Fagyasztás, felolvasztás, preparálás hatása a humán DNS fragmentáltságára Nagy Melinda MART VII. kongresszusa Sümeg, 2015.05.8-9
Bevezetés • Intézetünk egyik feladata a férfi infertilitás alapos kivizsgálása, a lehető legpontosabb diagnózis felállítása és az esetleges probléma kezelése. • A pontos diagnózis segít az orvosoknak, az ART centrumoknak a leghatékonyabb terápia és a megfelelő megtermékenyítési technika kiválasztásában . • A spermium genetikai állományának épsége elengedhetetlen a megfelelő termékenyítéshez és a korai magzati fejlődéshez. • Azok a spermiumok, amelyek nagy százalékban tartalmaznak fragmentált DNS-t , alkalmatlanok életképes utód létrehozására. • Irodalmi adatok szerint a humán ondóminták fagyasztása és fagyasztva tárolása növeli a spermiumok DNS állományának fragmentáltságát, és ezzel párhuzamosan csökkenti azok termékenyítő képességét.
Részletesebb spermium vizsgálat indokolt • • • • •
Ismeretlen eredetű meddőség Jó spermakép / de elmarad a gyermekáldás Több sikertelen lombik próbálkozás Elégtelen embriófejlődés Habituális vetélés
• Intézetünkben olyan páciensek DNS fragmentáltságát vizsgáltuk, ahol évek óta nem jött létre terhesség, vagy pedig vetéléssel végződött próbálkozások voltak. Közel másfél éve kezdtük el a férfi oldal alaposabb kivizsgálását.
Vizsgálataink menete és alkalmazott eljárások 1. Friss ejakultáum analízise WHO 5. előírásának megfelelően. 2. A rutin labordiagnosztikai vizsgálatok után visszamaradt natív minták DNS fragmentáltságát vizsgáltuk áramlási citometriára épülő Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) módszerrel. 3. A fagyasztást SpermCryo All-round (Gynotec) előírt protokoll szerint végeztük és a mintákat a vizsgálatok elvégzéséig folyékony nitrogénben tároltuk. A fagyasztott mintákat a mérés napján 37oC-os vízfürdőben felolvasztottuk. 4. A felolvasztott minták preparálását szintén adott protokoll alapján végeztük el (SpermFilter,SpermWash Gynotec). /gradiens centrifugálás, majd mosás/ 5. A DNS fragmentáltságot a fagyasztás előtt, a felolvasztás után és a felolvasztást követő mintapreparálás után határoztuk meg.
Enyhe savas kezelés denaturálja a DNS-t a törések mentén Acridin Orange festék képes kötődni a szimpla szálú illetve a dupla szálú DNS lánchoz, de az emissziós hullámhosszuk más
Eltérő emissziós maximum a kötődés függvényében Mintánként 10.000 db spermium DNS fragmentáltságát mérjük meg
Acridin Orange emisszió 500⁄526 nm-en (dsDNS)
DNS fragmentációs vizsgálat (SCSA módszer)
DFI = 12 %
DFI = 27 %
Acridin Orange emisszió 460⁄650 nm-en (ssDNS)
Eddig diagnosztikai céllal mért összes ondó minta DNS fragmentációjának gyakoriság megoszlása 25
Kvartilis 1 Medián
Átlag
Kvartilis 3
Darabszám
20
15
10
5
0 0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48
DNS Fragmentációs index (%)
n=174 db Átlag: számtani közép Medián: mértani közép
Átlag: Medián (Kvartilis 2): Kvartilis 1: Kvartilis 3:
15,3 13,0 8,6 20,5
Vizsgálat eredménye 1. 50
Összes minta esetében 45
60
50
40
40
Y Data
DNS Fragmentáltsági Index
35
30
30
20
10
25
0
20 Friss
15
Átlag: Medián:
10
17,5 15,5
Fagyasztott
20,4 17,1
5
n= 30
0
Friss
Fagyasztott
Fagyasztott preparált
Fagyasztottpreparált
10,2 7,8
Friss minta DFI>15,3
60
Összes minta esetében
DNS Fragmentáltsági Index
Vizsgálat eredménye 2.
50
40
30
20
10
60
0
50 Friss
Fagyasztottpreparált
Fagyasztott
Átlag: Medián:
30
24,5 22,2
20
24,7 22,8
12,1 8,3
Friss minta DFI <15,3
35
10 30
0
Friss
Átlag: Medián:
17,5 15,5
Fagyasztott
20,4 17,1
Fagyasztottpreparált
10,2 7,8
DNS Fragmentációs Index
Y Data
40
25
20
15
10
5
0 Friss
n= 30
Átlag: Medián:
8,9 9,2
Fagyasztott
14,5 12,3
Fagyasztottpreparált
8,3 6,9
A friss miták átlag fragentáltsága
Eltolódás a fragmentáltabb tartományba Eltolódás a kevésbé fragmentáltabb tartományba
Vizsgálat eredménye 3. Friss
n= 30
Átlag: 17,5 Medián: 15,5
Fagyasztott
Átlag: 20,4 Medián: 17,1
Fagyasztott preparált
Átlag: 10,2 Medián: 7,8
Vizsgálat eredménye 3. Fagyasztott preparált
Átlag: 10,2 Medián: 7,8
Fagyasztott
Átlag: 20,4 Medián: 17,1
Friss
Átlag: 17,5 Medián: 15,5
7
Darabszám
6 5
4 3 2 1 fagyasztott-preparált
0
0
6 18
12
fagyasztott 24 30 36 42
friss 48 friss
DNS Fragmentációs Index
fagyasztott fagyasztott-preparált
n= 30
Tapasztalataink Friss minta DFI <15,3
35
DNS Fragmentációs Index
30
25
20
15
10
5
0 Friss
Átlag: 8,9 Medián: 9,2
Fagyasztott
14,5 12,3
Fagyasztottpreparált
8,3 6,9
Alacsony DNS fragmentációval rendelkező minták esetében
Fagyasztás során nő a spermiumok DNS fragmentációjának mértéke. Fagyasztás-felolvasztáspreparálás után a friss mintához hasonló fragmentációs értékeket mutatnak a minták. A ivarsejt donorjainkat vizsgálva szintén ebbe a tartományba tartoznak mintáink.
Tapasztalataink Friss minta DFI>15,3
60
DNS Fragmentáltsági Index
50
40
30
20
10
0
Friss
Átlag: 24,5 Medián: 22,2
Fagyasztott
24,7 22,8
Fagyasztottpreparált
12,1 8,3
Magas DNS fragmentációval rendelkező minták esetében
Fagyasztás során nő a spermiumok DNS fragmentációjának mértéke. Fagyasztás-felolvasztás-preparálás után a friss mintához képest jelentős javulást (50-65%) mutatnak a minták. Eredményeink alapján a fragmentáltabb DNS-sel rendelkező mintákat termékenyítés előtt a sikeresebb beavatkozás érdekében hasznos lehet fagyasztani.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
