ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŢENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2011
Michal Šindelář
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŢENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
Fluorescenční korelační spektroskopie a studium interakce biomolekul část 1.
TÝMOVÝ PROJEKT
Vedoucí projektu:
Ing. Dalibor Pánek, Ph.D.
Konzultant:
Mgr. Radek Macháň
Student:
Michal Šindelář
prosinec 2011
II
Anotace Cílem 1. části týmového projektu (Fluorescenční korelační spektroskopie a studium interakce biomolekul) je seznámení se s problematikou fluorescenční korelační spektroskopie na měřicím přístroji ConfoCor2 ®, jeho sestavením a realizací zkušebního měření na předem připraveném vzorku.
Anotation The aim of the first part of the team project (Fluorescence correlation spectroscopy and the study of biomolecular interactions) is introduction with the problems of fluorescence correlation spectroscopy on a measuring instrument ConfoCor2 ®, its preparation and implementation of test measurement on pre-prepared sample.
III
Poděkování Děkuji vedoucímu týmového projektu panu Ing. Daliboru Pánkovi, Ph.D. za vedení mé práce, za důležité informace a za veškerý čas, který mi věnoval při sestavování měřícího zařízení. Dále bych chtěl poděkovat mému kolegovi Jaroslavu Královi, konzultantovi Mgr. Radkovi Macháňovi a celému týmu z Fyziologického ústavu Jaroslava Heyrovského v Praze za spolupráci při ověření správné činnosti celé měřicí aparatury.
IV
Prohlášení Prohlašuji,
že
jsem
týmový
projekt
s
názvem
Fluorescenční
korelační
spektroskopie a studium interakce biomolekul část 1. vypracoval samostatně a využil jsem k jeho realizaci pouze zdroje uvedené v celkovém výčtu pramenů uvedených na konci mé práce. Neexistuje závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).
V Kladně dne podpis
V
Obsah Obsah
6
Úvod
7
1. Současné metody
8
1.1.
Principy získávání a zpracování dat
8
1.2.
Technická řešení optické aparatury
9
1.3.
Fluorescenční barviva
9
2. Experimentální realizace 2.1.
12
Popis měřící soustavy
12
2.1.1. Excitační jednotka
12
2.1.2. Objektiv
14
2.1.3. Štěrbina a detektor
16
2.2. Příprava vzorku
17
2.2.1. Používané techniky extruze
17
2.2.2. Lipozomy
18
3. Vlastní měření
20
3.1.
Sestavení a příprava aparatury
20
3.2.
Příprava roztoku lipozomů
21
3.2.1. Použité sloučeniny
22
3.2.2. Výpočet
24
3.3.
Výsledky měření
24
Závěr
27
4. Seznam použitých zkratek
28
5. Zdroje
29
5.1.
Seznam literatury
29
5.2.
Jiné zdroje
29
6. Seznam obrázků
31
7. Seznam grafů
31
VI
Úvod Existuje mnoho pohledů na svět kolem nás, na jeho chápání a interpretaci různých dějů, které se v něm odehrávají. Jak ale můžeme pochopit celek, když neznáme funkci jeho stavebního dílku. Na to, abychom pochopily ráz věcí velkých, musíme se zaměřit na ty malé. A proto v dnešní době probíhá mnoho měření na částicích s atomární velikostí. Cílem mého týmového projektu je seznámit se teoreticky a později i prakticky s metodami, které jsou vhodné pro práci s fluorescenčním mikroskopem. Následně je mým úkolem sestavit celý měřicí systém a otestovat jeho správnou funkčnost. Poznatky, které získám realizací týmového projektu, dále využiji při tvorbě své bakalářské práce. Praktickou část týmového projektu jsem spolu s kolegou Jaroslavem Králem realizoval ve Fyziologickém ústavu Jaroslava Heyrovského Akademie věd v Praze 8.
7
1. Současné metody V dnešní době existuje mnoho metod získávání, zpracování a vyhodnocování dat pořízených pomocí fluorescenčního mikroskopu. Kromě klasické metody Fluorescent correlation spectroscopy (FCS) to jsou např. Fluorescent lifetime correlation spectroscopy (FLCS) a Time correlated signal photon caunting (TCSPC). 1.1.
Principy získávání a zpracování dat
FCS je nejstarší a přesto i nadále velmi hojně využívanou metodou. Jednou z nejlepších vlastností FCS je její neinvazivnost, která nám umožňuje provádět měření uvnitř živých buněk, kde můžeme ve vysokém rozlišení provádět prostorové a časové analýzy extrémně malých biomolekul v málo koncentrovaných vzorcích. FCS využívá argonových, či argon-kryptonových laserů, pomocí nichž dodává do daného prostoru tolik energie, kolik je potřeba na to, aby u jednotlivých částic došlo k excitaci elektronu do vyšších energetických hladin pomocí dopadajících fotonů. Excitovaný elektron ovšem nedokáže zůstat na vyšší energetické hladině trvale, a proto se navrací zpět do původní hladiny vyzářením dodané energie. V závislosti na tomto principu zaznamenává polohu registrovaného fotonu na kontinuální časové ose od začátku experimentu (měřeno v ns) a vykresluje jeho korelační křivku.[2] Přestože FLCS je obdobou předchozí metody, liší se jednou zásadní věcí. Zatímco u FCS je vzorek excitován kontinuální vlnou (CW) laserového záření, u FLCS musí být vzorek excitován pomocí pulzního buzení. Oproti FCS metodě navíc udává, jaká doba uplynula mezi posledním laserovým pulsem a detekcí vyzářeného fotonu (měřeno ps). V případě, že vzorek obsahuje, např. dva druhy difundujících fluoroforů je výsledná autokorelační funkce (ACF) řešena na základě superpozice, nikoliv lineární kombinací. Takto je možné zjistit, jakou měrou přispěly jednotlivé vzorky do celkové intenzity vyzařování. Pro měření je důležité, aby se difúzní časy dvou různých částic lišily nejméně o koeficient 1,6.
V praxi se užívají částice, u kterých má tento
koeficient hodnotu vyšší než 10.[1] Měření a analýza úbytku fluorescence pomocí TCSPC je další zavedenou technikou molekulární foto fyziky. Časově korelační počítání znamená opakované měření času mezi laserovým excitačním pulsem a emisí fluorescenčního fotonu. Délka trvání je 8
řádové v nanosekundách. Realizace signálu je rekonstruována v histogramu. Pokročilou verzí TCSPC je tzv. time-tag, time-resolved (TTTR) režim, který po částech neredukuje naměřená data, ale kontinuálně je zaznamenává. S vyšším výkonem počítačových sestav se opouští od hardwarového vyhodnocování a přechází se k softwarovému vyhodnocování naměřených dat.[4] 1.2. Technická řešení optické aparatury Hlavní součást fluorescenčního mikroskopu ConfoCor2® je optická a detekční jednotka. Je používaná pro zaostření laserového paprsku, který je potřeba pro excitaci elektronů ve vzorku. Tento objem je zkoumán na detektoru. Způsob zaostření mikroskopu se nazývá infinity corrected, tedy zaostřeno na nekonečno. Princip spočívá v tom, že je rovnoběžný světelný svazek pomocí čoček a dichroického zrcátka zaostřen na nekonečno, jak do vzorku, tak směrem k detekční jednotce. Princip ostření je na následujícím obrázku.
Obr 1: Schéma používané optické jednotky
1.3. Fluorescenční barviva Mezi první testovaná barviva při měření FCS patřily fluorofory a laserové barvy, které se již dříve osvědčili v mikroskopii a poté i ve fluorescenční spektroskopii. 9
Oproti klasickým metodám jsou požadavky kladené na fluorofory ve FCS mnohem vyšší. Důležitou roli hraje kvantová účinnost fluoroforu, absorpční průřez a fotostabilita, jelikož barvivo musí snést sílu laserového paprsku v řádu několika set kilowattů na centimetr čtvereční. V praxi se velmi často užívají barvy Alexa, jejichž
Obr. 2: různé barvy fluoroforu Alexa. Od leva: Alexa350, Alexa430, Alexa488, Alexa532, Alexa546, Alexa568, Alexa633, Alexa700, Alexa750; převzato z [2]
absorpční rozsahy odpovídají vlnové délce od 350 nm do 750 nm. Mezi ostatní vhodné barvy patří rhodaminy. Pro měření difúzních časů jednotlivých látek se používají dvě různá barviva, avšak ne každá kombinace dvou různých barviv je funkční. Barvivo, které se hodí pro snímání pouze jednoho druhu fotonů, se nemusí hodit pro snímání dvou fotonů. Hlavní společnou nevýhodou všech syntetických barviv spočívá v tom, že před provedením nějakého experimentu se musí konkrétně označit biologický vzorek. Je to často obtížné a zdlouhavé, zvláště když je nutné dostat bílkovinu po obarvení nazpět do buňky. Dnes se na to používají dva druhy autofluorescenčních bílkovin, zelený fluorescenční protein (GFP) a DsRed. GFP se vyrábí z medúzy Aequorea Victoria. A teprve nedávno byl objeven DsRed na korálu Dictiosoma. Tyto proteiny se zavedou přímo do buňky a ta si posléze začne produkovat vlastní fluoreskující molekuly. Tento postup významně zkracuje přípravu celého měření. [1]
10
Pro barvení lipozomů jsou velmi vhodná barviva z karbokyanů (obr. 3) pro barvení membrán. V lékařské praxi se používají při výzkumech neurální sítě. Tato barviva jsou velmi stabilní při změnách teplot. Skladují se rozpuštěné v roztocích etanolu s hustotou 1 mg/ml a nevystavují se vlivu slunečních paprsků.[8]
obr. 3: Vyzařování fluorescence u karbokyanových barviv; převzato z [8]
11
2. Experimentální realizace 2.1. Popis měřící soustavy Celá měřicí aparatura se skládá z několika základních komponent. Hlavní částí celého systému je mikroskop ConfoCor2® od firmy Carl Zeiss, v níž jsou vzorky buzeny pulzním laserem značky PicoQuant. Naměřená data jsou vyhodnocena v počítači, jenž obsahuje kartu PicoHarp 300 TCSPC. Laser musí být umístěn, co nejdále od monitoru, jelikož kolem sebe vytváří interferenční pole.
Obr. 4: Sestavená aparatura
2.1.1. Excitační jednotka Excitační jednotka vyváří impulsy s trváním od 50 do 70 pikosekund s frekvencí až 80 MHz s maximálním kontinuálním výkonem do 1 W (závisí na vlnové délce). Frekvence opakování je v rozmezí od 2,5 do 40 MHz a je řízena krystalovým oscilátorem, který pomocí polovodičové fotodiody vytváří laserové pulzy. Je kompatibilní TCSPC elektronikou.
12
Obr. 5: Zdroj laserového záření PicoQuant PDL 800B; převzato z [5]
Obr. 6: LDH – laser diode head; převzato z [10]
Zprovozňování měřicí jednotky spočívá ve správném usměrnění toku záření do jedno-vidového optického kabelu. Pomocí Power metru, jenž snímá celkový výkon laserového paprsku, se nalezne ideální hodnota výkonu laseru. Svazek laserového záření je veden skrz jednomodové optické vlákno, protože tato vlákna mají největší přenosovou kapacitu. Jejich tlumení je nízké, mají nulovou disperzi a velkou šířku pásma, a také jejich přenos méně ovlivňuje magnetické pole. Toto světelné spojení je výhodné, kvůli mechanickému oddělení od excitačního svazku z optické a detekční jednotky. Pulzy přicházejí do LDH (obr. 6) vodičem, polovodičová dioda září, odtud přes FC vstup, v kterém se snažíme o nastavení co možná největšího výkonu vstupujícího do světelného vodiče do ACP výstupu ústícího do soustavy kolimátorů (obr. 7). V kolimátoru se, za pomoci nastavitelných šroubků, usměrní paprsek tak, aby jeho nejvyšší intenzita byla právě v předmětovém ohnisku. Spektrum laseru odpovídá modré barvě, tj. vlnové délce okolo 500 nm. Laserový paprsek dodává energii pro excitaci fluorescenčního barviva. Vlnová délka laseru a vlnová délka absorbovaného záření fluoroforu by měly být téměř shodné.
13
Obr. 7: Vstup světelného vodiče do soustavy kolimátorů
2.1.2. Objektiv Objektiv je používán pro zaostření svazku záření do vzorku. Použitý objektiv značky Zeiss C-APOCHROMAT 40x, 1,2 W, KORR UV-VIS-IC. Apochromatický objektiv nám koriguje chromatickou vadu, tj. pro různé barvy bude existovat pouze jedno ohnisko. Úhel lomu je funkcí vlnové délky, tudíž se pro různé barvy láme různě. Objektiv má zvětšení 40x a numerickou aperturu 1,2. W znamená, že se jedná o vodní objektiv, tudíž se mezi objektiv a sklíčko nanese kapka vody. Dále je korigován pro ultrafialové, viditelné a infračervené světlo. [11]
Obr. 8: Zeiss C-APOCHROMAT 40x, 1,2 W, KORR UV-VIS-IC; převzato z [11]
14
Všechny imerzní techniky slouží k realizaci maximální numerické apertury a ke zvýšení rozlišovací schopnosti. Při snímání živých buněk jsou buňky ponořeny v kultivačním médiu v kultivační misce. Oblast zájmu může být 50-200 mikronů vzdálená od krycího skla. Objektivy s vysokou numerickou apreturou a s olejovou imerzí nejsou ideální pro zobrazování ohniskových rovin, které nejsou v těsné blízkosti krycího skla, protože aberace (hlavně sférická aberace, způsobená rozdíly v indexu lomu podél optické osy) vzrůstá s hloubkou ponoření. Protože je nutné pozorovat buňky hluboko ve tkáních, mají objektivy s vodní imerzí lepší výkon při rozlišení a korekcích aberace, než objektivy s olejovou imerzí. Jsou-li použity objektivy s vodní imerzí, je optická osa symetrická: světlo prochází z buňky (ve vodě) do skla (krycí sklo), do vody (imerzní médium) a znovu do skla objektivu. Objektivy s vodní imerzí mají mírně nižší numerickou aperturu ve srovnání s olejovou imerzí. Jsou schopné vyššího rozlišení při průchodu vodními vrstvami tlustými přibližně 200 mikronů. Další výhodou objektivů s vodní imerzí je to, že na rozdíl od objektivů s olejovou imerzí nevyžadují zvláštní postupy při čištění, není zde nebezpečí kontaminace fyziologického média a voda nemá vlastní fluorescenci, která by mohla komplikovat interpretaci obrazů. Objektivy s vodní imerzí jsou ideální pro zkoumání buněčné dynamiky v živých buňkách, kde se důležité vlastnosti mohou vyskytovat hluboko ve vzorku a daleko od krycího skla. Jsou korigovány pro viditelné záření, UVzáření i infračervené záření. Objektiv vyrovnává rozdíly v tloušťce krycího skla v intervalu od 0,14 do 0,18 mm. Jeho makro-pohyb se nastavuje mechanicky. Jemné ostření je prováděno skrze počítač za pomoci motorické kontrolní jednotky.
15
Obr. 9: Schéma vodního imerzního objektivu
2.1.3. Štěrbina a detektor Objektiv a přídavné optické součásti zaostřují záření vzorku, které má být detekováno do určitého místa na optické ose. Motorická kontrolní jednotka rovněž nastavuje polohu štěrbiny (pinhole) v souřadnicových osách X, Y a Z. Rozsah použité štěrbiny je od 25 μm do 75 μm. Optický signál je přeměněn na elektrický signál v lavinové foto diodě (SPAD). SPAD je velmi citlivý polovodičový fotodetektor. Při použití bývá předpnuta vysokým závěrným napětím řádu desítek až stovek voltů často těsně pod průrazným napětím, což umožňuje dosáhnout zisku okolo 100 až 1000. V tomto režimu jsou elektrony a díry excitované dopadem fotonů urychlovány silným vnitřním elektrickým polem a podobně jako ve fotonásobičích generují další nosiče, vzniká lavinový jev. Používá se v aplikacích, kde je třeba velké citlivosti. Lavinová fotodioda sestává ze čtyř vrstev: N+, P, čistého polovodiče a P+. Okolo vrstev N+ a P, mezi nimiž vzniká lavinový jev, se nachází ochranný prstenec z polovodiče typu N, který zvyšuje odolnost diody proti povrchovému napěťovému průrazu. Dopadající světlo způsobí vznik páru elektron díra, který je silným elektrickým polem transportován do "lavinové oblasti", zde je urychlen na takovou rychlost, že kolize s krystalovou mřížkou způsobí vznik dalšího páru elektron díra. Nový pár je rovněž urychlen silným elektrickým polem a postupně jakoby v řetězové reakci vznikají další a další nové páry elektron díra, čímž dochází k lavinovému efektu, proto lavinová fotodioda. 16
Intenzita použitého detektoru je udávána v počtu dopadajících fotonů na detektor, tj. s-1. Četnost je udávána v kHz. Maximální saturace detektoru je 1 GHz. Nad 1 GHz již není závislost lineární, což zkresluje výsledek. 2.2. Příprava vzorku Vzorky rozpuštěných lipozomů jsou uchovávány v roztoku fluoroforu v chladu při teplotách kolem bodu mrazu. Je totiž nezbytně nutné udržovat stálou teplotu, jelikož by při přílišném snížení mohlo dojít k ruptuře stěny lipozomu. Z tohoto důvodu je dovnitř vesiklu často vpravován pufr namísto vody. Jakmile se směs uvnitř zkumavky rozmrazí, je s ní možné dále pracovat. Obvykle se daná směs o určité koncentraci obarví a poté je smíchána s jedním či více obarvenými vzorky. Je také možné nejdříve dva lipozomy smíchat a až poté tuto směs obarvit. Poté je nutné zbavit směs fluroforu. Nejčastěji se fluorofor nechá odpařovat proudem dusíku. Je možné použít i jiné plyny, jako jsou kyslík nebo oxid uhličitý, avšak dusík má pro tento účel nejlepší vlastnosti. Celá procedura trvá přibližně dvacet minut. Poté se vloží vzorek v uzavíratelné plastové zkumavce do třepačky. Výsledkem by mělo vzniknout mírné zakalení. Obsah zkumavky se poté nasaje do mikropipety a přes extrudér, který obsahuje karbonovou síť, se přefiltruje do druhé mikropipety. Tímto procesem se přetrhají lipozomové řetězce na požadovanou velikost. Přefiltrování se několikrát po sobě opakuje a to nejméně čtyřicetkrát. V některých publikacích se udává více než sto filtrací. Odhady, zda je takové množství filtrací nutné, se různí. Po extruzi je vzorek připraven pro následující měření. 2.2.1. Pouţívané techniky extruze Extruze lipidů přes filtry z polykarbonátu je jedním z nejspolehlivějších způsobů přípravy lipozomů. Celý proces extruze probíhá v tzv. extrudéru, do kterého je z každé strany nasazena mikro stříkačka. Tyto pomůcky nesmí obsahovat plasty, jelikož používané chemikálie jsou polární, docházelo by k jejich rozpouštění. V lékařské praxi, kde je nutné přefiltrovat mnohem větší objemy, se používají mechanické přístroje, jelikož by člověk neměl dostatek sil ke stisku pístu. Jako filtr se obvykle používají membrány z polykarbonátů PF- 2501 (100 nm) a PF-2502 (200 nm) o průměru 25 mm. Extruze lipozomů vyšších mastných kyselin vyžaduje filtrování při 17
vyšších teplotách. To má vliv i na výběr kovů pro výrobu těchto extrudérů. Nejčastěji se vyrábí ze silného hliníkového plechu nebo z kvalitní nerezové oceli.[6]
obr. 10: Extrudér s ohřívačem; převzato z [6]
2.2.2. Lipozomy Uměle připravené uzavřené vezikuly tvořené lipidovou dvojvrstvou a vnitřním izolovaným kompartmentem obsahující vodný roztok. Vznikají např. působením ultrazvuku na vodní suspensi vhodných polárních lipidů; nejčastěji se pro tento účel používá lecitin z vaječného žloutku. Lipozomy mají obvykle průměr 1 – 2 μm; mohou být tvořeny i několika koncentrickými membránovými váčky. Pokud lipozom vzniká ve vodném prostředí, obsahujícím rozpustné složky (soli, bílkoviny atd.), jsou tyto složky uzavřeny do vnitřního prostředí váčku; toho se využívá pro transport některých léčiv do buněk (intravenózní aplikace vhodných lipozomů, které pak vnikají do buněk endocytózou). Lipozomy slouží též jako model pro studium vlastností biologických membrán. [7]
18
Obr 1: Struktura membrány lipozómu; převzato z [7]
Lipidová dvojvrstva se skládá ze dvou vrstev lipidů (tuků) – převážně fosfolipidů obrácených k sobě hydrofobními částmi tak, že polární konce, například fosfáty (zbytky kyseliny fosforečné u fosfolipidů) jsou směrovány napovrch, směrem k vodnímu okolí. Fosfolipidy a jiné lipidy s polárními konci mají tendenci k takovémuto uspořádání. V přírodních biologických membránách jsou lipidy doplněny příměsí bílkovin. [8]
Obr 2: Hydrofobní a hydrofilní uspořádání lipozomů; převzato z [14]
19
3. Vlastní měření
3.1. Sestavení a příprava aparatury Jakmile jsme se seznámili s možnostmi fluorescenčního mikroskopu, začal jsem sestavovat celou měřicí aparaturu. K mikroskopu ConfoCor2® bylo nutné připevnit CCD kameru (752 x 582 pixelů s citlivostí 10 luxů), soustavu kolimátorů, pulzní laser a dichroické zrcátko s emisním filtrem. Po sestavení optické měřicí soustavy bylo mým úkolem připojit detektor a motorickou jednotku k počítačům, do kterých jsem měl nainstalovat programy, které ovládají mikroskop a zároveň vyhodnocují pořízená data. Nejdříve jsem začal se sestavováním optické jednotky. Připevnil jsem kameru, která je zapotřebí při zaostření laseru. Následovalo dichroické zrcátko s emisním filtrem, jenž má za úkol propustit pouze světlo v rozmezí od 490 do 540 nm. Důležité bylo rovněž uvést do chodu pulzní laser značky PicoQuant. Jakmile byly propojeny všechny části tohoto zařízení, bylo nutné nastavit jej na co možná největší výkon. Jemným posunem šroubků na coupleru na výstupu z LDH a s použitím PowerMetru (NOVA II OPhir laser measurment) bylo docíleno nejlepšího možného průchodu paprsků do jedno-vidového optického vlákna. To bylo zavedeno do kolimátoru, který obdobným způsobem jako tomu bylo u coupleru zaostří paprsek do ohniska ležícího na optické ose objektivu. K práci s mikroskopem slouží dva počítače. První z nich obsahuje software, kterým se ovládají motory objektivu a motory pohybující štěrbinou (pinhole). Druhý z počítačů zpracovává data zaznamenaná SPAD pomocí TCSPC karty. Musely být použity dva počítače, protože program ovládající motory mikroskopu je zastaralý a je funkční pouze v operačním systému Windows 95. Druhý program pro záznam měření zase fungoval na platformě Windows XP, a proto byl používán na jiném počítači. Výsledná uložená data byla ve formátu t3r, z kterého se později vykreslí autokorelační křivka a histogram. Před samotnou přípravou vzorku se musí fluorescenční mikroskop nejprve zapnout a nastavit. Hodnota výkonu pulzního laseru se časem snižuje, tudíž byl PowerMetrem znovu vyladěn. V programu v prvním počítači se nyní zadá pokyn k inicializaci motorů, aby bylo možné posunout objektiv do takové vzdálenosti, aby se na kameře objevil paprsek laseru. To znamená, že u dichroického zrcátka prozatím 20
není emisní filtr. Kdyby tam byl, nebylo by možné na kameře modrý laser vidět. Na objektiv se kápne kapka destilované vody a přiloží se podložní sklíčko. Poté se zapne kamera a Focus control, kde se upravuje vzdálenost objektivu od horní hrany podložního sklíčka jednoduchým posuvem klávesami page up a page down. Optimální hodnota se nachází ve vzdálenosti 3,83 mm. Když není intenzita laserového paprsku směřována přímo na střed kamery, tedy později i do detektoru, zapneme si na mikroskopu pro orientaci kříž a pomocí kolimátoru se upravuje pozice a směr intenzity dopadajících paprsků. Vzorek ovšem nebude přesně na horní hraně podložního sklíčka, nýbrž o něco výše, a proto se ohnisko posune o 100 mikrometrů. Posledním prvkem, který se musí nakalibrovat, je pinhole o průměru 50 mikrometrů. Je možné nastavit ji manuálně či automaticky. Při automatické kalibraci hledá optimální pozici pomocí intenzity dopadajícího paprsku v kartézském souřadnicovém systému. Nejdříve je vyhledána pozice pro osu X, poté pro osu Y a opět pro osu X. Jakmile jsou plošné souřadnice v pořádku, začne se pinhole pohybovat i po ose Z. Je velmi pravděpodobné, že se po nelezení nejlepší pozice na ose Z, opět začne vyhledávání na osách X a Y. Program se ukončí, jakmile najde nejlepší možnou umístění štěrbiny. Poté je možné znovu použít dichroické zrcátko s emisním filtrem. SPAD detektor je možné zapnout jenom při měření, aby na lavinovou diodu nedopadali jiné než fluorescenční paprsky. Jinak by mohlo dojít ke zničení foto diody či devalvaci pořízených dat. Mikroskop je nyní připraven pro testovací měření. 3.2. Příprava roztoku lipozomů Po rozmrazení lipozomů fosfatidylserinu (POPS) a fosfatidylcholinu (POPC) rozpuštěných v roztoku s fluoroforem se tyto dva lipidy smíchaly v poměru jedna ku čtyřem. Výpočet je uveden níže. Výsledný roztok měl objem 1 ml a molární koncentraci 1 mmol/l. Následně se vzorek rozředil na koncentraci 0,01% v fluoroforu DiO o koncentraci 1,34 mmol/l ve vodném roztoku. Poté se roztok nechal odpařit proudem dusíku v digestoři. Asi po patnácti minutách, když už ve zkumavce zbyl pouze suchý film lipidů, byl roztok přepipetován do plastové uzavíratelné zkumavky, která se přiložila na třepačku. Roztok ve zkumavce se správně zakalil. Vzniklo tak několik slupek lipidů. Tato směs byla následně nasáta do mikro injekční stříkačky, která se nasadila na extrudér, ve kterém byl již umístěn karbonový filtr s velikostí pórů 100 nm. Všechny součásti extrudéru včetně mikro injekčních stříkaček byl od 21
firmy Avestin. Extruze probíhala tímto způsobem: po každém protlačení přes filtr se extrudér otočí kvůli snazší manipulaci a opět se roztok přefiltruje zpět do první mikro injekční stříkačky. Tento postup se čtyřicetkrát opakoval. Po extruzi byla přefiltrovaná směs opět přelita do uzavíratelné zkumavky. Zde byla zředěna v poměru 1:10 s fosfátovým pufrem, jenž měl koncentraci 10 mmol/l a pH 7,1. Poté byl vzorek připraven k testovacímu měření.
Obr. 13: Proces extruze
3.2.1. Pouţité sloučeniny Fosfatidylserin (POPS) není v cytoplazmatické membráně rovnoměrně rozložen po obou jejích stranách. Vyskytuje se téměř výhradně ve vnitřním listu membrány. Fosfatidylserin vzniká biosynteticky činností enzymu fosfatidyletanolaminserintransferázy a to z fosfatidyletanolaminu. Během této reakce je ethanolaminová hlavička substituována hlavičkou serinovou. Když se fosfatidylserin objeví na vnějším listu membrány, značí to probíhající programovanou buněčnou smrt. V testovacím vzorku to byl záporně nabitý lipid s molární koncentrací 12,76mmol/l. [13]
22
Obr. 3: Fosfatidylserin; převzato z [13]
Fosfatidylcholin (POPC) je chemické označení pro lecitin. Dovoluje emulgovat (smíchávat) tuky s vodou. Využívá se proto v kosmetickém průmyslu. Vyskytuje se rovnoměrně na obou stranách buněčné membrány. V úloze jsme použily tento neutrálně nabitý lipid o molární koncentraci 32,9mmol/l. [12]
Obr. 4: 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-fosfatidylcholin; převzato z [12]
Jako barvivo byl použit zelené fluoreskující, lipofilní karbokyanin DiO v praxi označovaným jako DiOC18(3). Chemický vzorec je chloristan 3,3´-dioktadecyloxakarbokyanin. Světélkuje ve vodě a je velmi foto stabilní. Má vysoký koeficient excitace a krátký difúzní čas (1 ns). Po nanesení na buňku se šíří laterálně v plasmatické membráně.[9] Fosfátový pufr je jedním z nejpoužívanějších pudrových roztoků využívaných v biologii, biochemii a medicíně. Používá se ke stabilizaci pH v neutrální a lehce zásadité oblasti (zhruba pH 6-8,5). Fluorescein se využívá jako adsorpční indikátor při argentometrickém stanovení
halogenidů a rhodamidů, fluorescenční indikátor a indikátor na stanovení bromidů.
23
3.2.2. Výpočet K tomu, abych získal výsledný roztok o dané koncentraci, jsem musel postupovat v několika krocích. Nejdříve bylo nutné zjistit objem POPC, který odpipetuji do zkumavky, aby výsledný roztok objem 1 ml a koncentraci 1 mmol/l, když jsem věděl, že POPC a POPS mají být v poměru 4:1. Vyšel jsem ze vztahu pro koncentraci:
(1) Za předpokladu, že látkové množství původního roztoku POPC musí být shodný s výsledným látkovým množstvím POPC, je jednoduché z jedné rovnice o jedné neznámé vypočítat výsledný objem, který se napipetuje do uzavíratelné zkumavky. Výsledný objem byl 0,024 ml POPC. Stejný postup byl použit i u POPS jež k celkovému objemu přispěje 20%. Výsledný objem činil 0,015 ml. Také množství barviva bylo nutné zjistit stejným způsobem. Jeho výsledný objem byl 0,075 ml.
3.3. Výsledky měření Získaná data byla později zpracována v prostředí Matlab skriptem, který pomocí dll knihoven načte data do matic, které funkcí vykreslí nejprve histogram a poté korelační funkci. K tomu, abychom zjistili správnost zapojení přístroje, jsme nejprve použili koncentrovaný karboxyfluorescein. Doba měření činila 120 sekund.
Graf. 1: Histogram karboxyfluorescein
24
Graf. 2: Křivka ACF pro karboxyfluoresceinu
Poté se karboxyfluorescein naředil další dávkou pufru tak, aby hodnota koncentrace byla 100 nmol/l. Doba měření se tentokrát prodloužila na 900 sekund. Třetím měřeným vzorkem byla směs POPC a POPS obarveným fluoroforem DiO. Doba měření byla opět 900 sekund. V posledním měření se smíchal obarvený lipozom se zředěným fluoroforem na dobu 900 sekund.
Graf. 3: Histogram pro směs lipozomů a zředěného karboxyfluoresceinu
25
Graf. 4: Křivka ACF pro směs lipozomů a zředěného karboxyfluoresceinu
26
Závěr V moderní době dochází k renovaci pracovních postupů u starých výzkumných principů. K využití moderních metod v biomedicínském výzkumu směřovalo také zadání mého Týmového projektu, v jehož rámci jsem se zabýval fluorescenční mikroskopií a principy, které využívá. Mým úkolem v týmovém projektu bylo seznámení se s principy FCS, FLCS a TCSPC používaných při detekci fotonů vyvolaných pulzním laserovým buzením. Dále jsem měl sestavit měřící aparaturu, připravit vzorek a otestovat správnou činnost celé měřicí soustavy. Všechny zadané úkoly se mi v praktické části podařilo splnit a aktivně jsem se podílel na interpretaci dosažených výsledků. Rovněž jsem se seznámil s přístrojovou laboratorní technikou, kterou jsem se naučil používat k vyhodnocování naměřených výsledků. Poznatky, které jsem během tohoto semináře získal, budu i nadále doplňovat a využiji je při psané bakalářské práce.
27
4. Seznam pouţitých zkratek ACF
Autocorrelated function
CW
Continuous wave
CCD
charge-couplet device
DiO
chloristan 3,3'-dioktadecyloxakarbokyanin
DsRed
barvivo z korálu Dictiosoma
FCS
Fluorescent correlation spectroscopy
FLCS
Fluorescent lifetime correlation spectroscopy
GFP
zelený fluorescenční protein
LDH
laser diode head
NA
Numerická apertura
POPC
Fosfatidylcholin
POPS
Fosfatidylserin
SPAD
Single photon avalanche diod
TCSPC
Time correlated signal photon counting
TTTR
Time-tagged, time-resolved
28
5. Zdroje
5.1. Seznam odborné literatury [1]
Kapusta, P.; Wahl, M.; Benda, A.; Hof, M.; Enderlein, J. FLCS - Fluorescence lifetime
correlation
spectroscopy.
[Online]
2006,
1-7.
http://optonlaser.com/IMG/pdf/AppNote_FLCS.pdf (accessed Dec 28, 2011). [2]
Schwille, P.; Haustein, E. Fluorescence Correlation Spectroscopy. An Introduction to
its Concepts
and
Applications [Online]
2009, 1-33.
http://www.mendeley.com/research/fluorescence-correlation-spectroscopyintroduction-concepts-applications/ (accessed Dec 28, 2011). [3]
WAHL, M. Time-Correlated Photon Counting Tech Note TCSPC 1.2. The Principle of Time-Correlated Single Photon Counting [online]. 2000 [cited 2011-12-28], p. 1–4. Available from http://freedownloadebooks.info/timecorrelated-photon-counting-tech-note-tcspc-1-2.html
[4]
BENDA, A., HOF, M., WAHL, M., PATTING, M., ERDMANN, R., KAPUSTA, P. TCSPC upgrade of a confocal FCS microscope. [online]. 2005 [cited 2011-1228], p. 1–4. Available from: http://rsi.aip.org/resource/1/rsinak/v76/i3/p033106_s1?isAuthorized=no
5.2. Jiné zdroje [5]
Lightsources [online]. updated 2011 [cited 28 Dec 2011]. Available from: http://www.picoquant.com/_lightsources.htm.
[6]
(ed.). Liposome extruders [online]. updated 2011 [cited 28 Dec 2011]. Available from: http://www.eastsci.com/Extruder.html.
[7]
Prof. RnDr. KODÍČEK, CsC., M. Liposomy [online]. Updated 2004 [cited 28 Dec 2011]. Available from: http://gvm.vm.cz/vyuka/bio_pojmy/hesla/liposomy.html.
[8]
INTERCHIM DiI, DiD, DiR, DiO, DiA [online]. updated 2009 [cited 28 Dec 2011]. Available from: http://www.interchim.fr/ft/4/46804A.pdf 29
[9]
lifetechnoligies.com
[online].
Updated
2011
Available
from:
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D275 [10] dwoptron.com
[online].
Updated
2011
Available
from:
http://www.dwoptron.com/korean/product/prod.list.asp?pageNo=4&code=12 3100100 [11] micro-shop.zeiss.com
[online].
Updated
2011
Available
from:
https://www.microshop.zeiss.com/index.php?s=528613984197dd&l=en&p=us&f=o&a=v&m=s&id =421767-9970-000 (accessed Dec 28, 2011) [12] Fosfatidylcholin. cs.wikipedia.org. 2011th ed. [online]. Available from: http://cs.wikipedia.org/wiki/Fosfatidylcholin (accessed Dec 28, 2011). [13] Fosfatidylserin,
cs.wikipedia.org,
2011th
ed.
[online];
Available
from:
http://cs.wikipedia.org/wiki/Fosfatidylserin (accessed Dec 28, 2011). [14] Přenašeče glukózy, cukrovka-ocima-biochemie.blog.cz 2011th ed. [online]; http://cukrovka-ocima-biochemie.blog.cz/1009/prenasece-glukozy Dec 28, 2011).
30
(accessed
6. Seznam obrázků Obr. 1: Schéma používané optické jednotky
9
Obr. 2: Různé barvy fluoroforu Alexa [2]
10
Obr. 3: Vyzařování fluorescence u karbokyanových barviv [8]
11
Obr. 4: Sestavená aparatura
12
Obr. 5: Zdroj laserového záření PicoQuant PDL 800B [5]
13
Obr. 6: LDH – laser diode head [10]
13
Obr. 7: Vstup světelného vodiče do soustavy kolimátorů
14
Obr. 8: Zeiss C-APOCHROMAT 40x, 1,2 W, KORR UV-VIS-IC [11]
14
Obr. 9: Schéma vodního imerzního objektivu
16
Obr. 10: Extrudér s ohřívačem [6]
18
Obr. 11: Struktura membrány lipozomu [7]
19
Obr. 12: Hydrofobní a hydrofilní uspořádání lipozomů [14]
19
Obr. 13: Proces extruze
22
Obr. 14: Fosfatidylserin [13]
23
Obr. 15: 1-palmitoyl-2-oleyl-fosfatidylcholin [12]
23
7. Seznam grafů Graf. 1: Histogram karboxyfluoresceinu
24
Graf. 2: Křivka ACF karboxyfluoresceinu
25
Graf. 3: Histogram pro směs lipozomů a zředěného karboxyfluoresceinu
25
Graf. 4: Křivka ACF pro směs lipozomů a zředěného karboxyfluoresceinu
26
31
