl velmi slabý. Huo et al., 2005 zjistili, ţe lokalizace iNOS závisí na vývojovém stádiu oocytu. Ve stádiu GV byla iNOS nalezena převáţně v oblasti zárodečného váčku, ale krátce po GVBD byla iNOS

lokalizována kolem

kondenzovaných chromozómů. Kolem chromozómů byla iNOS lokalizována i během metafáze I a II. V anafázi byla iNOS nalezena v okolí dělícího vřeténka, poté byla v telofázi jiţ rozptýlena mezi chromozómy a dále byla tato izoforma nalezena v samčím a samičím prvojádru (Huo et al., 2005). U skotu byla iNOS nalezena rozptýleně v cytoplazmě nezralých oocytů, kdeţto u zralých oocytů se vyskytovala více ve shlucích. Tato izoforma byla nalezena také během embryonálního vývoje do stádia blastocysty (Tesfaye et al. 2006). Pires et al. 2009 popisuje, ţe iNOS je lokalizována podobně jako eNOS, ve folikulu během vývoje folikulu skotu. V izolovaných oocytech nalezli iNOS v cytoplasmě a její distribuce se nelišila 30

během meiotického zrání. Tito autoři také nalezli mRNA pro tuto izoformu v oocytech, přičemţ největší mnoţství bylo nalezeno v rostoucích oocytech (Pires et al. 2009). U prasete byla nalezena iNOS v granulózních buňkách časných antrálních folikulů menších neţ 3 mm (Grasselli et al., 2001). Tao et al., 2004 nalezl iNOS pouze v oocytech z velkých folikulů, zatímco Kim et al., (2005) nalezl iNOS izoformu v oocytech z malých folikulů s jednou vrstvou kumulárních buněk. V těchto folikulech ovšem nenalezli iNOS v granulózních buňkách. U oocytů s více vrsvami kumulárních buněk a antrálních oocytů tuto izoformu jiţ detekovali jak v cytoplasmě oocytu, tak v granulózních buňkách a théce. Přítomnost mRNA pro iNOS a vlastní iNOS byla následně potvrzena v rostoucích oocytech od velikosti 80 µm také v jejich kumulárních buňkách. iNOS byla lokalizována v oocytech převáţně rozptýleně v cytoplazmě. Zajímavé bylo, ţe oocytů velikosti 80 µm se iNOS vyskytovala také v oblasti jadérka (Chmelíková et al., 2009). Tato izoforma byla dále nalezena při zrání prasečích oocytů in vitro. Podobně jako eNOS také iNOS se vyskytovala v nejvyšší koncentraci ve stádiu GV a poté její mnoţsví v oocytu klesalo. Zajímavé je, ţe se tato izofoma nevyskytovala v oblasti zárodečného váčku a kolem metafázního vřeténka (Chmelíková et al., 2010). nNOS V ovariu potkana nebyla nNOS zjištěna (Van Vohris et al., 1995). Abe et al., 1999 detekoval mRNA pro nNOS v myších oocytech (Abe et al., 1999). U skotu byla nalezena také pouze mRNA pro nNOS u nezralých oocytů, u zralých ovšem nalezna nebyla (Tesfaye et al., 2006). U prasete byla nNOS detekována v oocytech malých folikulů s jednou vrsvou buněk, v oocytech, granulóze i théce větších folikulů a také v antrálních folikulech. V této práci oocyty nebyly rozlišeny podle své velikosti, tudíţ ani podle meiotické kompetence (Kim et al., 2005). Podrobnější studie (Chmelíková et al., 2009) ukázala, ţe mRNA pro nNOS a také vlastní protein nNOS je přítomen ve všech námi sledovaných stádiích rostoucích oocytů prasete. Mnoţství proteinu nNOS v oocytu stoupá s růstem oocytu, ovšem v kumulárních buňkách tento protein nalezen nebyl. Tato izoforma byla v oocytech lokalizována v cytoplasmě. U rostoucích oocytů o velikosti 80 -89 µm bylo více nNOS nakumulováno v korové oblasti oocytu. U plně meioticky kompetentních oocytů se nNOS mimo cytoplasmy nacházela také v jádru a jadérka. Také třetí izoforma nNOS byla nalezena v oocytech a jejich kumulárních buňkách během meiotického zrání prasečích oocytů in vitro (Chmelíková et al., 2010).

31

Z těchto studií je zřetelné, ţe mRNA pro NOS, a všechny tři izoformy NOS jsou syntetizovány během růstu prasečích oocytů jiţ od stádia velikosti oocytu 80 µm. Změny v distribuci jednotlivých izoforem NOS naznačují, ţe NOS pravděpodobně hraje úlohu při růstu oocytů a zisku meiotické kompetence prasete (Chmelíková et al., 2009).

1.3.2 Úloha NO v meiotickém zrání savčích oocytů V organismu působí NO nejen jako neurotransmiter, vasodilatátor, inhibitor agregace krevních destiček a proliferace hladké svaloviny, ale také jako regulátor reprodukčních funkcí samic. NO hraje roli na kaţdé úrovni regulace reprodukce samic. Na úrovni hypotalamu reguluje uvolňování releasing hormonu LHRH který uvolní gonadotrpiny aktivací nNOS v hypofýze. (Rosselli et al., 1994). Ve vaječníku NO indukuje ovulaci a luteolýzu (Yang et al., 2003), v reprodukčním traktu relaxuje svalovinu dělohy přes působení cGMP (Mc Cann et al., 2003). V mnoha pracech bylo prokázáno, ţe je NO nezbytný pro meiotické zrání oocytů savců. Úloha oxidu dusnatého v meiotickém zrání oocytů je často studována pomocí vyblokování genů pro NOS nebo pomocí specifických inhibitorů NOS nebo donorů NO. Mnoho studií pouţívá jako modelové organismy laboratorní hlodavce. Úlohu oxidu dusnatého v meióze prokázali experimenty pouţívající myši s vyblokovaným genem pro eNOS. Po vyblokování genu pro eNOS se myším rodilo méně mláďat a některá z nich měla sníţenou ţivotaschopnost. Tato zvířata měla také méně dozrálých oocytů ve stádiu MII, neboť velké mnoţství oocytů degenerovalo. Některé z abnormalit pozorovaných u eNOS deficitních myší se podobaly abnormalitám vyskytujícím se při nedostatku MPF (Jablonka - Shariff a Olson, 1998, Jablonka - Shariff a Olson, 2000). Při vyblokování genu pro enzym iNOS bylo u myší mnoţství ovulovaných oocytů sníţeno jen nepatrně a tento zásah neovlivnil počet mláďat ve vrhu a jejich ţivotaschopnost (Jablonka - Shariff a Olson, 1998). Pomocí nespecifického inhibitoru NOS (L-NAME) bylo prokázáno, ţe inhibice NOS narušuje rozpad zárodečného váčku a postup z první do druhé meiotické metafáze. Řada takto ošetřených oocytů vykazovala podobné degenerativní změny jako oocyty získané od myší s vyblokovaným genem pro eNOS. Výsledky těchto studií ukázaly, ţe NO je nezbytný pro normální zrání oocytů u myší (Jablonka - Shariff a Olson, 1998, 2000). 32

Také u skotu bylo prokázáno, ţe je NO nezbytný pro meiotické zrání oocytů. Oproti laboratorním hlodavcům, inhibovaly u skotu meiotické zrání aţ 10 x vyšší koncentrace inhibitoru (100 mM AG). Tyto koncentrace také narušily expanzi kumulárních buněk a zvýšily koncentraci NO3-/NO2- v oocytech skotu. Během zrání tyto vysoké koncentrace také inhibovaly migraci kortikálních granul. V této studii se snaţili zvrátit inhibiční efekt pomocí donoru NO SNP. Kombinace 100 mM AG 10−5 M SNP ovšem nezvrátila efekt inhibitoru, pouze zvýšila koncentraci NO3-/NO2- v oocytech (Matta et al., 2009). Vliv inhibitorů NOS na zrání oocytů a raný embryonální vývoj u skotu sledovali také Schwarz et al. (2010). Inhibitor L-NAME (10

-7

M) sníţil počet oocytů, které dosáhly

stádia druhé meiotické metafáze (Schwarz et al., 2010). V několika pracech bylo zjištěno, ţe NO můţe mít i jiné efekty. Mitsube et al., (1999) popisuje, ţe inhibitory NOS (L-NMMA a AG) neměly vliv na ovulaci vyvolanou LH u potkanů. V této studii kultivovali celá ovária s inhibitory. Také u králíků inhibice NOS inhibitorem (L-NAME) neměla vliv na počet oocytů ve stádiu GVBD (Yamauchi et al. 1997). Odlišné výsledky byly také publikovány ve studii pouţívající inhibice NOS u oocytů potkana (Nakamura et al., 2002). V této studii bylo popsáno, ţe iNOS inhibitor indukoval zrání oocytů. Autoři se domnívají, ţe NO přímo inhibuje meiotické zrání v oocytech bez kumulárních buněk. V této práci ovšem sledovali vliv pouze iNOS izoformy, pouţívali jiných inhibitorů a v kontrolních skupinách měli malé mnoţství zralých oocytů (Nakamura et al., 2002). Ovšem také v další práci bylo u potkanů zjištěno, ţe NO můţe inhibovat zrání oocytů navozené LH. Při LH-indukovaném zrání oocytů NO donor SNAP sníţil poměr oocytů které prošly GVBD a inhiboval expanzi kumulu. Naopak při inhibici NOS pomocí AG byl napodoben efekt LH na redukci mezibuněčných spojů při ovulaci. Také při in vivo experimentech bylo zjištěno, ţe injekce NO donorů zainhibovala ovulaci stimulovanou hCG (Sela-Abramovich et al., 2008). V dalších studiích bylo zjištěno, ţe NO můţe mít na zrání myších oocytů dvojí efekt. Oxid dusnatý můţe v malých koncentracích působit stimulačně, ovšem vyšší koncentrace mohou mít naopak inhibiční efekt na meiotické zrání. 24-hodinová inhibice NOS (inhibitorem NOS - L-NAME) narušila vyloučení prvního pólového tělíska oocytů (Sengoku et al., 2001, Bu et al., 2003). Sengoku et al., 2001 zjistili, ţe je kromě koncentrace NO významná také přítomnost kumulárních buněk kolem oocytů neboť NOS inhibitor (L-NAME) výrazně potlačil znovuzahájení meiózy pouze u oocytů obklopených kumulárními buňkami. Niţší koncentrace donoru SNP 10-7 - 10-5 naopak stimulovaly 33

zrání oocytů obklopených kumulárními buňkami, ovšem neměly vliv na oocyty bez kumulárních buněk (Bu et al., 2003). Sengoku et al. (2001) ovšem zjistil, ţe pro stimulaci jsou nutné ještě niţší koncentrace donoru a naopak vysoké koncentrace (4 M SNP) způsobily vyšší procento atypických oocytů. Dvojí efekt NO byl prokázán také u skotu. Nízké koncentrace NO jsou nutné pro zrání oocytů (Matta et al., 2002), kdeţto vysoké koncentrace donoru SNP (10

-3

M)

blokovaly vývoj oocytů. Oocyty měly zpomalený průběh GVBD, většina oocytů byla zastavena v MI fázi a u těchto oocytů byla potlačená kumulární expanze. Tato inhibice vysokou koncentrací donoru byla nevratná. Inhibitor iNOS Aminoguanidin inhiboval GVBD v koncentracích 10 a 50 mM a naopak niţší koncentrace donoru NO SNP (0,01 μm) stimulovaly GVBD (Bilodeau-Goeseels., 2007). Také u prasečích oocytů hraje oxid dusnatý významnou roli během zrání. Pomocí experimentů, ve kterých byl pouţit iNOS inhibitor (AG) bylo prokázáno, ţe pro normální průběh GVBD je nutná funkční iNOS (Tao et al., 2004). Oocyty kultivované s nespecifickým inhibitorem L-NAME neměly blokován rozpad zárodečného váčku, ale většinou byly zastaveny před vyloučením prvního pólového tělíska. Naopak vyšší koncentrace NO donoru (0,3 mM SNP) inhibovaly utváření antra (Tao et al., 2004), a vysoké koncentrace NO donoru (SNP 1 - 10 mM) narušovaly meiotické zrání prasečích oocytů v době přechodu mezi první a druhou meiotickou metafází (Tao et al., 2005).

1.3.3 Mechanizmy působení NO během meiotického zrání oocytů Vliv oxidu dusnatého na meiotické zrání savčího oocytu byl prokázán v mnoha pracech. Jeho přesné působení v oocytu, však zatím není detailně prostudováno. Objasnění signální kaskády je komplikované zejména vzhledem k odlišnému působení nízkých a vysokých koncentrací NO na meiotické zrání, proto je nutné odlišovat inhibiční a stimulační efekt oxidu dusnatého. V nízkých koncentracích oxid dusnatý přenáší signály a působí jako vnitrobuněčný posel, a tím také pomáhá regulovat meiózu. Ve vysokých koncentracích ovšem značně poškozuje oocyt svými deriváty. Přebytečný oxid dusnatý můţe v buňce reagovat s jinými volnými radikály (O2-) a produkovat tak více toxické radikály, například peroxynitrity ONOO- (Bu et al, 2003).

34

Stimulační vliv NO na meiotické zrání NO můţe být klíčovým regulátorem signální kaskády, která kontroluje postup mezi metafází I a metafází II u oocytů myší a potkanů (Jablonka-Shariff a Olson, 1998). NO je znám jako aktivátor guanátcyklázy a cyklických nukleotidů, regulátorů zpětného zahájení meiózy. Jablonka-Shariff a Olson (1998) uvádějí, ţe oxid dusnatý pravděpodobně reguluje hladinu cAMP buď zvýšením syntézy cGMP, a nebo stimulací cAMP-PDE během přechodu z metafáze I do metafáze II (Jablonka-Shariff a Olson, 1998). V diskuzi svých výsledků vycházely z informace, ţe cGMP je lokalizována v granulózních buňkách potkaního vaječníku a v několika pracech bylo popsáno, ţe je zapojena do znovuzahájení meiózy u potkanů a křečků a ţe pro znovuzahájení meiózy je nutné zvýšení hladiny cGMP (Tornell et al., 1984, Hubbard a Price., 1988). V mnoha dalších pracech ovšem bylo naopak ukázáno, ţe pro výstup z meiotického bloku je nutné sníţení hladiny cGMP (Ratner et al., 1976, Hubbard a Terranova., 1982, Tornell et al., 1990, Vaccari et al., 2009). Inhibiční vliv NO na meiotické zrání Podle Sela-Abramovich et al., (2008), je pro znovuzahájení meiózy je nutný pokles NO v kumulárních buňkách. V této práci byl sledován vliv NO při kultivaci celých folikulů potkanů s LH. Úloha NO můţe být úzce spojena s produkcí NO v kumulárních buňkách odkud se NO můţe dostávat do oocytu a hrát tak roli při ovulaci a výstupu z prvního meiotického bloku. Bylo prokázáno, ţe NO inhibuje aktivaci MAPK v granulózních buňkách vyvolanou LH u potkanů. NO také brání přerušení mezibuněčných spojů při ovulaci (Sela-Abramovich et al., 2008). Dále bylo popsáno, ţe NO můţe působit na aktivitu MAPK pomocí adenylyl cyklázy (Tranguch et al., 2003) nebo přes utváření cGMP (Ingram et al., 2000). Sela-Abramovich et al. 2008, popisují, ţe NO můţe aktivovat sGC a zvyšovat produkci cGMP a je moţné, ţe pokles cGMP při ošetření LH umoţňuje aktivaci MAPK v granulósních buňkách. Ve své práci navrhli následující model působení NO po ošetření potkaních folikulů LH: Po stimulaci LH klesne hladina NO a sníţí se aktivita sGC a tím také hladina cGMP. To vede k aktivaci RAF1, MAP2K1 a MAPK a postupnému narušení mezibuněčných spojů. Přerušením mezibuněčných spojů se zabrání migraci molekul cAMP do oocytu. Sníţení koncentrace cGMP můţe vést také k odstranění inhibičního efektu cGMP na proteindiesterázy a tyto aktivní proteindiesterázy dále sniţují hladinu cAMP v oocytu (Sela-Abramovich et al., 35

2008). Kaskáda oxidu dusaného navrţená těmito autory je znázorněna na obrázku.

Obr. 12.: Model kaskády oxidu dusnatého, podle Sela-Abramovich et al., (2008). Tento tým později navrhl další moţný mechanismus zapojení NO produkovaného iNOS v kumulárních buňkách do znovuzahájení zrání. Donor NO SNAP blokoval proteindiesterázu PDE3A a inhibice iNOS vedla naopak k aktivaci PDE3A u folikulů vystavených působení LH. Na tomto modelu bylo ukázáno, ţe sníţená hladina NO má vliv aţ po LH vlně a spolu s přechodným zvýšením hladiny cAMP v konečném důsledku sniţuje hladinu cAMP. Tito autoři tudíţ navrhují, ţe NO je nezbytný pro udrţení meiotického bloku. Navrhované schéma je znázorněno na obrázku 13 (Edry a Dekel, 2009). Tyto výsledky jsou podobné výsledkům Nakamury et al. (2002), který popisuje, ţe pro GVBD je nutné sníţení koncentrace NO produkovaného iNOS kumulárními buňkami po ošetření hCG.

Obr. 13.: Model kaskády oxidu dusnatého podle Edry a Dekel (2009). Také u prasete bylo popsáno, ţe se hladina NO sniţuje po hormonálním ošetření gonadotropními hormony. U prasete byla ovšem sledována hladina NO produkovaného eNOS izoformou v oocytu na rozdíl od studie Sela-Abramovich et al. (2008), kde byla sledována koncentrace NO produkovaného iNOS v kumulárních buňkách oocytů potkanů. Produkce NO v oocytu prasete ovšem nebyla sníţena v přítomnosti LH, ale naopak byla 36

sníţena v přítomnosti FSH. V této práci bylo také ukázáno, ţe sníţení hladiny NO nezávisí na hladině mRNA eNOS a proteinu eNOS. NO donor (SNAP) potlačil expresi LH receptorů po ošetření gonadotropiny (Hattori et al., 2001). Model zapojení NO v savčím oocytu navrhl také Zhang et al., 2009. Podle tohoto modelu NO produkovaný kumulárními buňkami zvyšuje hladinu GC a cGMP které přes proteinkinázu G působí tak ţe inhibuje znovuzahájení zrání (inhibuje MAPK). Kdeţto sníţení hladiny NO po LH hladině se účastní znovuzahájení zrání.

Obr. 14.: Model zapojení NO v kaskádě vedoucí ke GVBD podle Zhang et al. (2009) V oocytech skotu vyšší koncentrace NO pravděpodobně nepůsobí přes kaskádu cGMP. Donor NO (SNP 500 μm) zvýšil hladinu cGMP jiţ po 3 hodinách kultivace, ovšem inhibitory rozpustné guanylát cyklázy (sGC) a protein kinázy G tento efekt nezvrátily. V této studii bylo navrţeno, ţe inhibiční efekt vyšších koncentrací NO nepůsobí přes kaskádu cGMP/PKG u skotu (Bilodeau-Goeseels., 2007). Současné znalosti o působení NO v oocytu prasete jsou stále nekompletní. Zejména není stále známo, jakou roli hrají NOS u rostoucích oocytů, a to ani u laboratorních hlodavců. Otázkou je, zda NO syntázy ovlivňují pouze meiotickou kompetenci plně kompetentních oocytů, jak působí na přechod z GV do MI a MII fáze. Stále není známo, zda má NO vliv na znovuzahájení meiotického zrání rostoucích oocytů a zda bychom nemohli pomocí NO donorů zvýšit meiotickou kompetenci těchto oocytů.

37

2 Cíl práce: Cílem práce bylo ověřit hypotézu, podle které jsou syntáza oxidu dusnatého (NOS) a její produkt oxid dusnatý (NO) zapojeny do řízení procesu zisku meiotické kompetence a růstu oocytů. V této práci bylo sledováno ovlivnění NO-dependentní kaskády pomocí inhibitorů NOS a donoru NO u oocytů s plnou meiotickou kompetencí a u oocytů rostoucích.

38

3 Materiál a metody Odběr vaječníků Prasečí vaječníky byly získány na jatkách z prasniček v neznámém stádiu estrálního cyklu. Vaječníky byly během jedné hodiny po poraţení transportovány do laboratoře v roztoku 0,9% chloridu sodného o teplotě 39°C. Zisk rostoucích oocytů, oocytů s ukončeným růstem a jejich kultivace Rostoucí oocyty byly získávány z folikulů menších neţ 2 mm z tenkých pruhů kůry vaječníku. Pruhy tkáně vaječníku byly přemístěny do Petriho misky o průměru 3.5 cm (Nunc, Roskilde, Dánsko) s modifikovaným kultivačním médiem M199 (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Skotsko) obsahujícím hydrogenuhličitan sodný (0.039 ml na 1 ml média), laktát vápenatý (0.6 mg/ml), pyruvát sodný (0.25 mg/ml), gentamicin sulfát (0.025 mg/ml), HEPES (1.5 mg/ml), 13.5 IU eCG : 6.6 IU hCG/ml (P.G. 600, Intervet Boxmeer, Holandsko) and 10% bovinní fetální sérum (GibcoBRL, Life Technologies, Karlsruhe, Německo). Oocyty byly uvolňovány z folikulů za pouţití jehly 25G protrţením folikulární stěny. Získané rostoucí oocyty byly pomocí okulárového mikrometru na mikroskopu rozděleny podle velikosti vnitřního průměru, tj. bez vrstvy zona pellucida, do třech skupin: 80–89 μm, 90–99 μm a 100–110 μm. Oocyty s ukončeným růstem o velikosti vnitřního průměru 120 μm. byly získávány aspirací folikulů velkých 2-5 mm pomocí jehly 20G. Pro další experimenty byly vybírány pouze oocyty s nepoškozenou cytoplazmou a celistvým obalem z granulózních, popřípadě kumulárních buněk. Před kultivací byly všechny oocyty třikrát promyty v kultivačním médiu M199. Oocyty byly kultivovány při 39°C a 5% CO2 v Petriho miskách obsahujících 3 ml nebo ve čtyřdůlkových miskách s 1ml modifikovaného média M199 s přídavkem PG 600. Oocyty byly kultivovány buď v čistém médiu, nebo s přídavkem inhibitoru nebo donoru, podle experimentálního schématu. Hodnocení stádia meiotického zrání oocytů Po kultivaci byly oocyty zbaveny okolních buněk opakovaným pipetováním skrz úzkostěnnou skleněnou pipetu. Poté byly umístěny na podloţní skla a fixovány octovou kyselinou a alkoholem (1:3, v:v) po dobu nejméně 24 hod a poté byly barveny 1 % 39

orceinem. Oocyty byly hodnoceny pomocí mikroskopu s fázovým kontrastem. Stádium meiotického zrání oocytů bylo hodnoceno podle kritérií publikovaných Motlíkem a Fulkou (1986). Oocyty s kompaktní jadernou membránou byly hodnoceny jako oocyty stádia GV. Při přítomnosti typického shluku chromatinu byly hodnoceny jako stádium pozdní diakineze (LD). Jako MI oocyty byly zařazeny oocyty s přítomností metafázního vřetena. Při přítomnosti metafázázního vřetena a pólového tělíska, byly oocyty zařazeny do stádia MII. Jako aktivované byly hodnoceny oocyty v pronukleárním stádiu s viditelným vyděleným pólovým tělískem nebo 2 – 4 buněčná embrya. Ostatní oocyty s netypickým uspořádáním chromozómů byly hodnoceny jako atypické.

40

4 Experimentální schéma Experiment 1. Cílem tohoto experimentu bylo ověřit meiotickou kompetenci oocytů v našich laboratorních podmínkách. Získané rostoucí oocyty byly rozděleny podle velikosti vnitřního průměru do tří skupin (80–89 μm, 90–99 μm a 100–110 μm), čtvrtou skupinu tvořily oocyty s ukončenou růstovou fází (120 μm). Po 48-hodinové kultivaci v čistém modifikovaném médiu M199 byly oocyty zbaveny okolních buněk, fixovány a bylo hodnoceno stádium meiotického zrání.

Experiment 2. V tomto experimentu byl ověřován účinek inhibitorů NOS na růstovou periodu a meiotickou kompetenci oocytu prasete a zjišťovali jsme, jak jsou růst a meiotická kompetence ovlivněny nedostatkem oxidu dusnatého, jeţ je způsoben aplikací inhibitorů NOS. Rostoucí oocyty bez meiotické kompetence (menší neţ 100 μm), s částečnou meiotickou kompetencí (100–110 μm) a oocyty s ukončeným růstem (120 μm) byly kultivovány 48 hod v modifikovaném médiu M199 s přídavkem iNOS specifického inhibitoru aminoguanidinu (AG, Sigma Aldrich, Německo) anebo s nespecifickým NOS inhibitorem L-NAME (Nω-nitro-L-arginin methyl ester, Sigma Aldrich, Německo), který inhibuje NOS izoformy, nejvyšší specificitu má však k eNOS izoformě. Inhibitory byly pouţity v koncentraci 10 mM, 7,5 mM; 5 mM a 2,5 mM. Jako kontrola toxicity L-NAME byl pouţit jeho D-neúčinný konformer (Nω-nitro-D-arginine methyl ester, Sigma Aldrich, Německo). Vzhledem k tomu, ţe aminoguanidin, na rozdíl od L-NAME, nemá D neúčinný konformer, byla provedena reverze pro vyloučení moţného toxického působení inhibitoru. Oocyty byly nejprve kultivovány 48 hodin s nejvyšší koncentrací inhibitoru a poté 24 hodin v čistém médiu. Dále jsme zkoumali, jak nedostatek oxidu dusnatého způsobený NOS inhibitorem ovlivňuje u oocytů s jiţ ukončenou růstovou periodou přechod mezi první a druhou meiotickou metafází. Oocyty s ukončeným růstem (120 μm) byly nejprve kultivovány 24 hodin v čistém modifikovaném médiu M199 a poté 24 hod v médiu s přídavkem 10

41

mM aminoguanidinu. Kontrola byla po 24 hod kultivace v čistém médiu přenesena do nové Petriho misky s čistým médiem pro vyloučení vlivu mechanického poškození. Po kultivaci byly oocyty zbaveny okolních buněk, fixovány a bylo hodnoceno stádium meiotického zrání. Inhibitor byl v médiu rozpuštěn 30 minut před kultivací oocytů.

Experiment 3. Ve třetím experimentu jsme zkoumali, jak ovlivňuje meiotickou kompetenci a růstovou periodu oocytu NO dodaný do kultivačního systému externě formou NO donoru. Rostoucí oocyty (80–89 μm, 90–99 μm a 100–110 μm) a oocyty s ukončeným růstem (120 μm) byly kultivovány 48 hod v modifikovaném médiu M199 s donorem NO SNAP (S-nitroso-N-acetylpenicillamine, Alexis, Německo) v koncentraci 2 mM; 0,1 a 0,03 mM. Donor NO byl v médiu rozpuštěn 30 minut před kultivací oocytů. Po kultivaci byly oocyty zbaveny okolních buněk, fixovány a bylo hodnoceno stádium meiotického zrání.

Experiment 4. V dalším experimentu jsme zjišťovali, zda můţe být nedostatek NO způsobený inhibitorem NOS zvrácen dodáním NO formou donoru do in vitro kultivačního prostředí. Rostoucí oocyty (80–89 μm, 90–99 μm a 100–110 μm) a oocyty s ukončeným růstem (120 μm) byly kultivovány 48 hod v modifikovaném médiu M199 s přídavkem nejniţší účinné dávky aminoguanidinu (5mM) společně s různou koncentrací NO donoru SNAP (2mM, 1mM, 0,5 mM, 0,25 mM a 0,1 mM). Byla hledána účinná koncentrace donoru pro zvrácení účinku inhibitoru. Inhibitor i donor byly v médiu rozpuštěny 30 minut před kultivací oocytů. Po kultivaci byly oocyty zbaveny okolních buněk, fixovány a bylo hodnoceno stádium jejich meiotického zrání. Statistická analýza Kaţdá experimentální skupina obsahovala celkem 120 oocytů. Všechny experimenty byly 4x opakovány. Data byla podrobena analýze rozptylu s vyuţitím programu Statistica verze 6.0. Rozdíly mezi skupinami oocytů byly podrobněji hodnoceny pomocí Tukeyho HSD testu. Hodnoty P < 0,05 byly povaţovány za statisticky významné. 42

5 Výsledky Experiment 1. Ověření meiotické kompetence oocytů. Cílem prvního experimentu bylo ověřit meiotickou kompetenci oocytů v našich laboratorních podmínkách. V našich kultivačních podmínkách jsou skupiny oocytů s vnitřním průměrem 80-89 a 90-99 µm zcela meioticky nekompetentní. Po 48 hodinové kultivaci v čistém médiu byla většina těchto oocytů zastavena ve stádiu GV a oocyty nebyly schopny prolomit první meiotický blok a znovuzahájit meiotické zrání. Skupina oocytů s vnitřním průměrem 100110 µm zahrnovala oocyty s jiţ částečně vyvinutou meiotickou kompetencí. Většina těchto oocytů během 48 hodin znovuzahájila meiózu, jejich jádro prošlo rozpadem zárodečného váčku a dosáhly stádia první meiotické metafáze. V tomto stádiu byly ovšem oocyty zastaveny a nebyly schopny přejít z první do druhé meiotické metafáze. Oocyty s průměrem 120 µm jsou v našich podmínkách zcela meioticky kompetentní, po 48 hodinách v in vitro kultuře dospějí do stádia druhé meiotické metafáze (Tabulka 1). V tomto experimentu jsme potvrdili, ţe oocyty získávají schopnost projít meiotickým zráním kontinuálně během růstové periody v závislosti na své velikosti. Tabulka 1. Ověření meiotické kompetence prasečích oocytů s různou velikostí vnitřního průměru po 48 hodinách kultivace in vitro % oocytů v daném stádiu meiotického zrání Stádium meiotického zrání

80 – 89 m

90 – 99 m

100 – 110 m

120 m

GV

97.8

2.2 A

88.5

6.0 A

12.8

5.4 B

6.2

6.1 B

MI

1.5

1.0 A

9.9

4.7 A

87.2

5.4 B

6.9

4.8 A

MII

0.7

0.7 A

1.6

1.2 A

0.0

0.0 A

86.9

5.7 B

Statisticky významné rozdíly (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu (mezi sloupci) jsou označeny odlišnými superskripty (A,B) GV – stádium zárodečného váčku, MI- stádium metafáze I, MII – stádium metafáze II,

43

Experiment 2: Vliv inhibice NOS na meiotickou kompetenci oocytů Zjišťovali jsme, jak na oocyty s různým stupněm meiotické kompetence působí nedostatek NO. Pro inhibici NOS jsme pouţili iNOS specifický inhibitor – aminoguanidin (AG) a inhibitor všech izoforem NOS L-NAME. Zjišťovali jsme, jak na oocyty bude působit zvyšující se koncentrace inhibitorů. Oba inhibitory v koncentraci 10 mM, 7,5 mM a 5 mM narušovaly meiotické zrání rostoucích oocytů s částečnou meiotickou kompetencí o velikosti vnitřního průměru 100 - 110 μm a rovněţ oocytů s ukončenou růstovou periodou a plnou meiotickou kompetencí o velikosti 120 μm (graf 1, 2, 3, 4). U inhibitoru AG jsme stanovili nejniţší účinnou koncentraci 5 mM. Tato koncentrace způsobila, ţe 89,8% částečně kompetentních oocytů zůstalo po 48 hodinové kultivaci zastaveno ve stádiu GV, coţ byl statisticky významný rozdíl oproti kontrolní skupině bez inhibitoru. U plně kompetentních oocytů tato koncentrace působila podobně, 90,2 % oocytů bylo zastaveno ve stádiu GV. Vyšší koncentrace (7,5mM a 10 mM) také inhibovaly znovuzahájení meiózy částečně kompetentních i plně kompetentních oocytů. Mezi koncentracemi 10mM, 7,5 mM a 5 mM nebyl pozorován efekt dávky, všechny tyto koncentrace oocyty plně blokovaly. Koncentrace 2,5 mM AG ovšem neměla na meiotické zrání oocytů s částečnou a plnou meiotickou kompetencí vliv. Částečně kompetentní oocyty dosáhly stádia první meiotické metafáze (91,5%) a oocyty s plnou meiotickou kompetencí stádia druhé meiotické metafáze (91,9%). Ţádný z inhibitorů v koncentraci 10 mM, 7,5mM, 5 mM a 2,5 mM neměl vliv na zrání oocytů bez meiotické kompetence o velikosti 80–89 μm a 90–99 μm. U druhého inhibitoru L-NAME jsme jako nejniţší účinnou koncentraci pro částečně meioticky kompetentní i pro plně meioticky kompetentní oocyty stanovili také 5 mM. Tento inhibitor měl velmi podobný efekt jako AG. Při pouţití koncentrace 5 mM byly oocyty po 48 hodinách kultivace stále zastaveny ve stádiu GV (91,6 % u částečně meioticky kompetentních a 91% u plně kompetentních oocytů). Koncentrace 2,5 mM jiţ neměla na oocyty vliv (90,2% plně kompetentních oocytů dosáhlo druhé meiotické metafáze, 91,9 částečně meioticky kompetentních oocytů dosáhlo stádia první meiotické metafáze). Jako kontrolu toxicity samotného L-NAME jsme pouţili jeho neaktivní konformer D-NAME. Ten ani ve vysokých koncentracích (10 mM) oocyty neovlivnil, tudíţ jsme toxický vliv samotné chemikálie vyloučili. Oocyty zastavené ve stádiu GV 44

po kultivaci s L-NAME vypadaly morfologicky v pořádku a nejevily známky atypických oocytů. Mezi působením iNOS specifického inhibitoru iNOS a NOS inhibitoru L-NAME jsme nezaznamenali významné rozdíly. Také jsme nezaznamenali rozdíly mezi působením na částečně meioticky kompetentní a plně meioticky kompetentní oocyty. Vzhledem k tomu, ţe aminoguanidin nemá, na rozdíl od L-NAME, neúčinný konformer, bylo testováno, zda není pro oocyty toxický pomocí reverze. Částečně meioticky kompetentní oocyty byly nejdříve kultivovány 48 hodin s inhibitorem AG a poté byly přemístěny do čistého média na 24 hodin. Oocyty měly po reverzi aminoguanidinu obnovenou schopnost prolomit první meiotický blok (Graf 5). U částečně meioticky kompetentních oocytů 76,7% oocytů dosáhlo stádia MI. Při kultivaci plně meiotických oocytů reverze způsobila, ţe celkem 39% oocytů dosáhlo stádia MII, tudíţ byl účinek inhibitoru plně nahrazen. Je zajímavé, ţe u 66% oocytů, které dosáhly MII došlo k samovolné partenogenetické aktivaci. Mezi partenogeneticky aktivovanými oocyty byly nalezeny oocyty s prvojádry a 4 buněčná embrya. Celkově měla reverze za následek nárůst podílu partenogeneticky aktivovaných embryí, 26 % oproti 3 % u kontrolní skupiny (Graf 6). Reverze také ovšem způsobila nárůst oocytů ve skupině MI (42%) a oocytů zastavených v GV (18,9%) oproti kontrolní skupině, kultivované 72 hodin.

45

Graf 1. Účinek aminoguanidinu na meiotické zrání oocytů s částečnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro.

Superskript () označuje statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu mezi pokusnou a kontrolní skupinou (například % GV kontrolní skupiny vůči % GV pokusné skupiny). GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafázeII.

Graf 2. Účinek aminoguanidinu (AG) na meiotické zrání oocytů s plnou meiotickou kompetencí (120 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro

Superskript () označuje statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu mezi pokusnou a kontrolní skupinou. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II.

46

Graf 3. Účinek L-NAME a D-NAME na meiotické zrání oocytů s částečnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro.

Graf 4. Účinek L-NAME a D-NAME na meiotické zrání oocytů s plnou meiotickou kompetencí (120 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro.

Superskript () označuje statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu mezi pokusnou a kontrolní skupinou (kontrola 48h). GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II

47

Graf 5. 24-hodinová reverze oocytů s částečnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) a plnou meiotickou kompetencí (120 μm) po 48 hodinové in vitro kultivaci s aminoguanidinem (10 mM).

Graf 6. Účinek aminoguanidinu na přechod plně kompetentních oocytů (120 µm) z první do druhé meiotické metafáze

Superskript () označuje statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu mezi pokusnou a kontrolní skupinou. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, MI – oocyty ve stádiu metafáze

48

I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II, Aktivované – oocyty s viditelnými prvojádry nebo 2 – 4 buněčná embrya.

Vzhledem k tomu, ţe oocyty s částečnou meiotickou kompetencí jsou při 48 hodinové kultivaci zastveny ve stádiu MI, sledovali jsme, jak inhibitory působí na přechod mezi první meiotickou a druhou meiotickou metafází. Tento experiment byl proveden pouze u plně kompetentních oocytů, které jsou schopny dosáhnout druhé meiotické metafáze. Pouţili jsme iNOS inhibitor AG. Zjistili jsme, ţe tento inhibitor působí také na přechod mezi první a druhou meiotickou metafází. Po 24 hodinách kultivace v čistém médiu a následné 24 hodinové kultivaci s 10 mM AG došlo u 46,9% oocytů k zastavení v první meiotické metafázi. Plně kompetentní oocyty měly omezenou schopnost prolomit meiotický blok a dosáhnout stádia metafáze II - tohoto stádia dosáhlo pouze 43,4% oocytů (Graf 7.) Vliv inhibitoru na přechod mezi první a druhou meiotickou metafází není tak silný jako na znovuzahájení meiotického zrání a prolomení prvního meiotického bloku. Pokud jsou oocyty zablokovány 10 mM AG ještě před GVBD, většina z nich zůstane v tomto stádiu, u inhibice po 24 hodinách ovšem polovina oocytů pokračuje ve svém vývoji. Graf 7. Vliv inhibitoru NOS Aminoguanidinu na přechod z MI do MII fáze u oocytů s plnou meiotickou kompetencí

% oocytů v daném stádiu

100

Vliv AG na přechod MI do MII u oocytů s plnou kompetencí 85,7

GV

80

MI

46.9 

60

43.4 

MII

40

atypických

20

14,3 9,2 0

0,5

0

0 Kontrola 48 h

24 h + 24 h 10 mM AG

koncentrace AG Superskript () označuje statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu mezi pokusnou a kontrolní skupinou. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II, atypické oocyty - oocyty s jiným uspořádáním chromozómů

49

Experiment 3: Vliv donoru NO na meiotickou kompetenci oocytů. Zjišťovali jsme, jak růstovou fázi a meiotickou kompetenci oocytů ovlivňuje oxid dusnatý dodaný in vitro z externího zdroje formou NO donoru. A dále pak, zda je donor NO schopen zvrátit inhibiční účinek NOS inhibitoru, aminoguanidinu. Vliv samotného NO donoru na meiotickou kompetenci oocytů U oocytů s částečnou a plnou meiotickou kompetencí došlo po 48 hodinové kultivaci s NO donorem ke sníţení počtu oocytů ve stádiu první a druhé meiotické metafáze (Graf 8,9. Tabulka 2, 3). Při pouţití 2 mM SNAP oocyty po 24 hodinové reverzi v čistém médiu nepokračovaly ve zrání. Pouţitá koncentrace NO donoru narušila ţivotnost oocytů. Stejně jako 2 mM SNAP působila na oocyty také koncentrace 1 mM, která aktivuje oocyty ve stádiu druhé meiotické metafáze ze 68%. Po kultivaci částečně kompetentních oocytů s donorem SNAP (0,03mM – 2 mM) se nezměnilo % oocytů ve stádiu GV. U všech těchto koncentrací nebyly nalezeny ţádné oocyty ve stádiu GVBD, zatímco se zvýšil počet oocytů ve stádiu pozdní diakineze. Při pouţití 2 mM SNAP pouze 12,5 % oocytů dosáhlo stádia MI a 79,2 % oocytů bylo zastaveno ve stádiu pozdní diakineze. U donoru SNAP jsme u oocytů s částečnou meiotickou kompetencí pozorovali závislost působení na koncentraci – se sniţující se koncentrací donoru byl negativní efekt na oocyty niţší. Při pouţití 0,1 mM SNAP bylo nalezeno 23,3 % ve stádiu MI a při pouţití niţší koncentrace (0,03 mM) bylo 46,7 % oocytů nalezeno ve stádiu MI. Se sniţující se koncentrací se sniţoval počet oocytů zablokovaných ve stádiu pozdní diakineze. Při koncentraci 2mM SNAP to bylo 79,2% oocytů, při 0,1 mM 63,6% oocytů a při 0,03 mM jiţ jen 36.1 % oocytů.

50

Graf 8. Efekt závislosti působení NO donoru SNAP na jeho koncentraci u částečně meioticky kompetentních oocytů (data a statistické rozdíly jsou uvedeny v tabulce 2).

Vliv donoru NO SNAP na meiotické zrání oocytů s částečnou meiotickou kompetencí 100%

4,9

4,9

23,3

80%

% oocytů v určitém stádiu

12,5

46,7 60%

MII

91,9 79,2 40%

63,6

MI PD

36,1

GV

20% 8,1

10,7

8,2

8,3

Kontrola 0 mM

0.03 mM

0.1 mM

2 mM

0%

koncentrace SNAP

Tabulka 2. Vliv donoru NO SNAP na meiotické zrání oocytů s částečnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro. koncentrace SNAP

Kontrola 0 mM

0.03 mM

0.1 mM

2 mM

GV

8.1 ± 8.34 A

10.7 ± 2.8 A

8.2 ± 1.9 A

8.3 ± 14.4A

GVBD

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

PD

0.0 ± 0.0 A

36.1 ± 2.6 C

63.6 ± 8.6 B

79.2 ±36.0 B

MI

91.9 ± 8.3 A

46.7 ± 8.7 C

23.3 ± 3.2 B

12.5 ± 1.7 B

MII

0.0 ± 0.0 A

4.9 ± 0.5 A

4.9 ± 3.6 A

0.0 ± 0.0 A

Statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu meiotického zrání mezi jednotlivými koncentracemi donoru NO SNAP (mezi sloupci) jsou označeny odlišnými písmennými superskripty. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, GVBD – rozpad zárodečného váčku, PD – pozdní diakineze, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II.

51

Na oocyty s ukončeným růstem působil donor NO SNAP mírně odlišně (graf 9. Tabulka 3). Nejvyšší pouţitá koncentrace 2mM SNAP a 0.1 mM způsobovaly shodně nárůst počtu oocytů ve stádiu pozdní diakineze na 75 %. Většina oocytů tudíţ prošla GVBD, ale záhy byla většina z nich zastavena. Ţádné oocyty neprošly přez stádium pozdní diakineze (u částečně meioticky kompetentních oocytů dosáhlo 23,3% MI stádia). Oproti kontrolní skupině se zvýšil se podíl oocytů zastavených v GV (25%). U nejniţší koncentrace 0,03 mM pouze 14% oocytů dosáhlo MII stádia a 11,5 % bylo zastaveno v MI stádiu. Efekt donoru tu byl silnější neţ u rostoucích částečně kompetentních oocytů kde polovina oocytů dosáhla MI stádia. U plně kompetentních oocytů nebyl pozorován tak významný efekt závislosti účinku donoru na jeho koncentraci. Na oocyty bez meiotické kompetence neměl externě dodaný NO (2 mM, 0,1mM a 0,03 mM SNAP) do kultivačního systému vliv.

52

Graf 9–vliv různých koncentrací NO donoru SNAP na u plně meioticky kompetentních oocytů (data a statistické rozdíly jsou uvedeny v tabulce 3).

Vliv donoru NO SNAP na meiotické zrání oocytů s plnou meiotickou kompetencí 100%

0

0

0

75

75

5,1 14,1

80%

% oocytů v určitém stádiu

11,5 60% 92,96

MII MI

40%

67,9

PD GV

20%

0%

Atyp

2,3

4,7

25

25

0,1 mM

2 mM

1,3

Kontrola 0 mM

0,03 mM

Koncentrace SNAP GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, GVBD – rozpad zárodečného váčku, PD – pozdní diakineze, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II. Atyp – oocyty s atypickým uspořádáním chromozómů.

Tabulka 3. Vliv donoru NO SNAP na meiotické zrání oocytů s plnou meiotickou kompetencí (120 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro. koncentrace SNAP

Kontrola 0 mM

0.03 mM

0.1 mM

2 mM

GV

2.3 ± 1.5 A

1.3 ± 0.5 A

25.0 ± 2.3 B

25.0 ± 2.3 B

LD

0.0 ± 0.0 A

67.9 ± 10.6 B

75.0 ± 20.2 B

75.0 ± 9.0 B

MI

4.7 ± 4.0 A

11.5 ± 2.6 A

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

MII

92.96 ± 6.3 A

14.1 ± 1.5 B

0.0 ± 0.0 B

0.0 ± 0.0B

Atyp

0.0 ± 0.0 A

5.1 ± 4.0 A

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0A

Statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu meiotického zrání mezi jednotlivými koncentracemi donoru NO SNAP (mezi sloupci) jsou označeny odlišnými písmennými superskripty. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, GVBD – rozpad zárodečného váčku, PD – pozdní diakineze, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II.

53

Vliv kombinace NOS inhibitoru a NO donoru na meiotickou kompetenci oocytů Pro sledování reverze inhibice pomocí donorů jsme jako inhibitor pouţili nejniţší účinnou koncentraci AG – 5 mM. Zjistili jsme, ţe jak u částečně meioticky kompetentních oocytů, tak také oocytů s plnou meiotickou kompetencí dokáţe NO donor částečně zvrátit účinek NOS inhibitoru. Jak oocyty s částečnou meiotickou kompetencí, však dosáhly pouze první meiotické metafáze a plně meioticky kompetentní oocyty měly pouze omezenou schopnost dosáhnout MII. Pro rostoucí oocyty s částečnou meiotickou kompetencí se pro reverzi ukázala být nejlepší koncentrace 0,1 mM SNAP, ve které bylo nejvíce oocytů pozorováno ve stádiu MI (47%), a zároveň zde bylo nalezeno nejméně oocytů zastavených ve stádiu GV (13,8%) (graf 10. Tabulka 4). Se zvyšující se koncentrací SNAP, se zvyšoval podíl oocytů zastavených ve stádiu GV nebo PD. Při pouţití koncentrace 1mM a výše, jiţ minimum oocytů dosáhlo stádia MI, a pouze polovina oocytů prošla GVBD a byly zastaveny ve stádiu PD. Nízká koncentrace SNAP (0,03 mM) jiţ neovlivnila počet oocytů zastavených v GV oproti samotnému inhibitoru.

54

Graf 10. Vliv kombinace inhibitoru NOS a donoru NO na oocyty s částečnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro vitro (data a statistické rozdíly jsou uvedeny v tabulce 4).

Vliv NOS inhibitoru (5 mM AG) + donoru NO SNAP na meiotické zrání oocytů s částečnou kompetencí 100%

7,88

8,2

3 9,1

4,3

8,2

80%

39,6

47,2

% oocytů v určitém stádiu

4,5

60%

59,3

MII

80,77 89,8

40%

MI

89,8

15,7 55,8

19

20%

0%

PD

0 mM Kontrola

GV

28,6

4,04 6,86

GVBD

13,8 0 mM

0,03 mM

0 mM AG

0,1mM

1 mM

2 mM

koncentrace SNAP

Tabulka 4. Vliv kombinace inhibitoru NOS a donoru NO na oocyty s částečnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro vitro. AG

0 mM AG

5 mM AG

SNAP

Kontrola

0 mM

0,03 mM

0.1mM

1 mM

2 mM

GV

6.86 ± 5.1 A

89.8 ±2.1 B

89.8 ±2.1 B

13.8 ± 1.2 A

28.6 ± 15.4 C

55.8 ± 1.8 B

GVBD

0.0 ± 0.0 A

0.0 ±0.0 A

0.0 ±0.0 A

19.0 ± 5.0 B

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

PD

4.04 ± 5.1 A

8.2 ±2.6 A

8.2 ±2.6 A

15.7 ± 6.6 A

59.3 ± 35.9 B

39.6 ± 4.6 B

MI

80.77 ± 11.0 A

0.0 ± 0.0 B

0.0 ± 0.0 B

47.2 ± 17.5 C

9.1 ± 15.7 B

4.5 ± 0.4 B

MII

7.88 ± 9.8 A

0,0 ± 0,0 A

0.0 ± 0.0 A

4.3 ± 1.0 A

3.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

Statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu meiotického zrání mezi jednotlivými koncentracemi donoru NO SNAP (mezi sloupci) jsou označeny odlišnými písmennými superskripty. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, GVBD – rozpad zárodečného váčku, LD – pozdní diakineze, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II.

55

U plně kompetentních oocytů byla situace mírně odlišná (graf 11. Tabulka 5). Při nízké koncentraci 0,03 mM SNAP, která na oocyty s částečnou meiotickou kompetencí ještě nepůsobila, došlo k významnému zvýšení počtu oocytů ve skupině MI (36%), oproti samotnému inhibitoru (5,9%). V této skupině nebyly nalezeny oocyty zablokované v GV, ovšem bylo zde pozorováno více atypických oocytů (31,6 %). Optimální koncentrace (0,1 mM SNAP) pro oocyty s částečnou meiotickou kompetencí měla podobný efekt i na oocyty s plnou meiotickou kompetencí (57,4% oocytů bylo nalezeno ve stádiu MI). Celkově však nebyl významný rozdíl mezi počtem oocytů, které prošly stádiem MI (MI+MII oocyty – 68,8 a 60,8 %) mezi skupinou s 0,1 mM a 1mM SNAP. U koncentrace 1mM však bylo dosaţeno plné reverze (MII stádia) u 34,8% oocytů na rozdíl od niţší koncentrace 0,1 mM, kde bylo jen 11,4% oocytů v MII stádiu. U této skupiny (1 mM) se objevilo také vyšší procento atypických oocytů (34,8%), které se u oocytů s částečnou meiotickou kompetencí neobjevovaly. Vysoká koncentrace 2 mM SNAP způsobila, ţe oocyty sice většinou prošly GVBD, ale byly zastaveny ve stádiu PD (73,3 % oocytů). Výsledky významných koncentrací SNAP jsou uvedeny v tabulce 5.

56

Graf 11.

Vliv kombinace inhibitoru NOS a donoru NO na oocyty s plnou meiotickou

kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro vitro (data a statistické rozdíly jsou uvedeny v tabulce 5).

Vliv donoru inhibitoru 5 mM AG + donoru NO SNAP na meiotické zrání oocytů s plnou kompetencí 100%

3,98 5,88

13,8 31,6

% oocytů v určitém stádiu

80%

11,4

34,8 73,3

10,5

60% 93,7

57,4

90,15

40%

Atypických MII

34,8

36,8

MI PD

20%

3,6

26,1

13,8

0 4,3

0,1mM

1 mM

21,1 0%

6,3 Kontrola 0 mM AG

0 mM

0,03 mM

26,7

GV

2 mM

SNAP

Tabulka 5. Vliv kombinace inhibitoru NOS a donoru NO na oocyty s plnou meiotickou kompetencí (100 – 110 μm) kultivovaných 48 hodin in vitro vitro.

AG

0 mM AG

SNAP

Kontrola

5 mM AG 0 mM

0,03 mM

0.1mM

1 mM

2 mM

GV

0.0 ± 0.0 A

90.15 ± 5.7 C 0.0 ± 0.0 A

13.8 ± 1.2A

4.3 ± 0.5 A

26.7 ± 2.1 B

PD

0.0 ± 0.0 A

0.0 ± 0.0 A

21.1 ± 6.3 C

3.6 ± 0.3 A

0.0 ± 0.0 A

73.3 ± 13.5 B

MI

6.3 ± 0.3 A

5.88 ± 1.3 A

36.8 ± 8.7 C

57.4 ± 6.2 B 26.1 ± 6.2 C

0.0 ± 0.0 A

MII

93.7 ± 4.5 A

3.98 ± 0.5 B

10.5 ± 1.7 B

11.4 ± 2.3 B 34.8 ± 7.8 C

0.0 ± 0.0 B

0.0 ± 0.0 A

31.6 ± 12.8 B 13.8 ± 2.9 A 34.8 ± 12.5 B 0.0 ± 0.0 A

Atypických 0.0 ± 0.0 A

Statisticky významný rozdíl (P < 0,05) v procentech oocytů v daném stádiu meiotického zrání mezi jednotlivými koncentracemi donoru NO SNAP (mezi sloupci) jsou označeny odlišnými písmennými superskripty. GV – oocyty ve stádiu zárodečného váčku, GVBD – rozpad zárodečného váčku, LD – pozdní diakineze, MI – oocyty ve stádiu metafáze I, MII – oocyty ve stádiu metafáze II.

57

6 Diskuze V této práci jsme pomocí inhibitorů NOS a donorů NO potvrdili roli oxidu dusnatého během procesu nabývání meiotické kompetence u oocytu prasete. Před vlastním sledováním účinku inhibitorů NOS na oocyty byla nejprve ověřena meiotická kompetence oocytů v našich laboratorních podmínkách. Výsledky ukázaly, ţe v našich kultivačních podmínkách jsou skupiny oocytů s vnitřním průměrem 80 – 89 µm a 90 – 99 µm zcela meioticky nekompetentní, skupina oocytů s vnitřním průměrem 100 – 110 µm zahrnuje oocyty s jiţ částečně vyvinutou meiotickou kompetencí a oocyty s průměrem 120 µm jsou zcela meioticky kompetentní. Potvrdili jsme, ţe oocyty získávají meiotickou kompetenci graduálně během růstové fáze. V dalších experimentech jsme sledovali účinek iNOS specifického inhibitoru Aminoguanidinu a nespecifického NOS inhibitoru L-NAME na meiotickou kompetenci oocytů. Oba pouţité inhibitory, aminoguanidin i L-NAME, blokovaly meiotické zrání jak oocytů s částečnou meiotickou kompetencí, tak i oocytů plně meioticky kompetentních s ukončenou růstovou periodou. Jejich účinek byl reverzibilní a nezaznamenali jsme rozdíly mezi inhibitory a mezi částečně a plně kompetentními oocyty. Po aplikaci inhibitorů byl narušen rozpad zárodečného váčku oocytů, coţ ukazuje na nezbytnost NO pro samotný počátek meiotického zrání. Pro meiotické zrání oocytů prasete se jeví jako klíčová regulace pomocí iNOS izoformy vzhledem k tomu, ţe po jejím vyblokování je narušen proces zrání podobně, jako po aplikaci neselektivních inhibitorů blokujících všechny NOS současně. U skotu bylo zjištěno, ţe po inhibici iNOS jsou schopny ostatní izoformy částečně nahradit produkci NO (Matta et al., 2009), u prasete se ale zdá, ţe konstitutivní izoformy NOS nejsou schopny produkcí NO tuto izoformu nahradit. Důvodem celkové inhibice můţe být částečný efekt iNOS specifického inhibitoru také na eNOS a nNOS izoformu. Vysvětlením můţe být také fakt, ţe produkce NO prostřednictvím iNOS je výrazně vyšší a důvodem můţe být rovněţ odlišná regulace iNOS a konstitutivních NOS, např. vápníku a kalmodulinu (Lamas et al., 1992; Ignarro et al., 1999). Blokáda NOS u plně kompetentních oocytů ve stádiu zárodečného váčku zabraňuje oocytům dosáhnout druhé meiotické metafáze a tento vliv inhibitorů NOS je patrný také 58

pokud dojde k zablokování plně kompetentních oocytů aţ ve stádiu první meiotické metafáze. Mnohem účinnější však byla inhibice zrání oocytů Aminoguanidinem, pokud byl přidán k oocytům uţ ve stádiu zárodečného váčku. Oocyty prasete pravděpodobně v době přechodu mezi metafázemi jiţ nepotřebují tak velká mnoţství NO jako oocyty ve stádiu zárodečného váčku, anebo jsou k jeho účinkům mnohem méně vnímavé, či jsou během přechodu mezi metafázemi regulovány NO vznikajícím z jiné neţ indukovatelné izoformy NOS. Naše zjištění, ţe inhibitor Aminoguanidin blokuje meiotické zrání prasečích oocytů se shoduje s výsledky, kdy byl tento inhibitor pouţit u potkanů, myší, prasat a skotu (Nakamura et al., 2002; Bu et al., 2003; Tao et al., 2004, 2005, BilodeauGoeseels., 2007, Matta et al., 2009). U skotu a u myší bylo také zjištěno, ţe inhibitor AG blokuje jiţ GVBD (Bildoeau et al., 1993, Huo et al., 2005), i kdyţ později Matta et al., 2009 popisuje, ţe u skotu tento inhibitor blokuje aţ přechod mezi MI a MII fází a to i při pouţití vysokých dávek AG. Co se týká druhého inhibitoru L-NAME, v naší práci tento inhibitor blokoval jiţ GVBD. V literatuře se výsledky při pouţití tohoto inhibitoru se liší. Například u skotu tento inhibitor pouze mírně sniţoval % oocytů v MII, i kdyţ byla pouţita velmi nízká koncentrace (Schwarz et al., 2010). U prasete nízké koncentrace 1 mM L-NAME blokovaly vyloučení prvního pólového tělíska při kultivaci oocytů s hypoxanthinem (Bu et al., 2003, Tao et al., 2005). U myší bylo popsáno, ţe 1 mM L-NAME blokuje jiţ znovuzahájení meiotického zrání oocytů (Sengoku et al., 2001), i kdyţ v předchozích pracech bylo popsáno, ţe inhibitor L-NAME blokuje aţ přechod mezi MI a MII fází u myší (Jablonka-Shariff a Olson., 2000). Námi pozorované změny v meiotickém zrání oocytů po aplikaci inhibitorů NOS se podobaly těm, ke kterým podle literatury dochází při kultivací oocytů získaných od zvířat s vyblokovaným genem pro některou z izoforem NOS (Jablonka-Shariff a Olson, 1997; 1998). Podle literatury můţe být částečným důvodem blokování meiotického zrání inhibice expanze kumulárních buněk. Bylo zjištěno, ţe iNOS inhibitor AG sniţuje syntézu kyseliny hyaluronové, která je nutná právě pro expanzi kumulu. Pokud nedochází k expanzi kumulu a přerušení spojů gap-junctions mezi kumulárními buňkami a oocytem, oocyt je blokován látkami které syntetizují kumulární buňky (Rubbo et al., 1996). U prasete bylo zjištěno, ţe oba inhibitory AG i L-NAME blokují expanzi kumulárních buněk (Tao et al., 2005). V naší práci jsme expanzi kumulárních buněk neměřili, po kultivaci s inhibitory kumulární buňky zůstávaly přisedlé na oocytu, takţe k expanzi kumulu pravděpodobně nedošlo ani u prasečích ooocytů. Tyto práce sledující expanzi 59

kumulu nadále pokračují. Můţeme předpokládat, ţe NO je v určité nízké koncentraci důleţitý také pro omezení poškození membrán kumulárních buněk peroxidací. Jiţ koncentrace 1 mM Aminoguanidinu ovlivňují integritu membrán kumulárních buněk u skotu, zvyšují se koncentrace NO3-,NO2-a tím pádem je ovlivněna ţivotnost samotných kumulárních buněk (Matta et al., 2009). Naše ošetření inhibitory však není pro oocyty toxické, protoţe po reverzi a také kultivaci s D neúčinným konformerem jsou schopny pokračovat ve zrání. Po inhibici oocytů 48 hodin Aminoguanidinem a následné 24 hodinové kultivaci oocytů v čistém médiu došlo ke zvrácení efektu inhibitoru. Částečně meioticky kompetentní oocyty dosáhly stádia metafáze I. U plně kompetentních oocytů 42 % oocytů dosáhlo stádia metafáze I a 39% oocytů dokonce za tuto krátkou dobu dosáhlo vyššího stádia neţ MI. Zajímavé je, ţe pouze 13% oocytů zůstalo zastaveno v MII fázi a 26% oocytů nebylo zastaveno ve druhém meiotickém bloku a prošlo partenogenetickou aktivací, v některých případech byla nalezena aţ 4 buněčná embrya. Pravděpodobně v tomto případě došlo k akceleraci meiotického zrání, kdy inhibitorem sice bylo zastaveno zrání jaderné, cytoplazmatické zrání však mohlo zůstat neovlivněno. Neschopnost oocytů zastavit se ve 2. meiotickém bloku můţe být způsobena narušením rovnováhy koncentrace MPF v cytoplasmě. Takováto meiotická akcelerace byla jiţ u prasečích oocytů pozorována při inhibici proteazómu (Chmelíková et al., 2004). Vzhledem k tomu, ţe aminoguanidin patří mezi kompetitivní inhibitory, je také moţné, ţe se během ošetření oocytů hromadí NOS enzym, kterému chybí substrát a po odmytí inhibitoru se začne produkovat NO ve vyšší míře, která je nezbytná pro aktivaci oocytů. NO také nitrosyluje ryanodinové receptory a jejich stimulace je schopná navodit partenogenetickou aktivaci u zralých oocytů prasete (Petr et al., 2002). Kromě inhibitorů jsme sledovali účinek NO donoru na oocyty s různým stupněm meiotické kompetence. Z experimentů provedených dříve na našem pracovišti bylo známo, ţe pokud se 2 mM SNAP přidají k oocytům ve druhé meiotické metafázi, dochází ze 71 % během deseti hodin k jejich partenogenetické aktivaci (Krejčová et al., 2009). Tato koncentrace donoru byla proto pouţita jako výchozí pro kultivaci oocytů s částečnou meiotickou kompetencí, tak i plnou meiotickou kompetencí a dokončenou růstovou periodou. SNAP je stabilním analogem endogenních S-nitrosothiolů a po penetraci do buňky je z něj oxid dusnatý uvolňován endogenními enzymy a je tedy zdrojem NO in vivo (Yamamoto a Bing, 2000; Megson a Webb, 2000) a z naší předchozí studie (Petr et 60

al., 2008) se jevil jako vhodnější pro ošetření prasečích oocytů neţli SNP, který uvolňuje NO jen na světle a můţe také uvolňovat pro oocyty škodlivé kyanidové ionty (Butler a Glidwell, 1987). Námi pouţitá dávka donoru NO 2 – 0,05 mM SNAP narušovala ţivotnost oocytů, oocyty po 24 hodinové reverzi v čistém médiu nepokračovaly ve zrání. Vysoké koncentrace NO dodané SNP donorem inhibují meiotické zrání oocytů myší, zatímco nízké koncentrace NO donoru zrání stimulují, omezují stárnutí oocytů a stimulují embryonální vývoj (Jablonka-Shariff and Olson, 1998; Sengoku et al., 2001; Bu et al., 2004; Huo et al., 2005; Tao et al., 2004; 2005). U skotu a myší NO donor SNP neblokoval přímo GVBD, ale byl zablokován aţ přechod z MI do MII fáze (Bu et al., 2003). Také v našem případě donor NO SNAP neovlivňoval raná stádia GVBD ale většina oocytů se nacházela ve stádiu pozdní diakineze. Zjistili jsme, ţe v případě oocytu prasete nedokáţe NO donor v nízké koncentraci ovlivnit meiotickou kompetenci oocytů, oocyty s částečnou meiotickou kompetencí nebyly v přítomnosti donoru NO schopny prolomit blok metafáze I. O účincích donorů NO na rostoucí oocyty můţeme v literatuře naleznout pouze výsledky vlivu donorů NO na utváření antra u rostoucích folikulů potkanů. V několika studiích jiţ bylo potvrzeno, ţe se NO účastní apoptózy folikulárních buněk a atrézie folikulů (Sugino et al., 1996, Dimmeler a Zeiher, 1997). Ingram et al., (2000) popsali, ţe NO můţe zasahovat do změn v uspořádání cytoskeletu. Vysoké koncentrace NO mohou narušit správnou konformaci mikrotubulů, například v kumulárních buňkách, coţ můţe ovlivňovat spojení gap junctions. Je známo, ţe donor SNAP způsobuje u nervových buněk rozrušení aktiniových filament, mikrotubulů a jaderné laminy, coţ vede k apoptóze (Bonfoco et al., 1996). V naší práci je negativní vliv vysokých dávek NO na cytoskelet oocytu vysoce pravděpodobný. Chromozómy zůstávají v hrudce tvořící pozdní diakinezi a je moţné, ţe jsou narušeny právě mikrotubuly, které přemísťují chromozómy do metafázové figury. Bylo také zjištěno, ţe NO způsobuje změny v DNA oocytů, které mohou být způsobeny superoxidy a hydrogen peroxidy, které vznikají z velkého mnoţství NO (Goud et al., 2007). Je známo, ţe vysoká mnoţství NO vedou v somatických buňkách ke vzniku toxických reakčních produktů (Messmer et al., 1995), k čemuţ dochází pravděpodobně také v případě oocytu prasete. Naše předchozí experimenty ukázaly, ţe SNAP v 1 mM koncentraci aktivuje oocyty prasete ve druhé meiotické metafázi ze 68% (Petr et al., 2005). Tato koncentrace donoru však působí na oocyty s částečnou meiotickou kompetencí a plnou meiotickou kompetencí 61

toxicky, coţ naznačuje, ţe oocyty jsou zřejmě na počátku své oogeneze k působení NO mnohem více citlivé neţli oocyty na konci svého meiotického zrání, ve stádiu druhé meiotické metafáze. Z literatury je známo, ţe dokud nedojde k přerušení gap junctions, NO z kumulárních buněk inhibuje znovuzahájení zrání tím, ţe inhibuje MAPK (Zhang et al., 2009). Je tedy moţné, ţe dodáním NO do rostoucích oocytů, které jsou stále spojeny s kumulárními buňkami napodobujeme spíše tento proces, a ţe pro zahájení zrání je třeba nejdříve mírný pokles hladiny NO a poté je jiţ přítomnost NO stimulujícím faktorem. Dalším negativním působením námi dodaného NO by mohla být inhibice transkripce vlastních NO-syntáz, nebo vazba na hemové ţelezo v nNOS vedoucí k inhibici syntézy NO, která je známa i z literatury (Griscavage et al. 1994). Inhibice transkripce by u částečně kompetentních oocytů nemusela mít tak velký význam, neboť jsme prokázali, ţe oocyty v tomto stádiu jiţ obsahují velké mnoţství NOS (otázkou je však, zda je dostatečné). Vazba k hemovému ţelezu je však moţná a můţe způsobit zablokování další produkce NO a současně navázání volného NO. V naší předchozí práci jsme prokázali, ţe lokalizace NOS v rostoucích oocytech je přísně daná, a ţe působení NO by mohlo být lokální. Otázkou tedy zůstává, jaké jsou přesné koncentrace NO, jakou hraje roli jeho distribuce a načasování působení včetně moţného pulzního působení v rostoucích oocytech. Naše výsledky potvrzují teorii Bu et al. (2003) o dvojím působení NO v závislosti na jeho koncentraci v buňkách. Dodaný NO můţe být pro rostoucí oocyty nadbytečný a působit toxicky díky vzniku dalších volných radikálů. Rostoucí oocyt nemusí mít ještě nasyntetizovány všechny proteiny účastnící se aktivační dráhy oxidu dusnatého, nebo nejsou tyto systémy aktivovány. Mimo jiné je známo, ţe pro zisk meiotické kompetence jsou nezbytné vápníkové ionty (Lefévre et al., 1997). Dále jsme prokázali, ţe inhibiční působení látek vyvolávajících v oocytech nedostatek NO můţe být u oocytu prasete zvráceno pouţitím NO donoru. Je však třeba pouţít donor ve velmi nízké koncentraci a u částečně nekompetentních oocytů donor nedokázal posunout většinu oocytů za stádium první meiotické metafáze. U oocytů s plnou meiotickou kompetencí do stádia první metafáze dosáhlo asi 26% a do druhé metafáze dosáhlo 35% procent oocytů. Inhibiční efekt AG byl tedy zvrácen pouze částečně. V literatuře nalezneme různé výsledky pouţití kombinace inhibitorů NOS a donorů NO. U myší byl efekt inhibitoru NOS (L-NAME) také zvrácen pouţitím donoru NO (SNP) (Sengoku et al., 2001), i kdyţ v jiné práci mělo shodné ošetření na oocyty 62

negativní efekt, a nebyl zvrácen blokační efekt SNP na oocyty (Bu et al., 2003). U skotu také nízké koncentrace donoru NO SNP nejsou schopny zvrátit efekt inhibitoru iNOS AG (Bilodeau et al. 1993, Matta et al., 2009), zvyšuje se ovšem koncentrace NO3- a NO2(Matta et al., 2009). Z literatury jeznámo, ţe reverze je moţná jen při pouţití určitých dávek donoru NO, a ţe jsou oocyty na větší mnoţství citlivé. V naší práci bylo pro částečnou reverzi působení inhibitoru NO Aminoguanidinu optimální 0.1 mM SNAP pro oocyty s částečnou meiotickou kompetencí a 1 mM pro oocyty s plnou meiotickou kompetencí. Tato vyšší koncentrace 1 mM SNAP u částečně meioticky kompetentních oocytů způsobovala, ţe většina oocytů byla zastavena ve stádiu pozdní diakineze. Výsledky naší práce ukazují, ţe částečně meioticky kompetentní oocyty jsou více citlivé na vyšší koncentrace NO neţ oocyty plně meioticky kompetentní. Celkově lze ovšem říci, ţe pro GVBD a dosaţení MI fáze je u obou typů oocytů potřebná stejná nízká koncentrace NO donoru (0,1 mM SNAP). Důvodů, proč nedojde k plné reverzi inhibice meiotického zrání, můţe být několik. Prvním důvodem můţe být krátká doba uvolňování NO z donoru SNAP, který má poločas rozpadu pouze asi 5 - 6 hodin při 37ºC (Iggnaro et al., 1981). Jelikoţ oocyty byly kultivovány 48 hodin, je moţné, ţe uvolňované mnoţství NO bylo dostatečné pouze pro prvních 24 hodin, po kterých oocyt dospěje do stádia MII. Z našich experimentů s pouţitím inhibitoru iNOS je viditelné, ţe NO je nezbytný také při přechodu z MI do MII a je moţné, ţe po 24 hodinách kultivace s donorem SNAP nebyl jiţ ţádný volný NO dostupný. Navíc při experimentech tímto donorem při aktivaci prasečích oocytů se ukázalo, ţe je mnohem výhodnější pouţít pulsační ošetření donorem neţ pouhé kontinuální působení (Krejčová et al., 2010). Je velmi pravděpodobné, ţe během meiotického zrání také dochází k výkyvům koncentrací NO, které regulují správný průběh meiotického zrání. Dalším významným důvodem můţe být samotné toxické působení kombinace pouţitých chemikálií. Pouţití dvou chemikálií silně zatěţuje oocyt, i kdyţ viditelně jsou postiţeny jen oocyty s plnou meiotickou kompetencí. U těchto oocytů bylo při kultivaci dohromady s inhibitorem NOS a donorem NO nalezeno aţ 34% oocytů atypických (s atypickým rozloţením chromozómů nebo atypickou cytoplazmou). Pro plnohodnotný zisk meiotické kompetence rostoucích oocytů je nezbytné přesné načasování nízkých koncentrací NO. Jelikoţ v rostoucích oocytech jsou NO syntázy distribuovány v různých lokalitách a jejich distribuce se mění, je pravděpodobné, ţe NO

63

nepůsobí v oocytu plošně, a proto nemůţeme externím dodáním NO v jedné dávce plně nahradit přirozené působení NO v oocytu. NO se v buňkách váţe na hemovou skupinu rozpustné guanylát cyklázy (sGC) a tak zvyšuje produkci cGMP (Jablonka-Shariff a Olson, 1998). Je také pravděpodobné, ţe cGMP sniţuje hladinu cAMP a ovlivňuje meitické zrání aktivací cAMP-fosfodiesterázy. Na druhé straně existují velice přesvědčivé důkazy, ţe NO můţe vyvolávat řadu biologických efektů mimo cGMP signální kaskádu, například vazbou na hemovou skupinu jiných proteinů neţ cGMP nebo nitrosylací řady proteinů typu Ras, který je součástí MAPK dráhy v oocytu, či tyrosinu (Moretto et al., 1993). Oocyty s ukončeným růstem a rostoucí oocyty se liší některými regulačními mechanizmy, například obsahem cyklinu B, cdc25C a wee 1, či schopností aktivovat InsP3/ Ca2+ (Murray a Hunt, 1993; Hampl a Eppig, 1995). Naše experimenty potvrdily zapojení NO do procesu zisku meiotické kompetence. Dokázali jsme, ţe lze částečně nahradit přirozeně se syntetizující NO v rostoucích oocytech oxidem dusnatým dodaným z externích zdrojů. Zůstává otázkou, jakým mechanizmem oxid dusnatý v oocytech působí, a zda je mechanizmus účinku stejný u oocytů rostoucích jako u oocytů s ukončenou růstovou periodou.

64

7 Závěr Tato práce potvrdila zapojení NOS/NO do procesu zisku meiotické kompetence. Pomocí inhibitorů enzymů NOS a donorů se podařilo potvrdit hypotézu, ţe oxid dusnatý je nezbytný pro zisk meiotické kompetence jak rostoucích (částečně meioticky kompetentních), tak i plně kompetentních oocytů prasete při kultivaci in-vitro. V našich laboratorních podmínkách jsme potvrdili, ţe oocyty získávají meiotickou kompetenci kontinuálně během růstu. Oocyty menší neţ 100 μm nejsou v našich in-vitro podmínkách schopny znovuzahájit meiotické zrání a zůstávají ve stádiu GV. Oocyty o velikosti 100 – 110 μm prolomily první meiotický blok a dosáhly po 48 hodinové kultivaci stádia metafáze I, kde byly ovšem zastaveny. Potvrdili jsme, ţe tyto oocyty mají částečně vyvinutou meiotickou kompetenci. Pouze oocyty o velikosti 120 μm měli plně vyvinutou meiotickou kompetenci. Po 48 hodinové kultivaci většina oocytů dosáhla stádia MII. Pomocí inhibice NO- syntáz jsme prokázali, ţe se NO účastní na rozpadu zárodečného váčku rostoucích i plně kompetentních oocytů. NO se u plně kompetentních oocytů částečně podílí i na přechodu z první do druhé meiotické metafáze. Působení inhibitorů je po jejich odmytí reversibilní. U části plně kompetentích oocytů po odmytí inhibitoru aminoguanidinu a další kultivaci 24 dochází samovolně k partenogenetické aktivaci do stádia prvojádra nebo čtyřbuněčného embrya. Účast NO na regulaci rozpadu zárodečného váčku (GVBD) jsme potvrdili pomocí donoru dodaného k oocytům s inhibovanou NOS. Působení inhibitoru AG lze částečně zvrátit pouţitím nízkých koncentrací NO donoru SNAP. Takto stimulované částečně meioticky kompetentní oocyty částečně dosáhnou stádia MI a plně meioticky kompetentní stádia MII. NO donor sám o sobě můţe působit na oocyty jak toxicky. Vysoké koncentrace NO donoru SNAP působí na obě kategorie oocytů toxicky a tyto změny jsou nevratné. Při nízkých koncentracích SNAP dochází u plně kompetentních oocytů k zastavení vývoje ve stádiu pozdní diakineze, kdeţto částečně kompetentní oocyty dosahují stádia MI. Pomocí pouţitého postupu se sice nepodařilo zvýšit meiotickou kompetenci rostoucích oocytů, prokázali jsme však nezbytnost NO při rozpadu zárodečného váčku jak u plně kompetentních tak i u rostoucích oocytů. Zjistili jsme, ţe pouze nízké koncentrace NO jsou účinné pro regulaci znovuzahájení zrání. Vysoké koncentrace NO mohou naopak na oocyty působit toxicky. 65

8 Seznam použitých zkratek

AC

Adenylate Cyclase, adenylát cykláza

AG

Aminoguanidin

AhR

Aryl-hydrocarbon receptor

AMH

Anti-Müllerian Hormone, antimulerův hormon

APC

Anaphase Promoting Complex

ATP

Adenosin Triphosphate, adenosin trifosfát

BMP

Bone Morphogenetic Factor, růstový faktor

CaM

Calmodulin, kalmodulin

CaM-KII

Calmodulin Dependent Kinase, kalmodulin dependentní kináza

cAMP

Cyclic Adenosin Monophosphate, cyklický adenosin monofosfát

Cdk

Cyclin dependent Kinases, cyklin dependentní kinázy

cGMP

Cyclic guanosine triphosphate, cyklický guanosin trifosfát

CSF

Cytostatic factor, cytostatický faktor

DNA

Deoxyribonucleotid Acide, deoxyribonukleová kyselina

EGF

Epidermal growth Factor, epidermální růstový faktor

eNOS

Endothelial Nitric oxide synthase, endoteliální syntáza oxidu dusnatého

ERK

Extracelular regulated Kinases,extracelulárně regulované kinázy

FAD

flavin-adenindinukleotid

FGF

Fibroblast growth factor, růstový faktor

FMN

Flavinmononukleotid

FSH

Folikulostimulační hormon

GDF-9

Growth differential factor, růstový diferenciační faktor

GH

Gonadotropní hormon

GTP

Guanosine triphosphate, guanosin trifosfát

GV

Germinal Vesical, zárodečný váček

GVBD

Germinal Vesicle Breakdown, rozpad zárodečného váčku 66

GVBD

Germinal vesicle breakdown, rozpad zárodečného váčku

HB4

Tetrahydrobiopterin

Hsp90

Heat shock protein, protein tepelného šoku

IGF

Insulin -like Growth Factor, růstový faktor

iNOS

Inducible Nitric oxide Synthase, indukovatelná syntáza oxidu dusnatého

IP3R

Inositol 1,4,5 trifosfátové receptory

KL

Kit ligand

LH

Luteinizační hormon

LHRH

Releasing hormon pro luteinizační hormon

L-NA

N-omega-nitro-L-arginin

L-NAME

N-omega-nitro-L-arginin metylester

L-NMMA

NG-monometyl-L-arginin

MAPK

Mitogen-activated protein kinases , mitogeny aktivovaná protein kináza

MEK

kináza

MI

první meiotická metafáze

MII

druhá meiotická metafáze

MPF

metaphase promoting factor

MPF

Metaphase Promoting Factor

mRNA

Messenger Ribonucleotic Acid, messengerová ribonukleová kyselina

mtNOS

Mitochondrial Nitric Oxide Snythase, mitochondriální syntáza oxidu dusnatého

NADPH

Nikotinamidadenin-Dinukleotid Fosfát

NFk-B

Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NGF

Nerve growth factor, nervový růstový faktor

NMDA

N-methyl-D-aspartic acid

nNOS

neuronal Nitric Oxide Synthase, nervová syntáza oxidu dusnatého

NO

Oxid dusnatý 67

NOS

Nitric oxide Synthase, syntáza oxidu dusnatého

OMI

Oocyte Maturation inhibitor,inhibitor zrání oocytů

PDE

Phosphodiesterase , fosfodiesteráza

PGC

Primordial Germ Cells, primordiální zárodečné buňky

PIN

Protein inhibitor syntázy oxidu dusnatého

PKA

Proteinkináza A

PKC

Proteinkináza C

Plk

Polo-like kinase

RNA

Ribonucleotid Acid, ribonukleová kyselina

rRNA

Ribosomal Ribonucleotid Acid, ribozomální ribonukleová kyselina

SAC

Spindle Assembly Checkpoint

SF

Steroidogenic Factor, steroidogenní faktor

sGC

Soluble Guanylate Cyclase, rozpustná guanylát cykláza

SNAP

S-nitroso-N-acetylpenicillamine

SNP

Sodium Nitroprusside

Src

Sarcoma Protooncogenic Tyrosine Kinase

TGF

Transforming Growth Factor, transformační růstový faktor

Thr

Threonin, aminokyselina

tRNA

Transfer RNA, transferová ribonukleová kyselina

Tyr

Tyrozin, aminokyselina

VIP

Vasoactive Intestinal Polypeptide

WT-1

Wilms Tumor protein

ZP

zona pellucida

68

Seznam použité literatury Abe K., Matsuoka K., Inoue N., Taga M., Kato T. 1999. Messenger RNA of neuronal nitric oxide synthase is expressed and possibly function in mouse oocytes and embryos during preimplantation development. Biomedical Research. 20. 61 –65. Alberts B., Bray D., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. 1998. Základy buněčné biologie, úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing Ústí nad Labem. Alderton K. W., Cooper Ch. E., Knowles G. R. 2001. Nitric oxide synhases: structure, function and inhibition. Biochemistry. 357. 593 – 61. Ambrosino A., Russo D., Lamanna C., Assisi L., Rizzo M., Vittoria A., Cecio A. 2003. Isoforms of nitric oxide in the pig testis. Acta Veterinaria. 72. 493 – 498. Bian K, Murad F. 2003. Nitric oxide (NO)-biogeneration, regulation, and relevance to human diseases. Front Biosci. 8. 264 -78. Bielanska-Osuchowska Z. 2006. Oogenesis in pig ovaries during the prenatal period: ultrastructure and morphometry. Reproductive Biology. 6. 161 – 193. Bilodeau S., Fortier M. A., Sirard M. A. 1993. Effect of adenylate cyclase stimulation on meiotic resumption and cyclic AMP content of zona-free and cumulus-enclosed bovine oocytes in vitro. Journal of Reproduction & Fertility. 97(1). 5-11. Bonfoco E., Leist M., Zhivotovsky B., Orrenius S., Lipton S. A., Nicotera P. 1996. Cytoskeletal breakdown and apoptosis elicited by NO donors in cerebellar granule cells require NMDA receptor activation. Journal of Neurochemistry.67(6). 2484-93. Bornslaegr J. L., Mattei P. M., Schultz R. M. 1986. Involvement of cAMP-dependent protein kinase and protein phosphorylation in regulation of mouse maturation. Developmental Biology. 114. 453 – 462. Bredt D. S., Hwang P. M., Snyder S. H. 1990. Localization of nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric oxide. Nature. 25. 347(6295). 768-70. Bredt D. S., Snyder S. H. 1992. Nitric oxide, a novel neuronal messenger. Neuron. 8. 3 – 11. Brune B., Lapetina E. G. 1995. Protein thiol modification of glyceraldehyde – 3- phosphate dehydrogenase as a target for nitric oxide signaling. General Engineering. 17. 149 – 164. Bu S., Xia G., Tao Y., Lei L., Zhou B. 2003. Dual effects of nitric oxide on meiotic maturation of mouse cumulus cell-enclosed oocytes in vitro. Molecular and Cellular Endocrinology. 207. 21 –30. Byskov A.1982. Primordial germ cells and regulation of meiosis. In: Wassarman P. M. 1988. The mammalian ovum. The physiology of reproduction. New York: Raven Press, 69 – 102. Cardena G., Fan R., Stern D. F., Liu J., Sessa W. C. 1996. Endothelial Nitric Oxide Synthase Is Regulated by Tyrosine Phosphorylation and Interacts with Caveolin-1. The Journal of Biological Chemistry. 271. 27237–27240. 69

Cetica P. D., Pintos L. N., Dalvit G. C., Beconi M. T. 2001. Antioxidantenzyme activity and oxidative stress on bovine oocyte in vitro maturation. IUBMB Life. 51. 57–64. Clementi E., Brown G. C., Feelisch M., Moncada S. 1998. Persistent inhibition of cell respiration by nitric oxide: crucial role of S-nitrosylation of mitochondrial komplex I and protective action of gluthione, Proceedings of the National Academy of Sciences. 95. 7631 – 7636. Colgan D. F., Murthy K.G.K., Prives C., Manley J. L. 1996. Cell-cycle related regulation of poly(A) polymerase by phosphorylation. Nature. 384:282–5. Coppens P., Novozhilova I., Kovalevsky A. 2002. "Photoinduced Linkage Isomers of Transition-Metal Nitrosyl Compounds and Related Complexes". Chemical Reviews. 102. 861-883. Danner S., Kajahn J., Geismann C., Klink E., Kruse C. 2007. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Molecular Human Reproduction . 13(1). 11-20. Dekel N., Ayalon D., Lewysohn O., Nevo N., Kaplan-Kraicer R., Shalgi R. 1995. Experimental extension of the time interval between oocyte maturation and ovulation: effect on fertilization and first cleavage. Fertility and Sterility. 64(5). 1023-8. Dimmeler S., Zeiher A.M. 1997. Nitric oxide and apoptosis: another paradigm for the doubleedged role of nitric oxide. Nitric Oxide. 1(4). 275-81. Dixit D. V., Parvizi N. 2001. Nitric oxide and the control of reproduction. Animal Reproduction Science. 65. 1 –16. Dong J., Albertini D. F., Nishimori K., Kumar T. R., Lu N., Matzuk M. M. 1996. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature. 383. 531– 535. Durlinger A. L. L., Visser J. A., Themmen A. P. N. 2002. Regulation of ovarian function: the role of anti-Mullerian hormone. Reproduction. 124. 601–609. Dyce P. W., Li J. 2006. From skin cells to ovarian follicles?. Cell Cycle. 5(13). 1371-5, Dyce P. W., Wen L., Li J. 2006. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nature Cell Biology . 8(4). 384-90. Edry I., Dekel N. 2009. Ups and downs of PDE3A activity: The control the meiotic status of oocytes. In5 th International Conference on the Female Reproductive Tract, Frauenchiemsee, Germany. Eppig J. J. 2001. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122(6). 829-38. Eppig J. J. O’Brien M. J. 1996. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54. 197–207. Eu J. P., Sun J., Xu L., Stamler JS., Meissner G. 2000. The sceletal muscle calcium release channel: coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102. 499 – 509. 70

Fan H. Y., Sun Q. Y. 2004. Involvement of mitogen-activated protein kinase cascade during oocyte maturation and fertilization in mammals. Biology of Reproduction. 70(3). 535-47. Fleming I., Fisslthaler B., Dimmeler S., Kemp B. E., Busse R. 2001. Phosphorylation of Thr495 Regulates Ca2+/Calmodulin-Dependent Endothelial Nitric Oxide Synthase Activity. Circulation Research. 88. 68 -75. Freeman B. 2003. The active migration of germ cells in the embryos of mice and men is a myth. Reproduction. 125. 635–643. Furchgott R. F. 1999. Endothelium-derived relaxing factor: discovery, early studies, and identification as nitric oxide. Angewandte Chemie International Edition. 38. 1870 – 1880. Furchgott R. F., Zawadski J. V. 1980. The obligatory role of the endothelial cells in the relaxation of artherial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288. 373 – 376. Garrett W. M., Guthrie H. D. 1999. Expression of Bcl-2 and 3-hydroxysteroid dehydrogenase protein during oocyte and follicle development in foetal and post-natal pig ovaries. Reproduction Fertilily and Development. 11. 463–470. Garthwaite, J. 1991. Glutamate, nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system. Trends in Neurological Science. 14. 60 –67. Goud A. P, Goud P. T., Diamond M. P., Abu-Soud H. M. 2005. Nitric oxide delays oocyte aging. Biochemistry. 44(34). 11361-8. Grasselli F., Ponderato N., Basini G., Tamanini C. 2001. Nitric oxide synthase expression and nitric oxide/cyclic GMP pathway in swine granulosa cells. Domestic Animal Endocrinology. 20. 241 – 252. Greif D. M., Sacks D. B., Michel T. 2004. Calmodulin phosphorylation and modulation of endothelial nitric oxide synthase catalysis. Proceedings of the National Academy of Sciences 101(5). 1165-70. Griscavage J. M., Fukuto J. M., Komori Y., Ignarro L. J. 1994. Nitric oxide inhibits neuronal nitric oxide synthase by interacting with the heme prosthetic group. Role of tetrahydrobiopterin in modulating the inhibitory action of nitric oxide. The Journal of Biological Chemistry. 26. 269 (34). 21644-9. Guthrie H. D., Garrett W. M. 2001. Apoptosis during folliculogenesis in pigs. Reproduction 58. 17–29. Hagting A, Jackman M, Simpson K., Pines J. 1999. Translocation of cyclin B1 to the nucleus at prophase requires a phosphorylation-dependent nuclear import signal. Current Biology. 9. 680–689. Hampl V., Huang J. M., Weir E. K., Archer S. L. 1995. Activation of the cGMP-dependent protein kinase mimics the stimulatory effect of nitric oxide and cGMP on calcium-gated potassium channels. Physiology Resources.;44(1):39-44.

71

Harrouk W., Clarke H. J. 1995. Mitogen-activated protein (MAP) kinase during the acquisition of meiotic competence by growing oocytes of the mouse. Molecular Reproduction and Development. 41(1). 29-36. Hattori M. – A., Nishida N., Takesue K., Kato Y., Fujihara N. 2000. FSH suppresion of nitric oxide synthesis in porcine oocytes. Journal of Molecular Endocrinology. 24. 65 – 73. Hemmens B., Mayer B. 1998. Nitric oxide Protocols, vol 100. Edited by Tiheradge MA, Totowa, New Jersey: Humana. Hirao Y., Nagai T., Kubo M., Miyano T., Miyake M., Kato S. 1994. In vitro growth and maturation of pig oocytes. Journal of Reproductive Fertility. 100(2). 333-9. Homa S. T. 1995. Calcium and meiotic maturation of the mamalian oocyte. Molecular Reproduction and Development. 40. 122-34. Huanmin Z, Yong Z. 2000. In vitro development of caprine ovarian preantral follicles. Theriogenology . 54(4). 641-50. Hubbard C. J., Price J. 1988. The Effects of Follicle-Stimulating Hormone and Cyclic Guanosine 3’, 5’-Monophosphate on Cyclic Adenosine 3’, 5’-Monophosphate Phosphodiesterase and Resumption of Meiosis in hamster cumulus-oocyte complexes. Biology of Reproduction. 39. 829 – 838. Hubbard C. J., Terranova P. F. 1982. Inhibitory action of cyclic guanosine 50-phosphoric acid (GMP) on oocyte maturation: dependence on an intact cumulus. Biology of Reproduction. 26. 628–32. Hulshof S. C. J., Figueiredo J. R., Beckers J. F., Bevers M. M., Vanderstichele H., Hurk R. 1997. Bovine preantral follicles and activin: immunohistochemistry for activin and activin receptor and the effect of bovine activin A in vitro. Theriogenology. 48. 133–142. Hunter M. G. 2000. Oocyte maturation and ovum quality in pigs. Reviews of Reproduction. 5 (2). 122 – 130. Huo L-J., Liang Ch-G.,Yu L-Z., Zhong Z-S., Yang Z-M., Fan H-Y, Chen D-Y., Sun Q-Y. 2005. Inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide regulates germinal vesicle breakdown and first polar body emission in the mouse oocyte. Reproduction. 129. 403 – 409. Cha K. Y., Chian R. C. 1998. Maturation in vitro of immature human oocytes for clinical use. Human Reproduction Update. 4.103-20. Chan J. Y., Cheng H. L., Chou J. L., Li F. C., Dai K. Y., Chan S. H., Chang A. Y. 2006. Heat shock protein 60 or 70 activates nitric-oxide synthase (NOS) I- and inhibits NOS II-associated signaling and depresses the mitochondrial apoptotic cascade during brain stem death. Journal of Biological Chemistry. 16. 282(7). 4585-600. Chmelíková E., Ješeta M., Sedmiková M., Petr J., Tůmová L., Kott T., Lipovová P., Jilek F. 2010. Nitric oxide synthase isoforms and the effect of their inhibition on meiotic maturation of porcine oocytes. Zygote. 18. 235–244. Chmelíková E., Sedmíková M., Petr J., Kott T., Lánská V., Tůmová L., Tichovská H., Ješeta M. 2009. Expression and localization of nitric oxide synthase isoforms during porcine oocyte 72

growth and acquisition of meiotic competence. Czech Journal of Animal Science. 54. 137– 149. Chmelíková E., Sedmíková M., Rajmon R., Petr J., Švestková D. 2004. Jílek F. Effect of proteasome inhibitor MG132 on in vitro maturation of pig oocytes. Zygote.12.157 – 162. Cho W. K., Stern S., Biggers J. D. 1974. Inhibition effect of dybytyryl cAMP on mouse oocyte maturation in vitro. Journal of Experimental Zoology. 187. 383 – 386. Ignarro L. J. 1999. NO in vascular biology. Angewandte Chemie International Edition. 38. 1882 –1892. Ignarro L. J., Burga G. M., Wood K. S., Byrns R. E., Chaudhuri G. 1987. Endotelium-derived relaxing factor produced realased from artery and vein is nitric oxide, Proceeding of the National Academy of Science sof the united statesof America. 84. 9265 – 9269. Ignarro L. J., Lippton H., Edwards J. C., Baricos W. H., Hyman A. L., Kadowitz P. J., Gruetter C.A.1981. Mechanism of vascular smooth muscle relaxation by organic nitrates, nitrites, nitroprusside and nitric oxide: evidence for the involvement of S-nitrosothiols as active intermediates. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1981. 218(3):739-49. Ingram A. J., James L., Cai L., Thai K., Ly H., Scholey J. W. 2000. NO inhibits stretchinduced MAPK activity by cytoskeletal disruption. Journal of Biological Chemistry. 275. 40301–40306. Inoue M., Naito K., Nakayama T., Sato E. 1995. Activation of mitogen-activated protein kinase during meiotic maturation in porcine oocyte. Zygote. 3 (3). 265 - 271. Jablonka-Shariff A., Olson M. L. 1997. Hormonal regulation of nitric oxide synthases and their cell- specific expression during follicular development in the rat ovary. Endocrinology. 138. 460 – 468. Jablonka-Shariff A., Olson M. L. 1998. The role of nitric oxide in oocyte meiotic maturation and ovulation: Meiotic abnormalities of endotelial nitric oxide synthase knock-out mouse oocytes. Endocrinology. 139. 2944 – 2954. Jablonka-Shariff A., Olson M. L. 2000. Nitric oxide is essential for optimal meiotic maturation of murine cumulus-oocyte complexes in vitro. Molecular Reproduction and Development . 55. 412 – 421. Jaffrey S. R., Snyder S. H. 1996. PIN: an associated protein inhibitor of neuronal nitric oxide synthase. Science 274. 774-777. Janssens S. P., Shimouchi A., Quertermous T., Bloch D. B., Bloch K. D. 1992. Journal of Biological Chemistry. 267. 14519 – 14522. Johnson J., Bagley J., Skaznik-Wikiel M., Lee H. J., Adams G. B., Niikura Y., Tschudy K. S., Tilly J. C., Cortes M. L., Forkert R., Spitzer T., Iacomini J., Scadden D. T., Tilly J. L. 2005. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood. Cell . 29. 122(2). 303-15. 73

Johnson J., Canning J., Kaneko T., Pru J. K., Tilly J. L. 2004. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 6979. 145-150. Jones K. T. 2004. Turning it on and off: M-phase promoting factor during meiotic maturation and fertilization. Molecular Human Reproduction. 1. 1 – 5. Kanagawa H., Ocampo M. B., Ocampo L. T. C. 1991. Timing of sequential changes in chromosome configurations during the 1st meiotic division of pig oocytes cultured in vitro. Japaniese Journal of Veterinary research.127 – 137. Kanayama N., Miyano T., Lee J. 2002. Acquisition of meiotic competence in growing pig oocytes correlates with their ability to activate Cdc2 kinase and MAP kinase. Zygote. 10(3). 261-70. Kim H., Moon C., Ahn M., Lee Y., Kim H., Kim S., Ha T., Jee Y., Shin T. 2005. Expression of nitric oxide synthase isoforms in the porcine ovary during follicular development. Journal of Veterinar Sciences. 6(2). 97-101. Kishimoto T. 2003. Cell-cycle control during meiotic maturation. Current Opinion in Cell Biology. 15. 654 – 663. Knox R. V. 2005. Recruitment and selection of ovarian follicles for determination of ovulation rate in the pig. Domestic Animal Endocrinology. 29(2). 385-97. Kokkola T., Savinainen J. R., Mönkkönen K. S., Retamal M. D., Laitinen J. T. 2005. Snitrosothiols modulate G protein-coupled receptor signaling in a reversible and highly receptor-specific manner. BMC Cell Biol. 25. 6(1). 2. Krejčová T.,Petr J., Krejčová M., Kheilová K. 2009. Effects of cycloheximide or 6-dimethyl aminopurine on the parthenogenetic activation of pig oocytes using pulsatile treatment with nitric oxide donor.Czech Journal of Animal Science. 54.7. 293 – 306. Kubišta V.: Buněčné základy ţivotních dějů. 1998. Scientia, spol s r. o., pedagogické nakladatelství, ISBN 80-7183 – 109-3. 97 –115. Kupková Z., Beneš L. 2004. Chemické vlastnosti, biologické účinky a metody detekce biologického oxidu dusnatého. Chemické listy. 98. 116 – 122. Lawrence T. S., Dekel N., Beers W.H. 1980. Binding of human chorionic gonadotropin by rat cumuli oophori and granulosa cells: A comparative study.Endocrinology. 106. 1114-1118. Lefévre B., Nagyova E., Pesty A., Testars J. 1997. Acquisition of Meiotic Competence Is Related to the Functionality of the Phosphoinositide/Calcium Signaling Pathway in the Mouse Oocyte. Experimental Cell Research. 236. 193–200. Liang Ch. G., Su Y., Fan H., Schatten H., Sun Q. 2007. Mechanisms Regulating Oocyte Meiotic Resumption: Roles of Mitogen-Activated Protein Kinase. Molecular Endocrinology. 21(9). 2037–2055. Logan K. P., McNatty K. A., Juengel J. L. 2003. Expression of Wilms’ tumor gene and protein localization during ovarian formation and follicular development in sheep. Biology of Reproduction. 68. 635–643. 74

Lorca T., Cruzalegui F. H., Fesquet D., Cavadore J. C., Mery J., Means A. 1993. Calmodulindependent protein kinase II mediates inactivation of MPF and CSF upon fertilization of Xenopus eggs. Nature. 366. 211 – 212. Lucas X., Martínez E. A., Roca J., Vázquez J. M., Gil M. A., Pastor L. M., Alabart J. L.: Relationship between antral follicle size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocytes in pigs. Theriogenology 58, 871 – 885, 2002 Luciano A. M., Lodde V., Beretta M. S., Colleoni S., Lauria A., Modina S. 2005. Developmental capability of denuded bovine oocyte in a co-culture system with intact cumulus-oocyte complexes: role of cumulus cells, cyclic adenosine 30,50- monophosphate, and glutathione. Molecular Reproduction Development .71. 389–97. Maller J. L, Krebs E. G. 1980. Regulation of oocyte maturation. Current Topics in Cellular Regulation. 16. 271-311. Masciarelli S., Horner K., Liu C., Park S. H., Hinckley M., Hockman S., Nedachi T., Jin C., Conti M., Manganiello V.: Cyclic nucleotidephosphodiesterase 3A-deficient mice as a model of female infertility. The Journal of Clinical Investigation. 114. 196–205. 2004. Matta S. G. C., Caldas-Bussiere M. C., Viana K. S., Faes M. R.,Paes de Carvalho C. S., Dias B. L., Quirino C. R. 2009. Effect of inhibition of synthesis of inducible nitricoxide synthasederived nitric oxide by aminoguanidineon the in vitro maturation of oocyte – cumulus complexes of cattle. Animal Reproduction Science. 111. 189 – 201. Matta, S. G. C., Bussiere, M. C. C., Viana, K. S., Quirino, C. R. 2002.: Efeito de diferentes concentraciones do inibidorda s´ıntese de ´oxido n´ıtrico na maturac¸ ˜ao nuclear in vitro de o´ocitos bovinos. Revista Brasileira de Reproduo Animal. 26.149–151. Mc Cann S. M., Mastronardi C., Walczewska A., Karanth S., Rettori V., Yu W. H. 2003. The role of nitric oxide (NO) n control of LHRH release that mediates gonadotropin release and sexual behavior. Current Pharmacological Design. 9. 381-390. Mc Donald L. J., Moss J. 1994. Nitric oxide and NAD-dependent protein modification. Molecular and Cellular Biochemistry. 138(1-2). 201-6. Meduri G., Charnaux N., Driancourt M. A., Combettes L., Granet P., Vannier B. 2002. Follicle-stimulating hormone receptors in oocytes? The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97. 2266–2276. Mehlmann L. M., Jones T. L., Jaffe L. A. 2002. Meiotic arres in the mouse follicle maintained by Gs protein in the oocyte. Science. 296. 1343 – 1345. Meinecke B., Krischek C. 2003. MAPK/ERK kinase (MEK) signalling is required for resumption of meiosis in cultured cumulus - enclosed pig oocytes. Zygote 11. 7 – 16. Messmer U. K., Lapetina E. G., Brüne B. 1995. Molecular Pharmacology.47(4). 757-65. Mitchell L. M., Kennedy C. R., Hartshorne G. M. 2004. Pharmacological manipulation of nitric oxide levels in mouse follicle cultures demonstrates key role of extrafollicular control of ovulation. Human reproduction. 19. 1705 – 1712.

75

Moor R., Dai Y. 2001. Maturation of pig oocytes in vivo and in vitro. Journal of Reproduction. 58. 91-104. Morbeck D. E., Esbenshade K. L., Flowers W. L., Britt J. H. 1992. Kinetics of follicle growth in the prepubertal gilt. Biology of Reproduction. 47 (3). 485 – 491. Moretto M., López F. J., Negro-Vilar A. 1993. Nitric oxide regulates luteinizing hormonereleasing hormone secretion. Endocrinology.133(5). 2399-402. Moricard R. a Moricard F. 1975. Espace périvitellin et réactions microvillositaires au cours de l´achévement de la méiose et de la fécondation chez les Mammiféres; orientation de recherches humanies. In: La fécondation. Thibult C., Collage Sociale Naturale Etude Sterilite. Paris. 37-48. Motlík J. a Fulka J. 1976. Breakdown of GV in pig oocytes in vivo and in vitro. Journal of Experimental Zoology. 198. 155 – 162. Motlík J., Crozet N., Fulka J. 1984. Meiotic competence in vitro of pig oocytes isolated from early antral follicles. Journal of Reproduction & Fertility. 72. 323 – 328. Motlík J., Fulka J. 1986. Factors affecting meiotic competence in pig oocytes. Theriogenology. 25. 87 – 96. Motlík J., Fulka J. 1986. Factors affecting meiotic competence in pig oocytes. Theriogenology. 25. 87 – 96. Motlik J., Pavlok A., Kubelka M. 1998. Interplay between cdc2 kinase and map kinase pathway during maturation of mammalian oocytes. Theriogenology. 49. 2. 416-469. Murad F. 1994. Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: the NO cyclic GMP signal transduction system, Advances in Pharmacology. 26. 19 –33. Murad F. 1999. Discovery of some of the biological effects of nitric oxide and its role in cell signaling. Angewandte Chemie International Edition. 38. 1856 – 1868. Murray A., Hunt T. 1993. The cell cycle. Oxford University Press, Oxford, UK, 251 stran, Nakamura Y., Yamagata Y., Sugino N., Takayama H., Kato H. 2002. Nitric oxide inhibits oocyte meiotic maturation. Biology of Reproduction. 67. 1588 – 1592. Nathan C., Xie Q – W. 1994. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. The Journal of Biological Chemistry. 269. 13725 –13728. Navaza F., Chevrier G., Alzari P. M., Aymonino P. J. 1989. "Single-crystal neutron diffraction structure of sodium pentacyanonitrosylferrate(2−) (sodium nitroprusside) dihydrate". Acta Crystallographica. 45 (6). 839–841. Nishio E., Fukushima K., Shiozaki M., Watanabe Y. 1996. Nitric oxide donor SNAP induces apoptosis in smooth muscle cells through cGMP-independent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 221. 163. Osawa Y., Lowe E. R., Everett A. C., Dunbar A. Y., Billecke S. S. 2003. Proteolytic degradation of nitric oxide synthase: Effect of inhibitors and role of hsp90 - based chaperons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 304. 2. 493 – 497. 76

Otsuka F. A Shimasaki S. 2002. A negative feedback system between oocyte bone morphogenetic protein 15 and granulosa cell kit ligand: its role in regulating granulosa cell mitosis. Proceeding of the National Academy of Science. 8. 8060–8065. Peterson D. A, Peterson D. C, Archer S., Weir E. K. 1992. The non specificity of specific nitric oxide synthase inhibitors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 187(2). 797-801. Peterson D. A., Peterson D. C., Archer S., Weir E. K. 1992. The non specificity of specific nitric oxide synthase inhibitors. Biochemistry Biophysic Resource Community. 16. 187(2). 797-801. Petr J, Rozinek J, Fulka J Jr, Jílek F. 1994. Influence of cytoplasmic microinjection on meiotic competence in growing pig oocytes. Molecular Reproduction and Development. 34(1). 81-7. Petr J, Rozinek J, Vaňourková Z, Jílek F. 1999. Cyclopiazonic acid, an inhibitor of calciumdependent ATPases, induces exit from metaphase I arrest in growing pig oocytes. Reproduction, Fertility and Development. 11(4-5). 235-46. Petr J., Chmelíková E., Kheilová K., Jílek F. 2009. Histone deacetylase inhibition improves meiotic competence but not developmental competence in growing pig oocytes. Zygote 17. (4). 307-14. Petr J., Rajmon R., Rozinek J., Sedmíková M., Ješeta M., Chmelíková E., Švestková D., Jílek F. 2005. Activation of pig oocytes using nitric oxide donors. Molecular Reproduction and Development. 71(1). 115-22. Petr J., Rozinek J., Hruban V., Jílek F., Sedmíková M., Vaňourková Z., Němeček Z. 2001. Ultrastructural localization of calcium deposits during in vitro culture of pig oocytes. Molecular Reproduction and Development. 58. 196 – 204. Petr J., Urbánková D., Tománek M., Rozinek J., Jílek F. 2002. Activation of in vitro matured pig oocytes using activators of inositol triphosphate or ryanodine receptors. Animal Reproduction Science. 70. 235 – 249. Picton H., Briggs D., Gosden R. 1998. The molecular basis of oocyte growth and development. Molecular and Cellular Endocrinology. 145. 27–37. Pires P. R. L, Santos N. P., Adona P. R., Natori M. M., Schwarz K. R. L., de Bem T. H. C., Leal C. L. V. 2009. Endothelial and inducible nitric oxide synthases in oocytes of cattle. Animal Reproductive Science. 116(3-4). 233-43. Pozzan T., Rizzuto R., Vsipe P., Meldolesi J. 1994. Molecullar and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiological Reviews 74. 595 – 636. Ratner A. 1976. Effects of follicle stimulating hormone and luteinizing hormone upon cyclic AMP and cyclic GMP levels in rat ovaries in vitro. Endocrinology. 99. 1496–1500.

77

Ravichandran L. V., Johns R. A., Rengasamy A. 1995. Direct and reversible inhibition of endothelial nitric oxide synthase by nitric oxide. American Journal of Physiology. 268. 221623. Rees D. D., Palmer R. M., Moncada S. 1989. Role of endothelium-derived nitric oxide in the regulation of blood pressure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86(9). 3375-8. Rees D. D., Palmer R. M., Schulz R., Hodson H. F., Moncada S. 1990. Characterization of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo. British Journal of Pharmacology. 101(3). 746-52. Rosselli M., Imthurm B., Macas E., Keller P. J., Dubey R. K. 1994. Circulating nitrite/nitrate levels increase with follicular development: indirect evidence for estradiol-mediated NO release. Biochem Biophys Res Commun . 202. 1543-1552. Rozinek J., Vaňourková Z., Sedmíková M., Lánská V., Petr J., Rajmon R., Jílek F. 2003.Ultrastructural localisation of calcium deposits in pig oocytes maturing in vitro.: effects of verapamil. Zygote. 11.253 – 260. Sadovski Y. A., Dorn C. 2000. Function of steroidogenic factor 1 during development and differentiation of the reproductive system. Reviews of Reproduction. 5. 136–142. Sagata N. 1997. What does Mos do in oocytes and somatic cells? BioEssays. 19. 13 – 21. Sawyer H. T., Smith P., Heath D. A., Juengel J. L., Wakefield S. J., McNatty K. P. 2002. Formation of ovarian follicles during fetal development in sheep, Biology of Reproduction 66. 1134–1150. Sedmíková M., Burdová J., Petr J., Etrych M., Rozinek J., Jílek F. 2003. Induction and activation of meiosis and subsequent parthenogenetic development of growing pig oocytes using calcium ionophore A23187. Theriogenology. 60(9). 1609-20. Sela-Abramovich S., Galiani D., Nevo N., Dekel N. 2008. Inhibition of rat oocyte maturation and ovulation by nitric oxide: mechanism of action. Biology of Reproduction.78(6). 1111-8. Sengoku K., Takuma N., Horikawa M.,Tsuchiya K., Komori H., Sharifa D., Tamate K., Ishikawa M. 2001. Requirement of nitric oxide for murine oocyte maturation, embryo development, and trophoblast outgrowth in vitro. Molecular Reproduction and Development 58. 262 – 268. Shen W, Li L, Bai Z, Pan Q, Ding M, Deng H. 2007. In vitro development of mouse fetal germ cells into mature oocytes. Reproduction. 134(2). 223-31. Shen Y. H., Wang X. L., Wilcken D. E. 1998. Nitric oxide induces and inhibits apoptosis through different pathways. Federation of European biochemici societies. 433. 125 -31. Shiraishi, K., Okada, A., Shirakawa, H., Nakanishi, S., Mikoshiba, S. & miyazaki, S. 1995. Developmental changes in the distribution of the endoplasmic reticulum and inositol 1,4,5trisphosphate receptors and the spatial pattern of Ca2+ release during maturation of hamster oocytes. Developmental Biology 170, 594-606.

78

Schwarz K. R. L., Pires P. R. L, de Bem T. H. C., Adona P. R., Leal C. L. V. 2010. Consequences of Nitric Oxide Synthase Inhibition During Bovine Oocyte Maturation on Meiosis and Embryo Development. Reproduction in Domestic Animal. 45. 75–80. Silva J. R., Hurk R., Matos M. H., Santos R. R., Pessoa C., Moraes M. 2004. Influences of FSH and EGF on primordial follicles during in vitro culture of caprine ovarian cortical tissue, Theriogenology. 61. 1691–1704. Singh B., Rutledge J. M., Armstrong D. T. 1995. Epidermal growth factor and its receptor gene expression and peptide localisation in porcine ovarian follicles. Molecular Reproduction and Development. 40. 391–399. Soyal S. M., Amleh A., Dean J. 2000. Fig α, a germ cell-specific transcription factor required for ovarian follicle development, Development. 127. 4645–4655. Stamler J. S. 1994.: Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide. Cell. 23. 78(6). 931-6. Stamler J. S., Toone E. J., Lipton SA., Sucher N. J. 1997. SNO signals, translocation, regulation, and consesus motif. Neuron. 18. 691 – 696. Stojkovic M., Motlik J., Kölle S., Zakhartchenko V., Alberio R., Sinowatz F., Wolf E. 1999. Cell-cycle control and oocyte maturation:Rewiew of literature. Reproduction of Domestic Animal. 34. 335 –342. Stuehr D. J. 1999. Mammalian nitric oxide synthase. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. 1411. 217 – 230. Sugino N., Takiguchi S., Ono M., Tamura H., Shimamura K., Nakamura Y., Tsuruta R., Sadamitsu D., Ueda T., Maekawa T., Kato H.1996. Nitric oxide concentrations in the follicular fluid and apoptosis of granulosa cells in human follicles. Human Reproduction. 11(11). 2484-7. Sugiura K, Naito K, Tojo H. 2005. Cdk2 activity is essential for the first to second meiosis transition in porcine oocytes. The Journal of Reproduction and Development . 51(1). 143-9. Sun Q., Nagai T. 2003. Molecular mechanism underlying pig oocyte maturation and fertilization. Molecular Reproduction and Develement. 49. 347 – 359. Suschek C., Rothe H., Fehsel K., Enczmann J., Kolb B. V. 1993. Induction of macrophage - like nitric oxide synthase in cultured rat aortic endothelial cells. IL – 1 β mediated induction regulated by tumour necrosis factor α and IFN - γ. The Journal of Immunology. 151. 3283 – 3291. Takesue K., Tabata S., Sato F., Hattori M. 2003. Expression of nitric oxide synthase-3 in porcine oocytes obtained at different follicular development. The Journal of Reproduction and Development. 49. 136 –140. Tao J. Y., Fu Z., Zhang M. L., Xia G., Lei L., Wu Z. L. 2005.Nitric oxide influences the meiotic maturation of porcine oocytes cultured in hypoxanthine-supplemented medium. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 89(1-2). 38-44. 79

Tao M., Kodama H., Kagabu S., Fukuda J., Murata M., Shimizu Y., Hirano H., Tanaka T. 1997. Possible contribution of follicular interleukin-1beta to nitric oxide generation in human pre-ovulatory follicles. Human Reproduction. 12(10). 2220-5. Tao Y., Fu Z., Zhang M., Xia G., Yang J., Xie H. 2004. Immunohistochemical localization of inducible and endothelial nitric oxide synthase in porcine ovaries and effects of NO on antrum formation and oocyte meiotic maturation. Molecular and Cellular Endocrinology. 222(1-2). 93-103. Tesfaye D., Kadanga A., Rings F., Bauch K., Jennen D., Nganvongpanit K., Holker M., Tholen E., Ponsuksili S., Wimmers K., Montag M., Gilles M., Kirfel G., Herzog V., Schellander K. 2006. The Effect of Nitric Oxide Inhibition and Temporal Expression Patterns of the mRNA and Protein Products of Nitric Oxide Synthase Genes During In Vitro Development of Bovine Pre-implantation Embryos. Reproduction in Domestic Animals. 41. 501–509. Tornell J., Billig H., Hillensjo T. 1990. Resumption of rat oocyte meiosis is paralleled by a decrease in guanosine 30,50-cyclic monophosphate (cGMP) and is inhibited by microinjection of cGMP. Acta Physiologica Scandinavica.139. 511–517. Tornell J., Brannstrom M., Hillensjo T. 1984. Different effects of cyclic nucleotide derivatives upon the rat oocyte-cumulus complex in vitro. Acta Physiologica Scandinavia. 122. 507–13. Tranguch S., Steuerwald N., Huet-Hudson Y. M. 2003. Nitric oxide synthase production and nitric oxide regulation of preimplantation embryo development. Biology of Reproduction. 68. 1538–1544. Tyryshkin A., Gorgun F. M., Abdel Fattah E., Mazumdar T., Pandit L., Zeng S., Eissa N. T. 2010. Src kinase-mediated phosphorylation stabilizes inducible nitric-oxide synthase in normal cells and cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 285(1). 784-92. Vaccari S., Weeks J. L. , Hsieh M., Menniti F. S., Conti M. 2009. Cyclic GMP signaling is involved in the luteinizing hormone-dependent meiotic maturation of mouse oocytes. Biology of Reproduction. 81(3). 595-604. Van Blerkom J. a Bell H. 1986. Regulation of development in the fully grown mouse oocyte: chromosome-mediated temporal and spatial differentiation of the cytoplasm and plasma membrane. Journal of Embryology & Experimental Morphology. 93. 213-38. Van den Hurk R., Abir R., Telfer E. E., Bevers M. M. 2000. Primate and bovine immature oocytes and follicles as sources of fertilizable oocytes. Human Reproduction 6. 457–74. Van der Hurk R., Bevers M. M., Beckers J. F. 1997. In vivo and in vitro development of preantral follicles. Theriogenology .47. 73–82. Van Voorhis B. J., Moore K., Strijbod P. J. L., Nelson S., Baylis S. A., Grzybicki D., Weiner C. P. 1995. Expression and localization of inducible and endothelial nitric oxide synthase in the rat ovary. European Journal of clinical Investigation. 96. 2719 – 2726. Vaziri N. D., Wang X. Q. 1999. cGMP-mediated negative-feedback regulation of endothelial nitric oxide synthase expression by nitric oxide. Hypertension. 34(6). 1237- 41. 80

Wandji S. A., Eppig J. J., Fortune J. E. 1996. FSH and growth factors affect the growth and endocrine function in vitro of granulosa cells of bovine preantral follicles. Theriogenology . 45. 817– 832. Wang R. 2004. Signal Transduction and the Gasotransmitters: NO, CO and H2S in Biology and Medicine. Humana Press, New Jersey, USA, 400 stran. Wassarman P. M. 1988. The mamalian ovum. In Knobil E., Neil J. The physiology of reproduction. New York. Raven Press. 70 –102. Wehrend A., Meinecke B. 2001. Kinetics of meiotic progression, M-phase promoting factor (MPF) and mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) activities during in vitro maturation of porcine and bovine oocytes: species specific differences in the length of the meiotic stages. Animal Reproduction Science. 66. 175-184. Wolff D. J., Lubeskie A. 1995. Aminoguanidine is an isoform-selective, mechanism-based inactivator of nitric oxide synthase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 316(1). 29030. Wu M., Gerhart J. C. 1980. Partial purification and characterization of the maturationpromoting factor from eggs of Xenopus laevis. Developmental Biology. 79(2). 465-77. Yamauchi J., Miyazaki T., Iwasaki S., Kishi I., Kuroshima M., Tei C., Yoshimura Y. 1997. Effects of nitric oxide on ovulation and ovarian steroidogenesis and prostaglandin production in the rabbit. Endocrinology. 138(9). 3630-7. Yang H., Bhat G. K., Wadley R., Wright K. L., Chung B. M., Whittaker J. A., Dharmarajan A. M., Sridaran R. 2003. Gonadotropin-releasing hormone-agonist inhibits synthesis of nitric oxide and steroidogensis by luteal cells in the pregnant rat. Biology of Reproduction. 68. 2222-2231. Ying Y., Qi X., Zhao G. -Q. 2001. Induction of primordial germ cells from murine epiblasts by synergistic action of BMP-4 and BMP-8b signaling pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98. 7858–7862. Zackrisson U, Mikuni M, Wallin A, Delbro D, Hedin L, Brännström M. 1996.Cell-specific localization of nitric oxide synthases (NOS) in the rat ovary during follicular development, ovulation and luteal formation. Human Reproduction. 11(12). 2667-73. Zhang M., Ouyang H., Xia G. 2009. The signal pathway of gonadotrophins-induced mammalian oocyte meiotic resumption. Molecular Human Reproduction. 15(7). 399-409. Zhang W., Wei Q-W., Wang Z-CH., Ding W., Wang-W, Shi F-X. 2011. Cell-specific expression and immunolocalization of nitric oxide synthase isoforms and the related nitric oxide/cyclic GMP signaling pathway in the ovaries of neonatal and immature rats. Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology). 12(1). 55-64 Zhao J, van Tol H. T. A, Taverne M. A, van der Weijde G. C., Bevers M. M., van den Hurk R. 2000. The effect of growth hormone on rat preantral follicles in vitro. Zygote 8. 275–83. Zou K., Yuan Z., Yang Z., Luo H., Sun K., Zhou L., Xiang J., Shi L., Yu Q., Zhang Y., Hou R., Wu J. 2009. Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries. Nature Cell Biology. 11(5). 631-6. 81

82

Příloha 1) Proces získávání oocytů.

Vlevo: získávání plně kompetentních oocytů aspirací jehlou. Uprostřed: oocyty před měřením velikosti a výběrem kvalitních oocytů. Vpravo: vybrané kvalitní oocyty (zde plně kompetentní o velikosti 120µm)

2) Fotografie oocytů po kultivaci s inhibitory NOS

Obrázek:. Oocyty o z velikostní skupiny 100–110 m kultivované 48 hod in vitro. Vlevo oocyt kultivovaný s 2,5 mM AG – ve stádiu MI, uprostřed s 5 mM AG ve stádiu GV a vpravo oocyt v kontrolní skupině – ve stádiu MI.

83

3) Fotografie oocytů po kultivaci s inhibitorem NOS AG (5mM) 48 hodin a následné reverzi 24 hodin v čistém médiu

Oocyty velikosti 120 µm s viditelným prvojádrem

V levo Oocyt velikosti 120 µm s viditelnými 2 prvojády. V pravo – 4 buněčné embryo vzniklé po inhibici plně kompetentního oocytu 48 hodin s AG (5 mM) a následnou reverzí 24 hodin v čistém médiu.

4) Fotografie oocytů po kultivaci s donorem NO SNAP

V pravo oocyt o velikosti 110 µm a vpravo o velikosti 120 µm kultivované s 0,1 mM SNAP. Oocyty jsou zastaveny ve stádiu pozdní diakineze

84

5) Fotografie oocytů po kultivaci s inhibitorem NOS aminoguanidinem společně s donorem NO SNAP

Vlevo – oocyt 120 µm kultivovaný s 5 mM AG + 0,1 mM SNAP – stádium zárodečného váčku. Vlevo – oocyt s částečnou meiotickou kompetencí (110 µm) s 0,1 mM 5 mM AG + 0,1 mM SNAP – stádium rozpadu zárodečného váčku (GVBD).

V levo: Oocyt velikosti 110 µm ve stádiu MI po kultivaci s 5 mM AG + 0,1 mM SNAP. Vpravo: Oocyt velikosti 110 µm ve stádiu MI po kultivaci s 5 mM AG + 0,03 mM SNAP.

V levo – Atypický oocyt velikosti 120 µm po kultivaci s 5 mM AG + 1 mM SNAP

85