ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
Aneta Galvasová
2012
i
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky
Významné biochemické látky a laboratorní techniky jejich stanovení v biomedicínských oborech II. Týmový projekt
Vedoucí projektu: Ing. Zuzana Fílová Student:
Aneta Galvasová
leden 2012 ii
Anotace Významné biochemické látky a laboratorní techniky jejich stanovení v biomedicínských oborech II. Cílem týmového projektu je vytvoření laboratorních úloh pro výuku biochemie. Jednou z nejdůleţitějších biochemických látek jsou bílkoviny. Jejich stavbou a strukturou se zabývají první kapitoly. Bílkoviny v různých formách tvoří podstatnou část lidského organismu, tímto se zabývá kapitola Bílkoviny a lidské tělo. Velký význam má analýza bílkovin a metody stanovení bílkovin, kterých je vyuţito i v laboratorních úlohách, především důkazových reakcích. Laboratorní úlohy jsou zaměřeny i na další biochemické látky.
Annotation Important biochemical compounds and laboratory techniques for theirs analysis in biomedical field II. The aim of this project is to create labs for biochemistry. One of the most important biochemical substances are proteins. First part of this project is deal with their structure. Proteins in various forms are an essential part of the human organism, which is included in chapter Proteins and human body. Very important is the analysis of proteins and methods for determination of proteins which is used in lab reports, especially for protein assay. Laboratory tasks are also focused on other biochemical substances.
iii
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem týmový projekt s názvem Chemie v medicíně a biomedicínském inţenýrství vypracovala samostatně a pouţila k tomu úplný výčet citací pouţitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloţeném k závěrečné zprávě.
Nemám závaţný důvod proti uţití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).
…………………….
V Praze dne 2. 1. 2012
podpis
iv
Obsah Úvod ........................................................................................................................................... 6 1. Základ živé hmoty - bílkoviny ............................................................................................. 7 2. Stavba bílkovin ..................................................................................................................... 7 2.1 Aminokyseliny.................................................................................................................. 7 2.1.1 Vlastnosti aminokyselin ............................................................................................. 7 2.1.2 Izoelektrický bod ....................................................................................................... 8 2.1.3 Dělení aminokyselin .................................................................................................. 9 2.2 Peptidy ............................................................................................................................ 10 3. Struktura bílkovin a její analýza ...................................................................................... 11 3.1 Primární struktura ........................................................................................................... 11 3.2 Sekundární struktura ....................................................................................................... 12 3.3 Terciární struktura .......................................................................................................... 14 3.4 Kvartérní struktura .......................................................................................................... 15 4. Stabilita bílkovin ................................................................................................................ 16 5. Metabolismus bílkovin ....................................................................................................... 17 6. Bílkoviny a lidské tělo ........................................................................................................ 19 7. Stanovení bílkovin .............................................................................................................. 21 7.1 Stanovení bílkovin v moči .............................................................................................. 22 7.2 C-reaktivní protein (CRP)............................................................................................... 23 8. Návody k laboratorním úlohám ........................................................................................ 25 8.1 Bílkoviny ........................................................................................................................ 25 8.2 Lipidy.............................................................................................................................. 30 Závěr ........................................................................................................................................ 33 Seznam použité literatury ...................................................................................................... 34 Samostatné přílohy ................................................................................................................. 36
v
Úvod Biochemie je vědní obor, který studuje chemické sloţení ţivé hmoty a podstatu procesů s ní spojených. Mezi nejdůleţitější látky ţivé hmoty patří bílkoviny, kterými se zabývám v této práci. Teoretická část je zaměřena na stavbu bílkovin, strukturu bílkovin a metody analýzy jejich struktury. Tyto znalosti jsou potřebné pro vytvoření laboratorních úloh pro výuku biochemie, coţ je cílem celého projektu. Jelikoţ ţivá hmota, jako předmět studia biochemie, neobsahuje pouze bílkoviny ale i další látky, jsou také laboratorní úlohy v části praktické zaměřené i na další biochemické látky. Laboratorní úlohy by měly obsahovat návody na provedení úloh, seznam potřebného vybavení a teoretický úvod shrnující potřebné znalosti k dané úloze. Součástí vytvořených úloh by měly být i prezentace obsahující fotodokumentaci, která by měla být ukázkou dosaţeného výsledku v jednotlivých laboratorních úlohách. .
6
1. Základ živé hmoty - bílkoviny Ţivá hmota je po chemické stránce souborem různých látek, jejichţ obsah je dán jednotlivým typem ţivých objektů. Všechny formy ţivota ale mají společnou přítomnost dvou typů látek – bílkovin a nukleových kyselin. Jsou to biomakromolekuly, které se od ostatních polymerů liší rozmanitostí základních sloţek a jejich uspořádáním. V procesu svého vzniku jsou na sobě obě biomakromolekuly závislé, jelikoţ jsou nutné jak bílkovinné katalyzátory, tak nukleové kyseliny, které podmiňují informační stránku vzniku. Z toho vyplývá, ţe jejich funkce ale nejsou rovnocenné. Zatímco bílkoviny jsou univerzálnější v procesu ţivota, účastní se všech biochemických pochodů, nukleové kyseliny jsou vhodné především pro přenos informace. Funkční univerzálnost bílkovin umoţňuje jejich struktura. Základní jednotkou bílkovin jsou aminokyseliny, z nichţ jsou bílkoviny syntetizovány. [1]
2. Stavba bílkovin 2.1 Aminokyseliny Aminokyseliny mohou být vyuţity v energetickém metabolismu a mnoho z nich je nezbytnou sloţkou potravy. Jsou to substituční deriváty karboxylových kyselin, obsahují karboxylovou skupinu (-COOH) a obsahují také aminoskupinu (-NR2). V biochemii se uplatňují především ty, které obsahují primární aminoskupinu (-NH2) vázanou na témţe uhlíkovém atomu jako karboxyl. Společný uhlíkový atom se označuje jako α-uhlík a celá skupina jako α-aminokyseliny. Jejich obecný vzorec je H2N – CH – COOH | R
2.1.1 Vlastnosti aminokyselin Pokud R ≠ H je na α-uhlíku chirální centrum a α-aminokyseliny tvoří dvě řady enantiomerů, D- a L-. Příslušnost aminokyselin k L- a D- řadě se určuje podle prostorové orientace substituentů na α-uhlíku. Většina aminokyselin tvořící bílkoviny patří k Lenantiomerům. Tato skutečnost určuje rys charakteru ţivé hmoty. Jestliţe funkční sloţky mají asymetrický charakter, musí probíhat asymetricky i chemické reakce. Optická asymetrie základních sloţek bílkovin vede k asymetrii vyšších struktur a dále vede k chiralitě (označuje asymetrii prostorového rozloţení objektu (např. molekuly) biologických objektů). Fyzikálně chemické vlastnosti volných aminokyselin ale neodpovídají uvedenému obecnému vzorci. 7
Jsou to pevné krystalické látky, které se při zahřívání rozkládají, aniţ by tály, jsou nerozpustné v nepolárních organických rozpouštědlech a rozpustné ve vodě v neutrálním prostředí. Chovají se jako iontové sloučeniny. Z přítomnosti karboxylu a aminoskupiny v molekule α-aminokyselin vyplývá závislost jejich formy na koncentraci vodíkových iontů v okolí. V závislosti na pH se mění aminokyselina z kationtu přes obojetný ion na aniont.[4]
2.1.2 Izoelektrický bod Hodnota pH, kdy aminokyselina existuje jako obojetný ion, se nazývá izoelektrický bod, pI a je pro kaţdou aminokyselinu jiná.[4]
| R
| R
| R
Karboxylová skupina je silnější kyselina a proton snadněji odštěpuje, neţ přijímá. Při nízkém pH, kdy je koncentrace vodíkových iontů v roztoku vysoká, obě dvě skupiny váţou proton. Při stoupajícím pH se nejprve uvolní proton vázaný v karboxylové skupině, protoţe ta má menší disociační konstantu a karboxylová skupina existuje pouze jako karboxylátový ion RCOO−, zatímco aminoskupina je protonovaná kyselina R-NH3+. Vzniká tak amfion, obojetný ion, který nese kladný i záporný náboj. Teprve je-li pH vysoké, uvolní se proton i z aminoskupiny a obě dvě funkční skupiny se nachází ve stavu konjugované zásady. Jednotlivé disociační stupně lze charakterizovat disociačními konstantami, které lze odečíst jako inflexní body titrační křivky aminokyseliny (obr. 1).
Obr. 1 Titrační křivka glycinu
8
Pro pI pak platí ,
kde pK1 a pK2 jsou záporné dekadické logaritmy disociačních konstant.[2] Na pH jsou závislé fyzikálně chemické vlastnosti aminokyselin. V izoelektrickém bodě dosahují extrémních hodnot, rozpustnost ve vodě je nejniţší a pohyblivost v elektrickém poli nulová.
2.1.3 Dělení aminokyselin Z celkového počtu 300 známých aminokyselin je pouze 20 proteinogenních, tedy těch, ze kterých jsou sestaveny všechny bílkoviny v ţivých organismech. S výjimkou prolinu jsou to všechno α-aminokyseliny, neboť mají karboxylovou i primární aminoskupinu na tomtéţ uhlíkovém atomu. Prolin, jako jediná výjimka, obsahuje sekundární aminoskupinu a tak je αiminokyselinou, kdyţ se běţně řadí mezi aminokyseliny. [3] Dělí se do několika skupin: [7]
Zkratky
Izoelektrický bod pI
Gly G
6,0
Ala A Val V Leu L
6,0 6,0 6,0
isoleucin
Ile I
6,0
serin
Ser S
5,7
threonin
Thr T
5,6
d) se sirnou skupinou v postranním řetězci - CH2SH cystein
Cys C
5,0
Met M
5,7
Asp D
3,0
Glu E
3,2
Asn N
5,4
Struktura Název postranního řetězce R a) bez postranního řetězce -H glycin b) s uhlovodíkovým nesubstituovaným řetězcem - CH3 alanin - CH(CH3)2 valin - CH2CH(CH3)2 leucin - CH(CH3)CH2CH3 c) s hydroxylem v postranním řetězci - CH2OH - CH(OH)CH3
- CH2CH2-S-CH3 methionin e) s karboxylem v postranním řetězci -CH2COOkys. asparágová (aspartát) -
- CH2CH2COO kys. glutamová (glutamát) f) s karboxyamidovou skupinou v postranním řetězci - CH2CONH2 asparagin 9
- CH2CH2CONH2
glutamin
Gln Q
5,7
Lys K
9,7
arginin
Arg R
10,8
histidin
His H
7,6
fenylalanin
Phe F
5,5
tyrosin
Tyr Y
5,6
tryptofan
Trp W
5,9
Pro P
6,3
g) s postranním řetězcem s bazickou skupinou lysin -(CH2)4NH3+ +
CH2 NH C 3
NH2
NH2 H+ N
CH2
N H
h) s aromatickým postranním řetězcem CH2
CH2
HO
CH2
N H
i) s postranním řetězcem jako součástí kruhu -
O C +
N H2
prolin
O
2.2 Peptidy Při polymeraci α-aminokyselin se odstraňuje molekula vody (obr. 2). Výsledné spojení CO – NH se nazývá peptidová vazba. Polymery sloţené ze dvou, tří nebo několika málo či mnoha aminokyselinových zbytků se nazývají dipeptidy, tripeptidy, oligopeptidy a polypeptidy. Zjednodušeně se jim říká peptidy. Molekuly sloţené z jednoho či více polypeptidového řetězce se nazývají proteiny.
Obr. 2 Kondenzací – OH a – NH2 vzniká peptidová vazba
10
3. Struktura bílkovin a její analýza Bílkoviny jsou hybnou sloţkou biologických dějů. Fungují jako enzymy, které katalyzují komplexní soubor chemických reakcí vytvářejících sloţitou strukturu ţivého systému. Bílkoviny slouţí především jako regulátory těchto reakcí, účastní se transportu a uskladnění biologicky důleţitých látek, utvářejí koordinovaný mechanický pohyb mnoha biologických procesů, přijímají smyslové informace a zpracovávají informace nervových buněk. Dále jsou součástí biologického ochranného systému ţivočichů a jsou tedy takzvanými stavebními kameny ţivé hmoty. Jejich funkce je spojena s jejich strukturou, coţ znamená se vztahy mezi atomy a tuto strukturu dělíme do čtyř úrovní. Primární struktura je dána pořadím aminokyselin jejich polypeptidových řetězců. Sekundární struktura je prostorové uspořádání v určitém místě hlavního řetězce bez ohledu na postranní řetězce. Terciární struktura je trojrozměrná struktura celého polypeptidu. Kvartérní struktura se vztahuje k prostorovému uspořádání podjednotek, coţ jsou polypeptidové řetezce, ze kterých je protein tvořen. Bývají spojeny nekovalentními vazbami.
3.1 Primární struktura Proteiny mají jedinečnou kovalentní, primární strukturu. Základem struktury bílkovin je polypeptidový řetězec obsahující více neţ 100 aminokyselinových zbytků. Znalost této primární struktury je důleţitá zejména pro objasnění působení proteinů na molekulové úrovni a následně pro objasnění vyšších struktur. Jedná se o analýzu pořadí aminokyselin, které má důleţité klinické aplikace, protoţe řada dědičných chorob je způsobena mutacemi, jeţ vedou k záměně aminokyselin v proteinu.
Obr. 3 Primární struktura . 11
bílkovin
.
. .
Určování primární struktury bílkovin je rozděleno do tří částí: příprava proteinu na sekvenování, coţ je pro proces, při němž se určuje pořadí chemických jednotek, sekvence, tedy následnost polypeptidových řetězců a sestavení celé struktury. Nejprve se analyzují koncové skupiny. Kaţdý polypeptidový řetězec má jeden N-koncový zbytek a jeden C-koncový zbytek. Identifikací těchto koncových skupin můţeme stanovit počet chemicky odlišných polypeptidů v proteinu. N-koncový zbytek můţeme určit několik způsoby, nejuţitečnější z nich je Edmanovo odbourávání. Podstatou reakce je reakce fenylisothiokyanátu s Nkoncovou skupinou ve slabě bazickém prostředí. Zbytek polypeptidu zůstává netknutý. Při identifikaci C-koncové skupiny se vyuţívají chemické metody jako například hydrazinolýza. Všechny peptidové vazby jsou rozštěpeny kromě C-terminálního zbytku, který je uvolněn jako volná aminokyselina. Dalším krokem je štěpení disulfidových vazeb, jeţ se oxidačně štěpí permravenčí kyselinou. Pokud protein obsahuje více podjednotek je třeba je od sebe oddělit. Před vlastním sekvenováním polypeptidového řetězce je třeba znát jeho aminokyselinové sloţení. To stanovíme úplnou hydrolýzou a následnou kvantitativní analýzou uvolněných aminokyselin. Následuje sekvenování polypeptidů, určení sekvence peptidových fragmentů a určení pořadí, ve kterém byly spojeny v původním polypeptidu. Poslední krokem je umístění disulfidových vazeb. Jelikoţ je sekvence proteinu velmi zdlouhavý proces slouţí pro rychlé porovnání sloţení příbuzných proteinů, které se liší třeba v jedné aminokyselině, tzv. fingerprint metody. Tato metoda spočívá v analýze hydrolyzátu, kdy na chromatogramu mají srovnávané bílkoviny všechny peptidy stejnou polohu kromě toho, který obsahuje aminokyselinu, v níţ se oba proteiny liší.[1]
3.2 Sekundární struktura Při kvantitativním zvětšování molekuly bílkovin má na celkový tvar větší vliv konformace jednotlivých částí peptidového řetězce, tj. prostorové uspořádání jednotlivých atomů a jejich skupin umoţněné rotací kolem jednoduchých vazeb. Nekovalentní interakce určují celkový tvar molekuly bílkovin. Podle celkového uspořádání peptidových řetězců rozlišujeme dva typy bílkovin: fibrilární a globulární. U fibrilárních jsou peptidové řetězce nataţeny a spojují se příčnými vazbami. U globulárních je peptidový základ molekuly sbalen do klubíčka, globule, jehoţ části jsou propojeny vnitřními příčnými disulfidovými vazbami. V molekulách bílkovin se vyskytují pravidelně se opakující struktury. Vychází se z představy o geometrickém uspořádání peptidové vazby jako části rovinného útvaru. Peptidový řetězec je sloţen z plošek, které jsou volně otočné okolo vazeb s α-uhlíky. Vzájemnou polohu lze specifikovat torzními úhly okolo vazby Cα – N (φ) a Cα – CO (ψ). 12
φ
ψ Obr. 4 Torzní úhly
Hodnota těchto úhlů je 180° v případě výchozí polohy plošek, struktura řetězce nataţená na maximální délku. Stabilizace sekundární struktury je vyvolána tvorbou vodíkových vazeb mezi kyslíkem karbonylu a skupinou – NH – peptidového seskupení. Stabilní útvary mohou vznikat jen spojením různých peptidových řetězců, nikoliv mezi příslušnými funkčními skupinami téţe peptidové vazby. Existují 4 podmínky pro vznik stabilní struktury: Všechny aminokyseliny musí mít L-konfiguraci, úhly vazeb musí odpovídat obrázku 4, α-uhlíky aminokyselinových zbytků spojených peptidovou vazbou musí být v poloze trans-, struktura musí poskytovat maximální moţnost tvorby vodíkových vazeb.[1] Teoretickou analýzou se zjistilo, ţe stabilní struktury mohou poskytovat pouze určité kombinace torzních úhlů, tak aby si postranní řetězce nepřekáţely. Objemnější postranní řetězce aminokyselin si vynucují vychýlení plošek sousedních peptidových vazeb ze společné roviny. Změnou velikosti torzních úhlů o stejnou velikost lze získat strukturu skládaného listu, β-strukturu. Úhel mezi sousedními ploškami je při pohledu z boku 153° a postranní řetězce směřují střídavě nad a pod společnou rovinu. Nestejnoměrnou změnou úhlů ψ a φ vznikají útvary, v nichţ se peptidový řetězec stáčí do šroubovice, nejčastěji do α-šroubovice, α-helix. Kaţdá šroubovice je chirální struktura a podmínka L-konfigurace aminokyselin způsobuje, ţe stabilní strukturou bílkovin je pravotočivá αšroubovice,
coţ
dále
přispívá
k celkové chiralitě ţivé hmoty. [4]
Obr. 5
α-šroubovice 13
struktura skládaného listu
α-Šroubovice je univerzální struktura dovolující včlenění všech proteinogenních aminokyselin s výjimkou prolin. Zbytek prolinu nemá na peptidovém dusíku vodík, a tudíţ nemůţe tvořit vodíkovou vazbu, vede tedy k narušení jak α-struktury, tak i β-struktury. Bílkovina, která obsahuje hodně prolinu tak nemůţe tvořit ţádnou sekundární strukturu. Takovou bílkovinou je například kolagen, který je tvořen z jedné třetiny právě prolinem. Kolagen se vyskytuje u mnohobuněčných organismů a je nejrozšířenějším proteinem obratlovců. Jako extracelulární protein je uspořádán do nerozpustných vláken, které mají velkou pevnost v tahu. Tato vlastnost jej předurčuje do role nejvíce namáhané sloţky pojivových tkání (kosti, zuby, chrupavky, šlachy). Základem této bílkoviny jsou šroubovice s vysokým stoupáním závitů, které neumoţňuje vnitřní propojení ale pouze meziřetězcové vodíkové vazby. Stabilní útvar vzniká spojením tří paralelních šroubovic a na jeden závit tak připadají tři peptidové vazby. Kaţdá šroubovice ale můţe vázat je dvě vazby, takţe maximální počet vodíkových vazeb je dvě třetiny peptidových vazeb. Tato kolagenová struktura se řadí mezi speciální sekundární struktury.
3.3 Terciární struktura Tato struktura znamená prostorové uspořádání molekuly proteinu, tzn. svinutí prvků jeho sekundární struktury a prostorové uspořádání jeho postranních řetězců. Postranní řetězce aminokyselin v globulárních proteinech jsou umístěny v prostoru podle svých polarit. Nepolární zbytky se nacházejí uvnitř molekuly coţ zajišťuje hydrofobní interakce. Polární zbytky aminokyselin jsou umístěny na povrchu molekuly. Globulární proteiny jsou velmi kompaktní a uvnitř jejich molekul je málo prostoru, takţe molekuly vody nejsou v molekule přítomny. Díky tomuto uspořádání jsou molekuly popisovány jako olejovité kapky s polárními plášti, coţ znamená, ţe vnitřek proteinu je účinně svinut. Polypeptidové řetězce, které se skládají z více neţ 200 aminokyselinovch zbytků bývají svinuty do dvou nebo více glubalárních shluků, domén. Domény mají specifickou funkci, například vazbu malých molekul.
14
Obr 6. A: Terciární struktura DNA-vazebné domény transkripčního faktoru, tzv. „sbalení okřídleného helixu“. N označuje konec s volnou aminoskupinou, C konec s volnou karboxylovou skupinou. α-helixy jsou znázorněny červeně, β-vlákna ţlutě a ohyby zeleně. B: Terciární struktura enzymu triosafosfátisomerasy. Jedná se o skládaný list s osmi vlákny, které vyvářejí válcovou strukturu známou jako β-soudek. Spojky jednotlivých β-vláken obsahují α-helixy. Celkovou terciární strukturu lze určit rentgenografickou metodou. Krystaly bílkovin slouţí jako mříţka pro rozptyl svazku RTG záření. Paprsky rozptýlené v různých úhlech spolu interferují a produktem této interakce jsou skvrny o různé intenzitě na rentgenogramu. Intenzita závisí na intenzitě a na fázi interferujících paprsků, rozptyl pak způsobují elektronové obaly jader atomů molekuly. Z těchto informací lze získat údaje o hustotě elektronů v různých bodech. Spojením míst o stejné elektronové hustotě v určitém rovinném průřezu molekuly lze získat elektronovou mapu této roviny. Srovnáním jednotlivých map pro různé roviny lze získat obraz vnitřní struktury bílkoviny. Rozlišovací schopnost metody závisí na dokonalosti pouţitého krystalu a na počtu bodů rentgenogramu. Pro identifikaci skupin atomů je třeba rozlišovací schopnost asi 0,3 nm, pro jednotlivé atomy asi 0,1 nm. Je třeba neopomenout, ţe konformace molekuly bílkoviny závisí na prostředí, v němţ se nachází, a proto není moţno výsledky rentgenografické analýzy krystalů plně přenášet na molekuly bílkovin v roztocích. [1]
3.4 Kvartérní struktura Proteiny váţou díky svým polárním a nepolárním skupinám téměř cokoliv kromě jiných proteinů. Povrchové skupiny proteinů jsou uspořádány tak, aby se zabránilo jejich shlukování. Při rozmanitosti aminokyselinových monomerů by s prodluţováním peptidového řetězce mohla vzrůstat pravděpodobnost chyby v primární struktuře, coţ by vedlo k závěţným změnám vlastností bílkovin. Za příčinu stability bílkovin lze povaţovat skutečnost, ţe jsou
15
sloţeny z více samostatných peptidových řetězců. Kvartérní struktura je zprostředkována stejnými interakcemi jako struktura terciární, ale působí intermolekulárně. Narůstání počtu peptidových řetězců vede k vzniku jiných vlastností celku. Za molekulu bílkoviny povaţujeme celý celek, nekovalentně spojené sloţky nazýváme podjednotky. Podjednotky jsou globulární bílkoviny s charakteristickou sekundární a terciární strukturou. [1]
Obr. 7 Kvartérní struktura bílkovin
4. Stabilita bílkovin Nativní bílkoviny jsou za fyziologických podmínek velmi málo stabilní jednotky, která je výsledkem
rovnováhy
mezi
různými
nekovalentními
interakcemi,
jako
například
elektrostatické interakce, vodíkové můstky nebo hydrofobní interakce. [1] Elektrostatické síly – Molekuly jsou soubory elektricky nabitých částic a jejich interakce je řízena zákony klasické elektrostatiky. Pro energie interakce platí Coulombův zákon. Vodíkové můstky - Jsou to elektrostatické interakce mezi slabě kyselou skupinou donoru a atomem akceptoru, který má volný elektronový pár. Vodíkové můstky významně ovlivňují strukturu proteinů, jelikoţ jsou orientovány tak, ţe můţou vzniknout všechny moţné vodíkové vazby. Jestliţe je protein svinut tak, ţe zabraňuje vzniku některých vnitřních vodíkových můstků, je sníţena jeho volná energie a je méně stabilní neţ ten, který má plný počet vodíkových můstků. Nesvinutý protein ale vytváří vodíkové můstky pouze s molekulami vody ve vodném roztoku. Hydrofobní interakce – Jsou to síly, které způsobují nepolární látky pro minimalizaci jejich styku s vodou.
16
Disulfidové vazby – Disulfidové vazby vznikají při svinutí proteinu do konformace, stabilizují jeho prostorové struktury. Cytoplazma, která má redukční povahu, tak sniţuje stabilitu disulfidových vazeb intracelulárních proteinů. Proteiny s disulfidovou vazbou jsou vylučovány do prostředí mimo buňku. Denaturace bílkovin – Stabilní konformace bílkovin způsobuje, ţe jsou uspořádané systémy. Forma, v níţ vznikají a fungují v organismech, se nazývá nativní. Působením fyzikálních a chemických vlivů se tato nativní forma porušuje a bílkoviny přecházejí na méně uspořádanou formu procesem denaturace. Denaturačně působí všechny vlivy, které porušují nekovalentní sekundární a terciární strukturu bílkovin (zvýšená teplota, rozptýlení bílkoviny na velkém povrchu, působení silných kyselin a zásad, organických rozpouštědel a sloučenin typu močovina nebo guanidin, které mají mimořádnou schopnost tvorby vodíkových vazeb a omezují jejich tvorbu v bílkovinné globuli). Primárním účinek denaturačních činidel je rozvinutí peptidového řetězce, čímţ se odkrývají nepolární aminokyselinové zbytky a sniţuje se tak solvatace molekuly a tím rozpustnost bílkoviny. Výjimkou je denaturační působení roztoků alkalických hydroxidů, které způsobují disociaci všech karboxylů a převádějí bílkoviny na polyanionty rozpustné ve vodě. Rozvinutí peptidového řetězce můţe být reverzibilní, při pozvolném odstranění činidla se protein vrací do nativní formy. V koncentrovanějších roztocích bílkovin ale nastává proces intermolekulární reakce odkrytých funkčních skupin. Vznikají stabilní agregáty o vysoké molekulové hmostnosti a dochází ke sníţení rozpustnosti. Denaturace se stává ireverzibilní, bílkovina je vyloučena z roztoku procesem koagulace. Ke koagulaci dochází při tepelné denaturaci. Denaturované bílkoviny jsou přístupnější hydrolytickým enzymům a jsou tak lépe stravitelné (podstata tepelné úpravy potravy). Ničí také choroboplodné zárodky a je základem chemické a tepelné sterilizace. [4]
5. Metabolismus bílkovin Metabolismus označuje soubor všech reakcí zahrnujících přeměnu látek i energie. Rozlišujeme metabolické procesy katabolické (za uvolnění energie se sloţitější látky štěpí na jednodušší) a anabolické (za spotřeby energie vznikají z jednodušších látek látky sloţitější). Energie získaná a posléze odevzdaná uchovávána prostřednictvím makroergických sloučenin. Takovouto univerzální sloučeninou je ATP, adenozitrifosfát.
17
Při metabolismu bílkovin probíhá jejich neustálá přeměna, na rozdíl od sacharidů a lipidů se nemohou ukládat do zásob. Katabolismus bílkovin – Bílkoviny ve střevě hydrolyticky štěpí enzymy aţ na aminokyseliny, které jsou dále vyuţívány především k syntéze nových bílkovin. Aminokyseliny mohou také slouţit jako zdroj energie. Při jejich odbourávání se odštěpuje aminoskupina ve formě toxického amoniaku. Amoniak vstupuje do ornitinového cyklu, kde je přeměněn na močovinu, která je jako odpadní produkt vyloučen ven. Uhlíkaté zbytky aminokyselin se začleňují do Krebsova cyklu. Anabolismus bílkovin – 8 esenciálních aminokyselin člověk nedokáţe syntetizovat, musí být přijímány potravou, 12 neesenciálních aminokyselin si člověk sám syntetizuje, vznikají transaminací (přenosem aminoskupiny z jedné aminokyseliny na α-oxokyselinu za vzniku jiné aminokyseliny). Bílkoviny jsou z aminokyselin syntetizovány v procesu zvaném proteosyntéza. Proteosyntéza – proces syntézy bílkovin probíhající na ribozomech. Informace o přesném pořadí aminokyselin v bílkovinách je uloţena v primární struktuře DNA. Proteosyntéza zahrnuje dvě fáze. První je transkripce, coţ je přepis informace o nukleotidovém sloţení z molekuly DNA na molekulu m-RNA, nukleotidy v m-RNA se řadí za sebou na základě komplementarity bází. Druhou fází je translace, coţ je překlad pořadí nukleotidů z m-RNA do pořadí aminokyselin vznikajícího polypeptidového řetězce. Aminokyseliny jsou na místo syntézy transportovány pomocí t-RNA (druh aminokyseliny určuje tzv. kodon = tři za sebou jdoucí báze v m-RNA, ke kaţdému kodonu je komplementární antikodon – tři za sebou jdoucí báze t-RNA komplementární ke kodonu). [6]
Obr. 8 Translace 18
6. Bílkoviny a lidské tělo Bílkoviny jsou obsaţeny ve všech tkáních a buňkách organismu. Tvoří část svalů, nehtů, kostí, vlasů, kůţe a představují přibliţně pětinu celkové hmotnosti těla. Různé bílkoviny se dále podílejí na činnosti enzymů, hormonů, neurotransmiterů a bílkoviny jako hemoglobin nebo myoglobin udrţují tělesné tkáně v dobrém stavu a zajišťují tak zdraví celého organismu.[5] Hemoglobin – Hemoglobin přenáší z plic do vlásečnic kyslík, který je vyuţíván k dýchání. Jeho obsah v krvi je nezbytný, jelikoţ rozpustnost kyslíku v krevní plazmě je příliš malá na to, aby zajistila dostatečné mnoţství kyslíku pro metabolické pochody.
V krvi
s obsahem hemoglobinu můţe koncentrace kyslíku dosáhnout hodnot srovnatelných s koncentrací kyslíku ve vzduchu. Funkční hemoglobin je tetramer sloţený ze 2 podjednotek α (lehké řetězce, 141 aminokyselin) a 2 podjednotek β (těţké řetězce, 146 aminokyselin). V kaţdé podjednotce je vázán jeden hem jako prostetická skupina (nebílkovinná sloţka, jejíţ funkcí je přenos atomů, jejich skupin nebo elektronů v průběhu biochemické reakce) koordinační vazbou Fe2+ na zbytky His. Hemoglobin se sytí kyslíkem v plicích, uvolňuje ho v tkáních. Proces je zefektivněn tím, ţe po navázání první molekuly kyslíku na jeden hem dochází ke konformační změně způsobující zvýšení afinity zbylých vazných míst pro kyslík.[9] Kolagen – Kolagen představuje více neţ 30 % bílkovin obsaţených v organismu člověka a je z něj vytvořena nejdůleţitější tělesná tkáň, tkáň pojivová. Existuje několik typů kolagenu. Nejdůleţitější je kolagen typu I, II, III, IV, a V. Nejrozšířenější je typ I, představuje 90 % kolagenu v organismech, je přítomen v pokoţce, šlachách, kostech a zubech. Typ II se vyskytuje v chrupavkách. Typ III je kolagen embryonálního vývoje, později je nahrazen typem I. Typ IV se vyskytuje v bazální membráně epitelů. Kolagen typu V je charakteristický pro stěnu krevních cév. Molekula kolagenu je tvořena hlavně aminokyselinami glycinem, prolinem, hydroxyprolinem a hydroxylysinem, které vznikají posttranslační modifikací prolinu a lysinu za účasti kyseliny askorbové. Keratin – Keratin je stavební bílkovina, skleroprotein. Patří mezi nejčastější proteiny v epiteliální tkáni a v buňkách tvoří tzv. intermediární filamenta, která se podílejí na vzniku buněčné kostry. Keratin je základní sloţkou vlasů, chlupů a vytváří se z něj také nehty.
19
Enzymy – Jsou to biologické katalyzátory, které s menšími energetickými nároky urychlují metabolické reakce v lidském těle. Aktivita enzymů je závislá zejména na koncentraci substrátu, teplotě, pH a přítomnosti aktivátorů a inhibitorů. Celá řada enzymů jiţ našla praktické vyuţití i v průmyslu a ve výzkumu. Dělí se na šest hlavních kategorií enzymů oxidoreduktázy (katalyzují oxidačně/redukční reakce), transferázy (přenášejí funkční skupiny), hydrolázy (katalyzují hydrolýzu chemických vazeb), lyázy (štěpí chemické vazby jiným způsobem neţ hydrolýzou či redoxní reakcí), izomerázy (katalyzují isomerizační reakce), ligázy (spojují dvě molekuly kovalentní vazbou). Kontraktilní proteiny - Aktin je bílkovina tvořící v sarkoméře, kontraktilní jednotce svalového vlákna, tenčí a početnější vlákna. Vlákna jsou sloţená ze dvou spirálně stočených makromolekul, zasahujících mezi tlustá myozinová vlákna. Myozin je bílkovina, jejíţ molekuly mají charakteristický tvar - kulovitou hlavu, ohebný krk a tyčinkovité tělo. Pro hlavu s vláknitým krčkem se také uţívá označení - příčný můstek. Prostřednictvím hlavy reaguje myozin s aktinem. Sval se pomocí těchto bílkovin zkracuje a generuje tah, jehoţ důsledkem je pohyb. Sval má ale také schopnost vracet se do své původní délky - je pruţný. Na molekulární úrovni tyto funkce zajišťují především dvě bílkoviny, titin a nebulin. [8] Imunoglobuliny – Skupina proteinů, které hrají klíčovou roli v imunitním systém. Řadíme mezi ně protilátky, specifické receptory T-lymfocytů a B-lymfocytů, molekuly HLA (hlavní histokompatibilní komplex). Charakteristickým znakem imunoglobulinů je výskyt tzv. imunoglobulinové domény v jejich struktuře. Domény obsahují asi 100 aminokyselin a mají globulární strukturu. Imunitní systém vytváří imunoglobuliny jako odpověď na vniknutí cizího antigenu do organismu. Protilátky jsou součástí humorální imunity a specifické protilátky proti patogenům vytváří na základě získané zkušenosti těla s infekcí. Transportní bílkoviny – Zajišťují přenos látek krevním oběhem, přenos přes buněčnou membránu, regulují mnoţství specifických, metabolitů v organismu a regulují rychlost biochemických procesů. Patří mezi ně například albumin. Albumin je syntetizován v játrech a tvoří 60 % všech plazmatických bílkovin. Je důleţitý při transportu látek krví (mastné kyseliny, minerály, léky) a pomáhá udrţet stálé vnitřní prostředí organismu. Peptidové hormony – Vznikají ve ţlázách s vnitřní sekrecí a jsou uvolňovány do krevního oběhu, čímţ se mohou dostat i do jiných částí těla. V místě působení se váţí na receptor. Patří mezi ně například endorfin, inzulin, prolaktin nebo růstový hormon. 20
7. Stanovení bílkovin Výběr metody pro stanovení bílkovin je zaloţen na moţnostech pro vlastní analýzu, mnoţství a charakter analyzovaného proteinu, přítomnosti interferujících látek a poţadavku na přesnost. Preferují se především spektrofotometrické metody. [10] Biuretová metoda – Metoda je zaloţena na koordinační vazbě měďnatého kationtu na peptidovou vazbu v alkalickém prostředí.(Obr. 9) Vzniklý komplex je pak detekován při vlnové délce 540 nm. Nevýhodou biuretové metody je nízká citlivost (0,05-5mg/ml) a moţná interference při výskytu amoniaku a některých detergentů ve vzorku.
Obr. 9 Koordinační vazba mědi na peptidové vazby v alkalickém prostředí Lowryho metoda – Metoda vylepšuje méně citlivou biuretovou metodu. První sloţkou je biuretové činidlo, druhou sloţkou činidlo Folin-Ciocalteau. Biuretová metoda je zaloţena na chelataci (vazbě organické sloučeniny na vícevazebný kationt) měďnatého iontu imidovými strukturami polypeptidového řetězce v alkalickém pH. Vzniká fialový komplex. FolinCiocalteauovo činidlo obsahuje kyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové, které se redukují tyrosinovými zbytky proteinů a barví se modře. Metoda je citlivá na změny v pH, a proto by pH reakční směsi mělo být drţeno v mezích 10 - 10.5. Lowryho metoda je citlivá na nízké koncentrace proteinu. Její nevýhoda je úzký interval pH reakční směsi, ve kterém je pouţitelná. Pouţití malých objemů vzorku (relativně vůči objemu reakční směsi) umoţňuje tuto nevýhodu odstranit. Látky, které interferujjí s Lowryho metodou jsou aminokyseliny, některé pufry, lipidy, cukry, soli, nukleové kyseliny. Tyto látky je nutno před měřením odstranit (např. vysráţením proteinů a následnou centrifugací). BCA metoda – Metoda vyuţívá sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA), která komplexuje ionty Cu1 tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2. Činidlo se připravuje smísením roztoků sodné soli BCA v alkalickém prostředí (100 dílů) a CuSO4 (1 díl). Měří se při 562 nm. Její citlivost je na úrovni Lowryho metody, 0, 5 mg/ml. Výhodou je menší interference.
21
Metoda Bradfordové - Principem této metody je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu. Citlivost je 1 mg/mL a závisí na obsahu bazických a aromatických aminokyselin. Jde o velmi rychlou metodu. Mnoţství látek však interferuje, negativně zejména detergenty. Nedává tak spolehlivé výsledky jako obdobně citlivá BCA metoda, kde tyto látky neruší. Citlivost je 5 x vyšší neţ u Lowryho metody. Činidlo (vodný roztok) obsahuje barvivo, ethanol a H3PO4. Barva hnědá, po reakci s proteinem intenzivně modrá, lmax = 595 nm. Přímá spektrofotometrická stanovení (UV oblast) -
Metoda je zaloţena na přítomnosti
chromoforů v molekulách proteinů, které absorbují v UV oblasti spektra. Velkou výhodou je, ţe jde o nedestruktivní metodu. V blízké UV oblasti (280 nm) není velká citlivost – 50 mg/mL, v daleké UV oblasti (205 nm) pak dochází ke značné interferenci. Je zde velká závislost na aminokyselinovém sloţení proteinu. Vzhledem k tomu, ţe UV absorpce je dána aromatickými aminokyselinami (hlavně Trp a Tyr), je nutná jejich přítomnost. Interference širokého absorpčního pásu nukleových kyselin (lmax = 260 nm) se eliminuje měřením při dvou vlnových délkách a početní korekcí. Maximum absorpce peptidové vazby je při 192 nm. Při měření v daleké UV oblasti je nutno precizně volit pufr tak, aby neabsorboval. Vzorky by měly být zbaveny malých částic centrifugací, pokud moţno bez velkého obsahu O2. Fluorescenční stanovení - Fluorimetrické stanovení proteinů je zaloţeno na reakci primárních aminoskupin v proteinu (Lys, N-koncová aminoskupina) s o-ftalaldehydem. Citlivost metody můţe být zvýšena hydrolýzou proteinů před měřením. Metoda ruší pufry s obsahem primárních aminoskupin (Tris), nejlépe je pouţít borátový pufr, pH 10.4. Měří se po přídavku hydroxidu sodného, excitační vlnová délka je 340 nm, emise mezi 440 a 455 nm. Kaţdý vzorek se měří pouze jednou, protoţe ozáření sniţuje intenzitu fluorescence.
7.1 Stanovení bílkovin v moči Moč je snadno dostupnou biologickou tekutinou, jejíţ analýzou lze získat cenné informace o stavu organizmu a jeho metabolizmu. Vyšetření moči patří mezi základní klinicko-biochemické postupy, které významně přispívají ke stanovení diagnózy, sledování průběhu onemocnění a výsledků léčby. Při analýze moči se vyuţívá různých metod. [11]
22
Cílem kvalitativní analýzy bílkovin v moči je separace a detekce pokud moţno všech pro diagnostiku a sledování vývoje onemocnění významných bílkovin. V klinické praxi se pouţívají elektroforéza v agarózovém gelu při vyšším napětí a elektroforéza v polyakrylamidovém gelu. Elektroforéza je metoda zaloţená na rozdílném chování nabitých částic v elektrickém poli. Vzhledem k tomu, ţe rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly, různě velké a různě nabité molekuly se budou pohybovat odlišnou rychlostí. Elektroforéza v agarózovém gelu - Elektroforéza probíhá v tenké vrstvě agarozového gelu při potenciálním spádu 20 V/cm. Standardní a dobře reprodukovatelná aplikace vzorku a homogenita elektrického pole v rozsahu celé plochy gelu umoţňují rychlé rozdělení bílkovin do ostrých, difusí málo ovlivněných zón. Tvar a elektroforetická pohyblivost jednotlivých zón mohou být významně ovlivněny individuálními vlastnostmi moče (iontové sloţení a koncentrace, poškození bílkovin při skladování a úpravě moče). Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu - Struktura gelu je chemicky a elektricky inertní. Elektroforéza probíhá v ultratenkých gradientních horizontálních gelech v prostředí laurylsíranu sodného (SDS). V prostředí dostatečně vysoké koncentrace SDS dochází k disociaci nekovalentních vazeb ve struktuře bílkovinných molekul a k rozvinutí jejich sekundární struktury.
Dvourozměrné elektroseparační techniky analýzy bílkovin v moči - V prvním stupni tohoto postupu se dělená směs podrobí izoelektrické fokusaci na polyakrylamidovém gelu. Izoelektrická fokusace patří k rovnováţným technikám, kinetický proces určuje pouze rychlost dosaţení rovnováhy. Při separaci částic, které obsahují zároveň kyselé i basické skupiny je dosaţením izoelektrického bodu pohyblivost iontu nulová. Ve směru kolmém je pak provedena zónová elektroforéza s přídavkem SDS, který normalizuje rozdíly v efektivním náboji. Po provedeném elektroforetickém dělení se získá dvourozměrná mapa bílkovin přítomných ve vzorku.
7.2 C-reaktivní protein (CRP) V současnosti je CRP nejznámější a diagnosticky nejhodnotnější ze skupiny proteinů akutní fáze, do které patří i další proteiny. Má pět identických nekovalentně vázaných podjednotek, kaţdá o velikosti 206 aminokyselin. Je syntetizován v játrech a epiteliálních 23
buňkách. Je to bílkovina, která hraje úlohu opsoninu (látky zabezpečující opsanizaci navázání určitých látek na povrch antigenu, které navozuje jeho fagocytózu imunitními buňkami). Plazmatická koncentrace CRP se zvyšuje jiţ za 4 hodiny po navození reakce akutní fáze, tedy při lokálním nebo systémovém zánětu, při traumatickém poškození tkání nebo při nádorovém bujení a v průběhu prvních dvou dnů jeho koncentrace vzroste i více neţ 100krát. Maximální koncentrace je dosaţeno za 24–48 hodin, přibliţně 24 hodin je i poločas CRP. Fyziologicky bývá plazmatická koncentrace niţší neţ 2–8 mg/l. Rychlý a vysoký vzestup CRP (typicky na hodnoty nad 60 mg/l) doprovází především akutní bakteriální infekce, méně obvykle také mykotické infekce. Virové infekce naproti tomu bývají charakterizovány relativně malým vzestupem CRP (zpravidla pod 40 mg/l). Okamţité stanovení plasmatické koncentrace CRP proto napomáhá v rozhodnutí jako léčbu zahájit.
24
8. Návody k laboratorním úlohám 8.1 NÁVOD č. 1 – BÍLKOVINY: Izolace bílkovin z přírodních zdrojů Izolace bílkovin z přírodních zdrojů Bílkoviny jsou pevné látky a jejich rozpustnost ve vodných roztocích je závislá na jejich struktuře. Pokud jsou rozpustné, tvoří koloidní roztoky. Při izolaci se vyuţívá nastavení takových podmínek, při kterých je daný protein nerozpustný a vzniklou sraţeninu je moţno od zbytku oddělit (centrifugací, filtrací). Při sráţení můţe, ale nemusí, dojít k denaturaci proteinu (ztráta prostorové sekundární struktury – ztráta rozpustnosti). Nejčastěji pouţívané způsoby sráţení bílkovin jsou: • Vysolování – zvyšování koncentrace soli u koloidních roztoků způsobí vyloučení bílkovin z roztoku ve formě sraţeniny (molekuly vody hydratující protein mají větší afinitu k iontům soli a desolvatované molekuly proteinu se shlukují) • Vliv pH - převedení na izoelektrický bod – hodnota pH, při které nenese molekula proteinu ţádný náboj, je nejméně rozpustná. • Sráţení organickými rozpouštědly s vodou mísitelnými (ethanol, aceton) – podobný princip, jako u vysolování, rozpouštědla působí podobně jako ionty solí.
Kasein Kaseiny tvoří hlavní sloţku mléka (asi 80% proteinů). Jsou to fosfoproteiny (obsahují kyselinu fosforečnou, která je esterově vázaná na hydroxylové skupině sereninu). Obsahují značné mnoţství prolinu, který způsobuje zlomy v řetězci proteinu (nemá potřebný vodíkový atom pro tvorbu vodíkového můstku) a inhibuje vytvoření kompaktní struktury. Struktura kaseinu není stabilizována sulfidovými můstky. Díky tomu nemá pevně danou sekundární strukturu a téměř ţádnou terciární a je obtíţné ji denaturovat. V mléku se nachází v micelách, které drţí pohromadě díky vápenatým iontům a hydrofobním silám. Při izolaci kaseinu se pouţívá metoda převedení na izoelektrický bod (tj. hodnota pH 4,6). Při tomto pH je kasein nerozpustný.
25
Úloha 1: Izolace kaseinu z mléka Pomůcky: kádinka, magnetické míchadlo, vodní lázeň, pH metr, kapátko, nálevka, filtrační papír, stojan, teploměr Chemikálie: kyselina chlorovodíková, odstředěné mléko, ethanol Postup: Do kádinky nalijeme odtučněné mléko, zahříváme na vodní lázni za průběţného míchání. Kdyţ teplota dosáhne 40° C, poloţíme na magnetické míchadlo a vloţíme pH metr. Po kapkách přidáváme roztok kyseliny chlorovodíkové. Vzniká sraţenina kaseinu. V přidávání roztoku HCl pokračujeme aţ do hodnoty pH 4,6. Sestavíme si filtrační aparaturu a sraţeninu kaseinu odfiltrujeme přes filtrační papír, filtrát přeneseme do kádinky (syrovátku pouţijeme na další důkazy), na filtru promyjeme vodou, přidáme 25 ml etanolu a znovu zfiltrujeme. Kasein rozprostřeme na filtrační papír, necháme uschnout. Zváţíme usušený kasein a určíme procentuální výtěţek. (Mléko obsahuje 26 gramů kaseinu na litr.) Úloha 2: Důkazové reakce bílkovin Pomůcky: kádinky, zkumavky, kapátko, lţička, nálevka, hodinové sklo, pH metr Chemikálie: odstředěné mléko, roztok kaseinu (polovina lţičky kaseinu + 45 kapek destilované vody), 10% NaOH, Fehlingovo činidlo, 5% CuSO4, HNO3, bezvodý NiCl2, HCl, AgNO3, syrovátka Biuretová reakce: Látky obsahující dvě peptidové vazby v alkalickém prostředí v přítomnosti měďnatých solí vytvářejí komplexní sloučeniny Cu2+ s ionty peptidových vazeb – fialové sraţeniny.
Název reakce je odvozen od biuretu (kondenzační produkt močoviny),
nejjednodušší sloučenina reagující s měďnatými solemi. Do zkumavky dáme 15 kapek roztoku kaseinu, přidáme 5 kapek 10% NaOH a 2 kapky 5% CuSO4, mícháme. Vzniká fialově zbarvený komplex. Xantoproteinová reakce: Proteiny obsahující fenylovou skupinu reagují s kyselinou dusičnou za vzniku ţlutě zbarvené aromatické nitro-sloučeniny.
26
K 15 kapkám roztoku kaseinu přidáme 10 kapek koncentrované kyseliny dusičné, mícháme. Při zahřívání ve vodní lázni vzniká ţluté zabarvení. Důkaz vody v mléku: Provádíme pomocí bezvodého chloridu nikelnatého. Na hodinové sklo dáme trochu mléka a malou lţičku chloridu nikelnatého. Pozorujeme zezelenání krystalků, vzniká hexahydrát chloridu nikelnatého. Závislost rozpustnosti kaseinu na pH: Do kádinky dáme 40 g odtučněného mléka, zahřejeme na 40°C, vloţíme pH metr a přidáme přibliţně 6 kapek kyseliny chlorovodíkové (nebo 10 kapek kyseliny octové). Vzniká sraţenina kaseinu. Vzorek rozdělíme napůl. K jedné polovině přidáváme dále HCl, přibliţně do hodnoty pH 2. Ke druhé polovině sraţeniny kaseinu přidáme roztok 10% NaOH do hodnoty pH 9. Při těchto hodnotách se sraţenina kaseinu rozpustí. Důkaz chloridů: Část syrovátky (kapalina oddělená od kaseinu) nalijeme do zkumavky, přidáme několik kapek AgNO3 (aq). Vytvoří se bílá sraţenina, která stáním tmavne - vzniká AgCl a Ag. Mléko tedy obsahuje chloridy. Důkaz cukru: Laktóza (cukr mléčný) dokáţeme v syrovátce. Laktosa je cukr, který reaguje pozitivně s Fehlingovým činidlem. Asi 0,5 ml syrovátky nalijeme do zkumavky a přidáme Fehlingovo činidlo I.(0,5 ml) a II. (0,5 ml). Směs ve zkumavce zahříváme ve vodní lázni, vzniká hnědočervená sraţenina oxidu měďného. Laktóza je tedy redukující sacharid. Změny mléka zahřátím: Mléko zahřejeme k varu, necháme vychladnout. Na povrchu mléka se vytvořil škraloup, který tvoří bílkovina albumin. Škraloup odstraníme a provedeme důkaz bílkoviny. (biuretová, xantoproteinová reakce) Úloha 3: Stanovení kyselosti mléka Pomůcky: titrační baňky, byreta, stojan, nálevka, pipeta, pipetovací balonek Chemikálie: odstředěné mléko, fenolftalein, NaOH Mléko obsahuje mléčný cukr laktosu, kterou mléčné bakterie postupně přeměňují na kyselinu mléčnou. Jestliţe se koncentrace kyseliny mléčné zvýší nad určitou hodnotu, mléko zkysne 27
(srazí se). Kyselost mléka se vyjadřuje ve stupních ºD. Jeden ºD odpovídá 0,1 g kyseliny mléčné v 1 litru mléka. Čerstvé mléko obsahuje méně neţ 18 ºD, kyselé mléko 18 - 40 ºD, nad 40 ºD mléko „tvarohovatí“. Postup: Byretu naplníme 0,1 M NaOH, do titrační baňky napipetujeme 20 ml mléka, přidáme 20 ml destilované vodu a 10 kapek fenolftaleinu. Postupně přidáváme roztok NaOH z byrety a stanovíme jeho spotřebu v bodě ekvivalence, kdy se mléko zbarví dorůţova. První spotřeba je orientační, z dalších tří vypočteme průměrnou hodnotu spotřeby NaOH. Vypočteme kyselost mléka v ºD.
28
Přílohy: Určení výtěţku kaseinu z mléka: Koncentrace proteinů v mléce: grams/ litre % of total protein _______________________________________________________________________________ Total Protein 33 100 Total Caseins 26 79.5 alpha s1 10 30.6 alpha s2 2.6 8.0 beta 9.3 28.4 kappa 3.3 10.1 Total Whey Proteins 6.3 19.3 alpha lactalbumin 1.2 3.7 beta lactoglobulin 3.2 9.8 BSA 0.4 1.2 Immunoglobulins 0.7 2.1 Proteose peptone 0.8 2.4 _____________________________________________________________
http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/chem.html#protein1
Filtrační aparatura:
Titrační aparatura:
29
8.2 NÁVOD č. 2 – LIPIDY: Preparace a vlastnosti lipidových frakcí z vaječného žloutku Preparace lipidových frakcí z vaječného ţloutku Ţloutek slepičího vejce obsahuje značné mnoţství tuků (23%), dále jsou v něm obsaţeny fosfatidy (lecitiny, kefaliny, plasmalogeny), sfingolipidy, látky terpenoidního charakteru (steroidy a karotenoidy), ale i bílkoviny. Ţluté zbarvení ţloutku je způsobeno zejména přítomností zeaxanthinu. Procentové sloţení frakcí ţloutku se mění v závislosti na přijaté potravě. Některé z uvedených látek se dají ze směsí snadno oddělit na základě rozdílných vlastnosti. Fosfatidy jsou nerozpustné ve studeném acetonu, ve kterém se naopak snadno rozpouštějí neutrální tuky a steroidy. S výjimkou neesterifikovaných sterolů se lipidy hydrolyzují alkáliemi za vzniku solí mastných kyselin (mýdel), jeţ jsou nerozpustné v etheru. Neutrální tuky a vodu odstraníme ze ţloutku extrakcí acetonem a z nerozpustného zbytku představujícího denaturované bílkoviny a fosfolipidy extrahujeme druhé jmenované 95% etanolem. Obsah jednotlivých sloţek v extraktu záleţí na pouţitém rozpouštědle. Etanolový extrakt obsahuje převáţně lecitin, kefalin a další minoritní sloţky. Lecitiny lze ze směsi fosfolipidů vysráţet alkoholických roztokem chloridu kademnatého. Vlastnosti lipidových sloţek vaječného ţloutku Lecitin lze rozštěpit hydrolýzou na vyšší mastné kyseliny, glycerol, kyselinu fosforečnou a cholin. Tyto sloţky lze v hydrolyzátu dokázat: mastné kyseliny jako mýdla, glycerol nitrochromovou reakcí a kyselinu fosforečnou jako ţlutý fosfomolybdenan amonný, který po redukci poskytne modré zbarvení fosfomolybdenanové modře. Cholin dává s přebytkem jodu málo rozpustnou adiční sloučeninu (Florenceovy krystalky) enneajodidu cholinu. Cholesterol patří mezi nezmýdelnitelné lipidy, protoţe není esterem. V chloroformovém prostředí dává cholesterol barevnou reakci a acetanhydridem, které se pouţívá k fotometrickému stanovení. Většina lipidů poskytuje hydrolýzou v alkalickém prostředí soli vyšších mastných kyselin (mýdla) a glycerol, eventuálně další molekuly. Draselná, sodná a amonná mýdla jsou rozpustná ve vodě, dají se však přidáním vhodného elektrolytu vysolit, mýdla vápenná a hořečnatá jsou nerozpustná.
30
Pomůcky: stojany, filtrační kruhy, nálevky, filtrační papír, kádinky, odpařovací misky, vodní lázeň, odměrné válce, tyčinky, stojan se zkumavkami, pipety, mikroskop Chemikálie: bezvodý aceton, chloroform, ether, 95% ethanol, 10% alkoholický roztok NaOH, nasycený roztok CdCl2 v ethanolu, slepičí vejce, ledová kyselina octová, kyselina sírová, kyselina dusičná, acetanhydrid, 5% Lugolův roztok, 10% vodný roztok NaOH, roztok CaCl 2, nastrohané mýdlo, rostlinný olej Postup: Úloha 1: Extrakce neutrálních lipidů Ţloutek oddělíme od bílku a důkladně promícháme v kádince s 25 ml bezvodého acetonu. Necháme stát za občasného míchání 10 minut. Potom extrakt zfiltrujeme přes filtrační papír navlhčený acetonem. Zbytek na filtru (denaturované bílkoviny, fosfolipidy) vpravíme zpět do kádinky a opět promícháme s 25 ml acetonu. Směs znovu zfiltrujeme a spojené filtráty (obsahující neutrální tuky a cholesterol) odpaříme na vodní lázni. Úloha 2: Izolace fosfolipidů Zbytek na filtru po dvojnásobné extrakci acetonem dáme zpět do kádinky a rozmícháme s 15 ml 95% etanolu. Směs zfiltrujeme přes filtrační papír navlhčený etanolem. Zbytek na filtru (denaturované bílkoviny) opět promyjeme 15 ml 95% etanolu. Spojené filtráty obsahující fosfolipidy odpaříme na vodní lázni. Získáme mazlavou sraţeninu fosfatidů, která sestává převáţně z lecitinu. Asi 100 mg lecitinu uchováme pro další práci, zbytek převedeme v adiční produkt s chloridem kademnatým. Po rozpuštění v několika ml etheru přidáme stejné mnoţství alkoholického roztoku chloridu kademnatého. Vytvoří se bílá krystalická sraţenina, kterou po deseti minutách odfiltrujeme a dáme usušit. Úloha 3: Odstranění tuku ve formě mýdla Acetonový filtrát (bod 1) smícháme s 15 ml alkoholického roztoku NaOH a zahříváme 30 minut na vodní lázni, čímţ zmýdelníme tuky. Zbytek ochladíme a dobře rozetřeme s 50 ml etheru. Sraţeninu sodného mýdla uchováme pro další práci. Úloha 4: Hydrolýza lecitinu Asi 100 mg lecitinu vpravíme na dno zkumavky a zahříváme nejméně 15 minut na vodní lázni s 5 ml 10% vodného roztoku NaOH. Hydrolyzát ochladíme, okyselíme kyselinou octovou na pH 6 a odfiltrujeme vyloučené mastné kyseliny. 31
(Důkaz cholinu: kapku hydrolyzátu smícháme na sklíčku se 2 kapkami Lugolova roztoku. Pod mikroskopem pozorujeme růst hnědých krystalků.) Úloha 5: Lecitin jako přirozený emulgátor Do dvou zkumavek přidáme po 2 ml vody a 1 ml rostlinného oleje. Do jedné ze zkumavek přidáme tyčinkou malé mnoţství lecitinu. Za mírného míchání zahřejeme na vodní lázni, zazátkujeme a intenzivně třepeme 2 minuty. Po 10 minutách srovnáme stabilitu bez emulgátoru a s emulgátorem. Úloha 6: Důkaz cholesterolu Liebermann-Buchardova reakce – Asi 1 ml chloroformového roztoku cholesterolu dáme do suché zkumavky, přidáme 10 kapek acetanhydridu a 2 kapky koncetrované kyseliny sírové. Protřepeme a necháme několik minut stát. pozorujeme zbarvení směsi. Úloha 7: Vlastnosti mýdla Získané mýdlo rozpustíme asi v 50 ml teplé vody. Do 4 zkumavek odměříme po 5 ml roztoku. Pro srovnání pouţijeme i nastrouhané mýdlo – taky do 4 zkumavek. Provedeme tyto reakce: 1. zkumavka: Při třepání pozorujeme vznik pěny (sníţení povrchového napětí). 2. zkumavka: Přidáváme 10% roztok chloridu vápenatého aţ do vzniku sraţeniny. 3. zkumavka: Přidáme několik kapek kyseliny octové aţ do vzniku bílé zákalu, který se mění v olejovitou vrstvu. 4. zkumavka: Rozpustíme tolik pevného NaCl aţ se objeví sraţenina vysoleného mýdla.
32
Závěr Cílem týmového projektu bylo vytvořit ucelený text týkající se bílkovin, důleţitých biochemických látek a především jejich vyuţití v biomedicínských oborech. Základem pro práci s těmito biochemickými látkami je znalost jejich základní struktury a znalost metod, které tuto strukturu zkoumají. Tyto informace obsahuje část teoretická. V praktické části byly vytvořeny laboratorní úlohy pro výuku biochemie. Jsou zaměřeny na základní důkazové reakce izolovaných bílkovin a dalších látek z běţně dostupných přírodních zdrojů. Návody k úlohám obsahují seznam potřebného vybavení, chemikálií a postup práce. Součástí laboratorní úlohy je i výuková prezentace, která obsahuje shrnutí základních znalostí, postup práce a především také fotodokumentaci, která názorně ukazuje výsledek provedené úlohy. Cílem projektu nebylo pouze vytvoření návodů, ale i příprava úloh přímo v laboratoři, coţ znamená přípravu potřebného vybavení, chemických vzorků a pouţívaných roztoků.
33
Seznam použité literatury [1] VOET, Donald a Judith G. VOETOVÁ. Biochemie. 1. Praha: Victoria Publishing, 1995. ISBN 80-85605-44-9. [2] NOVOTNÁ, Jana . Ústav lék. chemie a biochemie – Aminokyseliny [online]. 2009 [cit. 2011-12-8]. Dostupné z WWW: [3] ČEGAN, Alexander; KORECKÁ, Lucie. Biochemie pro bakalářské studium chemie a technické chemie. Univerzita Pardubice : Fakulta chemicko-technologická, 2008. 61 s. [4] ŠÍPAL , Zdeněk. Biochemie. Brno : SPN Praha, 1992. 480 s. ISBN 80-04-21736-2. [5] European Food Information Council: Bílkoviny v lidském organismu. [cit. 2011-11-22]. Dostupné z: http://www.eufic.org/article/cs/artid/bilkoviny-lidskem-organismu/ [6] BENEŠOVÁ, Marika; SATRAPOVÁ, Hana. Odmaturuj z chemie. 1. Brno: Didaktis spol, s.r.o., 2002. ISBN 80-86285-56-1. [7] MAREČEK , Aleš; HONZA, Jaroslav. Chemie pro čtyřletá gymnázia - 3.díl . 1. vydání. Nakladatelství OLOMOUC . ISBN 80-7182-057-1 [8] Příčně pruhovaná (kosterní) svalovina. [online]. [cit. 2011-11-17]. Dostupné z: [9] Hemoglobin. Interaktivní elektronická učebnice biochemie [online]. [cit. 2011-12-7]. Dostupné z: [10] Kolorimetrické stanovení koncentrace proteinů. Praktikum z experimentálních metod biofyziky
a
chemické
fyziky
I
[online].
[cit.
2011-12-11].
http://alma.karlov.mff.cuni.cz/biofyzika/english/vyuka/StanoveniProteinu.pdf
34
Dostupné
z:
[11] ENGLIŠ, Miroslav . Vyšetření moči. IZIP [online]. [cit. 2011-12-18]. Dostupné z: http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/AJCLP.htm
35
Samostatné přílohy P1 – Protokol: Izolace bílkovin z přírodních zdrojů P2 – Protokol: Preparace a vlastnosti lipidových frakcí z vaječného ţloutku P3 – Protokol: Izolace RNA P4 – Prezentace: Bílkoviny P5 – Prezentace: Lipidy P6 – Prezentace: RNA
36
Příloha č.1 PROTOKOL – BÍLKOVINY: Izolace bílkovin z přírodních zdrojů
Úloha 1: Izolace kaseinu z mléka Pomůcky: kádinka, magnetické míchadlo, vodní lázeň, pH metr, kapátko, nálevka, filtrační papír, stojan, teploměr Chemikálie: kyselina chlorovodíková, odstředěné mléko, ethanol Postup: Do kádinky jsme nalili 40 g odtučněného mléka, které jsme zahřívali na vodní lázni za průběţného míchání. Kdyţ byla teplota přibliţně 40° C, kádinku s mlékem jsme poloţili na magnetické míchadlo a vloţili jsme pH metr. Přidali jsme několik kapek kyseliny chlorovodíkové a pozorovali jsme vznik sraţeniny kaseinu. Poté jsme v přidávání roztoku HCl pokračovali aţ do hodnoty pH 4,6. Po sestavení filtrační aparatury jsme sraţeninu kaseinu odfiltrovali přes filtrační papír a filtrát (syrovátku) jsme přenesli do kádinky. Kasein na filtru jsme promyli vodou, přidali jsme k němu 25 ml etanolu a znovu zfiltrovali. Kasein jsme nechali uschnout na filtračním papíře a určili jsme procentuální výtěţek. Zváţený usušený kasein … m = 0,95 g ve 40 ml mléka Z tabulky … m = 26 g ve 1000 ml mléka → m = 1,04 g ve 40 ml Závěr: Z odstředěného mléka jsme získali jeho hlavní bílkovinu – kasein. Hmotnostní výtěţek kaseinu byl 0,95 g coţ přibliţně odpovídá tabulkové hodnotě, která je 1,04 g. Úloha 2: Důkazové reakce bílkovin Pomůcky: kádinky, zkumavky, kapátko, lţička, nálevka, hodinové sklo, pH metr Chemikálie: odstředěné mléko, roztok kaseinu (polovina lţičky kaseinu + 45 kapek destilované vody), 10% NaOH, Fehlingovo činidlo, 5% CuSO4, HNO3, bezvodý NiCl2, HCl, AgNO3, syrovátka
37
Biuretová reakce: Připravili jsme si roztok kaseinu tak, ţe jsme půl lţičky usušeného rozdrceného kaseinu rozpustili ve 45 kapkách destilované vody. Do zkumavky jsme dali 15 kapek roztoku kaseinu a postupně přidali 5 kapek 10% NaOH a 2 kapky 5% CuSO4. Za stálého míchání nám vznikl fialově zbarvený roztok. Xantoproteinová reakce: Do zkumavky jsme opět dali 15 kapek roztoku kaseinu a přidali jsme 10 kapek koncentrované kyseliny dusičné. Při zahřívání ve vodní lázni a míchání nám vznikl ţlutě zabarvený roztok. Důkaz vody v mléku: Na hodinové sklo jsme nalili trochu mléka a přidali malou lţičku chloridu nikelnatého. Krystalky chloridu zezelenaly, vznikl hexahydrát chloridu nikelnatého, čímţ jsme dokázali obsah vody v mléku. Závislost rozpustnosti kaseinu na pH: Postupovali jsme stejně jako v úloze č. 1. Do kádinky jsme nalili 40 g odtučněného mléka a zahřáli na 40°C. Vloţili jsme pH metr a přidali přibliţně 6 kapek kyseliny chlorovodíkové. Vznikla sraţenina kaseinu. Vzorek jsme rozdělili napůl. K jedné polovině jsme pokračovali v přidávání HCl, přibliţně do hodnoty pH 2. Ke druhé polovině sraţeniny kaseinu jsme přidali roztok 10% NaOH do hodnoty pH 9. Při těchto hodnotách pH jsme pozorovali, ţe se sraţenina kaseinu opět rozpustí. Důkaz chloridů: Část syrovátky (kapalina oddělená od kaseinu) jsme nalili do zkumavky a přidali několik kapek AgNO3 (aq). Pozorovali jsme vznik bílé sraţeniny, která postupně tmavla - vznikl AgCl a Ag. Dokázali jsme tedy, ţe mléko obsahuje chloridy. Důkaz cukru: Laktóza (cukr mléčný) jsme dokázali v syrovátce. Asi 0,5 ml syrovátky jsme nalili do zkumavky a přidali asi 0,5 ml Fehlingova činidlo I. a asi 0,5 ml Fehlingova činidla II. Směs ve zkumavce jsme zahřáli ve vodní lázni a vznikla nám hnědočervená sraţenina oxidu měďného. Změny mléka zahřátím: Mléko jsme v kádince zahřáli k varu a nechali vychladnout. Na povrchu mléka se vytvořil škraloup, který jsme odstranili a provedli na něm biuretovou (do zkumavky jsme dali část škraloupu a postupně jsme přidali 5 kapek 10% NaOH a 2 kapky 5% CuSO4. Za stálého míchání se škraloup fialově zabarvil) a xantoproteinovou reakci (do
38
zkumavky jsme dali druhou část škraloupu a přidali jsme 10 kapek koncentrované kyseliny dusičné. Při zahřívání ve vodní lázni a míchání se škraloup zabarvil ţlutě). Úloha 3: Stanovení kyselosti mléka Pomůcky: titrační baňky, byreta, stojan, nálevka, pipeta, pipetovací balonek Chemikálie: odstředěné mléko, fenolftalein, 0,1 M titrační roztok NaOH, kyselina šťavelová
Pro určení přesné koncentrace titračního roztoku NaOH jsme pouţili roztok kyseliny šťavelové (primární standard). Je to stálá látka, nereaktivní, neabsorbuje vzdušnou vlhkost a nerozkládá se účinkem světla. Příprava 250 ml 0,1 M roztoku kyseliny šťavelové (COOH)2 M(COOH)2 = 126,07 g/mol V(COOH)2 = 250 ml = 0,25 l c(COOH)2 = 0,1 mol/l výpočet: n(COOH)2 = c(COOH)2 · V(COOH)2 = 0,1 · 0,25 = 0,025 mol m(COOH)2 = n(COOH)2 · M(COOH)2 = 0,025 · 126,07 = 3,1518 g kyseliny šťavelové naváţeno: m(COOH)2 = 3,1508 g n(COOH)2 = m(COOH)2 /M(COOH)2 = 3,1508/126,07 = 0,0249 mol výsledná koncentrace kys. šťavelové: c(COOH)2 = n(COOH)2 /V(COOH)2 = 0,0249/0,25 = 0,0999 c(COOH)2 = 0,1000 mol/l Příprava 1 l 0,1 M roztoku hydroxidu sodného NaOH MNaOH = 40 g/mol VNaOH = 1 l cNaOH = 0,1 mol/l výpočet: nNaOH = cNaOH · VNaOH = 0,1 · 1 = 0,1 mol mNaOH = nNaOH · MNaOH = 0,1 · 40 = 4 g hydroxidu sodného 39
naváţeno: m = 4 g
výslednou koncentraci hydroxidu sodného jsme určili titrací kyseliny šťavelové 2NaOH + (COOH)2 → 2H2O + (COONa)2 1 mol kyseliny → 2 mol hydroxidu
c(COOH)2 = 0,1 mol/l V(COOH)2 = 10 ml = 0,01 l VNaOH = 0,01958 l cNaOH = ? mol/l n(COOH)2 = nNaOH/2 c(COOH)2 · V(COOH)2 = (cNaOH · VNaOH)/2 0,1 · 0,01 = (cNaOH · 0,01958)/2 cNaOH = 0,1021 mol/l Stanovení kyselosti mléka Postup: Sestavili jsme titrační aparaturu a byretu jsme naplnili 0,1021 M NaOH, do titrační baňky jsme napipetovali 20 ml mléka a přidali 20 ml destilované vody a 10 kapek fenolftaleinu. Postupně jsme přidávali roztok NaOH z byrety a stanovili jeho spotřebu v bodě ekvivalence, kdy se mléko zbarví dorůţova. Vypočítali jsme kyselost mléka v °D. čerstvé mléko … méně neţ 18 ºD kyselé mléko … 18 - 40 ºD nad 40 ºD … mléko „tvarohovatí“ 1°D = 0,1 g kyseliny mléčné v 1 l mléka → 0,002 g kyseliny mléčné ve 20 ml mléka
titrace: cNaOH = 0,1021 mol/l VNaOH = 0,0029 l 1. měření… 3,00 ml 2. měření… 2,85 ml 40
3. měření… 2,90 ml průměr… 2,91 ml Mkys.ml. = 90 g/mol mkys.ml. = ? g nNaOH = nkys.ml. cNaOH · VNaOH = mkys.ml./Mkys.ml. 0,1021 · 0,0029 = mkys.ml./90 mkys.ml. = 0,0266 g kyseliny mléčné 1°D … 0,002 g kyseliny mléčné x°D … 0,0266 g kyseliny mléčné x = 0,0266/0,002 = 13,3°D – hodnota kyselosti mléka odpovídá čerstvému mléku Závěr: Mléko jsme titrovali roztokem NaOH o přesně známé koncentraci. Určili jsme hmotnost kyseliny mléčné ve 20 ml mléka a dopočítali jsme hodnotu kyselosti mléka, která vyšla 13,3 °D. Tato hodnota odpovídá hodnotě kyselost
41
Příloha č.2 PROTOKOL – LIPIDY: Preparace a vlastnosti lipidových frakcí z vaječného žloutku Pomůcky: stojany, filtrační kruhy, nálevky, filtrační papír, kádinky, odpařovací misky, vodní lázeň, odměrné válce, tyčinky, stojan se zkumavkami, pipety, mikroskop Chemikálie: bezvodý aceton, chloroform, ether, 95% ethanol, 10% alkoholický roztok NaOH, nasycený roztok CdCl2 v ethanolu, slepičí vejce, ledová kyselina octová, kyselina sírová, kyselina dusičná, acetanhydrid, 5% Lugolův roztok, 10% vodný roztok NaOH, roztok CaCl 2, nastrohané mýdlo, rostlinný olej Postup: Úloha 1,2,3 : Extrakce neutrálních lipidů, izolace fosfolipidů, odstranění tuku ve formě mýdla Ze slepičího vejce jsme oddělili ţloutek od bílku a promíchali v kádince s 25 ml bezvodého acetonu a směs jsme míchali 10 minut. Sestavili jsme si filtrační aparaturu a extrakt zfiltrovali přes filtrační papír navlhčený acetonem. Zbytek na filtru představují denaturované bílkoviny a fosfolipidy, ty jsme vpravili zpět do kádinky a opět promíchali s 25 ml acetonu. Směs jsme znovu zfiltrovali a spojené filtráty jsme dali na vodní lázeň a nechali odpařit. Filtrát jsme dále smíchali s 15 ml alkoholického roztoku NaOH a 30 minut zahřívali na vodní lázni, čímţ jsme zmýdelnili tuky. Zbytek jsme ochladili a rozetřeli s 50 ml etheru. Zbytek na filtru po filtraci acetonem jsme dali zpět do kádinky a rozmíchali s 15 ml 95% etanolu. Směs jsme zfiltrovali na filtrační aparatuře přes filtrační papír navlhčený etanolem. Zbytek na filtru (denaturované bílkoviny) jsme opět promíchali 15 ml 95% etanolu. Spojené filtráty obsahující fosfolipidy jsme nechali odpařit na vodní lázni. Dostali jsme tak mazlavou sraţeninu fosfatidů, která sestává převáţně z lecitinu. Asi polovinu lecitinu jsme rozpustili v několika ml etheru a přidali přibliţně stejné mnoţství alkoholického roztoku chloridu kademnatého. Vznikla bílá krystalická sraţenina, kterou jsme odfiltrovali a dali usušit. Závěr: Filtrát, který obsahoval především neutrální tuky a cholesterol, jsme zmýdelnili a získali jsme tak sraţeninu sodného mýdla. Ze zbytku na filtru jsme získali lecitin, významný emulgátor, coţ jsme dokazovali v další úloze.
42
Úloha 4: Hydrolýza lecitinu Druhou polovinu lecitinu jsme dali do zkumavky a zahřívali 20 minut na vodní lázni s 5 ml 10% vodného roztoku NaOH. Směs jsme ochladili, okyselili kyselinou octovou na pH 6 a odfiltrovali vyloučené mastné kyseliny. Závěr: Hydrolýzou lecitinu jsme oddělili molekuly mastných kyselin z molekul fosfolipidu, vznikl takzvaný lysolecitin, který je zvlášť hydrofilní, čímţ jsou umocňovány emulgační vlastnosti.
Úloha 5: Lecitin jako přirozený emulgátor Do dvou zkumavek jsme dali 2 ml vody a 1 ml rostlinného oleje. Do jedné ze zkumavek jsme přidali tyčinkou malé mnoţství lecitinu a za mírného míchání jsme zahřívali na vodní lázni, zazátkovali a třepali 2 minuty. Po 10 minutách jsme srovnali stabilitu bez emulgátoru a s emulgátorem. Závěr: Po přidání lecitinu do jedné ze zkumavek jsme dokázali, ţe funguje jako přirozený emulgátor, tedy dovoluje míchat tuky a vodu. Úloha 6: Důkaz cholesterolu Asi 1 ml roztoku cholesterolu v chloroformu jsme dali do suché zkumavky, přidali 10 kapek acetanhydridu a 2 kapky koncetrované kyseliny sírové. Směs jsme protřepali a nechali odstát několik minut. Závěr: Po odstání získala směs tmavě zelenou barvu, coţ dokazuje přítomnost cholesterolu. Úloha 7: Vlastnosti mýdla Mýdlo, které jsme získali z úlohy 3, jsme rozpustili v 50 ml teplé vody a do 4 zkumavek jsme odměřili po 5 ml roztoku. Pro srovnání jsme vytvořili i roztok z nastrouhaného mýdla, který jsme také rozdělili do 4 zkumavek. Ve zkumavkách č. 1 jsme pozorovali při třepání vznik pěny. Do zkumavek č. 2 jsme přidali 10% roztok chloridu vápenatého aţ do vzniku sraţeniny. Do zkumavek č. 3 jsme přidali několik kapek kyseliny octové aţ do vzniku bílé zákalu, který se mění v olejovitou vrstvu. Ve zkumavkách č. 4 jsme rozpustili pevný NaCl aţ se objevila sraţenina vysoleného mýdla. Závěr: Při srovnání vlastností získaného mýdla a normální mýdla jsme dosáhli u všech reakcí téměř stejného výsledku.
43
Příloha č.3 PROTOKOL – RNA: Izolace RNA
Pomůcky: třecí miska, kádinky, centrifuga, skleněná tyčinka, odměrný válec (5 ml, 20 ml), zkumavky, lţička, vodní lázeň, kapátko Chemikálie: diethylether, ledový etanol, mořský písek, 5 % kyselina octová, 50 % kyselina octová, 0,1 N HCl, 0,1 N NaOH, 0,5 % NaOH, difenylaminové činidlo – 50 ml CH3COOH + 2 x 37,5 H2SO4 Postup: Úloha 1: Vysrážení RNA 20 gramů kvasnic, 3 ml destilované vody, 3 ml diethyletheru a asi tři lţičky mořského písku jsme dali do třecí misky a vytvořili homogenát. Do něj jsme přidali 25 ml 0,5% roztoku NaOH a třeli asi 15 minut. Poté jsme směs zahřívali na vodní lázni při 70°C 15 minut. 5% kyselinou octovou jsme upravili pH na hodnotu 6. Směs jsme centrifugovali při 3000xg po dobu 15 minut. Tekutinu nad sedimentem jsme odlili do kádinky a upravili její pH hodnotu na 3,5 pomocí 50% kyseliny octové. Ke směsi jsme do kádinky přidali stejné mnoţství vychlazeného etanolu. Vznikla sraţenina ribonukleoproteinu, kterou jsme centrifugovali 10 minut při 2000g. Sraţeninu jsme rozpustili v malém mnoţství 0,1 N NaOH, vzniklý roztok jsme zředili stejným mnoţstvím ledové destilované vody a znova zcentrifugovali. Supernatant, tekutinu nad sedimentem, jsme okyselili 1 N HCl na pH 6 a postupně přidali dvojnásobné mnoţství chlazeného etanolu. Směs jsme dali do lednice a RNA se znovu vysráţela, jiţ bez bílkovin, dále jsme si zcetrifugovali, sraţeninu promyli metanolem a vysušili. Závěr: Získali jsme sraţeninu RNA z kvasnic, na které jsme dále provedli důkazové reakce. Úloha 2: Důkaz RNA Do zkumavky s izolovanou RNA jsme dali 1 ml 0,5 % NaOH. Po promíchání a rozpuštění jsme přidali 1 ml difenylaminového činidla. Ve vroucí vodní lázni jsme směs zahřívali asi 20 minut. Závěr: Po reakci RNA s difenylaminovým činidlem vzniklo zelené zabarvení, coţ dokazuje přítomnost RNA. 44
