ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2012
Tomáš Neubert
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky
Hematologický analyzátor Týmový projekt
Vedoucí projektu: Ing. Roman Matějka Student:
Tomáš Neubert
leden 2012
Abstrakt Hematologické analyzátory hrají velmi důležitou roli v lékařské diagnostice. Z jejich výsledků se dají zjistit různé choroby od anémie (chudokrevnost) přes podezření na vnitřní krvácení až po leukémii. Práce zahrnuje teoretický úvod, ve kterém je popsáno vše potřebné pro získání znalostí o krvi a jejích elementech a metodách vyhodnocování krevního obrazu. Na základě těchto znalostí práce navrhuje sestavení experimentálního měřicího přípravku. Přípravek je schopen zjistit alespoň jeden hematologický parametr při laboratorních podmínkách. Dále práce realizuje software, který automaticky detekuje krevní částice. Funkční
měřící
přípravek
hematologického analyzátoru.
pomůže
studentům
pochopit
hlavní
principy
měření
Annotation Hematology analyzers play a very important role in medical diagnostics. Their results can detect various diseases from anemia over suspected internal bleeding to leukemia. The work includes a theoretical introduction, which describes everything you need to gain knowledge about blood and its elements and methods of evaluating blood count. Based on this knowledge, the work proposes a compilation of experimental measurement product. The product is able to detect at least one hematological parameter in laboratory conditions. Further work implements software that automatically detects blood particles. Functional measurement product helps students understand the basic principles of hematology analyzer measurements.
Poděkování V úvodu této práce bych rád poděkoval mému vedoucímu Ing. Romanu Matějkovi za podporu a vedení během celého řešení a zpracovávání této práce, za odbornou pomoc v oblasti techniky a cenné rady. Dále bych rád poděkoval panu MUDr. Mariánu Liberkovi za rady a dohled nad klinickou částí této práce. V neposlední řadě bych rád poděkoval svému kolegovi Michalu Kyselovi, který mi opatřil velmi užitečné literární zdroje a po celou dobu mi pomáhal při řešení této práce.
ii
Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem …………………………………………………………………………………………………..vypracov al(a) samostatně a použil(a) k tomu úplný výčet citací použitých pramenù, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě.
Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).
V ……………. dne ………………
……………………. podpis
iii
Obsah
Úvod ........................................................................................................................................... 5 1. Teorie ..................................................................................................................................... 6 1.1 Hematologie...................................................................................................................... 6 1.2 Krev .................................................................................................................................. 6 1.2.1 Srážení krve ............................................................................................................... 7 1.2.2 Složení krve ............................................................................................................... 7 1.2.3 Hemoglobin (červené krevní barvivo) ..................................................................... 13 2. Cíle práce.............................................................................................................................. 15 3. Současný stav řešení............................................................................................................. 16 3.1 Hematologické analyzátory ............................................................................................ 16 3.2 Principy počítání krevních částic .................................................................................... 17 3.2.1 Optické metody ........................................................................................................ 17 3.2.2 Další metody ............................................................................................................ 21 4. Použité metody ..................................................................................................................... 21 5. Experimentální část .............................................................................................................. 22 5.1 Mikroskop ....................................................................................................................... 22 5.2 CCD kamera ................................................................................................................... 23 5.3 Ovládací a vyhodnocovací software ............................................................................... 24 5.4 Zpracování obrazu .......................................................................................................... 25 Závěr......................................................................................................................................... 27 Seznam použité literatury ......................................................................................................... 28
4
Úvod Hlavním důvodem a záměrem výběru práce je osvětlení fungování a objasnění principu měření na klinických a biochemických přístrojů v medicíně. Většina lidí a bohužel i studentů nemají ponětí, jak tyto přístroje uvnitř pracují. Já jsem se zaměřil konkrétně na hematologický analyzátor. V dnešní době hematologické analyzátory své výsledky zpracují do několika vteřin a změří desítky parametrů. Cílem mé práce je vysvětlit, popsat a objasnit principy, jaký tento přístroj měří a zkonstruovat podobný přípravek o stejném principu, na kterém by si studenti zkusili, jak takovýto analyzátor funguje. Pro vytvoření takovéhoto přípravku je nutné mít základní znalosti o hematologii a jejích krevních částic. Poté návrh vhodného měřicího přípravku a jeho princip měření. Následuje konstrukce a ověření, zda přípravek funguje. Studenti by měli mít poté lepší představu o fungování hematologického analyzátoru.
5
1. Teorie 1.1 Hematologie Hematologie je nauka o krvi. Název je odvozen z řeckých slov haima – krev a logos – slovo. Hematologie je významný podobor vnitřního lékařství, má interdisciplinární charakter a navazuje na řadu dalších medicínských oborů. Hematologie se zabývá krví, krvetvornými orgány a krvetvorbou za normálních (fyziologických) a chorobných (patologických) stavů celého organismu. Do oblasti jejího zájmu spadá rozbor a poznávání vlastností krve a krvetvorných orgánů a rozbor, poznávání a léčení chorob krvetvorby. Úloha hematologie je dána samotnou povahou krve, která jako jediný orgán v těle přichází do bezprostředního styku s takřka všemi tkáněmi těla a odráží tudíž i jejich změny [1].
1.2 Krev Krev je vysoce specializovaná tělesná tekutina proudící uzavřeným cévním systémem vlastní nejen člověku, ale všem vyšším živočichům. Krev je důležitým spojovacím a transportním systémem. Zajišťuje nepřetržitou výměnu látek mezi buňkami a napomáhá udržovat stálost vnitřního prostředí, jak tkáňových, tak krevních buněk. Je tekutý orgán, u něhož můžeme rozeznat část buněčnou a část tekutou. Má většinou červenou barvu. Mezi fyziologické funkce krve patří přivádění tkáním živiny a kyslík, odvádění CO2 a pomáhat udržet stálé pH vnitřního prostředí. Odvádět odpadní produkty metabolismu a přenášet hormony, vitaminy a minerály. Zajišťovat obranné mechanismy organismu. Podílet se na udržování tělesné teploty. Rozlišujeme krev nativní (srážlivou), která je bez antikoagulačních přísad (krev se sráží) a nesrážlivou, ve které jsou antikoagulační přísady [1].
6
1.2.1 Srážení krve Za normálních podmínek krev koluje v cévách v tekutém stavu. To je určováno rovnovážným stavem systému krevního srážení a jeho regulačními mechanismy. Po narušení cévní stěny a z řady jiných příčin dochází k rozkolísání dynamické hemokoagulační rovnováhy a následně k aktivaci srážecích mechanismů. Rovněž jakmile krev opustí krevní řečiště, sráží se. Za srážení mohou látky obsažené v plasmě a to anorganické látky Ca2+ a Mg2+ a bílkovina Fibrinogen. Srážení krve je složitý a životně důležitý enzymatický proces, který představuje ochranu organismu proti přirozeným ztrátám krve, jež vznikají při nejrůznějších poraněních.
Antikoagulační činidla mohou být na bázi: -
citrátové – vyvazují Ca2+ (to se uplatňuje při srážení krve)
-
EDTA (Etylendiaminotetraoctové kyseliny nebo jejich solí) – vyvazuje Ca2+
-
heparinu – tvoří komplex antitrombinem a trombinem
Některé charakteristiky krve: -
na každý kilogram váhy je v lidském těle 70 – 75 ml krve
-
z celkové váhy těla krev zaujímá 7 – 8 % (asi 1/13 hmotnosti)
-
dospělý člověk má průměrně 5 litrů krve
-
muži mají v poměru ke své váze o 5 % červených krvinek více než ženy [1]
1.2.2 Složení krve Krev obsahuje: Tabulka č. 1- složení krve
Plasma
55 %
Buněčné součásti 45 %
7
Krev se skládá z buněčných elementů (červené krvinky, bílé krvinky, krevní destičky) rozptýlených v tekutém médiu (plasmě) [1].
Obrázek č. 1 – Složení krve Zdroj: http://www.cervenykriz.zlin.cz/jak-darovat-krev.html
Plasma Plasma je extracelulární světle žlutá, průhledná, lehce zkalená tekutina, ve kterém se pohybují krevní buňky. Získá se centrifugací nesrážlivé krve [1].
Plasma obsahuje: Tabulka č. 2 – složení plasmy
Voda
92 %
Bílkoviny
7%
Zbylé látky (anorganické a organické látky)
1%
8
Anorganické látky: -
kationty: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, Co2+
-
anionty: Cl-, Br-, J-, fosfáty, uhličitany, sírany
-
plyny: O2, CO2, N2
Organické látky: -
bílkoviny: albuminy, globuliny, fibrinogen, glykoprotein
-
sacharidy a lipidy
-
látky tvořící se při metabolismu bílkovin: bilirubin, močovina, acetonové látky, laktát
-
vitamíny a hormony
Buněčné součásti krve Buněčné krevní elementy jsou přítomny v plasmě a dělí se: -
červené krvinky (erytrocyty) – z řeckého erytros = červený a kýtos = buňka
-
bílé krvinky (leukocyty) - řeckého leukos =bílý a kýtos = buňka
-
krevní destičky (trombocyty) - řeckého thrombos = sedlina, sraženina a kýtos = buňka
Obrázek č. 2 – Buněčné součásti krve Zdroj: http://www.biologycorner.com/anatomy/blood/notes_blood.html 9
Červené krvinky (erytrocyty) Červená krvinka je bezjaderná buňka, v krvi nejpočetněji zastoupená. Erytrocyty zaujímají 40 – 45 % objemu krve. Neobsahuje většinu nitrobuněčných organel, proto erytrocyt považujeme spíše za neúplnou buňku. Buněčná membrána uzavírá přesycený roztok hemoglobinu. Barva hemoglobinu a poměrně velký počet erytrocytů v krvi dává krvi charakteristické červené zbarvení. Červená krvinka má bikonkávní (dvojvydutý) tvar, který představuje optimální poměr povrchu k objemu a je velmi výhodný proto, že může být deformován při průchodu kapilárou nebo mezi endotelovými buňkami. Erytrocyty tak mohou procházet kapilárami, jejichž světlost je menší, než průměr erytrocytu (ze 7,2 µm až na průměr 2 µm). V obvodové krvi krvinka žije 110 – 120 dní. Hlavní funkcí erytrocytu v organismu je přenos O2 z plic do tkání a CO2 opačným směrem. Tuto funkci zprostředkuje hemoglobin, který je z funkčního hlediska nejdůležitější součástí červené krvinky. Membrána erytrocytu je pevná a elastická. Do membrány může omezeně pronikat voda a některé anionty, zabraňuje úniku kationtů a bílkovin (hlavně hemoglobinu). Transportuje sodík a draslík a uskutečňuje se v ní výměna lipidů mezi erytrocyty a plasmou. V membráně lze rozlišit vnitřní stranu membrány, do které jsou fixovány kontraktilní bílkoviny, které napomáhají udržet tvar erytrocytu. Vnější stranu membrány, kde jsou uloženy integrální molekuly glykoproteinů a glykolipidů, které jsou nositeli antigenních vlastností červené krvinky, např. krevních skupin. Udržování stálé struktury membrány a cytoskeletu vyžaduje značný přísun energie, kterou zprostředkuje ATP vznikající při glykolýze. ATP je potřeba i pro aktivní transport buněčnou membránou [2].
10
Bílé krvinky (leukocyty) Bíle krvinky se zúčastňují obranných reakcí organismu. Jsou to bezbarvé kulovité buňky, které obsahují jádro. U bílé krevní složky na rozdíl od červené rozlišujeme několik druhů. Za normálních podmínek nacházíme v obvodové krvi tyto krvinky:
Z morfologického hlediska: U morfologického hlediska se přihlíží k přítomnosti, či nepřítomnosti specifických granulí v cytoplasmě.
-
-
Granulocyty: -
Neutrofilní tyče a segmenty
-
Eozinofilní segmenty
-
Bazofilní segmenty
Agranulocyty: -
Monocyty
-
Lymfocyty
Obrázek č. 3 – Druhy leukocytů Zdroj: http://www.biosbcc.net/doohan/sample/htm/Blood%20cells.htm
11
Neutrofily -
Jádro: je rozdělené na 2 – 5 částí, které jsou spojeny tenkými můstky. Jednotlivé úseky nejsou pravidelné.
-
Průměr: 10 – 14 µm
-
Přežívají v krevním oběhu jen několik hodin a pak přechází do tkání, kde pravděpodobně zanikají.
-
Obsahují: myeloperoxidázu, esterázy, lipidy
-
Zastoupení v kostní dřeni: 0,16 – 0,20
Eozinofily -
Jádro: většinou rozdělené na 2 části, které jsou spojeny nitkovitým můstkem
-
Cytoplasma: je velmi světlá až bezbarvá. Obsahuje zrna, které se při pohybu mikroskopu žlutě lesknou.
-
Průměr: 10 – 16 µm
-
V krevním oběhu přežívají 12 – 24 hodin a pak přechází do oblastí mimo krevní oběh.
-
Obsahují: myeloperoxidázu, lipidy
-
Zastoupení v kostní dřeni: 0,01 – 0,04
Bazofily -
Jádro: je nepravidelné, až laločnaté
-
Průměr: 10 – 12 µm
-
V krevním oběhu přežívají 4 – 7 dnů.
-
Obsahují: histamin, heparin
-
Zastoupení v kostní dřeni: 0,000 – 0,005
Monocyty -
Vzhled: největší buňka v obvodové krvi. Má většinou nepravidelný tvar.
-
Jádro: je podkovovité, fazolovité nebo laločnaté
-
Průměr: 18 – 22 µm
-
Přežívají v krevním oběhu několik dní, potom přechází do tkání. Některé se vracejí do oběhu. Monocyty v tkáních se diferencují na specifické tkáňové makrofágy (histocyty).
-
Obsahují: esterázy, myeloperoxidázu, lysozym
-
Zastoupení v kostní dřeni: 0,005 – 0,01
12
Lymfocyty -
Podle místa vzniku buňky rozlišujeme NK buňky, B – Lymfocyt (obě vznik v kostní dření), T – Lymfocyt (vznik v Thalamu)
-
Jádro: poměrně velké kulaté, oválné
-
Průměr: 8 – 12 µm (malá lymfocyt), 12 – 16 µm (velký lymfocyt)
-
Běžná populace lymfocytů přežívá několik dní až týdnů, paměťové buňky několik let
-
Obsahují: lipidy, kyselé hydrolázy Hlavní úlohou bílých krvinek je ochrana organismu před cizorodými látkami, které do
organismu vstupují jak zvenčí (bakterie, viry, prach, potraviny apod.), tak které vznikají přímo v organismu (procesy látkové přeměny). Zneškodňování látek probíhá dvěma způsoby. Fagocytózou tj. pohlcováním. Zúčastňují se ho granulocyty a monocyty. Druhý způsob je imunitní odpověď (tvorba protilátek nebo přímé působení krevní buňky a cizí buňku nebo částici), kterou způsobují lymfocyty. Tyto mechanismy se často kombinují [1][2].
Krevní destičky (trombocyty) -
účastní se při zástavě krvácení a regeneraci cév
1.2.3 Hemoglobin (červené krevní barvivo) Přenos kyslíku tělesnými tekutinami je dán jeho rozpustností ve vodě, která je poměrně malá. Proto v tělních tekutinách živočichů nacházíme dýchací barviva. U člověka je to hemoglobin. Lidský hemoglobin je složitá krevní bílkovin. V celkovém objemu krve je asi 750 g hemoglobinu. V jednom erytrocytu je přibližně 3 x 108 molekul hemoglobinu. Hemoglobin tvoří 80 – 90 % sušiny červené krvinky a 34 % její hmotnosti. V krvi se množství hemoglobinu udává v g/l.
13
Fyziologické hodnoty: Tabulka č. 3 – fyziologické hodnoty hemoglobinu
muži 135 – 172 g/l ženy
120 – 162 g/l
Všechny hemoglobiny mají v podstatě stejnou strukturu. Hemoglobin je tetramerní molekula složená ze 4 globulinových řetězců a 4 hemů. Globinové řetězce jsou bílkoviny složené z aminokyselin. Řetězce se vzájemně liší počtem a sledem aminokyselin. Hem je ferroprotoporfyrin. Základem molekuly hemu je protoporfyrin, který v organismu vzniká odbouráváním
některých
aminokyselin.
Působením
enzymu
ferrochelatázy
se
do
protoporfyrinu včelní 4 vazbami železo a vzniká hem. Základní funkcí hemoglobinu je přenos kyslíku z plic do tkání. Kyslík je vázán v hemu jen 1 vazbou, a proto se snadno uvolňuje. Přenos kyslíku do tkáně se nazývá oxygenace. Naopak vyvázání kyslíku z hemu
se nazývá deoxygenace. Na každý hem
v molekule hemoglobinu se naváže jedna molekula kyslíku. Jedna molekula hemoglobinu tedy naváže 4 molekuly kyslíku. Molekuly kyslíku se navazují postupně. Na 1 g hemoglobinu se váže 1, 35 ml kyslíku. U člověka může hemoglobin navázat až 200 ml kyslíku v jednom litru krve. Další funkcí hemoglobinu je odvod CO2 z tkání. Hemoglobin odvádí asi jen 30 % z celkového množství CO2. Většina CO2 se váže na pufrační systémy krve a pomáhá tak udržet její acidobazickou rovnováhu. Hemoglobin může na sebe vázat i další látky např. CO, který má 300x silnější afinitu k hemoglobinu než kyslík a je tedy pro člověka silně jedovatý. Další látky: S, NO, Fe [1].
14
2. Cíle práce Cílem práce je popsat a vyjasnit princip fungování hematologického analyzátoru. Bylo nutné prostudovat základní teoretické znalosti v oblasti krve a krevních buněk a jejich klinický význam. Dále zjištění metod, které hematologický analyzátor používá při svém vyhodnocování. Z těchto znalostí sestrojit měřící soustavu, která je vhodná pro stanovení alespoň jednoho hematologického parametru v laboratorních podmínkách, a vytvořit software pro automatickou detekci krevních buněk.
15
3. Současný stav řešení 3.1 Hematologické analyzátory Počet krvinek se v současné době měří na hematologických analyzátorech, které dnes poskytují až 24 parametrů. Tabulka č. 4 – Parametry přístroje Abacus 5 Tabulka převzata z [3].
16
Výhodou těchto analyzátorů je jejich rychlost, přesnost, spolehlivost a poměrně malé množství krve potřebné k vyšetření. V analyzátorech dochází nejprve k tomu, že se buňky pomocí speciálního systému řadí tak, aby byla pokud možno měřena jen jedna buňka. Současně dochází k ředění krevního vzorku, který se rozdělí do dvou cest. V jedné cestě se počítají erytrocyty a trombocyty (výraznější ředění), ve druhé cestě se po určité úpravě vzorku počítají leukocyty a zjišťuje se jejich rozpočet (méně výrazné dělení). Některé z parametrů se měří přímo, některé se zjišťují výpočtem z hodnot naměřených parametrů. K měření parametrů krevní buněk se na automatických analyzátorech používá buď kapilární, nebo žilní krev, která se odebírá za standardních podmínek. Jako antikoagulační přísady se využívá solí kyseliny etylendiaminotetraoctové (K3EDTA a K2EDTA). Rozdíl mezi těmito substancemi je v pH, které tyto látky vytváří v systému odebrané krve. pH K3EDTA se blíží fyziologické hranici pro pH krve, zatímco pH K2EDTA se pohybuje lehce nad hodnotou 5. Rozdíly jsou i ve fyziologickém působení na krevní buňky a v rozpustnosti obou solí [2].
3.2 Principy počítání krevních částic 3.2.1 Optické metody Počítání krvinek pomocí mikroskopu Tato metoda je nejjednodušší metodou počítáni krvinek. Krvinky se počítají v Burkerově komůrce. Burkerova komůrka je 0,5 cm tlusté sklo na němž se nacházejí dva počítací prostory. Dna těchto prostorů jsou pokryta jemnými velmi přesnými vrypy. Počítací prostory jsou oproti okolí snížené. Jednotlivými vrypy a tímto snížením je vytvořen prostor, v němž se krevní elementy počítají. Počítací prostor je rozdělen vrypy na různá čtvercová pole. Principem metody počítání v Burkerově komůrce je prosté sečtení všech krevních buněk ve známém objemu. Toto číslo se pak vztáhne na objem referenční (1 litr nebo 1 ml). U počítání červených krvinek se k ředění používá Hayemovův roztok (vodný roztok chloridu rtuťného, chloridu sodného a síranu sodného). Ten erytrocyty ještě zvýrazní a ostatní elementy rozruší. U bílých krvinek použijeme Türkův roztok (vodný roztok genciánové 17
violeti a octové kyseliny). Ten leukocyty obarví fialově a krev naředí. Po naředění krve kápneme kapku krve na počítací prostor. Červené krvinky počítáme v malých čtvercích (viz obrázek č. 4), bílé krvinky ve čtvercích větších (viz obrázek č. 5).
Obrázek č. 4 – počítací prostor pro
Obrázek č. 5 – počítací prostor pro
erytrocyty
leukocyty
Obrázek převzat z [4].
Obrázek převzat z [4].
Pokud se krevní buňky dotýkají hran čtverce, do celkového součtu se započítávají pouze buňky dotýkající se dvou sousedních hran. Ty, které se dotýkají zbylých dvou hran, nepočítáme.
Obrázek č. 6 – Způsob počítání krvinek (Světlé krvinky se počítají, tmavé nikoliv) Obrázek převzat z [4].
18
Tato metodika ztratila po zavedení automatických analyzátorech krve klinický význam. Je však stále validní a v případě nedostupnosti technického vybavení kdykoliv jednoduše použitelná [4].
Cytometrie Tato optická metoda obsahuje laserový zdroj. Ten osvětluje krevní buňky, které jsou ve speciálním zařízení řazeny jednotlivě za sebou. Za krevními buňkami je umístěn optický detektor. Změna intensity laserového paprsku přicházejícího z buněk, určuje objem a strukturu buňky. Počet pulsů je úměrný počtu částic a intensita každého pulsu je úměrná objemu a granularity krevní buňky. Světelný paprsek procházející skrz buňky se rozptýlí. Tento rozptyl záleží na vnitřní a vnější struktuře buňky. Vnější struktura buňky (a její velikost) způsobuje malý úhlový rozptyl. Vnitřní struktura buňky způsobuje vysoký úhlový rozptyl. Tyto rozdílné rozptyly nám zachytí optický senzor a dostaneme dva nezávislé parametry [3]. Tato metoda se nejčastěji používá pro počítání a rozlišení bílých krvinek.
Obrázek č. 7 – Princip cytometrie Obrázek převzat z [3].
19
Obrázek č. 8 – Rozptyl paprsku Obrázek převzat z [3].
Obrázek č. 9 – Rozptylový diagram Obrázek převzat z [3]. 20
3.2.2 Další metody Spektroskopie, Impedanční (Coulterova) metoda, Centrifugační princip s fluorescencí
4. Použité metody Z předchozích teoretických znalostí bylo rozhodnuto pro sestrojení měřící aparatury, která se skládá ze světelného mikroskopu napojeného na počítač přes CCD kameru. Počítač řídí jak intenzitu světelného zdroje mikroskopu, tak automaticky detekuje po zpracování obrazu přes CCD kameru krevní částice na vzorku. Při použití této aparatury se tedy použije principu optické metody pro počítání krevních částic, a to konkrétně metoda počítání krvinek na mikroskopu. Vylepšení této metody tkví v tom, že vyhodnocovatel nemusí krvinky sám počítat, ale krvinky jsou automaticky detekovány a spočítány počítačem.
Obrázek č. 10 – Měřící soustava
21
5. Experimentální část 5.1 Mikroskop Byl použit mikroskop Meopta. Mikroskop se skládá ze světelného zdroje, z mechanické části, a to konkrétně ze stativu, tubusu, stolkem s křížovým posunem a dvěma kolečky pro horizontální posun stolku a z optické části a to z objektivu.
Obrázek č. 11 – Mikroskop s CCD kamerou
22
Světelný zdroj Jako světelný zdroj byla použita halogenová žárovka. Při osvětlování bylo použito jak osvětlení skrz vzorek, tak osvětlení epiluminiscenční (je použit odraz světla ze vzorku). Mechanická část
Stativ zajišťuje stabilitu přístroje. Tubus zajišťuje, aby CCD kamera byla umístěna ve fokální vzdálenosti od objektivu. Optická část Mikroskop má čtyři objektivy o hodnotách zvětšení 4:1, 45:1, 10:1 a 100:1. Na náš experiment byl použit objektiv se zvětšením 10:1.
5.2 CCD kamera CCD kamera byla pořízena od firmy Thorlabs. Je přidělána na mikroskop a připojena na počítač přes USB 2.0 konektor.
Obrázek č. 12 – CCD kamera 23
5.3 Ovládací a vyhodnocovací software Software pro ovládání mikroskopu a vyhodnocení vzorku byl sestrojen pomocí programovacího jazyka LabVIEW 2011(National Instruments, Texas, USA). Software obsahuje sběr a následný přepis dat z dvou kanálů, které nám představují intenzitu obou světelných zdrojů. Přepis dat je možný pomocí dvou otočných šroubů nebo dvou digitálních číselníků, na kterých jde nastavit přepočtená hodnota od 0 V do 3 V, zobrazovaná vpravo od otočných šroubů.
Další součást softwaru je zobrazení vzorku a automatická detekce částic. Na konzoli je vidět snímek zobrazovaný mikroskopem s vyznačenými detekovanými buňkami a jejich celkový počet ve snímku. Jezdec se stupnicí vlevo od snímku nastavuje expozici snímku.
Obrázek č. 13 – Ovládací konzole
24
5.4 Zpracování obrazu Pro zpracování obrazu bylo použito metody HDR (High dynamic range). Jedná se o metodu vysokého dynamického rozsahu. Princip této metody je zpracovat nejméně tři snímky do jednoho, z čehož jeden snímek je přeexponovaný, druhý normální a třetí podexponovaný. Zpracování této metody bylo provedeno v programovacím jazyku Matlab. Ve výsledném obrazu se automaticky zdetekují krevní částice. Program na detekci je svázaný s programem LabVIEW.
Obrázek č. 14 – Princip HDR
25
Obrázek č. 15 – Detekce buněk
26
Závěr Podařilo se sestrojit měřící přípravek používající optické metody pro detekci buněk. Měřící přípravek se skládá z mikroskopu a z CCD kamery připojené na počítač. Byl naprogramován vyhodnocovací software, který řídí intenzitu světelného zdroje na mikroskopu a vlastnosti CCD kamery. Ze tří různě exponovaných snímků byl vytvořen jeden HDR snímek a z něj byly detekovány částice. Přípravek je vhodný na experimentální použit.
27
Seznam použité literatury
[1] PECKA, Miroslav – Laboratorní hematologie v praxi: Buňka a krvetvorba. FINDIR, s.r.o., Český Těšín, 2002. ISBN 80-86682-01-3 [2] PECKA, Miroslav – Laboratorní hematologie v praxi: Fyziologie a patofyziologie krevní buňky. FINDIR, s.r.o., Český Těšín, 2006. ISBN -86682-02-1
[3]
Abacus 5, Hematology Analyzer, User’s manual, 2010
[4] FRANĚK, Miloslav – VACULÍN, Šimon – Fyziologie a klinická fyziologie: Principy a praktická cvičení. R. B. C., Praha, 2009. ISBN 978-80-2545409-1
28
