diagnostika a laboratorní technika
Fagocytóza a technické aspekty jejího stanovení Phagocytosis and technical aspects of its determination ALEXANDRA LOCHMANOVÁ
Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta Ostravské univerzity v Ostravě SOUHRN Fagocytóza je základním nástrojem nespecifické buněčné imunity. Fagocytujícími buňkami jsou neutrofilní granulocyty, makrofágy a dendritické buňky. K posouzení fagocytárního procesu se používá řada laboratorních metod, z nichž pro praktickou medicínu mají význam především ty, které odhalují funkční poruchy fagocytů. Jedná se zejména o poruchy NADPH-oxidázového komplexu, který hraje ústřední roli v oxidačním vzplanutí neutrofilů a tvorbě reaktivních produktů kyslíku, které mají zásadní význam při degradaci fagocytovaného materiálu. Účelem této práce je provést analýzu problémů a omezení nejčastěji používaných metod pro posouzení metabolické aktivity fagocytů s ohledem na význam a detekci reaktivních produktů kyslíku vznikajících během oxidačního vzplanutí. Klíčová slova: fagocytóza, neutrofily, NADPH-oxidáza, reaktivní produkty kyslíku, fluorescenční sody
SUMMARY Initial elimination of invading microbes from the body is mediated by professional phagocytes. The neutrophil is the major phagocyte of the innate immunity and plays a key role in the host defense against infections. To assess the phagocytic proces uses a series of laboratory methods, one of which for practical medicine are important primarily those that reveal functional disorders of phagocytosis, particularly NADPH oxidative burst of neutrophils and the production of reactive oxygen species, which are essential for host defence against invading microbes. The purpose of this paper is to analyze the problems and limitations of the most commonly used methods for assesssing neutrophil function in particular with regard to the signifikance and detection of reactive oxygen products generated during oxidative burst. Key words: phagocytosis, neutrophil function, NADPH oxidase, fluorescent probes
Úvod Fagocytóza je klíčovým obranným mechanismem, který prostřednictvím buněk přirozeného imunitního systému umožňuje eliminaci mikrobů, apoptotických buněk a jiných cizorodých částic z organismu. Profesionální fagocyty představované neutrofily, eozinofily, monocyty a makrofágy jsou nezastupitelnými buňkami první obranné linie. Poruchy fagocytózy se projevují zvýšenou náchylností k infekcím způsobeným zejména stafylokoky, enterobakteriemi nebo plísněmi. Kostmannův syndrom neboli těžká kongenitální neutropenie a cyklická neutropenie patří mezi poruchy fagocytózy založené na nízkém počtu neutrofilních granulocytů. K funkčním poruchám fagocytózy patří např. LAD I a LAD II syndrom. Příčinou LAD I a LAD II syndromů (leukocyte adhesion deficiency syndrome) je defektní exprese adhezivních molekul, která vede k neschopnosti fagocytárních buněk adherovat a následně pronikat do místa zánětu. Závažnými klinickými příznaky se mohou manifestovat poruchy s vrozeným enzymatickým defektem některého z mechanismů nitrobuněčného zabíjení, zejména defektem v enzymatickém
202
systému NADPH-oxidázy, který je klíčovým enzymem baktericidního mechanismu fagocytů (14). Stanovení počtu fagocytujících buněk periferní krve, resp. neutrofilů, se provádí jako běžné screeningové vyšetření krevního obrazu zahrnující počet leukocytů a krevní diferenciál, tj. percentuální, resp. absolutní zastoupení lymfocytů, monocytů a neutrofilních, bazofilních a eozinofilních granulocytů. Případné defekty v expresi leukocytárních integrinů podílejících se na vzniku LAD syndromů je možno stanovit metodou průtokové cytometrie. Z hlediska funkčních poruch neutrofilních granulocytů je situace poněkud komplikovanější. Metodické spektrum je poměrně široké, v rámci laboratoří není jednotné a je ovlivněno experimentálními podmínkami laboratoře, což vede ke značné individuální i mezilaboratorní variabilitě, a tudíž i nedostatečné možnosti standardizace.
V čem spočívá metabolická aktivace fagocytů Fagocytární proces je zahájen vazbou receptorů exprimovaných na membráně fagocytující buňky k ligandům
Alergie 3/2015
diagnostika a laboratorní technika přítomným na povrchu fagocytované částice. Aktivace jednoho nebo více receptorů vede k přestavbě buněčné membrány a cytoskeletu a uzavření fagocytovaného materiálu do membránou ohraničeného váčku v cytoplazmě, tzv. fagozomu. Ve fagozomu pak probíhá maturační proces zahrnující remodelaci lipidů, následnou fúzi s endozomy, lysozomy a dalšími sekrečními váčky, zvýšení intracelulární acidity a akumulaci proteolytických enzymů (25, 18). Souhrn reakcí probíhajících ve fagocytující buňce vede ke zvýšené tvorbě kyslíkatých radikálů, resp. reaktivních produktů kyslíku (ROS), které mají výrazné baktericidní účinky. Jedná se zejména o superoxidový radikál (.O2-), peroxid vodíku (H2O2), hydroxylový radikál (.OH), singletový kyslík (1O2*) a kyselinu chlornou (HOCl). Na principu tvorby kyslíkatých radikálů po buněčné stimulaci je v současné době založena většina metod využívaných ke studiu funkční aktivity fagocytujících buněk (35, 8, 13). Celý proces je zahájen aktivací NADPH-oxidázy, která redukuje molekulární kyslík na superoxidový radikál .O2- : 2 O2 + NADPH → 2 .O2- + NADP+ + H+ Superoxidový radikál je značně nestálý a rychle dismutuje na peroxid vodíku. Reakce probíhá spontánně a je urychlována superoxiddismutázou. 2 .O2- + 2H+ → H2O2 + 2O2 Peroxid vodíku je poměrně slabým oxidačním činidlem, ale může přímo inaktivovat některé enzymy, nejčastěji oxidací jejich thiolových (-SH) skupin. Jedním z nejúčinnějších antimikrobiálních systémů je komplex myeloperoxidázy (MPO), peroxidu vodíku a oxidovatelného kofaktoru, tvořeného zejména anionty halogenových prvků, jako jsou Cl-, I- a Br-. Při reakci chloridu s peroxidem vodíku vzniká kyselina chlorná (HOCl), která je v zabíjení mikrobů až padesátkrát účinnější než peroxid vodíku. H2O2 + Cl- + H+ → HOCl + H2O Kyselina chlorná může dát vzniknout dalším, velmi silným oxidačním látkám. Reakcí se superoxidem nebo ionty dvojmocného železa může vzniknout vysoce reaktivní hydroxylový radikál, který je zřejmě hlavní příčinou toxického účinku HOCl. HOCl + .O2- → .OH + Cl- + O2 HOCl + Fe2+ → .OH + Cl- + Fe3+ V reakci HOCl s peroxidem vodíku může vzniknout singletový kyslík, představující další aktivní formu kyslíku. Vysoká elektronegativita této formy kyslíku pak způsobuje účinnou oxidaci cílových struktur (6). HOCl + H2O2 → 1O2* + HCl + H2O Tvorbu H2O2 z 1O2* a H2O mohou katalyzovat také protilátky, které realizují tento proces přes dihydrogen trioxid (H2O3) jako meziprodukt. I když samotná tvorba H2O2 protilátkami není zřejmě pro eliminaci bakterií dostatečná, protilátkami katalyzovaná oxidační dráha produkuje další molekuly, které působí jako signální molekuly podílející se na tvorbě prozánětlivých cytokinů,
Alergie 3/2015
např. nukleárního faktoru kappa B (NFκB), interleukinu 6 (IL-6) nebo tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-α) (17, 2, 33). Nicméně definitivní scénář, jakým způsobem se reaktivní produkty kyslíku podílejí na zabíjení mikrobů, ještě stále není definitivně uzavřen a je předmětem diskuse (36).
Laboratorní diagnostika poruch fagocytózy Metody určené k vyšetření fagocytózy, stejně jako všechny metody zaměřené na vyšetření funkční buněčné aktivity, vyžadují důsledné dodržování preanalytické fáze. Buňky musí zůstat neporušené, plně vitální, a proto je třeba doručit vzorek do laboratoře a zpracovat co nejdříve, optimálně do 2–3 hodin po odběru. Vzhledem k tomu, že nejčastěji se jedná o analýzu buněk periferní krve, velkou pozornost je nutno věnovat výběru vhodného protisrážlivého činidla a dodržení poměru mezi krví a protisrážlivým činidlem (6, 1). Mezi běžně užívaná antikoagulancia patří citrát sodný, kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA) a heparin. Z hlediska jejich použití pro vyšetření funkční buněčné aktivity jejich hlavní problém spočívá v tom, že jak citrát sodný, tak EDTA funguje na principu chelatace vápníku. Vzhledem k tomu, že vápník patří k nejvýznamnějším intracelulárním iontům, které se podílejí na buněčné aktivaci a metabolismu buňky, bývá použití antikoagulačních přípravků založených na principu vazby Ca2+ iontů v případě funkčních testů vesměs zmiňováno jako nevhodné a všeobecně je doporučován odběr krve výlučně do heparinu. Aktivita heparinu je podmíněna přítomností plazmatického antitrombinu III, který je přirozeným inhibitorem trombinu a dalších sérových proteáz, se kterými vytváří ireverzibilní komplex. Na druhé straně se však ukázalo, že i přes ztrátu Ca2+ iontů v případě použití EDTA jako antikoagulans nedochází k inhibici fagocytární aktivity v takové míře, jak by se dalo předpokládat. Nejjednodušším vysvětlením může být fakt, že i když přenos některých intracelulárních signálů může být preferenčně nebo výlučně spojen s Ca2+ ionty, během celého aktivačního procesu se zapojuje řada dalších receptorů, které mohou signalizaci prostřednictvím Ca2+ iontů obejít. Ukázalo se, že významnou roli hraje např. současné zapojení manózových receptorů, bakteriálního lipopolysacharidu (LPS) a chemotaktických peptidů. Svou roli hrají také rozdíly v metodickém přístupu jako je izolace buněk, lyzační postupy apod. (25, 34, 10, 29). Naproti tomu i samotný heparin míru fagocytózy tlumí, a tudíž jeho použití jako výlučného antikoagulans, zejména v případě studia fagocytózy, tak může být revidováno (5). Laboratorní testy využívané pro hodnocení fagocytární funkce granulocytů jsou schopny detekce abnormalit každé z jednotlivých fází fagocytózy: chemotaxe (chemotaxe pod agarózou, Migratest), adheze (přítomnost adhezních molekul na povrchu buněk), ingesce (pohlcení metakrylátových částic nebo mikroorganismů) a degradace/usmrcení (detekce oxidačního vzplanutí, tvorba reaktivních produktů kyslíku). Testy chemotaxe zjišťují schopnost leukocytů reagovat na chemotaktické látky cíleným pohybem ve směru
203
diagnostika a laboratorní technika gradientu chemotaktického agens (např. chemotaktický peptid formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin, resp. fMLP). Nejběžnější varianty chemotaktických testů jsou chemotaxe z kapiláry, chemotaxe pod agarózou a chemotaxe přes membránu, která je založena na principu Boydenovy komůrky. Boydenova komůrka sestává ze dvou prostorů oddělených membránou o velikosti pórů 3 μm. V horní části jsou buňky v živném médiu a ve spodní části v médiu s obsahem chemoatraktantu. Membrána mezi nimi představuje fyzikální bariéru, kterou mohou buňky překonat pouze aktivním pohybem. V současnosti je klasická Boydenova komůrka modifikována za využití speciálních kultivačních destiček při použití specifických kultivačních vložek. Navíc chemotaktickou aktivitu je možno korelovat i s expresí určitých povrchových znaků, které lze detekovat pomocí průtokové cytometrie (Migratest). Jako příklad je možno uvést adhezní molekulu LECAM-1, jejíž exprese na buňkách vystavených působení chemotaktických faktorů klesá. Změna tvaru buněk, která předchází jejich migraci, může být stanovena na základě analýzy změn čelného lomu světla (FSC) rovněž za užití průtokové cytometrie. Buněčná migrace je proces velmi komplikovaný a při jejím studiu je třeba brát v úvahu řadu biologických aspektů. Vzhledem k velké pracnosti a vysoké variabilitě výsledků se tyto testy využívají ve velmi omezené míře. Funkční testy fagocytů prováděné v imunologických laboratořích zahrnují nejčastěji testy ingesce a testy nitrobuněčného zabíjení, resp. respiračního vzplanutí. Z hlediska diagnostické významnosti je pro funkční aktivitu fagocytujících buněk zásadní jejich schopnost mikrobicidní aktivity realizované prostřednictvím reaktivních produktů kyslíku a z toho důvodu je testování funkční aktivity prováděné pouze za užití testů ingesce naprosto nedostačující. Vyšetření vzorků se provádí vždy paralelně, a to jednak bez přidání aktivátoru (spontánní aktivita nestimulovaných fagocytů) a jednak s přidáním buněčného aktivátoru, resp. stimulans, který za normálních okolností vede k aktivaci respiračního vzplanutí. Jako aktivátorů se používá jak korpuskulárních, tak solubilních stimulans. K nejběžnějším korpuskulárním aktivátorům patří suspenze mikroorganismů (např. E.coli), škrobové částice nebo opsonizovaný zymosan (složka buněčné stěny S. cerevisiae). Jako solubilní aktivátor se používá forbolmyristát acetát (PMA), formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP), možné je použít také lipopolysacharid (LPS) nebo cytochalazin B (3, 11). V případě použití jednotlivých stimulátorů je třeba mít na paměti, že i když jak korpuskulární, tak solubilní stimulátory vedou k aktivaci stejné NADPH-oxidázy, ne všechna stimulans sdílejí stejné aktivační dráhy. Při použití opsonizovaného zymosanu dochází k jeho navázání na buněčný povrch prostřednictvím komplementových CR3 receptorů a imunoglobulinových Fc receptorů, což vede k aktivaci NADPH-oxidázy, degranulaci specifických a azurofilních granul a tvorbě fagolysozomu. Naproti tomu in vitro stimulace pomocí chemotaktického peptidu fMLP a PMA vede k přímé aktivaci NADPH-oxidázy a fosforylaci některých PHOX-proteinových podjednotek (p67phox, p47phox).
204
Na rozdíl od PMA, který působí jako přímý aktivátor proteinkinázy C (PKC), aktivace prostřednictvím fMPL je vedena přes receptorový komplex přítomný na povrchu buňky a spustí proces respiračního vzplanutí i bez adheze a ingesce patogenu granulocytem. V této souvislosti je nutno opětovně zmínit vliv použitého antikoagulans a jeho vliv na přenos aktivačního signálu, jak již bylo zmíněno (27, 4, 20).
Možnosti stanovení reaktivních produktů kyslíku vzniklých během respiračního vzplanutí fagocytů a jejich limity Metody založené na principu redukce tetrazoliových solí Jedny z prvních testů umožňujících sledování metabolické, resp. NADPH-oxidázové aktivity fagocytů jsou testy založené na principu redukce tetrazoliových solí. Tetrazoliové soli jsou kvartérní amoniové soli, jejichž roztoky jsou bezbarvé nebo slabě nažloutlé. Jako rozpustné sloučeniny se dostávají do buňky, kde jsou redukovány vzniklým superoxidem na barevné formazany, které se ukládají v cytoplazmě jako nerozpustné sraženiny. V testech fagocytární aktivity se nejčastěji používá nitrotetrazoliová modř (nitro blue tetrazolium, NBT) nebo iod-nitro tetrazolium (INT). Redukčním činitelem je vodík, uvolněný dehydrogenázami při oxidaci substrátu. V závislosti na druhu použité tetrazoliové soli mají jejich redukované formy různé výsledné zbarvení od tmavě modré (NBT) až po tmavě červenou až oranžovou (INT). Změnu zbarvení soli, která se oxidačními pochody ve fagocytující buňce změnila na nerozpustný barevný formazan, lze detekovat buď pomocí mikroskopu, kdy určíme přítomnost barevných krystalů formazanu v buňkách, nebo lze využít přesnější metodu spektrofotometrickou. Výsledkem mikroskopického hodnocení je určení procenta buněk s tmavě modrými skvrnami formazanu. Výhodou této modifikace je, že ji lze provést z plné krve, na druhé straně je výsledné hodnocení zatíženo vyšší statistickou (menší počet analyzovaných buněk) a subjektivní chybou (nutná zkušenost s vyhodnocováním) než spektrofotometrické vyhodnocení. Spektrofotometrická modifikace metody vyžaduje separaci buněk (nejčastěji využívaná separace tzv. „buffy coat“), vzniklý barevný formazan se extrahuje a měří se intenzita výsledného zabarvení. Metodu lze provádět buď ve zkumavkách, nebo mikrotitračních destičkách (21). Testy respiračního vzplanutí založené na redukci tetrazoliových solí jsou vysoce specifické zejména pro diagnostiku chronické granulomatózní nemoci (CGD), která je způsobena mutací některé z podjednotek NADPH-oxidázového komplexu. Jak již bylo uvedeno, NADPH-oxidáza katalyzuje vznik superoxidu jednoelektronovou redukcí kyslíku na superoxidový radikál, což v případě výše uvedené in vitro reakce vede k redukci tetrazoliové soli a vzniku barevného formazanu. Vzhledem k tomu, že takto vzniklý superoxid slouží jako substrát pro tvorbu dalších vysoce reaktivních kyslíkatých derivátů, absence jeho tvorby již v tomto kroku vede ke ztrátě funkce prakticky celého tohoto antimikrobiálního systému, charakteristického právě pro CGD (11, 20).
Alergie 3/2015
diagnostika a laboratorní technika Chemiluminiscenční metoda Jednou z nejčastěji používaných metod pro monitorování volných radikálů a reaktivních metabolitů kyslíku je luminiscenční metoda. Podstatou luminiscence je návrat elektronů z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na základní hladiny a s tím spojené vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů. Chemiluminiscence vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci a emitované světlo vzniká oxidační reakcí organických sloučenin (luminol, lucigenin, luciferin) působením oxidantů (20). Chemiluminiscenční metoda využívá fakt, že během respiračního vzplanutí vzniká řada reaktivních forem kyslíku v elektron-excitovaném stavu, které při návratu do základního stavu emitují fotony. Přirozená chemiluminiscence fagocytů je velmi slabá, a proto je obvykle zesilována luminofory (7). luminol + oxidant → α-aminoftalát + N2 + světlo K nejčastěji využívaným luminoforům patří luminol a lucigenin. Lucigenin je vysoce specifický pro superoxidový aniont, a tudíž odráží aktivitu NADPH-oxidázy, naopak chemiluminiscence odvozená od luminolu je závislá na myeloperoxidázové aktivitě (35, 23, 28). Emise světla je detekována přístroji vybavenými citlivým detektorem a fotonásobičem – luminometrem. Výsledné hodnoty se pak podle typu měřicího zařízení uvádějí nejčastěji v relativních světelných jednotkách (RLU) nebo počtech světelných impulzů za minutu (c.p.m). Je možno měřit i takzvaný vrchol chemiluminiscence a čas potřebný k jeho dosažení (22). Hodnotí se jednak spontánní chemilumininiscence, kdy se nepřidává aktivátor, jednak se stanovuje aktivovaná chemiluminiscence, kdy se jako aktivátor používá např. phorbolmyristát acetát (PMA), který aktivuje přímo proteinkinázu C (PKC) a následně NADPH-oxidázu, fMLP (formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin) nebo opsonizovaný zymosan. Výhoda metody spočívá v tom, že k vyšetření stačí malé množství krve a není nutno pracovat s izolovanými leukocyty. Nulové hodnoty respiračního vzplanutí v testu chemiluminiscence za užití jak luminolu, tak lucigeninu svědčí pro CGD, zatímco v případě deficitu MPO zůstává chemiluminiscenční aktivita za užití lucigeninu zachována (20, 24). Metoda je vysoce citlivá a klinicky významná je i zvýšená spontánní chemiluminiscence, kdy se nepřidává aktivátor. Předpokládá se, že zvýšená hodnota je v tomto případě spojena s vyšší produkcí kyslíkových radikálů, které mohou vést k oxidačnímu poškození buněk a tkání vlastního organismu. Kromě rutinní laboratorní diagnostiky se chemiluminiscenční metody uplatňují i v biomedicínském výzkumu, kde slouží ke studiu vlivu biologických i chemických složek na fagocytární odpověď (12). Oxidace fluorogenních substrátů Fluorogenní substráty jsou látky, které primárně nemají fluorescenční vlastnosti a které mohou pasivně pronikat do buněk. V důsledku určité biologické aktivity, nejčastěji enzymatické, dochází k přeměně substrátu na fluoreskující produkt. Na rozdíl od chemiluminiscence, kdy je excitace elektronů vyvolaná chemickou reakcí, v případě
Alergie 3/2015
fluorescence je tato excitace způsobena absorpcí záření. Existuje rozsáhlá řada fluorogenních substrátů, které je možno využít k detekci aktivace NADPH-oxidázového komplexu. Emitovaná fluorescence je v tomto případě nejčastěji stanovována metodou průtokové cytometrie (32). Z fluorescenčních sond se pro detekci ROS využívá nejčastěji hydroethidin (HE), 2´7´- dichlorodihydrofluorescein diacetát (DCFH-DA) a dihydrorhodamin 123 (DHR123). HE (hydroethidin) je široce používané fluorescenční barvivo pro detekci intracelulárního superoxidu. Reakcí mezi HE a superoxidovým radikálem .O2vzniká 2-hydroxyethidin. Tato reakce však může probíhat i v přítomnosti dalších látek s oxidačním potenciálem, jako jsou např. hydroxylový radikál a perferylový radikál, peroxynitrit a další dimerní produkty. DCFH-DA je další fluorescenční sonda pro detekci intracelulárního H2O2 a oxidačního stresu (30). Oxidací DCFH-DA vzniká vysoce fluorescenční produkt 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein (DCF). Ačkoliv je DCFA-DA široce využívána k detekci intracelulárního H2O2, nereaguje s H2O2 přímo, ale pouze v přítomnosti katalyzátoru (cytochromy, peroxidázy). Svou roli sehrávají také redox-aktivní ionty železa nebo hem, což vede k předpokladu, že aktuální oxidanty vznikají v tomto případě spíše v průběhu Fentonovy reakce (26). Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH. Dihydrorhodamin 123 (DHR123) je v současné době snad nejpoužívanější fluorescenční sondou pro detekci ROS metodou průtokové cytometrie. Oxidační působení volných radikálů vedoucí k přeměně DHR123 rhodaminu je velmi podobné jako u přeměny DCFH (dichlorodihydrofluorescein) na DCFH (2,7‘-dichlor-fluorescein) radikál (DCFH.). Stejně jako DCF radikál i radikál DHR také rychle reaguje s kyslíkem za vzniku . O2- a H2O2, které se mohou podílet na reakci vedoucí k zesílení fluorescence rhodaminu. Kromě oxidačně působícího chlornanu se na výsledné reakci podílejí i další oxidační produkty vznikající především v důsledku Fentonovy reakce (16). Fluorescenční sondy DCFH, DHR 123 a HE jsou běžně využívány pro detekci respiračního vzplanutí polymorfonukleárních leukocytů průtokovou cytometrií. Nicméně jejich specifita pro jednotlivé formy reaktivních forem kyslíku není absolutní a je třeba si uvědomit, že tyto sondy reagují s různými druhy reaktivních produktů nejen kyslíku, ale i dusíku. Všechny tyto látky představují širokou škálu chemicky odlišných sloučenin s různou biologickou reaktivitou. Intenzita fluorescence stimulovaných granulocytů je tak závislá na typu a závažnosti poruchy fagocytózy – od absence fluorescenčního signálu charakteristického pro CGD až po různý stupeň poklesu intenzity fluorescence způsobený sníženou tvorbou reaktivních meziproduktů respiračního vzplanutí (15, 16). Z naměřených dat jsou vyhodnocovány dva parametry, které mohou vést k podezření na poruchu respiračního vzplanutí. Jednak je to procentuální zastoupení pozitivních granulocytů, které vykazují respirační vzplanutí po stimulaci korpuskulárním stimulans (nejčastěji
205
diagnostika a laboratorní technika
zdravá kontrola
matka přenašečka
pacient s CGD
Obr. 1: Sledování fagocytární aktivity neutrofilních granulocytů měřením respiračního vzplanutí po stimulaci E. coli v lidské periferní krvi pomocí průtokové cytometrie
E. coli) a jednak je to tzv. stimulační index, který představuje poměr mezi střední hodnotou intenzity fluorescence (MFI) granulocytů stimulovaného vzorku a vzorku nestimulovaného. Pokud stimulované granulocyty vykazují sníženou intenzitu respiračního vzplanutí, může se jednat o deficit enzymu myeloperoxidázy. Absence respiračního vzplanutí granulocytů svědčí pro chronickou granulomatózu. Pokud stimulované granulocyty vykazují dvě oddělené populace lišící se intenzitou respiračního vzplanutí, může se jednat o vzorek přenašečky chronické granulomatózy, která má část granulocytů s normální intenzitou respiračního vzplanutí a část s intenzitou sníženou podle povahy mutace na X chromozomu (obr. 1). Definitivní průkaz defektů NADPH-oxidázy a enzymu glukózo-6-fosfát dehydrogenázy, který se rovněž může podílet na nedostatečné funkci fagocytů, lze stanovit genetickým vyšetřením (9, 31). Stanovení mikrobicidní aktivity Poněkud méně často se v současné době využívají testy mikrobicidie. Při hodnocení mikrobicidní aktivity se fagocyty inkubují s indikátorovými živými mikroby (např. S. aureus, C. albicans, E. coli) a sérem jako zdrojem opsoninů. Vzorky se po proběhlé reakci naočkují na živné půdy a počet vytvořených bakteriálních kolonií odpovídá počtu živých bakterií. Test lze provádět z plné krve i s izolovanými granulocyty. Jinou variantu tohoto testu představuje kandidacidní test, který sleduje schopnost fagocytů pohlcovat a usmrcovat kvasinky (např. S. cerevisiae, C. albicans). Množství usmrcených kvasinek se hodnotí mikroskopicky po vitálním obarvení metylenovou modří (21, 19). K obecným nevýhodám těchto testů patří jejich pracnost, obtížná standardizace, nutné zázemí mikrobiologické laboratoře a změna antigenních vlastností bakteriálních kmenů během jejich pasážování.
206
Závěr Fagocytóza, resp. technické aspekty stanovení funkčních poruch neutrofilních granulocytů jsou poměrně složitou problematikou v oblasti laboratorní imunologie. Metodické spektrum je široké, provázené značnou individuální i mezilaboratorní variabilitou. Jednotlivé metody se zaměřují pouze na dílčí kroky, k poruchám však může docházet v každém z těchto dílčích kroků. Vzhledem k tomu, že existuje řada více či méně závažných poruch fagocytózy, není laboratorní diagnostika těchto stavů jednoduchá a nelze ji stavět pouze na jednom typu, resp. principu vyšetření. Ke stanovení hlavních příčin poruch fagocytózy je třeba použití širšího spektra laboratorních metod založených nejen na odlišném principu detekce, ale i stimulace NADPH-oxidázového komplexu.
LITERATURA 1. Anding K, Rost JM, Jacobs E, Daschner FD. Flow cytometric measurements of neutrophil functions: the dependence on the stimulus to cell ratio. FEMS Immunol Med Microbiol 2003; 35(2):147-52. 2. Babior BM, Takeuchi C, Ruedi J, Gutierrez A, Wentworth P Jr. Investigating antibody-catalyzed ozone generation by human neutrophils. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(6):3031-4. 3. Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: a graded response to membrane stimulation. J Immunol 1983; 130(4):1910-7. 4. Benna JE, Dang PM, Gaudry M, Fay M, Morel F, Hakim J, Gougerot-Pocidalo MA. Phosphorylation of the respiratory burst oxidase subunit p67(phox) during human neutrophil
Alergie 3/2015
diagnostika a laboratorní technika activation. Regulation by protein kinase C-dependent and independent pathways. J Biol Chem 1997. 5. Böhmer RH, Trinkle LS, Staneck JL. Dose effects of LPS on neutrophils in a whole blood flow cytometric assay of phagocytosis and oxidative burst. Cytometry 1992; 13(5):525-31. 6. Branum E, Cummins L, Bartilson M, Hopper M, Pruett S, O‘Brien JF. Effect of two anticoagulants on leukocyte yield and function, and on lysosomal enzyme activity. Clin Chem 1988; 34(1):110-3. 7. Campbell AK. Living light – chemiluminescence in the research and clinical laboratory. Trends in Biochemical Science 1986;11:104-108. 8. Dale DC, Boxer L, Liles WC. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood 2008; 112(4):935-45. 9. Dinauer MC. Chronic granulomatous disease and other disorders of phagocyte function. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005:89-95. 10. Ducusin RJ, Sarashina T, Uzuka Y, Tanabe S, Ohtani M. Phagocytic response of bovine polymorphonuclear leukocytes to different incubation conditions and following exposure to some effectors of phagocytosis and different anticoagulants in vitro. Can J Vet Res 2001; 65(1):38-44. 11. Geiszt M, Kapus A, Ligeti E. Chronic granulomatous disease: more than the lack of superoxide? J Leukoc Biol 2001; 69(2):191-6. 12. Guo H, et al. Recent advances in hydrogen peroxide imaging for biological applications. Cell Biosci 2014;4(1):64. 13. Hampton MB, Kettle AJ, Winterbourn CC. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood 1998; 92(9):3007-17. 14. Hořejší V, Bartůňková J. Základy imunologie. 3. vydání. Praha: Triton, 2008. 280 s. ISBN 80-7254-686-4. 15. Kalyanaraman B. Oxidative chemistry of fluorescent dyes: implications in the detection of reactive oxygen and nitrogen species. Biochem Soc Trans 2011; 39(5):1221-5. 16. Kalyanaraman B, Darley-Usmar V, Davies KJ, Dennery PA, Forman HJ, Grisham MB, Mann GE, Moore K, Roberts LJ 2nd, Ischiropoulos H. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med 2012; 52(1):1-6. 17. Kettle AJ, Winterbourn CC. Do neutrophils produce ozone? An appraisal of current evidence. Biofactors 2005; 24(1-4):41-5. 18. Klebanoff SJ, Kettle AJ, Rosen H, Winterbourn CC, Nauseef WM. Myeloperoxidase: a front-line defender against phagocytosed microorganisms. J Leukoc Biol 2013; 93(2):185-98. 19. Litzman J, et al. Základy vyšetření v klinické imunologii. Brno: Masarykova univerzita, 2007: 59 s. ISBN 978-80-210-4227-8. 20. Lochmanová A, Novák V. Funkční aktivita fagocytů v případě deficitu myeloperoxidázy – kasuistika. Alergie 2010; 2:122-125. 21. Lokaj J, Procházková J. Funkce fagocytů. In: Procházková J, John C a kol. Vybrané diagnostické metody lékařské imunologie. Praha: Avicenum, zdravotnické nakladatelství, 1986:205221. 22. Müller-Peddinghaus R. In vitro determination of phagocyte activity by luminol- and lucigenin-amplified chemiluminescence. Int J Immunopharmacol 1984; 6(5):455-66. 23. Nakano M, Sugioka K, Ushijima Y, Goto T. Chemiluminescence probe with Cypridina luciferin analog, 2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one, for estimating the ability of human granulocytes to generate O2-. Anal Biochem 1986; 159(2):363-9. Alergie 3/2015
24. Nauseef WM, Root RK, Malech HL. Biochemical and immunologic analysis of hereditary myeloperoxidase deficiency. J Clin Invest 1983; 71(5):1297-307. 25. Nunes P, Demaurex N. The role of calcium signaling in phagocytosis. J Leukoc Biol 2010;88(1):57-68. 26. Ohashi T, Mizutani A, Murakami A, Kojo S, Ishii T, Taketani S. Rapid oxidation of dichlorodihydrofluorescin with heme and hemoproteins: formation of the fluorescein is independent of the generation of reactive oxygen species. FEBS Lett 2002; 511(1-3):21-7. 27. Quinn MT, Gauss KA. Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases. J Leukoc Biol 2004; 76(4):760-81. 28. Rost M, Karge E, Klinger W. What do we measure with luminol-, lucigenin- and penicillin-amplified chemiluminescence? 1. Investigations with hydrogen peroxide and sodium hypochlorite. J Biolumin Chemilumin 1998; 13(6):355-63. 29. Salih H, Husfeld L, Adam D. Inhibitory effect of heparin on neutrophil phagocytosis and burst production using a new whole-blood cytofluorometric method for determination. Eur J Med Res 1997; 2(12):507-13. 30. Tampo Y, Kotamraju S, Chitambar CR, Kalivendi SV, Keszler A, Joseph J, Kalyanaraman B. Oxidative stress-induced iron signaling is responsible for peroxide-dependent oxidation of dichlorodihydrofluorescein in endothelial cells: role of transferrin receptor-dependent iron uptake in apoptosis. Circ Res 2003; 92(1):56-63. 31. van Bruggen R, et al. Deletion of leucine 61 in glucose-6-phosphate dehydrogenase leads to chronic nonspherocytic anemia, granulocyte dysfunction, and increased susceptibility to infections. Blood 2002; 100(3):1026-30. 32. Walrand S, Valeix S, Rodriguez C, Ligot P, Chassagne J, Vasson MP. Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes. Clin Chim Acta 2003; 331(1-2):103-10. 33. Wentworth P Jr, McDunn JE, Wentworth AD, Takeuchi C, Nieva J, Jones T, Bautista C, Ruedi JM, Gutierrez A, Janda KD, Babior BM, Eschenmoser A, Lerner RA. Evidence for antibody-catalyzed ozone formation in bacterial killing and inflammation. Science 2002;298(5601):2195-9. 34. White-Owen C, Alexander JW, Sramkoski RM, Babcock GF. Rapid whole-blood microassay using flow cytometry for measuring neutrophil phagocytosis. J Clin Microbiol 1992; 30(8):2071-6. 35. Winterbourn CC, Kettle AJ. Reactions of superoxide with myeloperoxidase and its products. Jpn J Infect Dis 2004; 57(5):S31-3. 36. Yamashita K, Miyoshi T, Arai T, Endo N, Itoh H, Makino K, Mizugishi K, Uchiyama T, Sasada M. Ozone production by amino acids contributes to killing of bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105(44):16912-7.
RNDr. Alexandra Lochmanová, Ph.D. katedra biomedicínských oborů Lékařská fakulta OU Syllabova 19 703 00 Ostrava-Zábřeh e-mail:
[email protected]
207
