UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Farmaceutische Technologie Academiejaar 2013-2014
FORMULATIE VAN ANTIGENEN IN IMMUNOMODULERENDE NANOPARTIKELS VOOR KANKERVACCINATIE
Astrid D’HONDT Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. Ir. B. De Geest Commissarissen Prof. Dr. Apr. J.P. Remon Dr. S. De Koker
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Farmaceutische Technologie Academiejaar 2013-2014
FORMULATIE VAN ANTIGENEN IN IMMUNOMODULERENDE PARTIKELS VOOR KANKERVACCINATIE
Astrid D’HONDT Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Ir. B. De Geest Commissarissen Prof. Dr. Apr. J.P Remon Prof. Dr. S. De Koker
SAMENVATTING Aangezien de huidige behandelingsstrategieën voor kanker, een lage specificiteit hebben en gepaard gaan met een grote kans op herval, wordt er tegenwoordig meer en meer onderzoek gedaan naar nieuwe specifieke therapieën. Een veelbelovende therapie is immunotherapie, waarbij gebruik gemaakt wordt van het immuunsysteem voor de bestrijding van kanker. In deze masterproef wordt verder ingegaan op actieve immunotherapie, ook wel kankervaccinatie genoemd, waarbij antigenen geformuleerd worden tot partikels. De encapsulatie-efficiëntie van partikels met verschillende polymeer:eiwit ratio’s werd nagegaan, met OVA en BSA als modelantigenen. Via RAFT-polymerisatie werd een HPMA-coAPMA polymeer gesynthetiseerd. Antigenbindende eigenschappen werden geïntroduceerd op dit polymeer door de substitutie van een linkermolecule, PDPA of maleimidobutyric acid. De modelantigenen werden gesubstitueerd met SATP om beschermde thiolgroepen te introduceren. Reversibele PDP-partikels en niet reversibele maleimide-partikels in reducerend milieu werden verkregen. Om economische redenen werd de complexatie ook uitgevoerd met SATGgesubstitueerd modelantigen. Daarnaast werd, met het oog op een patiënt specifieke therapie, lysaat bereid. Lysaat werd ook gesubstitueerd met SATP en de encapsulatie-efficientië van de partikels werd nagegaan. Daarnaast werd de opname van de partikels in DC’s geanalyseerd met de flowcytometer. Tot slot werd een TLR-agonist, CL264, gesubstitueerd op HPMA-co-APMA. CL264 is een gekende maturatiemerker en zou de maturatie van DC’s moeten induceren met een hogere stimulatie van DC‘s en opname tot gevolg. Algemeen kon er via de ninhydrine assays besloten worden dat de substituties met PDP, maleimidobutyric acid, SATP, SATG en CL264 zijn doorgegaan. Via SDS-page en DLS kon er vastgesteld worden dat er weldegelijk partikels gevormd zijn en dat de PDP-partikels een hoger encapsulatie-efficiëntie hebben. Daarnaast gaf de complexatie met SATP-gesubstitueerde modelantigenen een beter resultaat dan niet-gesubstitueerde of SATG-gesubstitueerde. De opname voor de PDP-partikels was beter dan voor de maleimide-partikels. Hoe hoger de hoeveelheid OVA, hoe beter de opname. Een 100% verzadiging werd nog niet bereikt. In de toekomst kan er getracht worden de formulatie van partikels met lysaat te optimaliseren en zo een stap dichterbij te komen bij een patiënt specifieke therapie. Daarnaast kan er op vlak van maturatie ook nog een grote sprong voorwaarts worden gemaakt en is verder onderzoek noodzakelijk.
DANKWOORD
Graag wens ik mijn promotor Prof. Dr. Ir. Bruno De Geest, te bedanken voor de goeie hulp en raad gedurende deze thesis.
Grote dank gaat uit naar mijn begeleidster, Lien Lybaert, voor de dagelijkse begeleiding en steun om deze masterproef tot een goed einde te brengen.
Tot slot wil ik ook mijn ouders en mijn vriend Wannes bedanken om me te steunen op de momenten wanneer ik het nodig had.
INHOUDSOPGAVE 1
INLEIDING ........................................................................................................................................ 1 1.1
HET IMMUUN SYSTEEM .......................................................................................................... 1
1.1.1
Algemeen......................................................................................................................... 1
1.1.2
B-cellen ............................................................................................................................ 2
1.1.3
T-cellen ............................................................................................................................ 2
1.1.4
De antigen presenterende cellen .................................................................................... 4
1.2
KANKER .................................................................................................................................... 7
1.2.1
Algemeen......................................................................................................................... 7
1.2.2
Behandeling ..................................................................................................................... 8
1.3
VACCINS ................................................................................................................................... 9
1.3.1
Algemeen......................................................................................................................... 9
1.3.2
Kankervaccinatie ........................................................................................................... 10
1.3.3
Partikels ......................................................................................................................... 11
2
OBJECTIEVEN ................................................................................................................................. 13
3
MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................................................... 15 3.1
POLYMEER ............................................................................................................................. 15
3.1.1
Algemeen....................................................................................................................... 15
3.1.2
RAFT-polymerisatie ....................................................................................................... 15
3.1.3
PDPA-substitutie............................................................................................................ 16
3.1.4
NHS/EDC-substitutie...................................................................................................... 19
3.1.5
Maleimide-substitutie ................................................................................................... 20
3.2
OVALBUMINE EN BOVINE SERUM ALBUMINE ...................................................................... 22
3.2.1
SATP-substitutie ............................................................................................................ 22
3.2.2
SATG-substitutie ............................................................................................................ 25
3.3
LYSAAT ................................................................................................................................... 26
3.3.1
Algemeen....................................................................................................................... 26
3.3.2
Aanmaak cultuurmedium .............................................................................................. 26
3.3.3
Lysaatbereiding ............................................................................................................. 27
3.3.4
SATP-substitutie ............................................................................................................ 28
3.4
POLYMEER-ANTIGENCOMPLEXATIE ...................................................................................... 28
3.4.1
PDP-complexatie ........................................................................................................... 28
3.4.2
Maleimide-complexatie................................................................................................. 30
3.4.3
Encapsulatie-efficiëntie ................................................................................................. 31
3.4.4 3.5
OPNAME PARTIKELS IN DENDRITISCHE CELLEN .................................................................... 35
3.5.1
Algemeen....................................................................................................................... 35
3.5.2
Aanmaak fluorescente partikels .................................................................................... 35
3.5.3
Flowcytometer .............................................................................................................. 36
3.6
4
Dynamic Light Scattering ............................................................................................... 34
MATURATIE ........................................................................................................................... 38
3.6.1
Algemeen....................................................................................................................... 38
3.6.2
CL264-substitutie........................................................................................................... 38
RESULTATEN EN DISCUSSIE ........................................................................................................... 39 4.1
PARTIKELS .............................................................................................................................. 39
4.1.1
RAFT-polymerisatie ....................................................................................................... 39
4.1.2
PDP-substitutie .............................................................................................................. 39
4.1.3
Maleimide-substitutie ................................................................................................... 40
4.1.4
SATP-substitutie ............................................................................................................ 40
4.1.5
SATG .............................................................................................................................. 40
4.1.6
PDP-complexatie ........................................................................................................... 41
4.1.7
NHS-complexatie ........................................................................................................... 45
4.1.8
Maleimide-complexatie................................................................................................. 45
4.2
OPNAME ................................................................................................................................ 48
4.2.1 4.3
Flowcytometer .............................................................................................................. 48
MATURATIE ........................................................................................................................... 50
4.3.1
CL264-substitutie........................................................................................................... 50
5
CONCLUSIE .................................................................................................................................... 51
6
BRONNEN ...................................................................................................................................... 53
7
BIJLAGEN ....................................................................................................................................... 55
LIJST MET AFKORTINGEN ACVA: azobis-4-cyanovaleriaanzuur APC’s: antigen presenterende cellen APMA: aminopropylmethacrylamide APS: amoniumpersulfaat BSA: bovine serum albumin CD: cluster of differentiation antigen CTL: cytoxische T-lymfocyten DC’s: dendritische cellen DMEM: dulbecco’s modified eagle medium DMSO: dimethylsulfoxide DMTMM: 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride EDC: N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide EDTA: ethyleendiaminetetra-azijnzuur FBS: foetaal kalfserum FSC: forward scatter HPMA: hydroxypropylmethacrylamide INF-γ: interferon gamma IL: interleukine LAF: laminar air flow MES: 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid MHC: major histocompatibility complex MWCO: molecular weight cut off
NHS: N-hydroxysuccinimide NK-cellen: natural killer cellen NMR: nuclear magnetic resonance NOD: nucleotide oligomerization domein OVA: ovalbumine PAMP’s: pathogen-associated molecular patterns PBS: phosphate buffered saline PDPA: 3-(2-Pyridyldithio)propaanzuur PFA: paraformaldehyde PRR’s: pattern recognition receptors RAFT: reversible addition-fragmentation chain transfer RPMI: Roswell Park Memorial Institute SATP: N-succinimidyl S-acetythiopropionaat SPDP: N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)proprionaat SDS: sodiumdodecylsulfaat SDS-page: sodium dodecylsulfaat polyacrylamide gele elektroforese SSC: side scatter Th-cellen: T helpercellen Tc-cellen: cytotoxische T-cellen TGF β: transforming growth factor beta TEMED: N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine TNF-α: tumornecrosefactor alfa TLR: toll-like receptor Tregs: regulatoire T-cellen
1 1.1
INLEIDING HET IMMUUN SYSTEEM
1.1.1 Algemeen Het immuunsysteem is hét verdedigingssysteem van ons lichaam tegen vreemde indringers en is verantwoordelijk voor de afweer tegen pathogenen, bacteriën en virussen en het elimineren van lichaamsvreemde cellen, tumorcellen en gemodificeerde lichaamscellen. Naast deze beschermende functie heeft het immuunsysteem echter ook een aantal ongewenste effecten, zoals een gevoel van onbehagen, weefselschade door te sterke of te lang aanhoudende inflammatie en een overgevoeligheids- of allergische reactie. (Hubbell, Thomas, & Swartz, 2009; Murphy, Porrett, & Turka, 2011) Het
immuunsysteem
verdedigingsmechanismen:
het
kan
worden
aangeboren
opgedeeld
in
immuunsysteem
twee en
verschillende het
adaptief
immuunsysteem. Het aangeboren immuunsysteem of de niet-specifieke immuniteit staat in voor de primaire verdediging tegen niet-lichaamseigen materiaal. Het is aanwezig vanaf de geboorte en daardoor niet antigen specifiek. De belangrijkste betrokken immuuncellen zijn macrofagen, neutrofielen, Natural Killer cellen (NK-cellen) en mastcellen. Deze afweerreactie wordt gekenmerkt door haar snelheid maar is vaak te zwak en wordt bijgestaan door het adaptief immuunsysteem. Het adaptief immuunsysteem of de verworven immuniteit daarentegen vormt de tweedelijns afweerreactie en treedt pas later in werking, aangezien deze telkens wordt voorgegaan door een lag fase of een periode waarin het adaptief immuunsysteem nog niet actief is. Deze immuniteit, die wordt verworven na de geboorte, is antigen specifiek en is in staat om geheugen op te bouwen zodat deze bescherming biedt bij herhaalde blootstelling. De hoofdrolspelers hier zijn voornamelijk T-cellen en B-cellen, ook wel lymfocyten genoemd. Ze dragen antigen receptoren, specifiek voor een welbepaald antigen. (Abbas & Janeway, 2000; Brody, Kohrt, Marabelle, & Levy, 2011; De Koker et al., 2011; Murphy et al., 2011) De samenwerking tussen het aangeboren en het adaptief immuunsysteem ontstaat door de dendritische cellen. De dendritische cellen (DC’s) worden verder nog uitvoerig besproken in 1.1.4. (Banchereau & Steinman, 1998) 1
1.1.2 B-cellen B-cellen ontwikkelen zich in de foetale lever en het beenmerg en staan in voor de humorale immuniteit. Afhankelijk van het type antigen zijn er één of meerdere signalen noodzakelijk voor efficiënte activatie van de B-cellen. De specifieke herkenning, via hun B-cel receptor, van een antigen staat in voor het eerste signaal. In het geval van T-cel onafhankelijke antigenen is dit signaal voldoende om B-cellen direct te stimuleren. Een voorbeeld hiervan zijn de lipopolysachariden afkomstig van bacteriën. Deze lipopolysachariden ook wel lipoglycanen genoemd, bevinden zich op de buitenmembraan van gram-negatieve bacteriën en zorgen voor hun structurele integriteit en bescherming. Voor T-cel afhankelijke antigenen is hulp van de T-helper -cellen (Th-cellen) noodzakelijk voor complete activatie van de B-cellen. Na activatie prolifereren de naïeve B-cellen en differentiëren ze tot B-effector- of plasmacellen. Deze produceren antilichamen die specifiek het antigen herkennen. Daarnaast ontwikkelen er zich ook geheugen B-cellen waardoor bij een tweede contact van het lichaam met het antigen een veel snellere immuunrespons zal geïnduceerd worden. (De Koker et al., 2011; Hubbell et al., 2009; Wang, Singh, Zeng, King, & Nema, 2007) 1.1.3 T-cellen T-cellen staan in voor de cellulaire immuniteit en ontwikkelen zich initieel in het beenmerg. De finale maturatie vindt echter plaats in de thymus. De herkenning van antigenen door Tcellen gebeurt door middel van de antigen specifieke T-cel receptor. In tegenstelling tot de Bcellen, die antigenen herkennen in oplosbare vorm, herkennen T-cellen antigenen in associatie met het major histocompatibility complex (MHC). De T-cel familie bevat verschillende subpopulaties. De indeling gebeurt op basis van cluster of differentation antigen of CD-moleculen die bepaalde types van eiwitten onderscheiden aanwezig op de T-cellen. De twee grootste klassen T-cellen zijn de T-helpercellen (Th-cellen of CD4+ T-cellen) en de cytotoxische T-cellen (Tc-cellen, cytotoxische T-lymfocyten (CTL) of CD8+ T-cellen). De Thcellen zijn CD4-positief en kunnen opgedeeld worden in Th1- en Th2-cellen. Th1-cellen secreteren interferon gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor α (TNF-α) en zetten macrofagen, NK-cellen en voornamelijk dendritische cellen aan om het micro-organisme intracellulair te vernietigen. De Th2-cellen secreteren interleukine 4 en 5 (IL-4,IL-5) en hun voornaamste functie is hulp bieden aan B-cellen voor de aanmaak van antilichamen door 2
cytokinevrijstelling. De cytotoxische T-cellen zijn CD8-positief en staan in voor het doden van viraal geïnfecteerde cellen en tumorcellen door het secreteren van cytokines, granzymes en perforines. (Abbas & Janeway, 2000; De Koker et al., 2011; Hubbell et al., 2009; Reddy et al., 2008) Naïeve T-cellen hebben drie signalen nodig voor activatie tot mature T-cellen (Figuur 1.1). De antigen presenterende cellen (APC’s) nemen antigenen op en presenteren de peptiden, na verwerking, samen met een MHC-molecule op hun celoppervlak. De T-cel herkent zowel de MHC-molecule als het peptide via zijn T-cel receptor. Bij dit eerste signaal dienen CD4 of CD8 als co-receptor, die de binding versterkt tussen de T-cel en de MHC-molecule. De interactie tussen de co-stimulatoire liganden, CD80 en CD86, aanwezig op de APC’s en CD28 receptor op de T-cel zorgt voor het tweede signaal. De APC’s secreteren hierbij inflammatoire cytokines die verantwoordelijk zijn voor het derde signaal. Na activatie ontstaan er T-effectorcellen en T-geheugencellen uit de naïeve T-cellen door proliferatie en differentiatie. (De Koker et al., 2011; Hubbell et al., 2009; Jensen, 2007; Murphy et al., 2011)
Figuur 1.1: Initiatie van naïeve T-cel tot T-effectorcel vereist 3 signalen (De Koker et al., 2011)
3
1.1.4 De antigen presenterende cellen De antigen presenterende cellen kunnen opgedeeld worden in drie verschillende soorten: de B-cellen, de dendritische cellen en de macrofagen. APC’s zijn noodzakelijk voor de presentatie van peptiden of antigenen aan T-cellen via een MHC-molecule. MHC-moleculen presenteren peptidefragmenten afkomstig van pathogenen of eiwitten. Er bestaan twee klassen van MHC-moleculen, MHC I- en MHC II-moleculen . MHC I-moleculen binden antigenen van endogene oorsprong terwijl MHC II-moleculen enkel antigenen binden van exogene oorsprong (Figuur 1.2). (De Koker et al., 2011; Hamdy, Haddadi, Hung, & Lavasanifar, 2011; Hubbell et al., 2009; Jensen, 2007) De MHC I-moleculen komen op alle lichaamscellen met een kern tot expressie. De proteïnen of antigenen aanwezig in het cytosol van een geïnfecteerde cel worden door een proteasoom afgebroken in peptiden en migreren naar het endoplasmatisch reticulum. De peptiden worden daar gebonden op een MHC I-molecule na versmelting van beide vesikels. Het MHC I-peptidecomplex wordt getransporteerd naar het celoppervlak en wordt herkend door de T-cel receptor van de CD8+ T-cellen of cytotoxische T-cellen. (Banchereau & Steinman, 1998; De Koker et al., 2011; Hubbell et al., 2009; Jensen, 2007) De MHC II-moleculen zijn niet aanwezig in alle lichaamscellen maar beperken zich tot de drie APC’s: de B-cellen, de macrofagen en de DC’s. Via endocytose worden proteïnen opgenomen in de cel waarna het endosoom versmelt met een proteasoom en het antigen wordt afgebroken tot peptiden door middel van lyozymes. De peptiden wordt vervolgens gebonden op MHC II-moleculen, gepresenteerd op het celmembraan en herkend door CD4+ T-cellen of T-helpercellen via hun T-cel receptor. (De Koker et al., 2011)
4
Figuur 1.2: De drie verschillende pathways voor antigenpresentatie. (Figuur uit Kurts, 2000)
1.1.4.1 Dendritische cellen De APC’s spelen een belangrijke rol in de activatie van het adaptief immuunsysteem wanneer een pathogeen ons lichaam binnendringt. De dendritische cellen herkennen zeer specifiek het lichaamsvreemd materiaal en vormen de belangrijkste schakel in het efficiënt activeren van het immuunsysteem. Dendritische cellen zijn uitermate interessant omdat ze tot cross-presentatie in staat zijn (Figuur 1.2). Cross-presentatie is een fenomeen waarbij ondanks materiaal extracellulair wordt opgenomen en afgebroken wordt tot peptidefragmenten, deze toch gepresenteerd worden op een MHC I- molecule en een cytotoxische T-lymfocyten respons (CTL-respons) kan teweeg brengen. Hierdoor is een dendritische cel, die niet geïnfecteerd is door een intracellulaire bacterie of virus, toch in staat deze af te doden. Dit proces is van groot belang bij het bestrijden van tumorcellen. Tumorcellen ontwikkelen zich uit normale weefselcellen en zijn dus geen APC’s waardoor geen CTL-respons kan veroorzaakt worden. Tumorcellen bezitten namelijk geen co-stimulatoire liganden om de cytotoxische T-cellen te activeren. Wanneer cross-presentatie optreedt kunnen de CTL’s wel worden geactiveerd, specifiek tegen de maligne cellen die vervolgens zeer efficiënt de tumorcellen zullen elimineren. Bij vaccinatie, waarbij een antigen wordt toegediend, is dit proces van cruciaal belang. (Banchereau & 5
Steinman, 1998; Jensen, 2007; Kurts, 2000; Palucka & Banchereau, 2012; Steinman & Banchereau, 2007) Immature DC’s worden gekenmerkt door een groot vermogen in de opname en de verwerking van antigenen maar zijn zwak in het stimuleren van de T-cel immuniteit. Als immature perifere dendritische cellen in contact komen met een antigen, nemen ze die antigenen op via endocytose en worden ze geactiveerd, gevolgd door maturatie (Figuur 1.3). De geactiveerde dendritische cellen secreteren verschillende cytokines afhankelijk van het soort stimulatie. Deze cytokines zullen naast het stimuleren van het aangeboren immuunsysteem ook de maturatie en migratie van dendritische cellen induceren. De geactiveerde dendritische cellen migreren via het lymfevatensysteem naar de naburige lymfeknopen waar ze de lymfocyten, die continu hercirculeren tussen het bloed en de lymfoïde organen, stimuleren. Men spreekt nu van mature DC’s. Deze zijn gespecialiseerd in het stimuleren van T-cellen. Omwille van die reden is maturatie enorm belangrijk, zeker met het oog op immunotherapie wat verder in 1.2.2 nog uitvoerig wordt besproken. (Cella, Sallusto, & Lanzavecchia, 1997; Tan & O'Neill, 2005) In de lymfeknopen bevinden zich verder ook residuele dendritische cellen die op hun beurt ook gestimuleerd kunnen worden weliswaar door antigenen die als dusdanig gemigreerd zijn via de lymfevaten. (Banchereau & Steinman, 1998; Hamdy et al., 2011; Steinman & Banchereau, 2007; Tewari, Sahai, Mishra, Shukla, & Shukla, 2012) Dendritische cellen zijn zeer efficiënt in de herkenning en opname van micro-organismen. Ze steunen namelijk op een receptorsysteem: de pattern recognition receptors (PRRs), die specifiek vreemd materiaal herkent waardoor de opname en activatie zeer efficiënt gebeurt maar ook de maturatie wordt geïnduceerd. Dendritische cellen brengen een breed spectrum van PRRs op hun celoppervlak tot ontwikkeling. Deze oppervlaktereceptoren herkennen geconserveerde microbiële structuren, ook wel de pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) genoemd, zoals lipiden, proteïnen, of lipoproteïnen. De grootste klassen van PRRs zijn de Toll-like receptoren (TLRs), scavenger receptoren en de nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptoren. (Hennessy, Parker, & O'Neill, 2010; Hubbell et al., 2009; Silva, Videira, Gaspar, Preat, & Florindo, 2013)
6
De dendritische cellen zijn het meest efficiënt in het presenteren van antigenen en zijn gespecialiseerd in het activeren van B- en T-cellen. Ze stimuleren onmiddellijk naïeve T-cellen aangezien zij zowel MHC I-, MHC II-moleculen als co-stimulatoire liganden hebben. In tegenstelling tot de DC’s dienen B-cellen en macrofagen eerst zelf geactiveerd te worden vooraleer ze co-stimulatoire liganden tot expressie kunnen brengen. Daarom is de voornaamste functie van dendritische cellen presentatie van antigenen, terwijl de macrofagen zich eerder richten op de eliminatie van pathogenen en de B-cellen op de productie van antilichamen. Ook de typische structuur van de dendritische cellen zorgt ervoor dat ze bijzonder competent zijn voor het presenteren van antigenen aan T-cellen. (Banchereau & Steinman, 1998; Hamdy et al., 2011; Kurts, 2000; Steinman & Banchereau, 2007)
Figuur 1.3: Overzicht van de verschillende aangrijpingspunten van dendritische cellen. ( Figuur uit Tewari et al., 2012)
1.2
KANKER
1.2.1 Algemeen Kanker is wereldwijd één van de grootste doodsoorzaken. (Aly, 2012) Kanker ontwikkelt zicht vanuit een normaal gezonde cel, die door een genetisch defect muteert en uitgroeit tot een abnormale cel. Met als gevolg dat de cel zich ongecontroleerd begint te vermenigvuldigen en een tumor begint te vormen (Figuur 1.4). Een tumor kan goedaardig of kwaadaardig zijn. In het geval van een kwaadaardige tumor spreken we van kanker en kan er 7
metastase optreden. Een goedaardige tumor kan verwijderd worden door chirurgie en zorgt meestal voor geen verdere complicaties. (Aly, 2012; Murphy et al., 2011; Sarkar et al., 2013) Kankercellen produceren antigenen die kunnen worden herkend door het immuunsysteem. Tumoren kunnen echter op tal van manieren het immuunsysteem onderdrukken. Enerzijds kunnen ze zich verbergen voor het immuunsysteem en anderzijds kunnen ze de immuuncellen uitschakelen. Tumoren zijn namelijk in staat een immunosuppressief milieu te creëren. Ze secreteren immunosuppressieve factoren zoals IL10 en transforming growth factor bèta (TGFβ). Alsook activeren en trekken ze regulatoire Tcellen (Tregs) aan. Deze spelen een belangrijke rol bij auto-immuunziekten waarbij lichaamseigen cellen aangevallen worden door het immuunsysteem. Tregs zorgen namelijk voor het onderdrukken van de immuunrespons. Anderzijds is de expressie van bepaalde oppervlaktemoleculen beduidend lager bij sommige tumoren, zoals de MHC I-moleculen en hebben ze geen co-stimulatoire liganden. (Beyer & Schultze, 2006; Rabinovich, Gabrilovich, & Sotomayor, 2007; Tewari et al., 2012) 1.2.2 Behandeling Indien mogelijk, probeert men initieel de tumor chirurgisch te verwijderen. Dit gebeurt veelal in combinatie met chemotherapie waarbij wordt gebruik gemaakt van cytostatica of anti-kankergeneesmiddelen, die de abnormaal groeiende cellen vernietigen of de groei ervan inhiberen. Daarnaast bestaat er ook nog radiotherapie, die ook vaak in combinatie met de andere therapieën wordt aangewend. Bij radiotherapie worden de cellen aangetast door middel van straling. De kankercellen zullen niet verder groeien of afsterven. Het nadeel van chemo- en radiotherapie is dat ze niet specifiek zijn en ook gezonde cellen aantasten met de nodige nevenwerkingen tot gevolg. Beide therapieën doden voornamelijk snel delende cellen af waaronder ook normale lichaamscellen die zich snel delen zoals bloedcellen, haarwortelcellen en slijmvliescellen. (Aly, 2012; Hamdy et al., 2011) Deze standaardmethoden zijn in staat de primaire tumor te verwijderen maar vaak groeit de tumor terug door onvolledige eliminatie en de aanwezigheid van micro-metastasen. Samen met het probleem van de vele nevenwerkingen van de huidige therapieën is de nood naar een nieuwe en betere therapie groot. Een nieuwe veelbelovende therapie is immunotherapie. Immunotherapie is een tumor specifieke behandeling. Door gebruik te 8
maken van het immuunsysteem tracht de therapie, naast het vermijden van metastasen en zo de kans op herval te verminderen, ook de kwaliteit van leven te verbeteren door het effect op gezonde cellen te minimaliseren en zo ongewenste effecten te voorkomen. Immunotherapie kan onderverdeeld worden in passieve en actieve immunotherapie. (Aly, 2012; Hamdy et al., 2011; Palucka & Banchereau, 2012) Bij passieve immunotherapie wordt een immuunrespons geïnduceerd doordat enerzijds monoklonale antilichamen en anderzijds ex vivo ontwikkelde effectormoleculen, zoals B-cellen, T-cellen of dendritische cellen, worden toegediend aan de patiënt. Passieve immunotherapie steunt niet op het immuunsysteem van de patiënt zelf. Omdat het immuunsysteem van de patiënt zelf vaak onderdrukt is door de aanwezigheid van tumoren of door eerder gebruikte medicatie, biedt dit een groot voordeel. Het nadeel echter, is dat resistentie kan optreden door mutatie of down regulatie. Bij actieve immunotherapie daarentegen, ook kankervaccinatie genoemd, worden antigenen toegediend. Het immuunsysteem van de patiënt zelf staat in voor de aanmaak en efficiënte activatie van de immuuncellen. Dit resulteert in een sterke en tumor specifieke immuunrespons en is tevens in staat om een immunologisch geheugen op te bouwen. (Brody et al., 2011; Hamdy et al., 2011; Palucka & Banchereau, 2012) 1.3
VACCINS
1.3.1 Algemeen Het basisprincipe van vaccinatie is het toedienen van een antigen waardoor het immuunsysteem wordt gestimuleerd en een zekere immuniteit wordt opgebouwd zonder de ziekte zelf te veroorzaken. (Aly, 2012; Foged, Hansen, & Agger, 2012; Reddy et al., 2007) Het toedienen van verzwakte levende pathogenen voor vaccinatie vormen de eerste generatie van vaccins. Dit zijn zeer goed werkende vaccins, maar het grote nadeel is dat ze niet veilig zijn. De kans bestaat er immers in dat ze de ziekte zelf veroorzaken. Met als gevolg dat er meer en meer overgeschakeld werd naar subunit vaccins. Deze zijn een stuk veiliger omdat enkel een deel van het pathogeen wordt gebruikt. De verzwakte levende pathogenen bevatten naast antigenen ook pathogen-associated molecular patterns, die specifiek worden herkend door de pattern recognition receptors van de dendritische cellen en andere
9
immuuncellen. Subunit vaccins hebben geen PAMP’s en zijn daardoor minder immunogeen waardoor co-formulatie met adjuvantia noodzakelijk is om een efficiënte immuunrespons te induceren. (De Koker et al., 2011; Foged et al., 2012; Hamdy et al., 2011) 1.3.2 Kankervaccinatie Kankervaccins kunnen een ideale behandeling zijn omdat het zeer specifiek werkt en het onder andere een immunologisch geheugen kan opbouwen. (Aly, 2012; Bachmann & Jennings, 2010; Brody et al., 2011; Palucka & Banchereau, 2012; Smith, Simon, & Baker, 2013) De vaccins zoals ze nu bestaan (zoals bijvoorbeeld de griepvaccins), ook wel preventieve vaccins genoemd, bevatten antigenen in combinatie met adjuvantia. Ze stimuleren voornamelijk B-cel- en Th2-gemedieerde immuniteit. Voor de bestrijding van kanker zijn immers curatieve vaccins nodig, die een immuunrespons onder leiding van de Th1en cytotoxische T-cellen te weeg brengen. De Th1-cellen stimuleren de APC’s. Tc-cellen zijn in staat geïnfecteerde cellen of tumorcellen te doden. Cross-presentatie is hier van essentieel belang. De dendritische cellen zijn hier in, zoals eerder vermeld, het meest bekwaam en vormen een ideale target voor kankervaccins. (Bachmann & Jennings, 2010; Brody et al., 2011; Hamdy et al., 2011; Silva et al., 2013; Tewari et al., 2012) Het gebruik van synthetische Toll-like receptoragonisten als adjuvantia veroorzaakt een meer efficiënte targeting naar en activatie van DC’s. De antigenen lijken door het gebruik van TLR-agonisten veel meer op micro-organismen voor DC’s omdat ze namelijk door de DC’s gezien worden als een PAMP, die met de pattern recognition receptor op de DC’s kan binden. Dit heeft een verhoogde activatie en maturatie van DC’s tot gevolg. Afhankelijk van het type TLR-agonist geeft dit aanleiding tot een Th1- of een Th2-gemedieerde immuniteit. TLRagonisten activeren naast de DC’s ook tal van andere componenten van het immuunsysteem zoals weergegeven in Figuur 1.4. Aangezien DC’s het breedste repertoire aan TLR’s bevatten, zullen deze optimaal gestimuleerd worden door TLR-agonisten. (Hennessy et al., 2010; Hubbell et al., 2009; Napolitani, Rinaldi, Bertoni, Sallusto, & Lanzavecchia, 2005; Reddy et al., 2008; Schlosser et al., 2008; Smits, Ponsaerts, Berneman, & Van Tendeloo, 2008)
10
TLR AGONIST
Figuur 1.4: Schematische weergave van de effecten van TLR-agonisten op de verschillende componenten van het immuunsysteem voor de bestrijding van tumoren (Figuur uit Smits et al., 2008)
1.3.3 Partikels Naast het gebruik van adjuvantia, zoals TLR-agonisten, om een meer efficiënte en grotere immuunrespons uit te lokken, kan men ook de formulatie van de antigenen gaan beïnvloeden. Het formuleren van antigen en adjuvantia onder de vorm van micro- of nanopartikels biedt enkele voordelen. Het verhoogt namelijk de kans op een simultane opname van antigen en adjuvantia. Een simultane opname is noodzakelijk voor zowel een stimulatie en maturatie van DC’s als voor een sterke T- en B-cel immuniteit. Dit wordt weergegeven in Figuur 1.5. (Schlosser et al., 2008; Slutter et al., 2010) Daarnaast bootsen de partikels de grootte na van virussen en bacteriën, waardoor ze beter worden herkend en veel efficiënter worden opgenomen door de dendritische cellen. Ze beschermen het antigen ook tegen enzymatische afbraak en tegen interacties met andere moleculen. (Brody et al., 2011; Hamdy et al., 2011; Moon, Huang, & Irvine, 2012; Reddy et al., 2008; Silva et al., 2013; Smith et al., 2013) Tot slot blijkt uit recente studies dat cross-presentatie veel efficiënter verloopt. (De Koker et al., 2011; Foged et al., 2012)
11
De ideale grootte voor opname door DC’s zijn partikels met een grootte tussen de 50 nm en 5 µm, dit is namelijk gelijkend aan de dimensie van micro-organismen en virussen. Zowel micro- als nanopartikels worden gebruikt. Het verschil tussen beide ligt in de targeting. De micropartikels moeten opgenomen worden door de perifere DC’s waarna deze DC’s via actief transport de lymfeknopen bereiken. De nanopartikels daarentegen kunnen namelijk ook via passieve diffusie de lymfeknopen bereiken, waar ze opgenomen worden door de residuele DC’s. (De Koker et al., 2011; Moon et al., 2012; Reddy et al., 2008; Silva et al., 2013) Voornamelijk worden emulsies, lyposomen en polymeerpartikels gebruikt om een partikel te formuleren. In deze masterproef werd geopteerd voor nanopartikels met polymeren. (Bachmann & Jennings, 2010; De Koker et al., 2011; Hamdy et al., 2011; Moon et al., 2012; Reddy et al., 2008; Silva et al., 2013; Smith et al., 2013)
A
B
C
Figuur 1.5: A) toediening van antigenen zonder adjuvantia leidt niet tot maturatie en T- of B-cel immuniteit, B) toedienen van een mengsel met antigen en adjuvantia zorgen voor maturatie maar niet voor een sterke T-cel of B-cel respons, C) toediening onder de vorm van antigen-adjuvantia conjugaat verhoogt de simultane opname en zorgt zowel voor maturatie als voor een sterke T-cel respons en antilichaamproductie. (Figuur uit Slutter et al., 2010).
12
2
OBJECTIEVEN De huidige maatregelen voor de bestrijding tegen kanker zijn door hun lage selectiviteit
onderhevig aan vele bijwerkingen. Daarnaast is de kans op herval enorm groot. Onderzoek naar een nieuwe specifieke en betere behandelingsstrategie is volop aan de gang. Immunotherapie blijkt veelbelovend. Deze therapie tracht tumoren te bestrijden door gebruik te maken van het immuunsysteem. Meer specifiek, actieve immunotherapie of kankervaccinatie, beschermt het lichaam en bouwt tevens een immunologische geheugen op. In deze masterproef zal het formuleren van partikels met behulp van de modelantigenen BSA en OVA, dit met het oog op actieve immunotherapie, worden onderzocht. Hiervoor zal eerst een HPMA-co-APMA polymeer gesynthetiseerd worden via RAFT-polymerisatie. Aan de hand van linkermoleculen zal het polymeer worden gecomplexeerd met de modelantigenen. Voor de eerste linkermolecule zal er worden geopteerd voor reductiegevoelige disulfidebindingen, een PDPA-molecule, aangezien zij een hoge antigenvrijstelling in APC’s garanderen en thiolgroepen op het polymeer introduceren. Op BSA en OVA worden er beschermde thiolgroepen geïnduceerd door de substitutie van SATP, die na ontscherming spontaan reageren met HPMA-co-APMA-PDP. Ter vergelijking zullen er partikels gevormd worden met een niet-reductiegevoelige NHS ester, maleimidebutyric acid, als linkermolecule. Zowel de reduceerbaarheid als de encapsulatieefficiëntie van de twee verschillende soorten partikels zullen geanalyseerd worden via SDSpage. Tot slot zal de opname door DC’s van beide partikels bestudeerd en vergeleken worden met de flowcytometer, door gebruik te maken van verschillende fluoroforen. Daarnaast zal lysaat bereid worden, waarmee ook partikels zullen worden gevormd. Dit met het oog op patiënt specifieke therapie. Antigenen met OVA en BSA heeft namelijk geen zekerheid op succes. Het is immers niet voorspelbaar of een patiënt de antigenen zal herkennen en het immuunsysteem zal geactiveerd worden. Lysaat daarentegen is tumor specifiek en kan genomen worden van de tumor van de patiënt. Na de formulatie tot partikels, kunnen ze worden toegediend aan de patiënt, die nu wel met zekerheid de antigenen zal herkennen.
13
Tot slot zal ook een TLR-agonist als maturatiemerker worden gebruikt. In deze masterproef wordt geopteerd voor CL264, die voor de maturatie van DC’s zorgt en die een veel efficiëntere stimulatie van de gewenste immuniteit geeft.
14
3 3.1
MATERIAAL EN METHODEN POLYMEER
3.1.1 Algemeen Als polymeer werd er gebuikt gemaakt van het co-polymeer van HPMA (of N-(2hydroxylpropyl)methylacrylamide) en APMA (of N-(3-aminopropyl-methylacrylamide), HPMA-co-APMA. Vervolgens werden antigenbindende eigenschappen geïntroduceerd via substitutie, al dan niet reversibel in reducerend milieu. 3.1.2 RAFT-polymerisatie HPMA-co-APMA
werd
gesynthetiseerd
via
RAFT-polymerisatie
(reversible
addition−fragmentation chain transfer), weergegeven in Figuur 3.1. Dit is een speciale vorm van radicalaire polymerisatie waarbij in vergelijking met de gewone polymerisatie de ketenlengte en polydispersiteit goed onder controle kan worden gehouden (Figuur 3.2). (http://www.sigmaaldrich.com/materials-science/polymer-science/raft-polymerization.html (30-3-2014)) 3.1.2.1 Materialen HPMA (Polysciences Inc, Warrington, U.S.), APMA (Polysciences Inc, Warrington, U.S.), 1-4
dioxaan
(Sigma-aldrich,
St
Louis,
U.S),
CTA
of
4-cyano-4-
phenylcarbonothioylthiopentaanzuur (Raft agent, Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.) en ACVA of 4,4’-azobis(4-cyanovaleriaanzuur) (initiator, Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.). 3.1.2.2 Methode Voor een polymerisatie met 80/20% HPMA/APMA werden volgende hoeveelheden afgewogen: 5,0 g HPMA, 1,560 g APMA, 121,16 mg CTA (RAFT agent) en 61,16 mg ACVA (initiator). In een schlenktube werden HPMA en APMA samen opgelost in 10 L milli-Q H20. CTA werd opgelost in 5,61 mL 1.4-dioxaan en daarna toegevoegd aan de polymeeroplossing. ACVA werd opgelost in 3,09 mL milli-Q water en druppelsgewijs toegediend. Met behulp van 8 ‘freeze-pump-thaw’ cyclussen was de oplossing voldoende ontgast. De oplossing werd hiervoor eerst ingevroren in vloeibaar stikstof (N2), daarna werd het zuurstof (O2) boven de
15
oplossing verwijderd door de schlenktube aan te sluiten op de vacuümpomp. Tot slot werd de schlenktube in een beker met warm water geplaatst tot alles terug ontdooid was. Deze laatste stap zorgde ervoor dat de O2, die nog aanwezig was in de oplossing, naar boven werd verplaatst wegens onderdruk. Daarna werd de vacuümpomp afgesloten en werd het gehele proces herhaald. Een ballon gevuld met N2 werd bevestigd aan de schlenktube en de oplossing werd geduurde 24 uur geïncubeerd in een oliebad van 70 °C. De initiator radicaliseert namelijk bij een temperatuur van 60-65 °C. Hierna werd de oplossing geprecipiteerd in aceton bij 0 °C en gefilterd door middel van een Whatman filter aangesloten op een vacuümpomp. Het staal werd in de vacuümoven geplaatst voor enkele dagen. De oplossing werd ook nog gedialyseerd bij een cut off moleculair gewicht van 3.5 kDa. Tot slot werd een staal genomen voor H-NMRanalyse (nuclear magnetic resonance).
Figuur 3.1: RAFT-polymerisatie van HPMA en APMA met behulp van CTA als RAFT agent en ACVA als initiator.
Figuur 3.2: RAFT-polymerisatie.
3.1.3 PDPA-substitutie Het co-polymeer werd gesubstitueerd met pyridyldisulfidegroepen, aangezien deze hoge antigenvrijstelling en opname garanderen (Torres & Gait, 2012) . Dit kan men later koppelen aan proteïnen voor het formuleren van partikels die reversibel zijn in reducerend milieu. Voor het invoeren van pyridyldisulfidegroepen werd vaak gebruik gemaakt van SDPP (N-succinimidyl-3-2-pyridyldithio)propionaat), die met zijn reactieve aminogroep, het NHSester, vlot reageert met het polymeer. Het nadeel is dat SDPP een heel duur product is. PDPA (3-(2-Pyridyldithio)propaanzuur) is een stuk goedkoper maar bevat geen reactieve aminogroep, alleen maar een OH-groep, die niet reactief is. De OH-groep kan worden geactiveerd via DMTMM. Waardoor deze spontaan zal reageren met aminogroepen, 16
afkomstig van APMA van het polymeer met vorming van een stabiele amine binding, zoals weergegeven in Figuur 3.3. De target voor de substitutie was 20% (ongeveer 20% APMA in HPMA-co-APMA). 3.1.3.1 Materiaal HPMA-co-APMA (nummer 1068), DMTMM of 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4methylmorpholinium chloride (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), PDPA (nummer 1056), PBS of phosphate buffered saline (Gibco by llife technologies, Paisley, UK), DMSO of dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.) en dialysemembraan MWCO 3.5 kDA (Spectrumlaboratories, Rancho Dominguez, U.S.). 3.1.3.2 Methode 2,0 g polymeer werd opgelost in 400 mL PBS, hieraan werd 1,255 g DMTMM toegevoegd. Er werd 650 mg PDPA afgewogen en opgelost in 60 mL DMSO. Dit werd druppelsgewijs toegevoegd aan de polymeeroplossing. Indien de oplossing troebel was, werd nog extra DMSO toegevoegd. De oplossing werd dan gedurende 1 nacht geïncubeerd op de roerplaat en daarna gedialyseerd over het weekend bij een cut off moleculair gewicht van 3.5 kDA. De oplossing werd dan ingevroren en gelyofiliseerd . Tot slot werd nog een staal genomen voor de analyse via H-NMR en werd het rendement van de substitutie bepaald via een ninhydrine assay.
Figuur 3.3: PDPA-substitutie.
17
3.1.3.3 Ninhydrine assay Een ninhydrine assay wordt gebruikt om het aantal vrije aminogroepen te bepalen. Ninhydrine reageert met zowel primaire als met secundaire amines en vormt hierbij een gekleurd product, dat spectrofotometrisch kan bepaald worden bij 570 nm. Na substitutie daalt het aantal vrije aminogroepen per polymeer en zo kan dan het rendement van substitutie bepaald worden. 3.1.3.3.1 Materiaal Ninhydrine reagent solution (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), HPMA-co-APMA (nummer 1068), HPMA-co-APMA-PDP (nummer 1069), NaHCO3 (Fagron, Waregem, België), ethanol 96% v/v (Fagron, Waregem, België), azijnzuur (Biosolve BV, Valkenwaard, Nederland) en een UV-1650PC spectrofotometer (Schimadzu, Suzhou Instruments Manufacturing Co Ltd, China). 3.1.3.3.2 Methode In een maatbeker werd 50 mg HPMA-co-APMA opgelost in 75 mL 0.1 M NaHCO3. Een 0.05% glaciaalzuur stockoplossing werd aangemaakt. De proefbuizen werden gevuld zoals weergegeven in Tabel 3.1. Tabel 3.1: Ninhydrine assay: Ninhydrine: afvullen van de proefbuizen voor het opstellen van de ijklijn op basis van standaarden.
Standaard 0
Standaard 1
Standaard 2
Standaard 3
Standaard 4
VHPMA-co-APMA(mL)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
Vglaciaalzuur0.05% (mL)
2
1,5
1,0
0,5
0
Vninhydrine (mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
5,0
5,0
10 min. koken (90 °C) Vethanol (mL)
5,0
5,0
5,0
Dit werd voor elke standaard in drievoud uitgevoerd en op basis hiervan werd een ijklijn opgesteld. Daarnaast werd ook 5,0 mg HPMA-co-APMA-PDP opgelost in 37,5 mL 0,1 M 18
NaHCO3 op de roerplaat. De proefbuizen werden op de zelfde wijze in drievoud gevuld als weergegeven in tabel 3.1 volgens standaard 1 en 2, maar in plaats van de HPMA-co-APMA stockoplossing werd de HPMA-co-APMA-PDP stockoplossing gebruikt. Dit gebeurde ook in drievoud. De spectrofotometer werd gekalibreerd ten opzichte van water en blanco op een golflengte van 570nm en de absorbantie werd gemeten van elk staal. Indien de absorbantie groter was dan 1, dan werden alle stalen verdund met ethanol. 3.1.4 NHS/EDC-substitutie De substitutie werd aangewend om partikels te creëren die niet reversibel zijn. De opname van deze partikels kan dan vergeleken worden met de partikels die wel reversibel zijn. 3.1.4.1 Materiaal MES hydraat of 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), NaCl (abc chemicals, Woutersbrakel, België), Ovalbumine (Whortington, Lakewood, U.S.), EDC of N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S), NHS of N-hydroxysuccinimide (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), HPMA-CoAPMAsuccinaat (nummer 1050), hydroxylamine HCl (Sigma-Aldrich, St-Louis, U.S), β-βmercapto-ethanol (Bio-rad laboratories, U.S.) en DMSO ( Sigma-Aldrich, St Louis, U.S). 3.1.4.2 Methode Voor de activatiebuffer was een concentratie van 0,1 M MES en 0.,5 M NaCl vereist. Hiervoor werd 2,1722 g MES en 2,9222 g NaCl opgelost in 100 mL gedestilleerd water. De pH werd gelijk gesteld op een waarde van 6 met een 1 M NaOH oplossing. De 5 maal geconcentreerde OVA stockoplossing (1 mg/mL) werd bereid door 50 mg op te lossen in 10 mL activatiebuffer en de HPMA-co-APMA~succinaat stockoplossing door 158 mg op te lossen in 10 mL activatiebuffer. De stockoplosing van EDC (2 mM) , NHS (5 mM) en hydroxylamine HCl (om eindconcentratie van 5 mM sulfo-NHS te bekomen) werden bereid door 80 mg EDC in 800 µL activatiebuffer op te lossen, 210 mg NHS in 2100 µL activatiebuffer en 340 mg hydroxylamine in 1700µL activatiebuffer. Omdat NHS en EDC, wanneer opgelost in waterig milieu, zeer gevoelig zijn aan hydrolyse werd hetzelfde protocol ook eens uitgevoerd waarbij NHS en EDC opgelost waren in DMSO en waarbij NHS en EDC direct als poeder waren 19
toegevoegd. De verschillende polymeer:eiwit ratio’s werden bereid zoals weergegeven in Tabel 3.2. Tabel 3.2: EDC/NHS-substitutie: bereiding van de verschillende ratio’s. A (1:1)
B (5:1)
C (10:1)
D (20:1)
Polymeer stock
125 µL
625 µL
1,25 mL
2,5 mL
Activatie buffer
4,8 mL
4 mL
3 mL
1 mL
EDC stock
20 µL
100 µL
200 µL
400 µL
NHS stock
55 µL
275 µL
550 µL
1100 µL
Reactie
15 min. (kamerT)
15 min. (kamerT)
15 min. (kamerT)
15 min. (kamerT)
Β-mercapto-ethanol
7 µL
35 µL
70 µL
140 µL
OVA stock
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Reactie
2 uur (kamerT)
2 uur 2 uur (kamerT) (kamerT)
2 uur (kamerT)
Hydroxylamine stock
41,6 µL
208 µL
832 µL
416 µL
Van elke ratio werden stalen (30 µL) genomen voor gelelektroforese (zie 3.4.3.2). Alsook werd voor elke ratio een blanco-oplossing van OVA ter controle bereid. Dit door een hoeveelheid activatiebuffer aan 1 mL OVA stockoplossing toe te voegen zodat het totaalvolume gelijk is als in de Tabel 3.2 (voor A werd 5,049 mL activatiebuffer toegevoegd, 5,243 mL voor B, 5,486 L voor C en 5,972 mL voor D). 3.1.5 Maleimide-substitutie Het polymeer werd gesubstitueerd met maleimidobutyric acid (Figuur 3.4). De later gevormde partikels zijn niet reversibel en het verschil in opname werd dan vergeleken met de reversibele partikels waar PDP gesubstitueerd polymeer werd gebruikt. Net zoals bij de PDPsubstitutie was de target van de substitutie ook hier 20%.
20
3.1.5.1 Materiaal HPMA-co-APMA (nummer 1068), DMSO (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), DMTMM (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), MBA of maleimidobutyric acid (Fluka BioChemika), dialysemembraan MWCO 3.5kDA (Spectrumlaboratories, Rancho Dominguez, U.S.) 3.1.5.2 Methode Er werd 0,30661 g HPMA-co-APMA opgelost in 6,1322 mL DMSO op de roerplaat. Indien de oplossing nog niet helder was, werd extra DMSO toegevoegd. Eerst werd 177,83 mg DMTMM toegevoegd. Wanneer alles goed opgelost was, werd 79,72 mg MBA toegevoegd. De oplossing, bedekt met parafilm, werd nog voor een nacht op de roerplaat geplaatst en werd daarna gedialyseerd met behulp van een dialysemembraan MWCO 3,5 kDA voor een dag. Daarna werd de oplossing ingevroren en gelyofiliseerd. Na lyofilisatie werd een H-NMR staal genomen en werd een ninhydrine assay uitgevoerd. De ninhydrine assay gebeurde op dezelfde manier als beschreven in 3.1.3.3.
Figuur 3.4: Maleimide-substitutie.
21
3.2
OVALBUMINE EN BOVINE SERUM ALBUMINE
3.2.1 SATP-substitutie SATP (N-succinimidyl S-acetythiopropionaat) bevat een NHS ester waardoor het in staat is om te reageren met de primaire aminogroepen van eiwitten via een nucleofiele aanval. SATP wordt gebruikt om beschermde thiolgroepen te introduceren (Figuur 3.5). Deze kunnen ontschermd
worden
door
middel
van
hydroxylamine.
(http://www.piercenet.com/instructions/2160126.pdf, (16-3-2014)) 3.2.1.1 Materiaal OVA of ovalbumine (Whortingtin, Lakewood, U.S.), BSA of bovine serum albumin (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), SATP (Thermo Scientific, Rockford, U.S.), PBS (Gibco by Life Technologies, Paisley, UK), droge DMSO (molecular probes by life technologies, New York, U.S.), een PD-10 desalting kolom (GE healthcare, Chicago, U.S.) en spectrofotometer (Schimadzu, Suzhou Instruments Manufacturing Co Ltd, China). 3.2.1.2 Methode Er werden 10 tabletten PBS opgelost in 2 L gedestilleerd water. Per eiwit werd een oplossing van 40 mL aangemaakt met een optimale proteïneconcentratie van 120 µM of 120x10-6 mmol per mL. De SATP-oplossing werd bereid met een concentratie van 81,55 x 10-3 mmol per mL en 40 mg werd opgelost in 2 mL droge DMSO (MWSATP: 245,25 g/mol). De molaire ratio eiwit:SATP bedroeg 1:15, dus per mL eiwitoplossing was 1.8 x 10-3 mmol SATP of 22 µL SATP-oplossing nodig. Per eiwitoplossing van 40 mL was 880 µL SATP-oplossing nodig. Deze twee oplossingen werden per eiwit samengevoegd in 40 mL tube. Voor BSA werd ook de ratio 1:30 bereid. Hiervoor werd 79,2 mg in 10 mL PBS opgelost en was er 44 µL SATP-oplossing per mL eiwitoplossing nodig. Er werd 440 µL SATP-oplossing samengevoegd met de eiwitoplossing. De stalen werden voor 45-50 min. op de shaker geplaatst (kamertemperatuur). Daarna werden beide stalen opgezuiverd. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een PD10 desalting kolom, die zorgt voor de scheiding van de hoge moleculaire moleculen van de lage. De kleine zoutmoleculen en onzuiverheden werden langer vastgehouden in kolom dan de moleculen met hoog moleculair gewicht. Het zijn de eerste fracties met hoog moleculair gewicht, het gesubstitueerd eiwit, die achteraf werden behouden. Vooreerst werd de kolom, 22
verwijderd van kapje en aanwezige vloeistof, onderaan opengeknipt en bevestigd met klemmen aan een bar. De kolom werd dan vijfmaal gespoeld met 5 mL PBS. Als er geen PBS meer uitdruppelt werd er 2,5 mL proteïne-SATP-oplossing toegevoegd die niet werd opgevangen. Dan werd 3,5 mL PBS op de kolom aangebracht, die werd opgevangen in fracties van 0,5 mL. Er werd nog een extra mL PBS aangebracht en opgevangen per 0,5 mL. Daarna werd er weer 5 maal gespoeld met PBS en werd het hele proces herhaald tot de stalen volledig door de kolom gepasseerd waren. Tot slot werd de absorbantie gemeten van elke fractie bij 280 nm, nadat de spectrofotometer gekalibreerd was ten opzichte van water en water. Aan elke fractie werd 0,5 mL gedestilleerd water toegevoegd om een meetbaar volume te verkrijgen en na meting werd met een pasteurpipet het staal terug uit de cuvet gehaald. De gewenste fracties werden dan overgebracht in verschillende vooraf afgewogen vials, ingevroren en gelyofiliseerd. Er werd ook nog een ninhydrine assay uitgevoerd om de koppeling van SATP op OVA en BSA na te gaan.
Figuur 3.5: SATP-substitutie.
23
3.2.1.3 Ninhydrine assay 3.2.1.3.1 Materiaal Ninhydrine reagent solution (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S) , azijnzuur (Biosolve BV, Valkenswaard, Nederland), ethanol 96% v/v (Fagron, Waregem, België), OVA (Worthington, Lakewood, U.S.), BSA (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), OVA-SATP, BSA-SATP en UV-1650 spectrofotometer (Shimadzu, Suzhou Instruments Manucfacturing Co Ltd, China). 3.2.1.3.2 Methode Een 0,05% glaciaalzuur stockoplossing werd aangemaakt. Een stockoplossing van 50 µM OVA en BSA werd bereid door 21,5 mg OVA en 33,0 mg BSA op te lossen in 10 mL 0.05% glaciaalzuur. De BSA stockoplossing werd 12 maal verdund en de OVA stockoplossing werd verdund volgens een 1:3 verhouding met 0,05% glaciaalzuur. Wegens grote kans op precipitatie van OVA, werd een 0,01% tween20-oplossing toegevoegd. Een ijklijn werd opgesteld door het afvullen van de proefbuizen volgens Tabel 3.3. Elke standaard werd in drievoud bereid. Voor de stalen, OVA-SATP en BSA-SATP, werd zelfde procedure gevolgd. Alleen werden nu enkel de proefbuizen in drievoud afgevuld volgens standaard 2 en 3. Tabel 3.3: Ninhydrine assay: afvullen van de proefbuizen voor het opstellen van de ijklijn op basis van standaarden.
Standaard 0
Standaard 1
Standaard 2
Standaard 3
Standaard 4
VStock eiwitopl (mL)
0
0,5
1,0
1,5
2
VWater(mL)
2,0
1,5
1,0
0,5
0
VNihydrine(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
5,0
5,0
10 min. koken (90 °C) Vethanol(mL)
5,0
5,0
5,0
24
Na kalibreren van de spectrofotometer ten opzichte van blanco (standaard 0) en water bij een golflengte van 570nm, werd de absorbantie van elk staal gemeten. Er werd aangelengd met ethanol indien de absorbantie groter was dan 1. 3.2.2
SATG-substitutie SATG (S-Acetylthioglycolic acid pentafluorophenyl ester) werd om dezelfde redenen
gebruikt als SATP maar is een stuk goedkoper (zie Figuur 3.6). 3.2.2.1 Materiaal OVA (Whortingtin, Lakewood, U.S.), BSA (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), SATG (Thermo Scientific, Rockford, U.S.), PBS (Gibco by Life Technologies, Paisley, UK), droge DMSO (molecular probes by life technologies, New York, U.S.) en PD-10 desalting kolom (GE healthcare, Chicago, U.S.). 3.2.2.2 Methode Ongeveer hetzelfde protocol als voor de SATP-substitutie werd toegepast (zie 3.2.1). Per eiwit werd 7,5 mL bereid en werd zowel een eiwit:SATP ratio van 1:10 en 1:15 toegepast. Er werd tweemaal 59,4 mg BSA en 38,7 mg OVA afgewogen en opgelost in 7,5 mL PBS. Er werd 20 mg SATG opgelost in 1 mL droge DMSO, een concentratie van 66,62 mmol/mL werd bekomen. De optimale eiwitconcentratie bedroeg 120 x10-6 mmol per mL. Voor de 1:10 ratio was 1,2 x 10-3 mmol of 18 µL SATG per mL eiwitoplossing nodig. Voor de 1:15 ratio was 1.8x103
mmol of 27 µL SATG per mL eiwitoplossing nodig. Een totaal volume van 675 µL SATG-
oplossing was nodig voor de vier eiwitoplossingen van 7,5 mL. Aan elke eiwitoplossing werd de nodige hoeveelheid SATG-oplossing toegediend. Men liet de reactie voor gedurende 45-50 min. doorgaan op de shaker (kamertemperatuur). De opzuivering gebeurde ook hier met een PD-10 kolom en er werd op dezelfde manier te werk gegaan als in 3.2.1. Daarna werd alles gelyofiliseerd. Na lyofilisatie werd de ninhydrine analyse uitgevoerd zoals beschreven in 3.2.1.3.
25
Figuur 3.6: SATG-substitutie.
3.3
LYSAAT
3.3.1 Algemeen Lysaat wordt geproduceerd wanneer cellen kapot gemaakt worden. De lyse van cellen kan onder andere enzymatisch of door osmose gebeuren. Lysaat bevat de inhoud van gelyseerde cellen. Voor de lysaatbereiding werden B16 OVA cellen gebruikt. B16 OVA cellen zijn afkomstig van een gemodificeerde melanoom-cellijn van muizen die OVA tot expressie brengen. De cellen werden continu gekweekt in cultuurflessen die verdund werden wanneer de cultuur confluent was. Voor de verdunning werden de cellen eerst losgemaakt met celdissociatiebuffer en hieruit werd dan een bepaalde hoeveelheid gepipetteerd en aangelengd met cultuurmedium volgens de gewenste verdunning. 3.3.2 Aanmaak cultuurmedium 3.3.2.1 Materiaal Foetaal kalfserum of FBS (Gibco by life technologies, NY, U.S.), L-glutamine (200mM, Gibco by life technologies, NY, U.S.), pyruvaat (100 mM, Gibco by life technologies, NY, U.S.), streptomycine/penicilline (5000 units penicilline, 5000 µg streptomycine per mL, Gibco by life technologies, NY, U.S.), Dulbecco’s Modified Eagle medium of DMEM (Gibco by life technologies, NY, U.S.), RPMI of Roswell Park Memorial Institute (Gibco by life technologies, 26
NY, U.S), SFCA Serum filter Unit 500 mL (NalgeNUnc International, NY, U.S.) en LAF-kast (Nuaire, Plymouth, U.S) 3.3.2.2 Methode Naargelang de cellijn werd er voor een bepaald medium gekozen. Voor de B16 OVA cellen maakte men gebruik van het medium DMEM. Hieraan moest standaard nog 50 Ll FBS en 10 mL streptomycine/penicilline aan worden toegevoegd. Pyruvaat (5 mL) en/of glutamine(5 mL) werden toegevoegd indien nodig. De nodige hoeveelheden FBS, streptomycine, pyruvaat en glutamine werden uit de 500 mL fles van DMEM gehaald, die werd leeggegoten bovenop de SFCA Serum Filter. De genoemde elementen werden ook overgebracht op de filter. Het vacuümsysteem werd aangesloten en het medium werd gefilterd. Als dendritische cellen zouden gebruikt geweest zijn, werd hetzelfde protocol toegepast. Alleen werd dan een RPMI medium en FBS-DC in plaats van FBS gebruikt. 3.3.3 Lysaatbereiding 3.3.3.1 Materiaal B16 OVA cellen, celdissociatiebuffer (Gibco by life technologies, NY, U.S.), PBS zonder magnesium en calcium (Gibco by life technologies, NY, U.S.) en Centrifuge (Heraeus Electro Nite, Houthalen, België). 3.3.3.2 Methode Er werd 10 mL celdissociatiebuffer in elke cultuurfles van 50 mL toegediend. De fles werd voor gedurende 15 min. terug in de oven geplaatst. De 10 mL dissociatiebuffer werd dan overgebracht in een 40mL tube. Dit werd gecentrifugeerd gedurende 5 min. bij 200 G en bij een temperatuur van 4 °C. Daarna werd er 3 maal gewassen met PBS zonder magnesium en calcium, dit door achtereenvolgens te hersuspenderen en opnieuw te centrifugeren. De cellen werden geteld met behulp van de telkamer van Burker-Turk, door 20 µL celsuspensie toe te voegen aan 180 µL tryptaanblauw en hiervan een deel over te brengen op de telkamer. De celoplossing werd overgebracht per fractie van 500 µL in tubes van 1,5 mL. Er werden 6 ‘freeze-pump-thaw’ cyclussen toegepast, het principe hiervan werd al eerder besproken in 3.1.2. Daarna werden de tubes voor 10 sec. in ijskoud water gesonificeerd en voor 50 sec. op ijs geplaatst, dit proces werd 6 keer herhaald. Bij een temperatuur van 4 °C en 5000 G werd 27
er voor 10 min. gecentrifugeerd. Het supernatans werd overgebracht in een vial, ingevroren bij -20 °C en gelyofiliseerd. 3.3.4 SATP-substitutie De SATP-substitutie gebeurde op identieke wijze als beschreven in 3.2.1. Exact hetzelfde protocol als voor OVA werd gevolgd. Er werd een ratio eiwit:SATP van 1:15 aangemaakt. 3.4
POLYMEER-ANTIGENCOMPLEXATIE
3.4.1 PDP-complexatie Voor de complexatie van SATP-gesubstitueerde proteïnen met HPMA-co-APMA-PDP werd via deacetylatie de thiolgroepen ontschermd door het toevoegen van hydroxylamine (Figuur 3.7). De vorming van de partikels gebeurd door de spontane reactie van de vrijgekomen thiolgroepen met de pyridylsulfidebruggen van HPMA-co-APMA-PDP (Figuur 3.8). 3.4.1.1 Materiaal Hydroxylamine HCL (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), Na2EDTA of ethyleendiaminetetraazijnzuur (Fagron, Waregem, België), NaOH of natriumhydroxide (Fagron, Waregem, België), OVA (Worthington, Lakewood, U.S.), BSA (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), lysaat (zelf aangemaakt), HPMA-co-APMA-PDP (nummer 1069), OVA-SATP, BSA-SATP en PBS (Gibco by Life Technologies, Paisley, UK). 3.4.1.2 Methode De deacetylatiebuffer werd bereid door 1,74 g HCl (0,5 M) en 0,365 g Na2EDTA (25 mM) op te lossen in 40 mL PBS en aan te lengen tot een volume van 50 mL met gedestilleerd water. De pH werd met behulp van een 0.1 M NaOH-oplossing tussen de 7,2-7,5 gebracht. De stockoplossingen van proteïnen en polymeer hadden allen een concentratie van 0,555 mM in PBS. Van zowel OVA (stockoplossing A), OVA-SATP (stockoplossing B), BSA (stockoplossing C), BSA-SATP (stockoplossing D) werd 10 mg opgelost in 1 mL PBS. Voor de stockoplossing van het polymeer werd voor OVA en OVA-SATP 4,19 mg HPMA-co-APMA-PDP per mL PBS opgelost (stockoplossing G). Voor de BSA en BSA-SATP complexatie werd 2,73 mg HPMA-co-APMA-PDP 28
per mL PBS opgelost (stockoplossing H). Voor lysaat werd er in een 10 maal hoger concentratie gewerkt. Voor lysaat (stockoplossing E) en lysaat-SATP (stockoplossing F) werd een 10 mg eiwit per 100 µL PBS eiwitstockoplossing aangemaakt en een 41,9 mg HPMA-co-APMA-PDP per mL PBS polymeerstockoplossing (stockoplossing I). Er werd gebruik gemaakt van verschillende HPMA-co-APMA-PDP:proteïne ratio’s: 1:1, 2:1, 2.5:1 3:1, 4:1. De partikels werden bereid zoals weergegeven in Tabel 3.4. Tabel 3.4: Complexatie: aanmaak partikels.
1:1
2:1
2.5:1
3:1
4:1
A/B/C/D/E/F (µL)
100
100
100
100
100
PBS (µL)
700
600
550
500
400
G/H/I (µL)
100
200
250
300
400
DA buffer (µL)
100
100
100
100
100
De partikels werden gedurende 2 uur geïncubeerd op kamertemperatuur. Ook werden er blancostalen gemaakt. Dit door van elke stock eiwitoplossing (A-F) 100 µL te nemen en 900 µL PBS aan toe te voegen. Tot slot werden er stalen genomen voor gelelektroforese om de encapsulatie-efficëentie na te gaan. Alsook werden de partikels met de ideale ratio in triplicaat aangemaakt voor analyse met image J. Dit wordt verder nog besproken in 3.4.3.
Figuur 3.7: Deacetylatie van de beschermde thiolgroepen van SATP door middel van hydroxylamine.
29
Figuur 3.8: PDP-complexatie.
3.4.2 Maleimide-complexatie HPMA-co-APMA-maleimide is door de aanwezigheid van een NHS ester zeer reactief en zal spontaan reageren met een eiwit die al dan niet gesubstitueerd is met SATP, zoals weergegeven in Figuur 3.10. Het resultaat zijn niet reductiegevoelige partikels. 3.4.2.1 Materiaal BSA (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), OVA (Whortington, Lakewood, U.S.), OVA-SATP, BSA-SATP, HPMA-co-APMA-Maleimide (nummer 1070) en PBS (Gibco by Life Technologies, Paisley, UK). 3.4.2.2 Methode Voor de eiwitstockoplossingen, werd 10 mg BSA/OVA/BSA-SATP/OVA-SATP opgelost in 10 mL PBS (1 mg/mL) en voor de polymeerstockoplossingen werd 2,73 mg HMPA-co-APMAMaleimide voor BSA en BSA-SATP en 4,19 mg voor OVA en OVA SATP in 10 mL PBS opgelost. Eerst werd enkel gebruik gemaakt van de verschillende polymeer-maleimide:BSA ratio’s, 10:1, 20:1 en 50:1. Voor de 10:1 ratio werd 1000 µL van de polymeeroplossing genomen, voor 20:1 30
2000 µL en voor 50:1 5000 µL. Hieraan werd voor elke ratio 100 µL eiwitoplossing aan toegevoegd. Dit werd 2 tot 3uur geïncubeerd bij kamertemperatuur, daarna werd een staal genomen voor gelelektroforese. De overige oplossing liet men verder complexeren en de volgende dag werd opnieuw een staal genomen voor gelelektroforese (zie 3.4.3.2). Dit werd ook toegepast voor BSA-SATP 1:15, OVA-SATP 1:15. Zelfde methode als hierboven werd gebruikt, alleen werden nu de polymeer-maleimide:eiwit ratio’s 5:1, 10:1, 15:1 en 20:1 aangemaakt. Een staal voor gelelektroforese werd nu na 2 uur incubatie genomen. Tot slot werden, zowel voor de niet gesubstitueerd als voor de SATP-gesubstitueerde eiwitten, de partikels met ratio 10:1 en 50:1 in drievoud gemaakt voor analyse met image J.
Figuur 3.9: Maleimide-HPMA-co-APMA substitutie.
3.4.3 Encapsulatie-efficiëntie De graad van complexatie wordt nagegaan aan de hand van SDS-page (sodium dodecylsulfaat polyacrylamide gele elektroforese). De scheiding gebeurt op basis van het moleculaire gewicht van de eiwitten. Er ontstaan afzonderlijk banden van individuele moleculen evenredig met hun lading tot massa verhouding. Door verhogen van de temperatuur en het gebruik van een laemli buffer met SDS worden de proteïnen gedenatureerd, waardoor een negatieve lading ontstaat in verhouding tot hun lengte, zie Figuur 3.10. Tijdens het runnen van de gel richting de anode of positieve pool worden de proteïnen gescheiden volgens moleculair gewicht. 31
Figuur 3.10: Het effect van SDS op de conformatie en lading van proteïnen (Figuur van website http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf, (16-4-2014) pag 11).
Zowel de encapsulatie-efficiëntie van de verschillende ratio’s van het eiwit met en zonder SATP werden met elkaar vergeleken. De ideale ratio voor complexatie kan dan worden bepaald. Alsook werd de reduceerbaarheid van de partikels getest door β-mercapto-ethanol toe te voegen. En tot slot kan bepaald worden hoeveel eiwit er precies geëncapsuleerd werd aan de hand van image J analyse. Hiervoor werden de partikels met bepaalde ratio in triplicaat gemaakt en er werd gebruik gemaakt van commerciële gels. Een voorbeeld van een plot en selectie van de banden op SDS-page voor image J analyse worden weergegeven in Bijlage 1. 3.4.3.1 Aanmaken gels 3.4.3.1.1 Materiaal Trometamol of TRIS (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), Glycine (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), Acrylamide (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), Bisacrylamide (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), APS of amoniumpersulfaat (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), TEMED of
N,N,N′,N′-
Tetramethylethyleendiamine (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), SDS of sodiumdodecylsulfaat (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.) en HCl (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.). 3.4.3.1.2 Methode Eerst werd een APS 10% oplossing gemaakt, hiervoor werd 100 mg APS toegevoegd aan 1 mL gedestilleerd water. Voor de 30% bisacryamide:acrylamide (1:37,5) oplossing werd 4,383 g acrylamide en 117 mg bisacrylamide in 15 mL gedestilleerd water opgelost. Daarna werden de verschillende buffers aangemaakt. Voor de separating gel buffer werd 4 g SDS en 32
181,7 g TRIS in 800 mL gedestilleerd water opgelost. De pH werd tot 8,8 gebracht met 6 M HCl-oplossing en de oplossing werd uiteindelijk aangelengd tot 1 L met gedestilleerd water. De stacking gel buffer werd bereid door 2 g SDS en 30,28 g TRIS op te lossen in 400 mL gedestilleerd water, de pH werd op 6.8 gebracht met 6 M HCl-oplossing en daarna werd de oplossing aangelengd tot 500 mL. De opstelling van de apparatuur ziet er uit als afgebeeld in Figuur 3.11. Voor de aanmaak van 40 mL separating gel (10%) werd achtereenvolgens 10,8 mL 30% bisacrylamide:acrylamide oplossing, 10 mL separating buffer, 19.2 mL gedestilleerd water, 400 µL APS 10% oplossing en 40 µL TEMED toegevoegd. Dit werd zo snel mogelijk tussen de 2 glaasjes tot net onder de groene boord gebracht met behulp van 5mL pipettor. Hierop werd dan een laag gedestilleerd water aangebracht. Dit had 30-45 min. de tijd nodig om te stollen. Het water op de gestolde gel werd verwijderd. De stacking gel werd aangemaakt door 3,2 mL 30% bisacrylamide:acrylamide oplossing, 5,2 mL stacking buffer, 12 mL gedestilleerd water, 200 µL APS 10% oplossing en 20 µL TEMED toe te voegen. Deze oplossing werd op de gestolde gel gebracht en de kammen werden bevestigd. Na 10-15 min. waren de gels gestold en klaar voor gebruik.
Figuur 3.11: Opstelling voor de aanmaak van gels voor gelelektroforese.
3.4.3.2 Gelelektroforese 3.4.3.2.1 Materiaal Laemli buffer (denaturatiebuffer, Biorad Laboratories, U.S.), β-mercapto-ethanol (Biorad Laboratories, U.S.), ladder of precision plus protein dual core standard (Biorad Laboratories, U.S.), Bio-Safe Coomassie G-250 Stain (kleurstof, Biorad Laboratories, U.S.), 33
Mini-PROTEAN Tetra Cell system (Biorad Laboratories, U.S.) en Eppendorf thermostat 5320 thermoblock (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S). 3.4.3.2.2 Methode Voor de stalen werd gebruikt van de partikels aangemaakt zoals in 3.4.1 en 3.4.2, van elk staal werd 30 µL genomen en hieraan werd 10 µL denaturatiebuffer of laemli4x aan toegevoegd. Om de reversibiliteit van de complexatie na te gaan werd 30 µL van elk staal en 10 µL denaturatiebuffer, 1:9 β-mercapto-ethanol:laemli4x, samengevoegd. Alle stalen werden 5 min. bij 95 °C in de thermoblock geplaatst. De gels werden bevestigd in de gelhouder en in het Mini-PROTEAN Tetra cell systeem geplaatst. Dit systeem werd gevuld met running buffer, die werd bereid door 2 g SDS, 6 g TRIS en 30,42 g glycine samen te voegen en aan te lengen tot 2 L gedestilleerd water. Vaak werd ook een 10 µL ladder geladen. Als alle stalen (max. 10 inclusief ladder) op de gel beladen zijn, werd het deksel op het systeem geplaatst. De stroombron werd op 150 V gezeten en de gel werd gerund tot het running front bijna tot op het einde van de gel was gemigreerd (30-45 min.). De gels werden na het runnen verwijderd uit de gelhouders en de glaasjes. De gels werden dan 3 maal 5min. gewassen op de shaker. Hierna werden de gels voor 1-12 uur geïncubeerd in Coomassie blauwe kleurstof en daarna nog 3 maal gewassen gedestilleerd water op de shaker. Tot slot werd nog een foto genomen van de gels, door de gels tussen een plastiek mapje te plaatsen. 3.4.4 Dynamic Light Scattering Om de grootte van de partikels te meten, werd gebruikt gemaakt Dynamic Light Scattering of DLS, die partikels kan meten met een grootte tussen 0,00015 µm en 10 µm. De PDP-partikels werden aangemaakt in een polymeer:eiwit ratio van 2:1 voor OVA- en BSASATP. De maleimide-partikels in een ratio van 50:1 en dit enkel voor BSA. 3.4.4.1 Materiaal DLS Zetasizer (Malvern, UK), Acrodisc Syringe Filter (1mm, 0.45µM, Walters,), Whatman Filter (0.22µM, GE healthcare, Chicago, U.S.), dialysemembraan MWCO 100 kDA (spectrumlaboratories, Rancho Dominguez, U.S) en LAF-kast (Nuaire, Plymouth, U.S).
34
3.4.4.2 Methode De partikels werden op exact dezelfde wijze bereid als beschreven onder 3.4.1 en 3.4.2, alleen werd alles nu stofvrij en zo steriel mogelijk aangemaakt. Voor de stockoplossingen werden de eiwitten en de polymeren afgewogen in steriele 1,5 mL en 15 mL tubes. Deze werden in de LAF-kast (laminar air flow) opgelost in PBS die gefilterd werd met een 0,22 µm filter. Ook de deacetylatiebuffer werd gefilterd. De partikels werden dan met een polymeer:eiwit ratio, voor maleimide 50:1 en voor PDP 2:1, in triplicaat bereid. Er werd geprobeerd om zoveel mogelijk in LAF-kast te werken. Na de incubatieperiode van 2 uur werden de partikels overnacht gedialyseerd met behulp van een dialysemembraan MWCO 100 kDa. Daarna werden zowel de polymeerstockoplossingen (HPMA-co-APMA-PDP en HPMA-co-APMA-maleimide) als de eiwitstockoplossingen (BSA en OVA) en de partikels gemeten met de DLS zetasizer. Dit gebeurde door voordien elk staal over een Acrodisc Syringe filter te brengen met behulp van een 1 mLl spuit (ongeveer 1.1 mL staal per cuvet). 3.5
OPNAME PARTIKELS IN DENDRITISCHE CELLEN
3.5.1 Algemeen De opname van de partikels in dendritische cellen is noodzakelijk voor het gewenste immunologische effect. De graad van opname werd nagegaan met de flowcytometer. De opname voor de PDP-partikels werd vergeleken met de opname voor de maleimide-partikels. 3.5.2 Aanmaak fluorescente partikels 3.5.2.1 Materialen Atto NHS 647 (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), Atto NHS 488 (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.), NaHCO3 (Fagron, Waregem, België), HPMA-co-APMA-PDP, droge DMSO (molecular probes by life technologies,), OVA Alexa 488 (molecular probes by life technologies, New York, U.S.), OVA Alexa 647 (molecular probes by life technologies, New York, U.S.), PBS (Gibco by life technoligies, Paisley, U.S.), deacetylatiebuffer, OVA-SATP, LAF-kast (Nuaire, Plymouth, U.S) en dialysemembraan MWCO 100 kDA (spectrumlaboratories, Rancho Dominguez, U.S).
35
3.5.2.2 Methode Het polymeer werd enerzijds gesubstitueerd op een Atto NHS 647 en een Ato NHS 488 fluorofoor. Hiervoor werd 100 mg HPMA-co-APMA-PDP opgelost in 20 mL van een 0,1 M NaHCO3 buffer met een Ph van 8.3. Het fluorofoor werd opgelost in 500 µL droge DMSO en werd daarna toegevoegd aan de polymeeroplossing. De oplossing werd, afgeschermd van licht, gedurende 24 uur geïncubeerd. Er werd gedialyseerd aan de hand van een dialysemembraan met MWCO 3,5 kDa. OVA-SATP werd fluorescent gemaakt met behulp van OVA Alexa 488/647, die in 2 mg/mL stockoplossing ter beschikking was. Er werd zo steriel en stofvrij als mogelijk gewerkt. Het maleimide-polymeer was echter niet fluorescent. De complexatie werd uitgevoerd in de LAF-kast. Voor de PDP-partikels werd 300 µL OVA-SATP stockoplossing (10 mg per mL gefilterd PBS) toegevoegd aan 60 µL van de OVA Alexa 647/488 stockoplossing (2 mg per mL), 1800 µL gefilterd PBS, 600 µL polymeer-Atto 647/488 stockoplossing (4.19 mg per mL gefilterd PBS) en 300 µL deacetylatie buffer (aangemaakt zoals beschreven in 3.4.1). Voor een ratio van 50:1 bij maleimide-complexatie werd 60 µL OVA-SATP stockoplossing (1 mg/mL gefilterd PBS), 60 µL OVA Alexa 647/488 stockoplossing (2 mg per mL) en 3000 µL polymeer-maleimide stockoplossing (4.19 mg per mL gefilterd PBS) samengevoegd. Voor beide soorten partikels liet men de reactie doorgaan voor 2 uur bij kamertemperatuur. Voor het opname-experiment 1 werden de fluoroforen OVA Alexa 647 en HPMA-co-APMA-PDP Atto 488 gebruikt. Voor het opname-experiment 2 de fluoroforen OVA Alexa 488 en HPMA-co-APMA-PDP Atto 647. 3.5.3 Flowcytometer De flowcytometer steunt op een techniek die microscopische kleine deeltjes in een stromende vloeistof telt en analyseert. Op de stromende vloeistof wordt een laserstraal gericht, de cellen passeren één voor één de laserstraal. Een aantal detectoren bevinden zich op het punt waar de straal de vloeistof passeert. Eén detector staat in lijn met de straal en meet de forward Scatter (FSC) of voorwaartse lichtverstrooiing. Een aantal detectoren staan loodrecht ten opzichte van de lichtstraal en meten de Side Scatter (SSC) of de zijwaartse lichtverstrooiing. Daarnaast bevinden zich er ook een aantal fluorescente detectoren. Via de verschillende detectoren wordt de lichtweerkaatsing en de fluorescentie gemeten van elke cel afzonderlijk. De lichtverstrooiing in deze proef werd afhankelijk van het fluorofoor 36
gemeten in verschillende kanalen, zo kan de fluorescentie van de verschillende fluoroforen tegelijk gemeten worden. Het FL-1 kanaal voor de 488 fluoroforen en het FL-4 kanaal voor de 647 fluoroforen. 3.5.3.1 Materiaal Flowcytometer (Accuri, BD Biosciences, U.S.), RPMI-CM (Gibco by life technologies, New York, U.S.), PBS zonder Mg en Ca (Gibco by life technologies, New York, U.S.), celdissociatiebuffer (Gibco by life technologies, New York, U.S.), Na2EDTA (Fagron, Waregem, België) en Centrifuge (Heraeus Electro Nite, Houthalen, België). 3.5.3.2 Methode De dendritische cellen werden in cultuur gehouden in een cultuurfles met medium RPMI-CM. Wanneer de fles voldoende confluent was, werden de cellen losgemaakt met celdissociatieuffer en geteld met de telkamer van Burker-Turk. Een 24 well plaat met 200.000 cellen per well werd gedurende 24 uur geïncubeerd. De maleimide- en PDP-partikels, zoals bereid in 3.5.2, werden toegevoegd (zie Tabel 3.4) met een oplopende concentratie. De concentratie aan OVA bedroeg voor beide partikels 1 mg/ml. Alles werd in drievoud uitgevoerd. De well plaat werd gedurende 24uur geïncubeerd in de incubator. Tabel 3.4: Toegevoegde volumes van partikels met oplopende concentratie OVA.
STAAL A B C D E F
Hoeveelheid OVA 0 µg 1 µg 2 µg 3 µg 4 µg 5 µg
Volume 0 µL 10 µL 20 µL 30 µL 40 µL 50 µL
Het medium werd verwijderd van elke well en 0,5-1 mL 10mM EDTA oplossing werd toegevoegd. Er werd zo lang als nodig geïncubeerd (15-30 min.). De celsuspensie werd overgebracht in epjes en er werd gecentrifugeerd voor 5 min. bij 300G en 0 C°. Het supernatans werd geïsoleerd en 200 µL PBS werd toegevoegd. Ieder staal werd dan gemeten met de FACS.
37
3.6
MATURATIE
3.6.1 Algemeen Naast opname is maturatie enorm belangrijk voor de optimale activatie van dendritische cellen. Een partikel gekoppeld aan een bepaalde maturatiemerker, bv een TLRagonist, is niet alleen in staat tot maturatie van de dendritische cel maar wordt door de DC’s beter herkend als vreemd materiaal met een betere opname tot gevolg. 3.6.2 CL264-substitutie CL264 is een gekende TLR-agonist en zorgt voor de gewenste activatie en de maturatie van dendritische cellen. CL264 werd gesubstitueerd op HPMA-co-APMA en kan later gebruikt wordt voor het maturatie-experiment van dendritische cellen. Voor de substitutie werd 2% getarget. 3.6.2.1 Materiaal HPMA-co-APMA, CL264 (molecular probes by life technologies, New York, U.S.), DMTMM (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S), milli Q water, dialysemembraan MWCO 3.5kDa (spectrumlaboratories, Rancho Dominguez, U.S). 3.6.2.2 Methode Er werd 20 mg HPMA-co-APMA opgelost in 2 mL milli Q water. Hieraan werd 1,365 mg DMTMM toegevoegd (aan de hand van de bereiding van een stockoplossing). 5 mg CL264 werd opgelost in 5 mL steriel water. Alles diende goed opgelost te zijn. Tot slot werd er 1,176 mL CL264-oplossing toegevoegd aan de polymeeroplossing. De oplossing werd over nacht op de roerplaat geïncubeerd. Daarna werd er gedialyseerd voor minimum 24 uur met een dialysemembraan MWCO 3,5 kDA. De oplossing werd ingevroren en in de droogviezer geplaatst voor een nacht. Er werd een H-NMR staal genomen. Alsook werd er een ninhydrine assay uitgevoerd, deze werd uitgevoerd zoals besproken in 3.1.3.3. De zelfde ijklijn werd gebruikt en er werd 2mg HPMA-co-APMA-CL264 opgelost in 5 mL NaHCO3 voor de stockoplossing. De proefbuizen werden op dezelfde wijze afgevuld.
38
4
RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1
PARTIKELS
4.1.1 RAFT-polymerisatie Via integratie van het H-NMR spectrum (Bijlage 2) van HPMA-co-APMA werd een 19,57% APMA-gehalte, van de 20% die er getarget was, bekomen. Dit leverde een rendement van 98.75% op. 4.1.2 PDP-substitutie 4.1.2.1 H-NMR In bijlage wordt het H-NMR spectrum weergegeven (Bijlage 3). Het PDP-gehalte die bekomen werd, bedroeg 4,25%. De target van de substitutie was 20%, wat een uiteindelijk rendement van 21,25% opleverde. 4.1.2.2 Ninhydrine-assay Om de hoeveelheid PDP gekoppeld aan HPMA-co-APMA te bepalen, werd gebruik gemaakt van de ijklijn weergegeven in Grafiek 4.1.
Ninhydrine HPMA-APMA 1 y = 10,962x - 0,0079 R² = 0,9963
Absorbantie
0,8 0,6
Series1
0,4
Linear (Series1)
0,2 0 0 -0,2
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
Concentratie (mg/mL)
Grafiek 4.1: Ijklijn voor de bepaling van het rendement van de PDPA-substitutie.
39
Het PDP-gehalte werd berekend aan de hand van de gemeten absorbantie (zie Bijlage 4). Van de 20% die getarget was, werd een gemiddelde substitutie van 18,60% bekomen. Wat een substitutie-efficiëntie van 93% opleverde. 4.1.3 Maleimide-substitutie 4.1.3.1 Ninhydrine assay De substitutie-efficiëntie werd berekend aan de hand van de ninhydrine assay. Hiervoor werd gebruik gemaakt van dezelfde ijklijn als bij de PDP-substitutie (Grafiek 4.1). De resultaten worden weergegeven in Bijlage 5. De gemiddelde substitutie was 19,57% en het rendement van de substitutie was 97,85%. 4.1.4 SATP-substitutie 4.1.4.1 Ninhydrine assay Aan de hand van de ijklijnen weergegeven in Bijlage 6, werd het rendement van de SATP-substitutie op BSA, OVA en lysaat bepaald. De ijklijn van OVA en lysaat zijn niet optimaal (R²<0.99), maar het rendement werd toch berekend. Aan de hand van de resultaten die weergegeven zijn in Bijlage 7, werd het gemiddelde rendement van de substitutie berekend. Voor BSA was dat 79,90%,voor OVA 85,93% en voor lysaat 70,91%. 4.1.5 SATG 4.1.5.1 Ninhydrine assay Hier werd gebruik gemaakt van de ijklijn van BSA en OVA zoals bij de SATP-substitutie (Bijlage 7). In Bijlage 8 worden de resultaten weergegeven. Voor BSA bedroeg het rendement van de 1:10 substitutie 78,29 % en voor de 1:15 substitutie 78,20%. Voor OVA respectievelijk 69,06% en 65,22%. 4.1.5.2 Encapsulatie-efficiëntie Op onderstaande Figuur 4.1 is duidelijk te zien dat de complexatie met BSA-SATG 1:15 veel minder efficiënt was in vergelijking met BSA-SATP 1:15. Dit kon verklaard worden door het verschil tussen SATG en SATP. De SATG-molecule heeft namelijk één binding extra in
40
vergelijking met de SATP-molecule waardoor er meer sterische hinder was en de substitutie waarschijnlijk daardoor minder efficiënt was.
Figuur 4.1: SDS-page van de complexatie van HPMA-co-APMA met BSA, BSA-SATP en BSA.
4.1.6 PDP-complexatie 4.1.6.1 Encapsulatie-efficiëntie De complexatie van OVA en BSA was al voldoende doorgegaan bij een ratio van 2:1, zoals weergegeven in Figuur 4.2 en 4.3. Wanneer werd gebruik gemaakt van eiwit die niet gesubstitueerd was op SATP, werden er geen partikels gevormd. Dit kwam omdat er geen reactieve thiolgroepen aanwezig zijn die kunnen reageren met de pyridylsulfide groepen van HPMA-co-APMA.
Complexatie met BSA vs BSA-SATP 1:15
Figuur 4. 2: SDS-page van de complexatie van HPMA-co-APMA-PDP met BSA versus die met BSASATP. 41
Complexatie met OVA vs OVA-SATP 1:15
Figuur 4.3: SDS-page van de complexatie van HPMA-co-APMA-PDP met OVA versus die met OVASATP.
De complexatie met een ratio eiwit:SATP van 1:15 en 1:30 werden met elkaar vergeleken (Figuur 4.4). Dit experiment werd enkel uitgevoerd met BSA. BSA-SATP 1:30 vertoonde een betere complexatie. Er werd zowel voor OVA als voor BSA toch voornamelijk verder gewerkt met de ratio 1:15 omdat de complexatie al voldoende hoog bleek te zijn en het dus niet zinvol was om verder te werken met ratio 1:30.
Figuur 4.4: SDS-page van de complexatie met BSA:SATP 1:30 versus BSA-SATP 1:30.
Er werd ook gekeken naar de reversibiliteit met behulp van β-mercapto-ethanol. De partikels waren duidelijk reversibel (zie Figuur 4.5 en 4.6). Daarnaast werd de complexatie ook uit gevoerd met lysaat, de SDS-page hiervan wordt weergegeven in Figuur 4.7. De complexatie lijkt geslaagd maar verder optimalisatie is nodig. De partikels zijn ook reversibel.
42
Figuur 4.5: SDS-page ter controle van de reversibiliteit van complexatie met BSA-SATP.
Figuur 4.6: SDS-page ter controle van de reversibilieit van complexatie met OVA-SATP.
Figuur 4.7: Links de SDS-page van de complexatie met lysaat en lysaat SATP 1:15 en rechts de SDSpage ter controle van de reversibiliteit van de complexatie.
4.1.6.2 DLS De DLS-resultaten werden verwerkt in graphpad en de grafieken voor complexatie met BSA-SATP 1:15 en OVA-SATP 1:15 worden weergegeven in Grafiek 4.2 en 4.3. De grootte van de gevormde partikels was groter dan het polymeer en het eiwit apart. Aan de hand hiervan en samen met de resultaten van SDS-page, kon besloten worden dat er weldegelijk partikels gevormd
zijn.
(Biedermann,
Rauwald,
Zayed,
&
Scherman,
2011)
. 43
Volume (procent)
OVA/HPMA-PDP/OVA PARTICLES 2:1
30
HPMA-PDP OVA OVA Particles 2:1
20
10
0 0.1
1
10
100
1000
10000
100000
Grootte (nm)
Grafiek 4.2: Volume (%) in functie van de grootte (nm) van de partikels, HPMA-co-APMA-PDP:OVASATP 2:1, gemeten met DLS. Volume (procent)
BSA/HPMA-PDP/BSA PARTIKELS 2:1
30
HPMA-PDP BSA
20
BSA partikels 2:1 10
0 0.1
1
10
100
1000
10000
100000
Grootte (nm)
Grafiek 4.3: Volume (%) in functie van de grootte (nm) van de partikels, HPMA-co-APMA-PDP:BSASATP 2:1, gemeten met DLS.
4.1.6.3 Image J Het percentage gebonden eiwit van de verschillende polymeer:eiwit ratio’s werd via image J met elkaar vergeleken. De grafieken worden weergegeven in Grafiek 4.4 en de resultaten in Bijlage 9 9. PDP-PARTIKELS: %gebonden OVA-SATP
PDP PARTIKELS: % gebonden BSA-SATP 100 80
72.4
77.2
79.2
81.5
86.4
20
40
65.3
76.0
80.4
3: 1
40
60
2: 1
60
1: 1
80
%gebonden
%gebonden
100
83.0
20
Ratio HPMA-PDP:OVA-SATP
0 4: 1
4: 1
3: 1
2. 5: 1
2: 1
1: 1
0
Ratio HPMA-PDP:BSA-SATP
Grafiek 4.4: Percentage gebonden eiwit van de PDP-partikels met OVA-SATP en BSA-SATP in de verschillende ratio’s via image J. 44
De partikels met ratio 2:1 werden in triplicaat gemaakt en geanalyseerd met image J. Het bekomen percentage was lager (zie Grafiek 4.5), maar was wel semi-kwantitatief. De bijhorende SDS-page en resultaten worden weergegeven in Bijlage 10. PDP-PARTIKELS MET OVA-SATP vs BSA-SATP: %gebonden eiwit via image j
%gebonden
80 60 40
71.2
66.1
20
-S A SA B
O
VA -S A
TP
TP
0
Ratio HPMA-PDP:eiwit 2:1
Grafiek 4.5: Percentage gebonden eiwit van PDP partikels in triplicaat gemaakt met ratio 2:1 via image J.
4.1.7 NHS-complexatie Zowel wanneer EDC en NHS werden opgelost in activatiebuffer of DMSO, als wanneer toegevoegd als gewoon poeder was de substitutie niet doorgegaan, dat is duidelijk te zien op de SDS-pages in Bijlage 11. De oorzaak hiervoor was waarschijnlijk omdat EDC en NHS niet meer actief waren wanneer het eiwit werd toegevoegd. EDC en NHS kunnen namelijk in waterig milieu hun activiteit verliezen. 4.1.8 Maleimide-complexatie 4.1.8.1 Encapsulatie-efficiëntie Zowel na 2,5 uur als na 24 uur incubatie van de partikels met BSA werden gels gerund zoals weergegeven in Figuur 4.8. De ratio polymeer:BSA van 50:1 vertoonde de meest efficiënte complexatie maar was echter wel minder efficiënt dan de eerder vermeldde PDPcomplexatie met ratio 2:1. De complexatie werd ook uitgevoerd met OVA; OVA-SATP en BSASATP. Zoals te zien is op de SDS-page in Figuur 4.9, was de complexatie met SATP gesubstitueerd eiwit veel efficiënter. Dit valt te verklaren doordat het aanwezige zwavelatoom ook kan aanvallen op de dubbele binding van maleimidebutyric acid. Daarnaast was de encapsulatie-efficiëntie voor OVA en OVA-SATP beter dan voor BSA en BSA-SATP. Tot slot werden polymeer:eiwit-SATP ratio’s 1:1, 5:1, 10:1, 15:1 en 20:1 ook getest, zowel zonder en 45
als met β-mercapto-ethanol om de reversibiliteit na te gaan. Deze SDS-pages bevinden zich in Bijlage 12. Voor BSA-SATP blijkt ratio 15:1 al voldoende en voor OVA-SATP ratio 10:1. De complexatie is niet reversibel in reducerend milieu.
Figuur 4.8: SDS-page van de partikels met maleimide-polymeer en eiwit in de verschillende ratio’s na 2.5u vs 24u incubatie.
10:1
50:1
10:1
50:1
Figuur 4.9: SDS-pages van de maleimide complexatie voor OVA, OVA-SATP, BSA en BSA-SATP met polymeer:eiwit ratio 10:1 en 50:1.
4.1.8.2 DLS De complexatie met de polymeer:BSA ratio 50:1 werd steriel in triplicaat gemaakt. De grootte van de gevormde partikels waren groter dan het polymeer en het eiwit apart. Aan de hand hiervan en samen met de resultaten van SDS-page, kon besloten worden dat er partikels gevormd zijn.
46
BSA/MALEIMIDE-HPMAcoAPMA/PARTIKELS 50:1
Volume (procent) 25
20
BSA MAL-HPMAcoAPMA PARTIKELS 50:1
15
10
5
0 0.1
1
10
100
1000
10000
100000
Grootte (nm)
Grafiek 4.6: Volume (%) in functie van de grootte (nm) van de partikels, HPMA-co-APMAmaleimide:BSA 50:1, gemeten met DLS.
4.1.8.3 Image J Het percentage gebonden eiwit, berekend via image J, van de verschillende ratio’s wordt weergegeven in onderstaande grafieken. Zoals al eerder vermeld werd, was de complexatie met OVA-SATP efficiënter (zie Grafiek 4.7). De resultaten worden weergegeven in Bijlage 13. MALEIMIDE PARTIKELS: % GEBONDEN OVA-SATP
100
100
80
80
60 40
54.5
81.5
83.8
87.9
90.0
20
60 40
63.6
89.3
90.2
91.0
91.9
20
Ratio HPMA-MALEIMIDE:BSA SATP
20 :1
15 :1
10 :1
5: 1
1: 1
20 :1
15 :1
10 :1
5: 1
0 1: 1
0
%gebonden
%gebonden
MALEIMIDE PARTIKELS: %GEBONDEN BSA SATP
Ratio HPMA-MALEIMIDE:OVA SATP
Grafiek 4.7: Percentage gebonden eiwit van de maleimide-partikels van BSA-SATP versus OVASATP in de verschillende ratio’s.
Voor een semi-kwantitatief resultaat werden de ratio’s 10:1 en 50:1 voor beide eiwitten in triplicaat uitgevoerd en werd via image J het percentage gebonden eiwit berekend. Net zoals bij de encapsulatie-efficiënte kan besloten worden dat de hoogste ratio en het SATP gesubstitueerd eiwit een betere complexatie geeft. De gebruikte SDS-pages en resulaten worden weergegeven in Bijlage 14. 47
MALEIMIDE-PARTIKELS MET BSA vs BSA SATP: %gebonden eiwit via image J
%gebonden
100
BSA BSA-SATP
80 60 40
74.3
81.0
91.0
78.5
20
50 :1
10 :1
0
Ratio HPMA-MALEIMIDE:eiwit
Grafiek 4.8: Percentage gebonden eiwit van maleimide-partikels aangemaakt in triplicaat met BSA versus BSA-SATP via image J. MALEIMIDE-PARTIKELS MET OVA vs OVA SATP: %gebonden eiwit via iamge j
%gebonden
100
OVA OVA-SATP
80 60 40
71.2
88.3
81.8
91.0
20
50 :1
10 :1
0
Ratio HPMA-MALEIMIDE:eiwit
Grafiek 4.8: Percentage gebonden eiwit van maleimide-partikels aangemaakt in triplicaat met OVA versus OVA-SATP via image J.
4.2
OPNAME
4.2.1 Flowcytometer Zowel de opname van de PDP-partikels en de maleimide-partikels werden geanalyseerd met de flowcytometer en vergeleken met elkaar. De eerste opname werd getest door gebruik te maken van het fluorofoor OVA Alexa 647 en het PDP-polymeer gesubstitueerd met het Atto 488 NHS ester fluorofoor. De tweede analyse werd uitgevoerd met OVA Alexa 488 en Atto 647 NHS ester gesubstitueerd PDP-polymeer. Voor de maleimide partikels werd enkel het fluorescent eiwit gebruikt. Alleen de enkelvoudige cellen werden geanalyseerd. Hiervoor werden de doubletten en tripletten verwijderd door de oppervlakte en de hoogte van de zijwaartse lichtverstrooiing en de voorwaartse lichtverstrooiing uit te zetten ten opzichte van elkaar en de enkelvoudige cellen te selecteren zoals weergegeven in Bijlage 15. Zowel het percentage cellen, die fluorescentie bevatten en dus partikels hadden opgenomen, als de gemiddelde fluorescentie werden verwerkt in een grafiek. De gemiddelde fluorescentie 48
is een maat voor de opgenomen hoeveelheid van de cellen. Voor de PDP-partikels werden beide fluoroforen apart bekeken ( Grafiek 4.9 en 4.10) en voor de maleimide-partikels enkel het fluorofoor eiwit (Grafiek 4.11). De tabellen met de resultaten worden weergegeven in Bijlage 16. Gemiddelde Fluorescentie en % cellen met opname van HPMA-PDP Atto 488-OVA Alexa 647 partikels in DC's
Gemiddelde Fluorescentie en % cellen met opname van HPMA-PDP Atto 488-OVA Alexa 647 partikels in DC's % cellen HPMA-PDP Atto 488 +
% cellen OVA Alexa 647 +
Gemiddelde fluorescentie HPMA-PDP Atto 488
40
100000
20
50000
488
30000
80
25000
60
20000 15000
40 10000 20
5000
Hoeveelheid OVA (µg)
15 µg
1µ g
12 5µ g
05 µg
0µ g
0 02 5µ g
0
1. 5µ g
1µ g
0. 5µ g
1. 25 µg
0
0µ g 0. 25 µg
0
% cellen HPMA-PDP Atto
150000
60
100
Gemiddelde fluorescentie HPMA-PDP Atto 488 [a.u.]
200000 80
+
35000
250000 100
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 647 [a.u.]
% cellen OVA Alexa 647 +
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa
647
Hoeveelheid OVA (µg)
Grafiek 4.9: Opname 1 van PDP partikels, de gemiddelde fluorescentie en het percentage cellen met opname van OVA Alexa 647 (links) en HPMA-PDP Atto 488 (rechts). Gemiddelde Fluorescentie en % cellen met opname van HPMA-PDP Atto 647-OVA Alexa 488 partikels in DC's
Gemiddelde Fluorescentie en % cellen met opname van HPMA-PDP Atto647-OVA Alexa488 partikels in DC's % cellen HPMA-PDP Atto647 +
% cellen OVA Alexa 488 +
100000 40 50000
40000
60
30000
40
20000
20
10000
Hoeveelheid OVA (µg)
5µ g
4µ g
3µ g
0µ g
0 2µ g
0
5µ g
4µ g
3µ g
2µ g
0 1µ g
0
80
1µ g
20
50000
% cellen HPMA-PDP Atto
150000
60
0µ g
% cellen OVA Alexa 488 +
80
100
Gemiddelde fluorescentie HPMA-PDP Atto 647 [a.u.]
200000
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 488 [a.u.]
100
647 +
Gemiddelde fluorescentie HPMA-PDP Atto 647
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 488
Hoeveelheid OVA (µg)
Grafiek 4.10: Opname 2 van PDP-partikels, de gemiddelde fluorescentie en het percentage cellen met opname van OVA Atto 488 (links) en HPMA-PDP Atto 647 (rechts). Gemiddelde fluorescentie en % cellen met opname van HPMA-maleimide-OVA Alexa 647 partikels in DC's +
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 647
% cellen OVA Alexa 488 + 250000
Hoeveelheid OVA (µg)
5000
0
0 1. 5µ g
5µ g
4µ g
3µ g
2µ g
1µ g
0 0µ g
0
10000
20
1µ g
50000
20
15000
40
1. 25 µg
40
20000
60
0. 5µ g
100000
25000 80
0. 25 µg
150000
60
30000 100
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 488 [a.u.]
200000 80
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 488
0µ g
100
Gemiddelde fluorescentie OVA Alexa 647 [a.u.]
% cellen OVA Alexa 647 +
Gemiddelde Fluorescentie en % cellen met opname van HPMA-maleimide-OVA Alexa 488 partikels in DC's
% cellen OVA Alexa 488 +
% cellen OVA Alexa
647
Hoeveelheid OVA (µg)
Grafiek 4.11: Opname 1 (links) versus opname 2 (rechts) van maleimide-partikels, de gemiddelde fluorescentie en het percentgage cellen met opname van het gebruikte fluorofoor. 49
Een betere visualisatie van de opname wordt weergegeven in Figuur 4.10 voor de maleimide-partikels. De figuren voor de PDP-partikels worden weergegeven in Bijlage 17. Op basis van de grafieken en onderstaande figuren, kon er algemeen besloten worden dat de PDP-partikels beter werden opgenomen, dit valt te verklaren door de aanwezig van de disulfidebinginen (Torres, 2012). Daarnaast was het 488 fluorofoor autofluorescent was. De negatieve controle van de 488 fluorofoor was namelijk al te veel naar rechts opgeschoven waardoor de waarden een vertekend beeld gaven en de percentages opname lager lagen. Hoe hoger de hoeveelheid aan OVA, hoe beter de opname. Voor de maleimide partikels hadden nog niet alle cellen iets opgenomen. Vanaf 4 µg aan OVA hadden alle cellen de PDP partikels opgenomen maar de gemiddelde fluorescentie stijgt nog waardoor er nog niet kon gesproken worden van 100% verzadiging. Hiervoor werd er, wegens autofluorescentie, gekeken naar het 647
fluorofoor. OPNAME 1
OPNAME 2
Figuur 4.10: Aantal cellen met opname van het fluorofoor bij de maleimide-partikels.
4.3
MATURATIE
4.3.1 CL264-substitutie 4.3.1.1 Ninhydrine assay Voor de ninhydrine assay werd er gebaseerd op de ijklijn voor HPMA-co-APMA zoals gebruikt werd bij de PDP- en maleimide-substitutie (Grafiek 4.1). Aangezien een andere verdunning gebruikt werd voor de stalen dan de standaarden voor het opstellen van ijklijn, moest worden rekening gehouden met de gebruikte verdunning. De resultaten worden weergegeven in Bijlage 17. Van de 2% die getarget was, werd een substitutie van 1,23% bereikt. Dit leverde een rendement van 61,5% op. 50
5
CONCLUSIE Het HPMA-co-APMA polymeer werd succesvol aangemaakt via RAFT-polymerisatie.
Via
de
verschillende
linkermoleculen
PDPA
en
maleimidobutyric
acid
werden
antigenbindende eigenschappen geïntroduceerd. Dit met het oog op de formulatie van respectievelijk reversibele en niet-reversibele partikels in reducerend milieu. De substitutieefficiëntie van beide substituties werd bepaald via een ninhydrine assay en er kon worden vastgesteld dat de substitutie is doorgegaan (resp. 93% en 97,85%) OVA en BSA werden gesubstitueerd met SATP om beschermde thiolgroepen in te voegen. Een eiwit:SATP ratio 1:15 bleek voldoende te zijn en via ninhydrine werd ook hier het rendement bepaald (78.9 % voor OVA-SATP en 85.6% voor BSA-SATP). De modelantigenen en de SATP-gesubstitueerde modelantigenen, na ontscherming, reageerden spontaan met de PDP-polymeren. De encapsulatie-efficiëntie van beide partikels werd geanalyseerd via SDSpage. De PDP-complexatie gaf een beter resultaat, polymeer:eiwit ratio 2:1 versus 15:1 voor de maleimide-complexatie bleek voldoende. Daarnaast hadden partikels gevormd met SATP gesubstitueerde modelantigenen een hogere encapsulatie-efficiëntie. Ook uit de image J resultaten kon dit geconcludeerd worden. De reversibiliteit werd nagegaan door het gebruik van β-mercapto-ethanol. Uit de SDS-pages kon er afgeleid worden dat de PDP partikels reductiegevoelig zijn en de maleimide-partikels niet. Vervolgens werden de modelantigenen gesubstitueerd met SATG en vergeleken met de SATP-substitutie. Volgens ninhydrine was de substitutie doorgegaan. De encapsulatieefficiëntie van de gevormde partikels was lager dan de partikels gevormd met SATPgesubstitueerde modelantigenen. De bereiding van een ander modelantigen werd uitgevoerd met het oog op patiënt specifieke therapie. In deze masterproef werd de encapsulatie-efficiëntie van de gevormde partikels met lysaat en lysaat-SATP getest. De complexatie leek geslaagd. Tot slot werd er naar de opname van de partikels gekeken in dendritische cellen via de flowcytometer. Het toevoegen van stijgende hoeveelheden OVA leidde tot beter partikelopname. Alsook werden de PDP-partikels iets beter opgenomen, er moest echter wel
51
rekening worden gehouden met de autofluorescentie van de 488 fluoroforen. Een 100% verzadiging van de cellen was nog niet bereikt. De CL264-substitutie voor de maturatie van DC’s bleek via de ninhydrine assay succesvol (rendement 61.50%). In de toekomst is verder onderzoek naar de maturatie van DC’s essentieel. Er kan nagegaan worden of het CL264-gesubstitueerde polymeer weldegelijk maturatie tot gevolg heeft. Indien dit effectief zo is kunnen ook partikels gevormd worden met het CL264gesubstitueerd polymeer en kan de opname geanalyseerd worden met de flowcytometer. Daarnaast kan de ontwikkeling van partikels met lysaat geoptimaliseerd worden. Dit zou een grote stap vooruit zijn, aangezien elke kanker met een vaste tumor dan in principe behandeld zou kunnen worden. Nadeel van de therapie is de lange ontwikkeling. Voor de substitutie van de modelantigenen kan gezocht worden naar alternatieve methoden voor het dure SATP om beschermde thiolgroepen in te voeren.
52
6
BRONNEN
Abbas, A. K., & Janeway, C. A. (2000). Immunology: Improving on nature in the twenty-first century. Cell, 100(1), 129-138. doi: 10.1016/s0092-8674(00)81689-x Aly, H. A. A. (2012). Cancer therapy and vaccination. Journal of Immunological Methods, 382(1-2), 123. doi: 10.1016/j.jim.2012.05.014 Bachmann, M. F., & Jennings, G. T. (2010). Vaccine delivery: a matter of size, geometry, kinetics and molecular patterns. Nature Reviews Immunology, 10(11), 787-796. doi: 10.1038/nri2868 Banchereau, J., & Steinman, R. M. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 392(6673), 245-252. doi: 10.1038/32588 Beyer, M., & Schultze, J. L. (2006). Regulatory T cells in cancer. Blood, 108(3), 804-811. doi: 10.1182/blood-2006-02-002774 Biedermann, F., Rauwald, U., Zayed, J. M., & Scherman, O. A. (2011). A supramolecular route for reversible protein-polymer conjugation. Chemical Science, 2(2), 279-286. doi: 10.1039/c0sc00435a Brody, J., Kohrt, H., Marabelle, A., & Levy, R. (2011). Active and Passive Immunotherapy for Lymphoma: Proving Principles and Improving Results. Journal of Clinical Oncology, 29(14), 1864-1875. doi: 10.1200/jco.2010.33.4623 Cella, M., Sallusto, F., & Lanzavecchia, A. (1997). Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Current Opinion in Immunology, 9(1), 10-16. doi: 10.1016/s09527915(97)80153-7 De Koker, S., Lambrecht, B. N., Willart, M. A., van Kooyk, Y., Grooten, J., Vervaet, C., . . . De Geest, B. G. (2011). Designing polymeric particles for antigen delivery. Chemical Society Reviews, 40(1), 320-339. doi: 10.1039/b914943k Foged, C., Hansen, J., & Agger, E. M. (2012). License to kill: Formulation requirements for optimal priming of CD8(+) CTL responses with particulate vaccine delivery systems. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 45(4), 482-491. doi: 10.1016/j.ejps.2011.08.016 Hamdy, S., Haddadi, A., Hung, R. W., & Lavasanifar, A. (2011). Targeting dendritic cells with nanoparticulate PLGA cancer vaccine formulations. Advanced Drug Delivery Reviews, 63(10-11), 943-955. doi: 10.1016/j.addr.2011.05.021 Hennessy, E. J., Parker, A. E., & O'Neill, L. A. J. (2010). Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics? Nature Reviews Drug Discovery, 9(4), 293-307. doi: 10.1038/nrd3087 Hubbell, J. A., Thomas, S. N., & Swartz, M. A. (2009). Materials engineering for immunomodulation. Nature, 462(7272), 449-460. doi: 10.1038/nature08604 http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (16-4-2014) http://www.sigmaaldrich.com/materials-science/polymer-science/raft-polymerization.html (30-32014) (http://www.piercenet.com/instructions/2160126.pdf, 16-3-2014) Jensen, P. E. (2007). Recent advances in antigen processing and presentation. Nature Immunology, 8(10), 1041-1048. doi: 10.1038/ni1516 Kurts, C. (2000). Cross-presentation: inducing CD8 T cell immunity and tolerance. Journal of Molecular Medicine-Jmm, 78(6), 326-332. doi: 10.1007/s001090000108 Moon, J. J., Huang, B., & Irvine, D. J. (2012). Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity. Advanced Materials, 24(28), 3724-3746. doi: 10.1002/adma.201200446 Murphy, S. P., Porrett, P. M., & Turka, L. A. (2011). Innate immunity in transplant tolerance and rejection. Immunological Reviews, 241, 39-48. doi: 10.1111/j.1600-065X.2011.01009.x Napolitani, G., Rinaldi, A., Bertoni, F., Sallusto, F., & Lanzavecchia, A. (2005). Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nature Immunology, 6(8), 769-776. doi: 10.1038/ni1223 Palucka, K., & Banchereau, J. (2012). Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Reviews Cancer, 12(4), 265-277. doi: 10.1038/nrc3258 53
Rabinovich, G. A., Gabrilovich, D., & Sotomayor, E. M. (2007). Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells Annual Review of Immunology (Vol. 25, pp. 267-296). Reddy, S. T., van der Vlies, A. J., Simeoni, E., Angeli, V., Randolph, G. J., O'Neill, C. P., . . . Hubbell, J. A. (2007). Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology, 25(10), 1159-1164. doi: 10.1038/nbt1332 Reddy, S. T., van der Vlies, A. J., Simeoni, E., O'Neil, C. P., Swartz, M. A., & Hubbell, J. A. (2008). Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Tissue Engineering Part A, 14(5), 734-735. Sarkar, S., Horn, G., Moulton, K., Oza, A., Byler, S., Kokolus, S., & Longacre, M. (2013). Cancer Development, Progression, and Therapy: An Epigenetic Overview. International Journal of Molecular Sciences, 14(10), 21087-21113. doi: 10.3390/ijms141021087 Schlosser, E., Mueller, M., Fischer, S., Basta, S., Busch, D. H., Gander, B., & Groettrup, M. (2008). TLR ligands and antigen need to be coencapsulated into the same biodegradable microsphere for the generation of potent cytotoxic T lymphocyte responses. Vaccine, 26(13), 1626-1637. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.01.030 Silva, J. M., Videira, M., Gaspar, R., Preat, V., & Florindo, H. F. (2013). Immune system targeting by biodegradable nanoparticles for cancer vaccines. Journal of Controlled Release, 168(2), 179199. doi: 10.1016/j.jconrel.2013.03.010 Slutter, B., Soema, P. C., Ding, Z., Verheul, R., Hennink, W., & Jiskoot, W. (2010). Conjugation of ovalbumin to trimethyl chitosan improves immunogenicity of the antigen. Journal of Controlled Release, 143(2), 207-214. doi: 10.1016/j.jconrel.2010.01.007 Smith, D. M., Simon, J. K., & Baker, J. R. (2013). Applications of nanotechnology for immunology. Nature Reviews Immunology, 13(8), 592-605. doi: 10.1038/nri3488 Smits, E., Ponsaerts, P., Berneman, Z. N., & Van Tendeloo, V. F. I. (2008). The use of TLR7 and TLR8 ligands for the enhancement of cancer immunotherapy. Oncologist, 13(8), 859-875. doi: 10.1634/theoncologist.2008-0097 Steinman, R. M., & Banchereau, J. (2007). Taking dendritic cells into medicine. Nature, 449(7161), 419426. doi: 10.1038/nature06175 Tan, J. K. H., & O'Neill, H. C. (2005). Maturation requirements for dendritic cells in T cell stimulation leading to tolerance versus immunity. Journal of Leukocyte Biology, 78(2), 319-324. doi: 10.1189/jlb.1104664 Tewari, M., Sahai, S., Mishra, R. R., Shukla, S. K., & Shukla, H. S. (2012). Dendritic cell therapy in advanced gastric cancer: A promising new hope? Surgical Oncology-Oxford, 21(3), 164-171. doi: 10.1016/j.suronc.2012.03.003 Torres, A. G., & Gait, M. J. (2012). Exploiting cell surface thiols to enhance cellular uptake. Trends in Biotechnology, 30(4), 185-190. doi: 10.1016/j.tibtech.2011.12.002 Wang, W., Singh, S., Zeng, D. L., King, K., & Nema, S. (2007). Antibody structure, instability, and formulation. J Pharm Sci, 96(1), 1-26. doi: 10.1002/jps.20727
54
7
BIJLAGEN
Bijlage 1 SDS-page met selectie in image J :
Voorbeeld van enkele plots van de intensiteit van de selectie in image J:
55
Bijlage 2
56
Bijlage 3
57
Bijlage 4 Ninhydrine HPMA-PDP HPMA-co-APMA (ijklijn) :
Absorbantie Standaard 0 Standaard 1 Standaard 2 Standaard 3 Standaard 4
0 0,195 0,479 0,683 0,843
0 0,201 0,439 0,720 0,890
gemiddelde Concentratie stdev 0 0 0 0 0,193 0,196 0,021 1,60E-17 0,441 0,453 0,042 3,21E-17 0,716 0,706 0,062 1,28E-16 0,922 0,885 0,083 1,92E-16
HPMA-co-APMA-PDP (stalen) :
Absorbantie staal 1 volgens standaard 2 staal 2 volgens stanaard 3
0,014 0,037
0,013 0,033
0,013 0,028
Gemiddelde Standaarddeviatie 0,013 2,00E-18 0,033 6,01E-18
%substitutie : Substitutie Staal 1
18,64%
Staal 2
18,55%
Gemiddelde substitutie
18,60%
Standaarddeviatie
2,510 x 10-15
Rendement
93,00%
58
Bijlage 5 Ninhydrine HPMA-MALEIMIDE HPMA-co-APMA (ijklijn) : Absorbantie Standaard 0 Standaard 1 Standaard 2 Standaard 3 Standaard 4
0 0,195 0,479 0,683 0,843
gemiddelde Concentratie stdev 0 0 0 0 0,193 0,196 0,020 1,60E-17 0,441 0,453 0,041 3,21E-17 0,716 0,706 0,062 1,28E-16 0,922 0,885 0,083 1,92E-16
0 0,201 0,439 0,720 0,890
HPMA-co-APMA-maleimide : Absrobantie staal 1 volgens stand 2 0,006 staal 2 volgens stand 3 0,025
0,010 0,018
gemiddelde stdev 0,016 0,0107 1,00E-36 1,00E-18 0,025 0,0227 1,20E-35 2,00E-18
%substitutie :
Staal 1 Staal 2 Gemiddelde Substitutie Rendement
Substitutie 19,79% 19,36% 19,57% 97,85%
59
Bijlage 6
Ijklijn BSA Absorbantie
0,8 0,6
y = 1,0293x - 0,0017 R² = 0,9955 Series1
0,4 0,2
Linear (Series1)
0 -0,2
0
0,1
0,2 0,3 0,4 Concentratie (mg/mL)
0,5
0,6
OVA Absorbantie
0,8
y = 0,4079x + 0,1395 R² = 0,9803
0,6 0,4
Series1
0,2
Linear (Series1)
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Concentratie (mg/mL
Absorbantie
Ijklijn Lysaat 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
y = 0.0546x - 0.016 R² = 0.9832 Series1 Linear (Series1) 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Concentratie (mg/mL)
60
Bijlage 7 Nihydrine BSA-SATP 1:15 Ijklijn BSA : Reeks 1 Standaard 0 Standaard 1 Standaard 2 Standaard 3 Standaard 4
Reeks 2 0 0,149 0,259 0,426 0,606
Reeks 3
0 0,147 0,286 0,386 0,521
0 0,147 0,288 0,387 0,618
Gemiddelde Concentratie SDEV 0 0 0,148 0,138 0,278 0,275 0,400 0,413 0,582 0,550
0 0,001 0,013 0,019 0,043
Gemiddelde Concentratie Stdev 0,000 0,000 0,261 0,358 0,470 0,717 0,575 1,075 0,713 1,433
0,000 0,020 0,007 0,019 0,019
%substitutie :
Staal 1 Staal 1 Staal 1 Gemiddelde
Absorbantie 0,083 0,080 0,090 0,084
%substututie 80,52 79,27 76,74 78,90
Ninhydrine OVA-SATP 1:15 Ijklijn OVA : Reeks 1 Standaard 0 Standaard 1 Standaard 2 Standaard 3 Standaard 4
0,000 0,245 0,460 0,596 0,724
Reeks 2 Reeks 3 0,000 0,290 0,473 0,580 0,730
0,000 0,249 0,476 0,550 0,686
%substitutie :
Staal 1 Staal 1 Staal 1 Gemiddelde
Absorbantie 0,090 0,087 0,071 0,084
Substitutie 84,90% 85,00% 87,09% 85,63%
61
Bijlage 7 (vervolg) Ninhydrine lysaat-SATP Ijklijn Lysaat : Reeks 1 Standaard 0 Standaard 1 Standaard 2 Standaard 3 Standaard 4
0 0,009 0,019 0,039 0,070
Reeks 2 0 0,006 0,019 0,045 0,060
Reeks 3
Gemiddelde
0 0,005 0,018 0,043 0,062
0 0,007 0,019 0,042 0,064
Concentratie
SDEV 0 0,358 0,717 1,075 1,433
0 0,000 0,000 0,002 0,037
%substitutie :
Staal volgens standaard 2 Staal volgens standaard 3
Reeks 1 Reeks 2 Reeks 3 Gemiddelde 0,006 0,004 0,012 0,007 0,005 0,010 0,009 0,008 Substitutie
staal 1 staal 2 gemiddelde
60,71% 81,10% 70,91%
62
Bijlage 8 Ninhydrine SATG-substitutie : OVA SATG 1:10
GEMIDDELDE
substitutie
ST 3
0,180
0,180
0,158
0,170
70.51%
ST 4
0,235
0,233
0,225
0,230
67.61%
gem
69.06%
OVA SATG 1:15 ST 3
0,189
0,179
0,179
0,180
61.18%
ST 4
0,227
0,224
0,207
0,220
69.25%
gem
65.22%
BSA-SATG 1:10 ST 3
0,104
0,100
0,109
0,100
73.89%
ST 4
0,0940 0,111
0,097
0,100
82.69%
gem
78.29%
BSA-SATG 1:15 ST 3
0,108
0,109
0,112
0,110
72.56%
ST 4
0,0820 0,100
0,100
0,0900
83.84%
gem
78.20%
63
Bijlage 9 Resultaten van Image J van de PDP-partikels in de verschillende polymeer :eiwit ratio’s met OVA-SATP: Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Oppervlakte ongebonden fractie staal/blanco %gebonden
Blanco 1:1 2:1 2,5:1 3:1 4:1 106396 29395 24272 21589 19650 14513 0,276 0,228 0,203 0,185 0,136 72,37 77,19 79,71 81,53 86,36
Resultaten van Image J van de PDP-partikels in de verschillende polymeer :eiwit ratio’s met BSA-SATP: Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Oppervlakte ongebonden fractie staal/blanco %gebonden
Blanco 1:1 2:1 3:1 4:1 43416 15027 10425 8491 7367 0,346 0,240 0,196 0,170 65,39 75,99 80,44 83,03
64
Bijlage 10 SDS-page image J PDP partikels in triplicaat :
Resultaten image J PDP-partikels met OVA-SATP en polymeer :eiwit ratio 2 :1 :
Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden gem %gebonden
Blanco 2:1 2:1 2:1 85980 25587 24786 24077 0,298 0,288 0,280 70,24 71,17 72,00 71,14 %
Resultaten image J PDP-partikels met BSA-SATP en polymeer :eiwit ratio 2 :1 :
Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden gem %gebonden
Blanco 2:1 2:1 2:1 77195 24403 25379 28838 0,316 0,329 0,374 68,39 67,12 62,64 66,05 %
65
Bijlage 11 EDC en NHS opgelost in activatiebuffer:
EDC en NHS opgelost in DMSO:
66
Bijlage 11 (vervolg) EDC en NHS toegevoegd als poeder:
67
Bijlage 12 SDS-page maleimide-partikels met BSA-SATP: zonder β-mercapto-ethanol:
SDS-page maleimide-partikels met BSA-SATP : met β-mercapto-ethanol:
68
Bijlage 12 (vervolg) SDS-page maleimide-partikels met OVA-SATP : zonder β-mercapto-ethanol:
SDS-page met maleimide-partikels met OVA-SATP : met β-mercapto-ethanol:
69
Bijlage 13 Resultaten Image J van maleimide-partikels met verschillende polymeer :eiwit ratio’s met OVA-SATP:
Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden
Blanco 1:1 5:1 10:1 15:1 20:1 84127 30604 9001 8225 7599 6789 0,364 0,107 0,098 0,090 0,081 63,62 89,30 90,22 90,97 91,93
Resultaten Image J van maleimide-partikels met verschillende polymeer :eiwit ratio’s met BSA-SATP:
Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden
Blanco 1:1 5:1 10:1 15:1 20:1 90510 41218 16741 14670 10990 9059 0,455 0,185 0,162 0,121 0,100 54,46 81,50 83,79 87,86 89,99
70
Bijlage 14 SDS-pages voor image J van maleimide-partikels in triplicaat en resultaten OVA :
Blanco 118004 1 0 71,24 Blanco Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie 89609 Opp ongebonden fractie staal/blanco 1 %gebonden 0 gem %gebonden 81,78 Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden gem %gebonden
10:1 10:1 10:1 34090 33092 34641 0,289 0,280 0,294 71,11 71,96 70,64 % 50:1 50:1 50:1 14900 16988 17104 0,166 0,190 0,191 83,37 81,04 80,91 %
OVA-SATP :
Polymeer:OVA-SATP
Blanco 80556 1 0 88,33 Blanco Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie 80556 Opp ongebonden fractie staal/blanco 1 %gebonden 0 gem %gebonden 91,05 Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden gem %gebonden
10:1
10:1 9889 0,123 87,72
% 50:1
10:1 8852 0,110 89,01
50:1 7060 0,088 91,24
9463 0,117 88,25 50:1
7349 0,091 90,88
7232 0,090 91,02
%
71
Bijlage 14 (vervolg) BSA :
Blanco Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie 102982 Opp ongebonden fractie staal/blanco 1 %gebonden 0 gem %gebonden 74,34 Blanco Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie 102982 Opp ongebonden fractie staal/blanco 1 %gebonden 0 gem %gebonden 78,49
10:1 10:1 10:1 26604 25424 27259 0,258 0,247 0,265 74,17 75,31 73,53 % 50:1 50:1 50:1 22752 22311 21379 0,221 0,217 0,208 77,91 78,34 79,24 %
BSA-SATP :
Blanco 80380 1 0 80,95 Blanco Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie 80380 Opp ongebonden fractie staal/blanco 1 %gebonden 0 gem %gebonden 91,01 Oppervlakte onder de curve van ongebonden fractie Opp ongebonden fractie staal/blanco %gebonden gem %gebonden
10:1 10:1 10:1 13901 15978 16059 0,173 0,199 0,200 82,71 80,12 80,02 % 50:1 50:1 50:1 7300 6361 8013 0,091 0,079 0,100 90,92 92,09 90,03 %
72
Bijlage 15 Selectie van de enkelvoudige cellen FLowJo:
SSC-A Cells 71,6
FSC-A
FSC-H Single Cells 90,6
FSC-A SSC-H
Single Cells
SSC-A
73
Bijlage 16 Resultaten flowcytometer PDP-partikels: Opname 1 : OVA Alexa 647 : Hoeveelheid OVA
% cellen OVA Alexa 647 +
0µg 0.25µg 0.5µg 1µg 1.25µg 1.5 µg
0,021 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
Gemiddelde fluorescentie (a.u)
0,031 99,90 99,40 99,70 100,00
128 84530 86507 144270 194259 218903
436 43679 77287 153597 186378
Opname 1 : HPMA-PDP Atto 488 : Hoeveelheid OVA
% cellen HPMA-PDP Atto 488 + Gemiddelde fluorescentie (a.u)
0µg 0.25µg 0.5µg 1µg 1.25µg 1.5 µg
0,056 23,20 18,10 49,30 62,50 69,90
0,037 4,75 18,60 51,20 62,90
3956 15320 14196 20005 29726 29549
3956 8286 11938 27238 22578
Opname 2 : OVA Atto 488 : Hoeveelheid OVA 0µg 1µg 2µg 3µg 4µg 5µg
% cellen OVA Atto 488 + 0,065 16,20 54,40 70,10 99,60 99,30
Gemiddelde fluorescentie (a.u) 0,120 27,80 86,80 84,40 94,00 98,10
0,044 18,20 71,80 87,10 97,40 99,50
2105 8382 17808 21700 164751 82235
2031 11906 70520 45753 38065 40350
2181 8848 28905 36447 46879 81477
Opname 2 : HPMA-PDP Atto 647 Hoeveelheid OVA 0µg 1µg 2µg 3µg 4µg 5µg
% cellen HPMA-PDP Atto 647 + 0,063 96,00 99,90 99,90 100,00 100,00
0,088 96,30 99,90 99,70 100,00 100,00
Gemiddelde fluorescentie (a.u) 0,030 93,80 99,90 99,90 100,00 100,00
392 7109 17198 20650 47707 47484
386 7766 15051 23285 32797 33001
415 6658 21115 23637 35467 50716
74
Bijlage 16 (vervolg) Maleimide-partikels Opname 1 : OVA Alexa 647: Hoeveelheid OVA
% cellen OVA Alexa 647 +
0µg 1µg 2µg 3µg 4µg 5µg
0,079 77,90 96,40 87,40 98,90 99,50
Gemiddelde fluorescentie (a.u) 0,091 61,70 75,40 95,90 98,70 99,30
63,60 81,80 97,10 99,10
403 12519 10786 20955 18154 20054
403 5390 11129 19315 21187 21767
8504 7697 10653 26651
Opname 2 : OVA Atto 488 : Hoeveelheid OVA 0µg 1µg 2µg 3µg 4µg 5µg
% cellen OVA Atto 488 + 0,130 92,20 96,40 98,00 98,30 99,80
Gemiddelde fluorescentie (a.u) 0,096 96,00 95,40 99,30 99,80 99,80
0,050 97,60 98,20 99,00 99,60 99,70
3499 67490 79039 72951 36417 207771
3441 88713 66900 119318 163527 187801
2671 106934 101733 113783 130863 146821
75
Bijlage 17 Figuren flowcytometer verwerkt in FlowJo PDP opname 1 :
PDP opname 2 :
76
Bijlage 18 Ninhydrine CL264-substitutie Ijklijn HPMA-co-APMA : Absorbantie Standaard 0 Standaard 1 Standaard 2 Standaard 3 Standaard 4
1 0 0,195 0,479 0,683 0,843
2 0 0,201 0,439 0,720 0,890
3 gemiddelde Concentratie stdev 0 0 0 0 0,193 0,196 0,0208 1,6E-17 0,441 0,453 0,0416 3,2E-17 0,716 0,706 0,0624 1,28E-16 0,922 0,885 0,0832 1,92E-16
HPMA-co-APMA-CL264: Absorbantie staal 1 volgens stand 2 staal 2 volgens stand 3
1 0,168 0,37
2 3 gemiddelde Stdev Concentratie vermfactor Niewe absorbantie 0,174 0,181 0,174 3,2E-17 0,0250 mg/ml 0,832 0,145 0,382 0,392 0,381 3,2E-17 0,0500 mg/ml 0,832 0,317
%substitutie: % substitutie staal 1 1,36 staal 2 1,10 gemiddelde substitutie (%) 1,23 rendement (%) 61,53
77
VERSLAG LEZINGEN PROF. DR. DAAN J. A. CROMMELIN Prof Daan J.A Crommelin, professor aan de universiteit van Utrecht, ontving dit jaar de Francqui-Leerstoel van de Universiteit van Gent. De Francquileerstoel, genoemd naar Emiel Francqui wordt de Belgische Nobelprijs genoemd en wordt uitgereikt aan hoogleraars die een bijdrage leveren aan de wetenschap. Wat is nu precies de impact van de farmaceutische wetenschappen de laatste decennia. Er is al veel veranderd de afgelopen 50 jaar. Vooreest hebben de farmacautische wetenschappen verschillende domeinen: ontdekking, ontwikkeling, productie, distributie zijn enkele voorbeelden hiervan. Daarnaast zijn de farmaceutische wetenschappen sterk gereguleerd en gereglementeerd. In vergelijking met vroeger zijn er heel wat geneesmiddelen van toen verdwenen en zijn er heel veel nieuwe geneesmiddelen bijgekomen waardoor veel bestaande ziekten nu onder controle zijn . Algemeen kan besloten worden dat men in vergelijking met vroeger een beter idee heeft over de opname van geneesmiddelen en ook de term biologische beschikbaarheid werd ingevoerd, die nu een steeds belangrijkere rol begint te spelen. Daarnaast gaat de ontwikkeling nu veel trager dan vroeger, nu moet een geneesmiddel eerst volledig als veilig bewezen en goedgekeurd worden vooraleer het op de markt komt. Moesten parcetamol en asprine de dag van vandaag ontdekt worden zouden deze geneesmiddelen nooit toegelaten worden op de markt. Wat het nu veel moeillijker maakt om een geneesmiddel te ontwikkelen. Op vlak van therapie is het plan voor de toekomst meer en meer gericht op een gepersonaliseerde behandeling door gebruik te maken van ‘genomic’ gegevens en ook het DDD concept (Diagnosis, Drugs en Devices) zal meer en meer een standaard worden. Volgens aspect zijn de biotehnologische geneesmiddelen. ‘Biologicals en biosimiliars gaan het overnemen en we zouden ons beter voorbereiden’. Een zeer hoog percentage van de geneesmiddelen zijn biotechnologische geneesmiddelen. Van de 10 blockbuster geneesmiddelen in 2012 zijn er zeven biologicals. Biologicals zijn proteïnen die gebruikt worden als geneesmiddelen en biosimilars zijn de generische versie van biologicals, die daardoor veel goedkoper zijn. Biosimilars zijn minder gemakkelijk op de markt te brengen dan een generisch product. Biotechnologische geneesmiddelen zijn de toekomst. Nadeel van deze geneesmiddelen is dat ze naast hun complexe structuur en hun problemen met 78
stabilsatie ook heel moeilijk te karakteriseren zijn en problemen geven met immunogeniciteit. Dit laatste is het grootste probleem. Een klein verschil in sequentie en glycolysatiegraad, slechte opzuivering, duur van de therapie, manier van reconstructie en de toedieningsroute zijn enkel voorbeelden die een rol spelen in die immunogeniciteit. Daarnaast moet er gezocht worden naar een alternatieve toedieningsroute dan injectie zoals bijvoorbeeld pulmonaire inhalatie, micronaalden of naaldvrije injectie wegens de kans op naaldenfobie bij de patiënt en een groter infectierisico. Maar de naald blijkt nog steeds de beste methode Op vlak van targeting van geneesmiddelen kan nog een grote progressie gemaakt worden. Nanogeneesmiddelden zijn een stap in de goede richting. Er bestaan veel ‘drug targeting’ strategieën. Een voorbeeld is passieve drug targeting bij tumoren. Deze therapie is enkel maar interessant als de tumor gekenmerkt wordt door lekkende bloedvaten, die bij ratten en muizen vaak voorkomen maar bij de mens helaas niet. Een oplossing zou zijn om veel vlugger naar de patiënt zelf te kijken, indien tumor lek is dan kan je therapie toepassen. Gepresonaliseerde therapie is de toekomst. Het verschil van de lekkende bloedvaten is één van de zovele verschillen tussen mens en dier en ondersteund de stelling dat mens en dier niet te vergelijken zijn. De reproduceerbaarheid van proefdieren wordt dan ook vaak in vraag gesteld. Daarnaast nog een klein woordje over gentherapie. Dit is technisch een grote en dure uitdaging en kent nog geen groot succes. Algemene oplossing is het ‘KISS principle’, maar er is nog veel werk aan de winkel. Deze interessante lezingen hebben me zelf ook doen nadenken over verschillende onderwerpen. Het gebruik van proefdieren in de geneesmiddelindustrie moeten volgens mij, mede door de lezingen, zoveel mogelijk gereduceerd proberen te worden wegens de diversiteit tussen mens en dier en het kans op verkeerde beslissingen over geneesmiddelen. Het feit dat er meer moet gefocust worden op de patiënt zelf voor de juiste therapie heeft me ook geboeid. Het kan inderdaad bij bepaalde ziekten tot betere prognoses leiden.
79
80
