ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2012
Kristýna Müllerová
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky
Využití laserového záření pro léčbu plísňových onemocnění
Účinky laserového záření a vedení tepla v tkáni
Vedoucí projektu: Mgr. Jana Urzová Student:
Kristýna Müllerová
leden 2012
Anotace: Název práce: Účinky laserového záření a vedení tepla v lidské tkáni Naše práce v rámci týmového projektu se zabývá zejména účinky UV záření na tkáň. Celý výzkum by měl vést k ověření metody, která by v budoucnu vylepšila způsob léčby plísňových onemocnění. Podrobněji jsme se zabývali problematikou průchodnosti UV záření lidským nehtem a germicidními účinky laserového záření, kterým je věnována experimentální část projektu. Úvodní část je věnována základním vlastnostem UV záření a jeho interakci s lidskou tkání, laserům a jejich využití v praxi a v neposlední řadě také různým typům plísňových onemocnění kůže a jejich původcům, dermatofytům. V závěru jsou uvedené metody, které jsme použili pro experimenty, výsledky, ke kterým jsme došli, vyhodnocení a vize do budoucna.
Annotation: Title: Effects of laser radiation and heat conduction in human tissue Our work is particularly concerned with the effects of UV radiation on tissue. The entire research should lead to averification method that would improve the future treatment of fungal diseases. More detail, we examined the issue of throughput UVgermicidními human fingernail and effects of laser radiation, which is devoted to the experimental part of the project. The introductory part is devoted to basic properties of UV radiation and its interaction with human tissue, lasers and their application in practice and, ultimately, various types of fungal skin diseases and their agents, dermatophytes. At the end are the methods that we used for the experiments, the results, which we reached, evaluation and visions for the future.
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem ………………………………………………………………………………………………….. vypracovala samostatně a použial k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k práci. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V ……………. dne ………………
……………………. Podpis
I
Obsah: Úvod ...................................................................................................................................1 1.
UV záření .....................................................................................................................1
1.1.
Historie UV záření ........................................................................................................1
1.2.
Základní vlastnosti UV záření .......................................................................................2
1.3.
Dělení UV záření. .........................................................................................................2
1.4.
Vliv UV záření na člověka .............................................................................................3
1.5.Využití UV záření ...............................................................................................................4 2.
Laser ............................................................................................................................5
2.1.
Konstrukce laserů ........................................................................................................6
2.2.
Dělení laserů ................................................................................................................6
2.3.
Excimerový laser ..........................................................................................................7
2.4.
Využití laseru v dermatologii ........................................................................................8
2.5.
Působení laserového záření na tkáň .............................................................................8
3.
Plísňová onemocnění, jejich příčina a léčba ...............................................................13
3.1.
Dermatofytóza ...........................................................................................................13
3.2.
Onychomykóza ..........................................................................................................14
3.3.
Plísně způsobující dermatofytózu a onychomykózu ...................................................15
3.4.
Léčba .........................................................................................................................19
4.
Metody ......................................................................................................................21
5.
Použité přístroje a zařízení .........................................................................................22
6.
Měření .......................................................................................................................23
7.
Závěr a vize do budoucna ...........................................................................................24
8.
Seznam použité literatury ..........................................................................................25
II
Úvod V dnešní době je laserové záření používáno již ve většině odvětví medicíny, neboť výhody spojené s laserem dalece převyšují možná rizika. Laserové operace jsou přesné, časově nenákladné a oproti běžným operacím je obecně i kratší následná doba rekonvalescence. První pokusy léčby plísňového onemocnění nehtů pomocí laserového záření jsou dokumentovány již v roce 1980, v praxi šlo ale jen o vyhloubení děr v nehtu pomocí laseru a následné aplikaci masti. V této době je léčba plísňových onemocnění nehtů zprostředkována převážně perorálními antimykotiky, kde je léčba dlouhodobá a častokrát se musí opakovat kvůli návratu plísně. Mezi další možnosti patří chirurgické odstranění nehtu (velmi bolestivé) nebo antimykotické masti, roztoky a laky (častá aplikace a méně účinné). Je známo, že záření v oblasti UV spektra je vysoce germicidní. *2+ Tudíž je zde teoretická možnost léčby těchto onemocnění pomocí laserového záření v UV spektru. Teoretická část obsahuje základy UV záření, jeho rozdělení, vliv na lidský organismus a tkáň, dále pak základní rozdělení laserů a problémy které mohou nastat při interakci laserového záření s tkání. V experimentální části se poté věnujeme průchodu UV záření skrz nehet (a tudíž možnému poškození tkáně pod nehtem) a účinnosti UV záření na různé druhy plísní způsobující onemocnění nehtů.
Teoretická část:
1. UV záření
1.1. Historie UV záření Ultrafialové záření bylo objeveno již v roce 1801 německým fyzikem Johannem Wilhelmem Ritterem, který pozoroval dopad slunečního světla rozloženého optickým hranolem na pruhy papíru namočené v chloridu stříbrném. Zjistil, že neviditelné paprsky těsně za fialovým koncem spektra mají největší efekt (papír zčernal). Tyto neviditelné 1
paprsky poté nazval "oxidačními paprsky". Objev UV záření o vlnových délkách kratších než 200nm byl učiněn v roce 1893 německým fyzikem Victorem Schumannem.
1.2. Základní vlastnosti UV záření Ultrafialové záření je elektromagnetické záření o vlnové délce v rozmezí 10nm až 400nm. Přestože je UV záření pro lidské oko neviditelné, většina lidí si je vzhledem k tomu, že je jeho přirozeným zdrojem slunce, vědoma jeho vlivu (spálení od slunce). Někteří živočichové jsou ale schopni UV záření (konkrétně UV-C) vnímat. Například pro lidské oko vypadají samice a samec motýla stejně, ale motýli se navzájem od sebe rozeznají díky ultrafialovým značkám na křídlech (jsou schopni vidět vlnové délky přibližně od 310nm do 700nm). UV záření se nachází ve slunečním světle a je emitováno tělesy zahřátými na vysokou teplotu (např. elektrickým obloukem) nebo výbojkami, které jsou naplněné párami rtuti (např. UV lampy). Ultrafialové záření má uplatnění v mnoha oborech - forenzní analýzy, analýzy proteinů, UV vodoznaky, desinfekce, analýza chemických struktur a mnoho dalších.
1.3. Dělení UV záření. UV záření můžeme dělit dle různých parametrů, standart ISO (21348 -2004) pro určení slunečního záření rozděluje spektrum UV záření následovně: Spektrální podkategorie
Vlnová délka λ [nm]
Název
UV
100 - 400
UV
VUV
10 - 200
Vakuové UV
EUV
10 - 121
Extrémní UV
H -lyman -α
121 - 122
Hydrogen Lyman-alpha
FUV
122 - 200
Daleké UV
UVC
100 - 280
UV C
MUV
200 - 300
Středně dlouhé UV
UVB
280 - 315
UV B
NUV
300 - 400
Blízké UV
UVA
315 - 400
UV A
Tab. 1-Rozdělení UV záření dle vlnových délek
2
Podkategorie do sebe navzájem zasahují neboť VUV, EUV, FUV, MUV, NUV je používáno pro rozdělení ve fyzice a UVA, UVB a UVC je používáno z hlediska biologických účinků, které jsou pro nás důležité. Slunce emituje záření ve vlnových délkách UVC až UVA, z toho je ale 97-99% blokováno v atmosféře ozónovou vrstvou. Záření které pronikne, je z cca 98% UVA záření, běžné okno propustí zhruba 90% světla s vlnovou délkou delší než 350nm, ale nepropustí přes 90% světla s vlnovou délkou kratší než 300nm.
UVA (315-400nm)- Spektrum UVA má nejméně ničivý účinek na lidskou tkán, přesto však může pomocí nepřímého poškození DNA přispět k rakovině kůže. Toto záření téměř nepůsobí popáleniny a proniká hlouběji, kde může vytvářet vysoce reaktivní hydroxylové a kyslíkové radikály, které pak mohou poškozovat DNA. Stimulací melanocytů způsobuje krátkodobé zhnědnutí kůže, které nepředstavuje žádnou ochranu proti slunci. Vzhledem k poškozování kolagenu tímto zářením kůže ztrácí elasticitu a předčasně stárne.
UVB (280-315nm) - Ze slunečního spektra se UVB podílí nejvíce na poškozování buněk a působí přímé poškození DNA. Je příčinou spálení od slunce a díky mutaci DNA i rakoviny kůže. UVB má dále největší dopad na poškození očí, dokáže až zcela spálit tyčinky, čípky a nervová zakončení v rohovce (způsobuje např. sněžnou slepotu). Se zpožděním 72 hodin po ozáření způsobuje ve svrchní vrstvě kůže dlouhodobé zhnědnutí, které ochraňuje před UV zářením. Současně vystavení tomuto záření vede k tvorbě vitaminu B3 (cholekalciferol- protirakovinotvorný účinek), takže je životně nutné. Způsobuje také poškození kolagenu, ale v daleko menší míře nežli UVA.
UVC (100-280nm) - Je nejtvrdší UV záření, způsobuje vznik ozónu. V přírodě se téměř nevyskytuje, stejně jako FUV a VUV je zcela absorbováno v atmosféře. Toto záření je vysoce germicidní, a proto je používáno k ničení bakterií. Nadměrné vystavení tomuto záření může způsobit popáleniny a mutace DNA, navíc je velmi bolestivé. Průnik tohoto záření tkaní je proti UVB poměrně větší.
1.4. Vliv UV záření na člověka Většina lidí si je vědoma pouze škodlivých účinků UV záření, přestože je pro nás životně důležité. Vystavení se UVB záření vede k produkci vitamínu D3 regulujícímu vápník v 3
organismu (důležitý pro správnou činnost nervového systému, růst kostí), imunitní systém, sekreci inzulinu nebo krevní tlak. Krátké vystavení tomuto záření vede také k menšímu přímému poškození DNA, které je pak díky fotolyáze (opravný mechanismus DNA) rozpoznáno a opraveno, což následně zvýší produkci melaninu, který vytvoří dlouhodobou ochranu proti UV záření. Dále je UV záření používáno například k léčbě psoriázy (lupénky), fototerapie využívá UVB složku záření a fotochemoterapie UVA složku v kombinaci s tablety psoralenu, či k léčbě vitiliga (nemoc při které odumírají buňky tvořící kožní pigment).
1.5.Využití UV záření Při působení UV záření je rozhodující rozsah vlnových délek (od UV-A do UV-C). Podle Grotthus-Draperova zákona jsou účinné pouze složky paprsků, které jsou pohlcovány ozařovaným materiálem. Musí tedy docházet k absorpci složkami biologické hmoty, aby mělo nějaký účinek. Zajímavé jsou v tomto ohledu proteiny a nukleové kyseliny. Pro tryptofan, thyrosin a fenylalanin je charakteristická absorpce právě UV paprsků o vlnových délkách 250-300 nm. Podobné vlnové délky jsou schopny absorbovat i proteiny. Pokud se do problematikyzavrtáme hlouběji, dostaneme se až k procesu dělení buňky, které je rozčleněno do několika fází, kdy se na příklad buňky diferencují a získávají tak charakteristické vlastnosti, rostou, opravují své DNA, připravují DNA na replikaci, replikují se (kopírují genetickou informaci uloženou v DNA), kopírují ostatní své organely a připravují se na dělení jádra, karyokinezi, a následně na dělení celé buňky, cytokinezi. Základní stavební jednotkou DNA je nukleotid, který se skládá ze sacharidu deoxyribóza, kyseliny fosforečné (H3PO4) a bází, což jsou dusíkaté organické zásady adenin, thymin, guanin a cytosin. Tyto báze spojují dva řetězce na základě své komplementarity. Adenin prvního řetězce je vždy spojen s thyminem druhého řetězce, a stejně tak cytosin s guaninem tvoří dvojici Replikace DNA probíhá tak, že se DNA dvojšroubovice, tzv. matrice, na podnět enzymů rozpojí a v prostoru kolem, tj. uvnitř jádra, je nalezena k matriční bázi báze komplementární, která je následně pomocí dalších enzymů navázána na původní řetězec. Na oba dva rozpojené řetězce se tedy postupně navážou komponenty, které jsou přesnou kopií původního odpojeného řetězce a vznikají tak z jedné matriční dvoušroubovice DNA dvě dceřinné, naprosto identické. 4
Obrázek 1: Replikace DNA [6]
1.5.1. Dezinfekce
UV záření vyvolává změny na DNA (fotochemické reakce), při kterých dochází k tvorbě dimerů thyminových bází, čímž je blokována vazba thyminu na adenin, která je nezbytná právě k replikaci a tím i k množení buněk, jejich látkové přeměně a k přežití. [7] UV-technologie využívají právě této vlastnosti při desinfekcích bazénů, kde ničí bakterie, viry, plísně a jejich spory. Tímto způsobem zabraňuje jejich přenesení či rozmnožení na kůži, v trávicím traktu, v očích nebo dýchacích cestách.[5] Právě tento směr využití je inspirací pro realizaci takové metody při léčbě plísňových onemocnění kůže (tzv. dermatofytóz), která by ničila dermatofyty způsobující tato onemocnění rychle, efektivně a snad i dlouhodoběji, než dosavadní metody.
2. Laser Laser je zkratka anglického LightAmplification by StimulatesEmissionofRadiation, což můžeme přeložit jako „Zesílení světla pomocí stimulované emise záření“. K řečené emisy dochází díky tomu, že námi dodanou energií vybudíme atomy z jejich základního, 5
počátečního stavu do stavu vzbuzeného, excitovaného. Atomy však mají tendenci se opět vracet do svého základního stavu, na základní energetickou hladinu. Právě pádem z hladin s vyšší energií na hladinu s nižší energií dochází k uvolnění energie v podobě fotonů. Tyto fotony dopadají na další „klidné“ atomy, kterým touto srážkou opět dodají energii a vybudí je do vyšších energetických hladin odkud opět následně padají zpět. Vzniká tak řetězová reakce a získaná energie se hromadí v optickém rezonátoru. Laserové záření je koherentní (všechny paprsky kmitají se stejnou fází), monochromatické (všechny paprsky mají stejnou vlnovou délku) a polarizované (vektor intenzity elektromagnetického pole se nemění nahodile, jako tomu je u nepolarizovaného světla, ale kmitá pouze jedním směrem a kolmo na směr šíření).
2.1. Konstrukce laserů Zdroj je nedílnou součástí každého laseru. Může být optický, elektrický, nebo chemický. Zdrojem je energie dodávána do aktivního prostředí, kde slouží k vybuzení atomů do vyšších energetických hladin, do jejich excitovaných stavů. Výkon tohoto budícího zařízení a celková konstrukce zrcadel uvnitř zařízení určují optický výkon laseru. Optický rezonátor je tvořen soustavou dvou zrcadel, z nichž jedno je nepropustné, má postříbřený povrch a jeho reflektance dosahuje nad 99 %. Druhé zrcadlo je polopropustné s reflektancí od 8 až do 90 %.Fotony vznikající stimulovanou emisí se odrážejí od zrcadel a zmíněnou řetězovou reakcí se zde hromadí a tím se zvyšuje intenzita světla uvnitř zeronátoru. Po dosažení určité hodnoty výboj pronikne skrz polopropustné zrcadlo ven.Jakmile je energie takto vyzářena , atomy se vrací zpět do svého počátečního stavu.*8]
2.2. Dělení laserů Kontinuální – získání kontinuálního provozu laseru s tuhou fází s optickým vybuzením je velmi náročné. Způsobuje to nevyhnutelnost používat dostatečně silný kontinuální zdroj budícího světla a je třeba odvádět velké množství tepla, které v laseru vzniká. Hodnota špičkového výkonu se pohybuje do 100 W Impluzní- jsou zdrojem mohutných světelných záblesků, trvajících někdy jen stomiliontinu sekundy. K hromadění energie může docházet v rezonátoru (fotony) nebo v atomárním systému (inverzní obsazení). Impulsní lasery dosahují o řád vyšších
6
špičkových výkonů (<1000 W), než lasery kontinuální. Kvazikontinuální- vyznačuje se spínáním zdroje pouze na určité časové úseky. Tím pádem jsou omezeny nežádoucí tepelné účinky, avšak tyto časové úseky jsou dostatečně dlouhé na to, abychom provoz označili za kontinuální. Kvazikontinuální laser poskytuje vysoký špičkový výkon za cenu nižšího průměrného výkonu Neinvazivní terapeutické - mají oproti invazivnímu laseru mnohem nižší výkon. Základním mechanismem působení je stimulace buněčných aktivit (především mitochondrií). Kromě stimulačního efektu má terapeutický laser také analgetický a protizánětlivý účinek Nejvíce využíván je v dermatologii – při léčení kožních defektů, akné, herpetických insektů, problematických ran atd. Laser našel stabilní uplatnění v chirurgii, v ortopedii i rehabilitační medicíně, při terapii popálenin, různých ran, při bolestivých stavech svalů, kloubů, úponů. Prosadil se i tam, kde je pro klinika cenný efekt stimulace, úlevy od bolesti, utlumení zánětlivých pochodů. V dnešní době je hojně rozšířen v estetické medicíně. Pomocí aplikace kosmetického gelu, jehož substance jsou aktivovány laserovým zářením, dochází k jednoznačným pozitivním efektům – tonizaci a rejuvenaci ošetřovaných částí.. Invazivní chirurgické lasery - disponují vyšším výkonem než lasery terapeutické. Jejich princip působení nespočívá ve stimulaci, nýbrž v odstraňování, řezání, přichycení nebo jiné manipulaci s tkání. Výše uvedených účinků invazivních laserů na tkáň se využívá zejména v oftalmologii při očních operacích. Využívá se jevů jako je fototermická afotoevaporizační laserová terapie, excimerováfotoablace (fototerapeutická keratektomie – PTK, fotorefraktivní keratektomie – PRK, Laser in situkeratomileusis - LASIK). Další oblastí využití invazivních laserů je chirurgie, kde se krvácející rány zastavují pomocí fotokoagulace, nádory odstraňují fotodisrupcí.
Převzato z [8]
2.3. Excimerový laser Excimer je molekula, která je velice nestabilní a vzniká jen na přechodnou dobu, a to při srážce atomu v jeho základním stavu se svazkem elektronů o vysoké energii. Ve vzbuzeném stavu má potenciální energie lokální minimum, a proto se při vzájemném přiblížení atomů vytváří vázaný stav, excimer. Komponenty se v excitovaném stavu přitahují a v základním odpuzují.
7
Při návratu do základního stavu se molekula excimeru opět rozpadá na jednotlivé atomy. Slovo excimer je složeninou slova excited (tj. vzbuzený) a dimer (tj. chemická sloučenina dvou stejných nebo podobných podjednotek). Excimerový laser je laser plněný plynnou směsí. Využívá se u něj stimulovaných přechodů excimerů z jejich vzbuzeného stavu do stavu základního, kdy je využívána energie uvolněná při pádu. Vzniklé optické záření je zesilováno, přičemž k docílení výstupní energie v řádech stovek kilojoulů jsou využívány vlastnosti plynných směsí (např. Kr +F + He + Ne) a tlak 2-4 atmosféry působící na objem 40-60 litrů. Plyn bývá tvořen z 88-99 procenty bufferem (Ne, He).Tyto lasery jsou impulsní, jsou buzeny buďto silnoproudým svazkem nebo el.výbojem.[8][9]
2.4. Využití laseru v dermatologii První použití excimerového laseru pro dermatologii bylo prezentováno v roce 1997. Nyní je bráno jako vylepšení konvenční fototerapie a fotochemoterapie. UV zářením jsou indikovány lupénky, poruchy pigmentace a atopický ekzém. Jsou schválené aplikace laserem XeCl o vlnové délce 308 nm, frekvenci 250 Hz a dávce 4 – 350 mJ/cm2, které se používají právě při léčbě lupénky a pigmentových skvrn.
2.5. Působení laserového záření na tkáň
2.5.1.
Fyzikální procesy
Interakci laserového záření s tkání ovlivňuje několik faktorů. Primární význam má vlnová délka, dále výkon a hustota výkonu, doba vystavení, jedná-li se o pulzní laser pak také délka a frekvence pulzu, druh tkáně a optické vlastnosti tkáně. Většina organických molekul vykazuje vysokou absorpci v ultrafialovém spektru a proto je průnik UV velmi slabý. Během optické fáze při dopadu laserového záření na tkáň dochází k následujícím fyzikálním procesům. Absorbanci (pohlcení záření), transmitanci (průchod záření), rozptylu a reflexi (odražení). 8
Obrázek1: Průchod laserového záření tkání z optického hlediska
Absorbance je přenos energie ze záření do ozařované tkáně. V ideálním případě (žádný rozptyl paprsku), pokud je nějaké prostředí ozařováno paprskem světla o intenzitě l0 můžeme použít Lambert-Beerův zákon pro monochromatické záření 𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝜇𝑑
μ je absorpční koeficient prostředí (tkáně), d tloušťka prostředí (tkáně) a I intenzita záření po průchodu a poté pro absorbanci 𝐴 = 𝑙𝑜𝑔
𝐼0 𝐼
Optický rozptyl je způsoben nehomogenním indexem lomu v daném prostředí. Jeho intenzita a prostorové rozložení závisí na velikosti a tvaru nehomogenity vzhledem k vlnové délce a rozdílech v indexu lomu.
Transmitance určuje množství světla, které prošlo daným prostředím. Je definována následovně: 𝑇 = 𝑙𝑜𝑔
𝐼 𝐼0
kde I je intenzita světla po průchodu prostředím a I0intenzita světla před průchodem.
Reflexe je odraz paprsku na rozhraní dvou prostředí s různým indexem lomu
9
2.5.2.
Účinky laserového záření na tkáň
Fotochemické efekty - Při nízké hustotě výkonu a dlouhých časech působení dochází ve tkáních k fotochemickým procesům. Takovéto reakce mohou probíhat již při malých intenzitách a jsou vyvolány zářením o vlnových délkách kratších než 400nm. U expozic, které jsou delší než cca 1ms, bude laserové záření o vlnových délkách kratších než 320nm narušovat chemické vazby v nukleových kyselinách a může způsobovat mutace. V této reakci absorpce fotonu vnějšími elektrony je nutná k zajištění excitovaného molekulárního elektronového stavu, ze kterého chemická reakce může nastat. Toho je využíváno v rozsáhlé oblasti fotodynamické terapie a nachází použití při terapii bolesti, urychlení hojení ran a léčbě alergií.
Fototermické efekty - Od hustot výkonu kolem 100W/cm2 dochází k fototermickým změnám ve tkáních. Tento efekt je typický pro záření s delší vlnovou délkou (700nm a více). Může se jednat o hypertermii- mírné zvýšení teploty o několik stupňů (teplota tkáně od 41° do 44°C), což při delší době (desítky minut) vede k buněčné smrti v důsledku změn v enzymatických procesech. Při teplotách od 50° do 100°C a době okolo jedné sekundy je tkáň koagulována. Jedná se o denaturaci proteinů a kolagenu vedoucí k nevratné bezprostřední nekróze tkáně. Při teplotě přesahující 100° dochází k vypařování tkáně již v relativně krátké době (cca desetina sekundy) Vlivem přenosu tepla v tkáni se vytvoří v okolí ozářeného místa koagulační zóna. Touto metodou je možné zničit větší tumory (i několik milimetrů v průměru) než při použití běžnékoagulace. Tento proces je používán při hemostázi, rozrušení tkání (terapie tumoru, vyhlazení vrásek). Další použití je v oblasti operací sítnice.
Fotoablace - Při hustotách výkonu nad 106W/cm2d a krátkých vlnových délkách (cca 190-300nm) dochází k fotoablaci. Určitý objem tkáně je přitom náhle zahřát a odpařen, neboť elektrické pole související se zářením je větší než vazebná energie mezi molekulami. Pokud je tkáň vystavena cílenému pulsu excimerového laseru, energie tohoto pulsu bude při krátké vlnové délce UV záření absorbována v tenké vrstvě materiálu (většinou méně než 0,1μm). Díky vysokému výkonu ve špičce 10
soustředěnému do tenké vrstvy dojde k rozbití chemických vazeb. Výsledné molekulární fragmenty následně expandují do oblaku plazmy, která nese tepelnou energii vyvolanou rozpadem. V důsledku krátkosti času, potřebného k odpaření, nedochází k přenosu tepla tepelnou vodivostí na okolní tkáň. Pro CO 2 kontinuální lasery (vlhká tkáň absorbuje CO2 laserové záření velmi dobře) můžeme vypočítat rychlost ablace takto: 𝑣 = 𝑓𝐸/𝑄 kde E je hustota záření [W/cm2], Qteplo potřebné k vypařování vody [J/cm2],f účinnost přeměny energie absorbované na ablaci. Při využití kontinuálního Nd:YAG laseru se vyžaduje nejdříve vytvoření vrstvy karbonizované tkáně než nastane ablace. Laser tak nejdříve jen ohřívá a vysušuje tkáň, což poté zapříčiní její oxidaci a vytvoří se zuhelnatělá vrstva. Tento proces je díky ohřívání, sušení, odpařovaní složitější. rychlost ablace můžeme vyjádřit: 𝑣 = 𝑓 ∗ 𝜇𝑎 ∗ 𝑑 ∗ 𝑘 ∗ 𝐸/𝑄 KdeEje hustota záření [W/cm2], Q teplo potřebné k vypařování vody [J/cm2], μ0 absorpční koeficient karbonizované tkáně *cm -1], d tloušťka karbonizované tkáně *cm+, k faktor zvětšení vzhledem k mnohanásobnému průchodu světla skrz karbonizovanou vstvu, ,f účinnost přeměny energie absorbované na ablaci. Např. V oční chirurgii se takto používají excimerové lasery s pulsy (18 ns).
Fotomechanické efekty - Mechanické účinky mohou vést buď k vytvoření plazmy, explozivnímu vypařování nebo kavitaci a s každým z těchto jevů je spojen vznik rázové vlny. S pevnolátkovými lasery se dosahuje velmi vysoké intenzity záření na malou plochu (1010 až 1012W/cm2 při délce pulsu piko až nanosekunda). Takováto intenzita ionizuje atomy a vytvoří plazmu. Na hranici ionizované oblasti je poté velmi vysoký tlakový gradient, který způsobuje šíření rázové vlny. Ještě vyšší hustoty výkonu až do oblasti 109W/cm2 jsou dosahovány pevnolátkovými lasery. Požití je například při operacích šedého zákalu.
2.5.3.
Faktory ovlivňující přenos tepla 11
Přenos tepla v tkáních ovlivňují termofyzikální vlastnosti tkáně, geometrie ozařování organismu, produkce tepla způsobená absorpcí laserového světla, produkce tepla vzniklá metabolickými procesy, produkce tepla vzniklá perfúzí krve a mechanismy regulující teplo. Pro zachování celkové energie v určitém objemu platí tato rovnice: 𝑞𝑝 = 𝑞𝑢 + 𝑞𝑧 + 𝑊 kde qp představuje přijatou energii, quenergii uskladněnou ve tkáni, qq energetické ztráty a W vykonanou práci. Tepelný tok v tkáni v závislosti na vedení tepla, může být pak vyjádřen takto: 𝑓 = −𝑘∇𝑇 kde fje .vektor tepelného toku, k je součinitel tepelné vodivosti a 𝜵T se rovná maximální změně teploty na jednotku vzdálenosti Při přenosu tepla uvnitř tkáně jsou potom zásadní dva hlavní parametry - tepelná vodivost tkáně a průtok krve: 𝑓∇= −𝜌𝑐
𝜕𝑇 + 𝑞𝑝 + 𝑆 𝜕𝑡
kde 𝝆je hustota [kg.𝑚3 +, c je měrné teplo *J . kg-1 . K-1]a 𝒒𝒑 je množství tepla daného prouděním krve. Generované teplo v daném místě za jednotku času při velmi malé tloušťce (Δz) je dáno následovně: 𝑆 𝑧 =
𝐼 𝑧 − 𝐼(𝑧 + 𝛥𝑧) 𝜕𝐼(𝑧) = = 𝜇𝑎 ∗ 𝐼(𝑧) 𝛥𝑧 𝜕𝑧
kde z je pozice, μa absorpční koeficient v daném místě a I(z) hustota zářivého toku v daném místě. Tato rovnice vyjadřuje, že generované teplo ve tkáni je rovno absorbované energii a může být popsáno jako absorpční koeficient násobený intenzitou v daném místě. Ve většině případů je světlo zároveň absorbováno i rozptýleno ve vzorku. Paprsek je tlumen dle 12
Lambert-Beerova zákona, součinitel zeslabení je ale poté dán součtem koeficientů absorpce a rozptylu, nazývá se celkový součinitel zeslabení: 𝜇 = 𝜇𝑎 + 𝜇𝑠 kde μr je celkový součinitel zeslabení, μa absorpční koeficient, μsrozptylový koeficient. Při použití kontinuálního laserového záření použít pro výpočet energie E *W/m 2+ následující rovnici : 𝐸 𝑧 = 𝐸0 𝑒 −𝜇𝑡𝑧 a pro pulzní laser: H [j/m2]: 𝐻 𝑧 = 𝐻0 𝑒 −𝜇𝑡𝑧
3. Plísňová onemocnění, jejich příčina a léčba
3.1. Dermatofytóza Nejsvrchnější vrstva pokožky je tvořená mrtvými zrohovatělými buňkami obsahujícími keratin.Stejně tak se z této látky skládá struktura nehtů a vlasů. Keratin je stavební bílkovina, kterou je tvořen buněčný cytoskelet (mikrotubuly a mikrofilamenta).Za dermatofytózy jsou označována onemocnění kůže způsobená plísněmi, dermatofyty, které jsou schopné využívat látku keratin jako zdroj živin. Majítotiž k dispozici takové enzymy, které dokážou tuto látku účinně rozkládat.Kolonie dermatofytů sice napadají neživé části tkáně, nicméně už jejich přítomnost a jejich metabolické produkty způsobují u hostitele alergické a zánětlivé reakce. Dermatofytózy rozlišujeme podle místa kontaminace, druhu hostitele a druhu plísně. Některé plísně napadají výlučně člověka, některé přežívají v půdě a způsobují infekce po fyzickém kontaktu. Stejně tak se i ty, které primárně parazitují na zvířatech, mohou přenést na člověka. Za onychomykózy označujeme plísňové infekce nehtů, a právě jimi se budeme v této práci podrobněji zabývat. 13
3.2. Onychomykóza Onychomykóza se řadí mezi nejčastější dermatologické potíže. Jak dokázaly studie četnosti této nemoci v U.K., Finsku a Spojených Státech Amerických, nakažených stále přibývá.Ve Spojených Státech se uvádí, že mezi postižené patří 7-10% populace[1], což by v České republice znamenalo přibližně 800 tisíc obyvatel. Nejvíce znepokojující je tato nemoc u starších lidí, pacientů s diabetem, či infekční celulitidou, s nimiž jde velice často ruku v ruce a vážně komplikuje jejich léčbu. Distální a laterální podnehtováonychomykóza je nejčastější formou onychomykózy a výrazně zhoršuje kvalitu života ať už bolestmi při chůzi, či nevzhledností, kvůli níž pacienti své nehty schovávají a dál je uzavírají do bot, kde se nemoc díky vhodným podmínkám ještě zhorší. *3+
Příčiny vzniku onychomykózy o Nošení uzavřené a neprodyšné obuvi z nevhodných materiálů o Hromadné využívání plaveckých bazénů o Traumatizace nohy při delší námaze, např. sportu, turistických výpravách atd. o Některá onemocnění, zvlášť cukrovka, cévní onemocnění a obezita o Zvýšené pocení nohou, hlavně v letním období o Širší užívání antibiotik a kortikosteroidů [3]
Obrázek 3: Onychomykóza
14
3.3. Plísně způsobující dermatofytózu a onychomykózu 3.3.1.
Trichophyton rubrum
Tento druh se stal nejrozšířenější příčinou plísňových onemocnění u člověka. Způsobuje chronické infekce pokožky a nehtů. Jsou známy dva typy tohoto druhu, chmýřitý a granulovitý.Granulovitý typ byl častou příčinou dermatomykózy trupu (tineacorpotis) mezi domorodci v jihovýchodní Asii a severní Austrálii. Po ukončení války ve Vietnamu se však s návratem vojáků tato nemoc rozšířila postupně po celém světě.
Obrázek 4: Trichophyton r. pod mikroskopem –chmýřitý typ(vlevo) a granulovitý typ(vpravo)
3.3.2.
Trichophyton interdigital
Dalším typem plísně, způsobujícím u lidí dermatomykózy a onychomykózy je Trichophyton interdigital. Tyto kolonie tvoří ploché kruhové útvary bílé až krémové barvy se semišovým povrchem. Starší kultury zespodu tmavnou a získávají narůžovělou až červenohnědou barvu. Je charakteristická tím, že na kůži vytváří drobné puchýřky.
Obrázek 5: Kultura Trichophyton interdigital a struktura jejích kolonií pod mikroskopem
3.3.3.
Microsporum canis 15
Kolonie této plísně jsou obvykle bílé až krémové barvy s povrchem, na němž se mohou vyskytovat i radiální drážky. Jde o dermatofyt rozšířený po celém světě. Zvířata, typicky kočky a psi, jsou hlavními přenašeči infekce na člověka. Infekce se drží ve vlasech a na kůži, jen zřídka kdy na nehtech.
Obrázek 6: Kultura Microsporum canis a struktura jejích kolonií pod mikroskopem
3.3.4.
Trichophyton mentagrophytes
Jde o typ plísně tvořící kolonie bílé až krémové barvy s prachovým až zrnitým povrchem. Je uspořádaná centrálně a šíří se kruhovitě. Periferní oblasti se barví od žlutohnědé až po červeno-hnědou barvu. Tato forma napadá zejména zvířata, v první řadě myši, morčata, klokany, kočky, koně , ovce a králíky. U lidí napadá pokožku hlavy v oblasti temene a pod fousy.
Obrázek 7: Klokan napadený Trichophyton mentagrophytes na hřbetě a kultura této plísně
16
Obrázek8: Kolonie Trichophyton mentagrophytes pod mikroskopem
3.3.5.
Trichophyton mentagrophytes var. Quinckeanum
Tato forma Trichophyton mentagrophytes zvaná quinckeanum se liší tvarem kolonií, které v tomto případě nejsou zcela ploché, ale mírně rostou i do výšky a tvoří tak nápadné textury. Zbarvení při okrajích nedosahuje hnědo-červené barvy, charakteristický je však jeho štiplavý zápach. Jde o formu napadající převážně zvířata, zejména myši. U lidí se s tímto typem plísně můžeme setkat velice zřídka, a to na temeni hlavy a pod vlasy.
Obrázek 9: Napadená myš a kultura Trichophyton mentagrophytes typu quinckeanum
Obrázek 10: Trichophyton mentagrophytes quinckeanum pod mikroskopem 17
3.3.6.
Epidermophyton floccosum
Tyto kolonie jsou zeleno-hnědé barvy se semišovým povrchem. Periferie jsou ploché. U starších kultur se mohou objevit bílé chomáčky mycelia. Jde o celosvětově rozšířený dermatofyt, který napadá lidskou pokožku a způsobuje plísňová onemocnění na chodidlech, ve stydké oblasti, v oblasti třísel, na vnitřní straně stehen, na trupu i na nehtech.
Obrázek 11: Kultura Epidermophyton floccosum
Následující obrázky mapují nejčastější oblasti nákazy a nejčastější dermatofyty parazitující na lidech:
Obrázek 12: Plíseň způsobená Trichophyton rubrum (vlevo) a T. intrdigital (vpravo)
18
Obrázek 13: Čtyři různá místa postižená plísní Trichophyton rubrum
Obrázek 14: Microsporum canis na hlavičce dítěte po kontaktu s kočkou a ve vlasech
3.4. Léčba Způsobů léčby je hned několik, avšak žádná z nich není jednoduchá, rychlá, ani stoprocentně účinná. Pokud se s ní začne pozdě, je nedokončená, nebo se zvolí špatný způsob, může způsobit vážné komplikace.
3.4.1.
Způsoby léčby 19
Dle rozsahu a stádia infekce je třeba volit mezi domácí léčbou, lokálním nanášením antimykotických roztoků, laků a mastí, perorálním užíváním antimykotik a chirurgickým zákrokem.
Domácí léčba - Dezinfikujeme postižená místa a případně i obuv, potíráme nehet česnekem
Lokální léčba - Je třeba zbavit se poškozené části nehtu (odstřihneme, zbrousíme nebo odstraníme chemickou cestou). Následně nanášíme roztok nebo mast 2 krát denně, nebo lak 2 krát týdně. Tento způsob je vhodný pokud je postižená jen část nehtu (30 – 50 % nehtové ploténky )
Perorální léčba – Je nezbytně potřebná, pokud se mykotická infekce rozšíří až na nehtovou marix, což je místo u kořene nehtu, odkud nehet vyrůstá. Antimykotikum se v tomto případě po požití dostává krevním řečištěm až k nehtovému lůžku, kde zničí dermatofyt a umožní tak růstu zdravého nehtu
Chirurgický zákrok – Volíme až jako krajní variantu v akutním případě
3.4.2.
Farmaceutické přípravky používané k léčbě
Antimykotika k lokální léčbě onychomykózy o Imidazoly o Allylaminy o Ciclopiroxolamin o Amorolfin
Antimykotika k systémové léčbě onychomykózy o Azoly o Terbinafin
Převzato z *8+
3.4.3.
Komplikace při léčbě antimykotiky , antimykotickými roztoky, laky a mastmi, a při chirurgických zákrocích:
Nepřesné určení typu plísně, kterou je pacient nakažený, nebo stádia, ve kterém se plíseň nachází (primární či sekundární patogen) 20
Neznalost přesného a konkrétního antimykotika na konkrétní daný druh plísně.*1+
Místní léčba např. mastmi nebývá účinná, protože medikament v této formě většinou nepronikne na místo určení skrz nehet.
Orálně podávaná antimykotika jsou sice účinnější, naproti tomu ale jejich toxické působení neblaze postihuje játra, dochází k dlouhodobějším ztrátám chuti a jiným životu nebezpečným interakcím s organismem.
Pokud jsou ústně podávaná antimykotika užívána dlouhodobě, mohly by si také houby způsobující toto onemocnění vytvořit rezistenci (odolnost) vůči daným účinným látkám v léčivu.*2+
Chirurgické zákroky jsou složité a pro jejich nevratnost by měly patřit v pořadí léčebných procesů až na konec.
3.4.4.
Nové možnosti v léčbě
UV záření a jeho germicidní účinky by bylo možné využít pro hubení původců plísňových onemocnění. Momentální situace je taková, že použití UV světla v lékařství je schváleno pro některé léčebné účely, jako je zmíněno v kapitole Využití laseru v dermatologii. Pro léčbu plísňových onemocnění je nutné provést studie a experimenty, které by měli určit jaké intenzity záření bude možno použít, aby nemělo negativní účinky na zdravou tkáň, aby nedošlo k popálení, či jinému poranění v důsledku ozařování.
Experimentální část:
4. Metody Mým úkolem bylo otestovat schopnost UVC záření inaktivovat kolonie dermatofytů. Pro tento účel jsem navrhla metodu měření, která by splňovala dané požadavky. K experimentu jsem použila kolonie plísní, které byly poskytnuty paní MUDr. Jarkou Kymplovou Ph.D. S největší pravděpodobností šlo o Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigital, Microsporum canis. Pracoviště jsem připravila podle následujícího obrázku. 21
Obrázek 15: Mirror (zrcátko), Excimer laser (excimerový laser), specimen of fungi (ozařované exempláře plísní)
5. Použité přístroje a zařízení Pro tento experiment jsem využila vybavení laboratoře excimerového laseru na Albertově.
Obrázek 16: Excimerový laser v laboratoři na albertově
22
KrF (krypton - fluor) excimerový laser COMPEX 205 Pro, Lambda Physik -
Plynový laser generující pulsní zážení v UV oblasti spektra na vlnové délce 193 nebo 248 nm
-
Výstupní energie – 400 mJ (pro 193 nm) nebo 700 mJ (pro 248 nm)
-
Délka impulsu – 20 ns
-
Opakovací frekvence – 50 Hz
Zrcátko
6. Měření
Obrázek 17: Plísně před ozářením
Obrázek 18: Plísně po ozářením Na obrázcích je vidět, jakým způsobem byly plísně laserovým zářením zničeny. V místech dopadu (vypálené tečky) byly plísně vyhubeny. Dalším krokem pro zjištění následného chování kolonií bude jejich sledování pod mikroskopem. 23
7. Závěr a vize do budoucna V experimentu jsme si ověřili, že záření generované excimerovým laserem je takové, že kolonie dermatofytů zcela zničí. Otázkou zůstává, jak fatální bude jeho účinek na lidskou tkáň, která při případné léčbě onychomykóz a jiných plísňových onemocnění kůže bude ozařována spolu s dermatofyty. Proto se naše další měření bude ubírat cestou ke zjištění vhodných intenzit záření tak, aby nedošlo k poškození zdravé tkáně. Součástí týmového projektu bylo měření kolegy Erika Vokatého, který svým pokusem potvrdil, že konkrétně u onychomykózy, tzn. plísňového onemocnění nehtu, záření UV skrz nehet vůbec neprochází, což by znamenalo, že tkáň pod nehtem by při ozařování neměla býti poškozena.
24
8. Seznam použité literatury [1] ROBERTS,D.T.- TAYLOR,W.D. - BOYLE,J..Introduction Guidelines for treatment of onychomycosis; 148; strana402. BritishJournal of Dermatology 2003. [2] Dai, T. -Tegos, G. P. - Rolz-Cruz, G. – Cumbie, W.E. – Hamblin, M.R..Ultraviolet C inactivation of dermatophytes: implications for treatment of onychomycosis.Clinical and laboratory investigations. 2008 [3]Onychomykóza - příčina plísňového onemocnění nehtů nohou *online+. Mudr. Mlčoch, Zbyněk. 4.11.2009. URL:
[4] Identification of Common Dermatophytes [online]. Dr. Ellis, David. 2.1.2012. URL :< http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Dermatophytes/index.html> [5] Desinfekce bazénové vody [online]. URL: < http://irmann.cz/bazenova_voda.html> [6] Karcinom prsu [online]. MuDr. Strnad, CSC., Pavel. 2002-2011. Senologická sekce ČGPS . URL: [7] Molekulární genetika *online+.MuDr. Šípek, Antonín. Genetika – biologie. URL: [8] Tichý, Peter. Studium optických účinků UV laserového záření na živočišnou tkáň. 2009. Bakalářská práce. [9+ Prof. Ing. Jelínek, DrSc, Miroslav. Laser a dělení laseru; Interakce UV s tkání. 2008. Přednášky z biofotoniky. [10] Vural, Emre a kolektiv. The effects of laser irradiation on Trichophyton rubrum growth.2008. Lasers Med Sci [11] Alifano, P. a kolektiv. Results of UV laser application on biological material. 2002. International Conference on Advanced Laser Technologies.
25
