Field-Flow Fractionation (FFF)
Jiří Pazourek Farmaceutická fakulta Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 27.11.2008 1
Co je to FFF?
2
Co je to FFF?
3
Co je to FFF?
4
5
Co je to FFF? Frakcionace tokem v poli (FFF) je eluční metoda formálně podobná kapalinové chromatografii. Nevyužívá ale chemickou afinitu, nepotřebuje vysoké koncentrace org. rozpouštědel. Lze ji použít k charakterizaci, separaci a určení velikosti pro:
makromolekulární polymery mikronové částice baktérie, viry, buňky (živé !) jíly / sedimenty
6
Co je to FFF?
7
HISTORIE
8
GEORGIUS AGRICOLA (1494-1555) Joachimsthal De re metallica libri XII Georgius Agricola, Basel, 1556.
9
Historie
10
11
Historie - J. Calvin Giddings (1930-1996)
12
Princip FFF
13
Instrumentace FFF připomíná HPLC, kde je kolona nahrazena FFF „kanálem“ (channel) Nosič injektor 12.34
POLE
PC
PUMPA 254 nm
Detektor
FFF kanál odpad 2.000 ml/min
průtokoměr
19.980g
váhy 14
FFF: separační proces dávkování
Sample Mixture
w
Field RELAXACE
Diffusion
Field SEPARACE
l1
l2 15
Proč FFF separuje ?
Chrom.mpg Fl_fff.mpg
HPLC:
FFF:
16
Unikátní rysy FFF
R = t0 / tR ≈ 6 D / U w
Distribuční data lze spočítat po spojení FFF s LALLS, MALLS, ICP-MS, ICP-AES, AAS atd. 17
Operační prostor FFF
18
Operační prostor FFF
19
Techniky FFF Flow FFF
Stěna/y je polopropustná ultrafiltrační membrána podepřena keramickou fritou
Thermal FFF
Stěny jsou kovové, horní stěna je elektricky vyhřívána, spodní chlazena vodou
Sedimentation FFF Electrical FFF
Kanál je zabudován v rotoru centrifugy (je využíváno odstředivé pole)
Pole je vytvořena aplikací elektrického napětí (1-10 V) skrze výšku kanálu 20
Toková FFF (Asym. Flow FFF)
21
Termální FFF
22
Sedimentační FFF Kanál v rotoru centrifugy
Latexové částice, d = 100, 200, 320, 600 nm
23
Gravitační FFF
Jak si udělat kanál ?
Typické rozměry • • •
délka 20-100 cm šířka 1-2 cm tloušťka 50-500 micronů 24
Teorie Např. je-li kromě pole dalším působícím faktorem pouze difúze působící proti koncentračnímu gradientu, za rovnováhy platí pro difúzní tok
Jx = −D
dc dx (1. Fickův zákon, D = difúzní koeficient)
25
Teorie a výsledný koncentrační profil je
c(x) = c 0 .e
−
D Uw
c0 = koncentrace u akumulační stěny kanálu (x=0), U = rychlost analytu indukovaná polem, w = charakteristická výška kanálu.
Celý děj se odehrává v kanále s laminárně proudící kapalinou, kde v důsledku viskozity existuje rychlostní profil v(x), nejčastěji parabolický (Newton, 1666): ⎛ x x2 ⎞ v (x ) = 6 v ⎜ − 2 ⎟ ⎝w w ⎠
= průměrná lineární rychlost kapaliny. 26
t0 R= tr
Co měříme? Protože retenční poměr
R=
ui v
se může obecně vyjádřit středními hodnotami < > w
R=
c(x ). v (x ) c( x ) . v ( x )
=
1 c(x ). v (x )dx w ∫0 w
w
1 1 ( ) . c x dx v (x )dx ∫ ∫ w0 w0
řešení lze odvodit s (1) a (2)
⎡ ⎤ ⎛ 1 ⎞ R = 6 λ ⎢ c o th ⎜ ⎟ − 2λ ⎥ ⎝ 2λ ⎠ ⎣ ⎦ R ≈ 6λ
R = t0 / tR ≈ 6 D / U w
kde λ = D/|U|w (rel. tloušťka zóny analytu). 27 experimentálně pozorovatelná veličina R je přímo dána účinkem pole (U) a vlastností analytu (D).
R = t0 / tr (<1)
Co měříme ? Retention ratio R
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 0
500
1000
1500
2000
Particle Diameter / nm
2500 28
SdFFF
t0 R= tr ⎡ ⎤ ⎛ 1⎞ R = 6λ ⎢ coth⎜ ⎟ − 2λ ⎥ ⎝ 2λ ⎠ ⎣ ⎦ R ≈ 6λ 29
Vybrané příklady technik FFF
30
Gravitational FFF ( 1g )
Both the walls are of glass (plexiglass) the field = Earth’s gravity
31
Separation of a mixture of non-porous silica gel particles. Experimental conditions: carrier liquid = water, flowrate = 0.10 ml/min, stop-flow time = 5 min, injection volume and concentration of each individual = 0.25 µl and 0.1 mg/ml, respectively. 0.35
R
µm µm µm µm
0.62 0.91 1.21 1.43
0.30
J. Pazourek , K.-G.Wahlund, J. Chmelík , Journal of Microcolumn Separation, 8 (5), 331 (1996)
0.25
0.20
0.15 0
1
2
3
4
5
6
flowrate [ml/min]
Simulation (flowrate independent)
experiment
A 254
flowrate 0.100 ml/min
1.43 µm
0.5 mAU 0.62 µ m
1.21 µ m
0.91 µ m
1.21 µ m 1.43 µ m
0.91 µ m 0.62 µm
0
1
2
3
4
retention volume [ml]
0
1
2
3
4
retention volume [ml]
32
Applications
A254
Separation of the non-porous silica gel chromatographic support Monospher.
flowrate 0.200 ml/min 0.5 mAU
1.50 um
0.93 um Experimental conditions: carrier liquid=water, flowrate=0.20 ml/min, stop-flow time=2 minutes.
0
5
t0
10
retention time [min]
33
Asymmetrical flow FFF
34
Asymmetrical flow FFF
35
splitt FFF (PREPARATIVNÍ )
36
Trendy
37
Trendy
38
Trendy
39
Trendy - ThFFF
www.chemie.de/articles/d/81965/.
40
Trendy
41
KONEC
42
FFF lidé Karin Caldwell (Utah, USA) P. Steve Williams (Ohio, USA) Kim Ratanathanawongs Williams (Colorado, USA) Martin Schimpf (Idaho, USA) Ron Beckett (Australia) Michel Martin (Paris,F) Philippe Cardot (Paris, F) Karl-Gustav Wahlund (Lund, S) Bengt Wittgren (Göteborg,S) Pierluigi Reschiglian (Bologna,I) Josef Chmelík (Brno, CZ) 43
Realita
l2
l1
a2 a1
44
Realita Velocity Vectors
Velocity Vectors
l2
l1
a2 a1
45
