ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2011
Michal Kysel
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky
Koagulometr Týmový projekt
Vedoucí projektu: MUDr. Marián Liberko Student: Michal Kysel
leden 2012
Abstrakt Práce je členěná do dvou částí a to teoretické a praktické. V teoretické části je vše potřebné pro získání základních znalostí a povědomí o koagulaci krve, ovlivňujících faktorech, detekčních metodách a jednotlivých typech koagulometrů. V experimentální části se práce zabývá přípravou, realizací a vlastním měřením PT (protrombinový čas) a APTT (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) na komerčně dostupném koagulometru ST4 firmy Diagnostica STAGO, včetně realizace softwaru pro grafické zobrazení průběhu detekce vzniku koagula. Klíčová slova: koagulace krve, koagulační faktory, detekční metody, koagulometr, PT (protrombinový čas), APTT (aktivovaný parciální tromboplastinový čas), ST4, koagulum
ii
Annotation This work is divided into two parts - theoretical and practical. The theoretical part is all you need to acquire the basic knowledge and awareness of blood coagulation, influencing factors, detection methods and different type of coagulometers. In the experimental part of the work deals with the preparation, implementation and measurement of PT (prothrombin time) and APTT (activated partial thromboplastin time) on the commercially available coagulometer ST4 by Diagnostica STAGO company and this part includes the implementation of software for the graphis representation of clot detection.
Keywords: blood coagulation, influencing factors, detection methods, coagulometer, PT (prothrombin time), APTT (activate partial thromboplastin time) ST4, clot
iii
Poděkování V úvodu této práce bych rád poděkoval Ing. Romanu Matějkovi za velkou podporu a vzorné vedení při realizaci této práce, v oblasti techniky, a také za množství dobrých rad a nápadů, které mi velmi usnadnili celou práci a rovněž vedoucímu mé práce MUDr. Mariánu Liberkovi, za odborné rady, kontrolu a dohled nad klinickou částí této práce. Dále bych rád poděkoval svému otci, Mgr. Michalu Kyselovi, za odborné konzultace, podporu a pomoc, kterou mi v průběhu celé realizace neustále poskytoval. V neposlední řadě bych pak rád poděkoval svému kolegovi Tomáši Neubertovi za pomoc při testování a prvotním opravování a čištění koagulometru a pak bych také chtěl poděkovat Bc. Ondřeji Čadkovi, který mi pomohl a naučil mnoho věcí především v oblasti elektrotechniky Za překladatelskou pomoc zde musím rovněž poděkovat svému příteli Jakubu Špiříkovi.
iv
Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem „Koagulometr“ vypracoval samostatně a použil k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb.,
o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).
V ……………. dne ………………
……………………. Podpis
v
Obsah OBSAH ................................................................................................................................................................ VI SEZNAM ZKRATEK ....................................................................................................................................... VII ÚVOD..................................................................................................................................................................... 9 HISTORIE .......................................................................................................................................................... 11 1.
CÍLE PRÁCE .............................................................................................................................................. 13 SOUČASNÝ STAV V OBLASTI DETEKCE KOAGULA ........................................................................ 14
2. .......................................................................................................................................................................... 14 2.1. METODY STANOVENÍ .........................................................................................................................................14 2.1.1. Koagulační .......................................................................................................................................................14 2.2. PRINCIPY STANOVENÍ.....................................................................................................................................16 2.2.1. Manuální metody ..........................................................................................................................................16 • • •
2.2.2. • • • •
2.2.3. 3.
Přístrojové elektromechanické principy ............................................................................................16
Háčkové................................................................................................................................................................................................16 Viskozitní.............................................................................................................................................................................................16 Vibrační ................................................................................................................................................................................................16 Kuličkové .............................................................................................................................................................................................17
Přístrojové optické principy .....................................................................................................................19
KOAGULACE KRVE A MOŽNOSTI JEJÍHO OVLIVNĚNÍ ........................................................ 20 3.1. PŘEHLED KOAGULAČNÍCH FAKTORŮ: ............................................................................................................. 20 3.2. KOAGULACE KRVE ..............................................................................................................................................21 3.2.1. Vnitřní systém: ................................................................................................................................................21 3.2.2. Zevní systém (viz obr. 1) .............................................................................................................................22 3.2.3. Společný systém .............................................................................................................................................22 3.2.4. Poslední fáze koagulačních dějů ............................................................................................................23 3.3. ŘÍZENÍ HEMOKOAGULACE .................................................................................................................................24 3.4.
4.
Naklánění zkumavky ......................................................................................................................................................................16 Rotace zkumavky .............................................................................................................................................................................16 Háčkování............................................................................................................................................................................................16
• Proud krve ..........................................................................................................................................................................................24 • Souvislý neporušený cévní endotel ..........................................................................................................................................24 • Nejdůležitější a nejpřesnější je inhibice humorální, .........................................................................................................24 [1] ....................................................................................................................................................................................................................25 UMĚLÉ OVLIVNĚNÍ SRÁŽENÍ KRVE ............................................................................................................ 25 • Defibrinace .........................................................................................................................................................................................25 • Zamezení kontaktu..........................................................................................................................................................................25 • Dekalcifikace ......................................................................................................................................................................................25 • Hirudin .................................................................................................................................................................................................25 • Podání heparinu ...............................................................................................................................................................................25 • Kumarin a jeho deriváty................................................................................................................................................................25
TESTY KE STANOVENÍ KOAGULAČNÍHO ČASU ............................................................................ 28 4.1. TROMBOPLASTINOVÝ TEST (PROTROMBINOVÝ TEST - PT, QUICKŮV TEST) ........................................... 29 4.1.1. Reagencie:.........................................................................................................................................................29 • • •
Rekombinantní PT reagencie ......................................................................................................................................................29 Tkáňové tromboplastiny ..............................................................................................................................................................29 Kombinované tromboplastiny....................................................................................................................................................29
• •
Reakční směs .....................................................................................................................................................................................31 Startovací reagencie .......................................................................................................................................................................31
4.1.2. Abnormální hodnoty PT se nachází: ....................................................................................................30 4.2. APTT (APTT - AKTIVOVANÝ PARCIÁLNÍ TROMBOPLASTINOVÝ TEST) .................................................... 31
vi
•
4.2.1. • • •
4.2.2. 4.2.3. 3.
4.
Hodnoty kontrolní plasmy ...........................................................................................................................................................31
Reagencie:.........................................................................................................................................................31
Kontaktní aktivátory ......................................................................................................................................................................31 Fosfolipidy ..........................................................................................................................................................................................31 Ca2+ .........................................................................................................................................................................................................31
Odlišení mezi nedostatečností faktorů a inhibitory nebo LA (lupus antikoagulans) ....32 Abnormální hodnoty APTT .......................................................................................................................32
MOŽNOSTI OVLIVNĚNÍ KOAGULAČNÍCH VYŠETŘENÍ ............................................................... 33 3.1. NEJČASTĚJŠÍ CHYBY PŘI ODBĚRECH KRVE ...................................................................................................... 33 3.2. APTT (28,0 – 40,0 S) ......................................................................................................................................35
KLINICKÝ VÝZNAM ............................................................................................................................... 35 4.1. DISEMINOVANÁ INTRAVASKULÁRNÍ KOAGULACE (DIC) ............................................................................. 35 4.1.1. Onemocnění s častým výskytem DIC: ...................................................................................................37 4.1.2. Diagnostika:.....................................................................................................................................................37 4.2. TROMBOFILNÍ STAVY .........................................................................................................................................37 4.2.1. Diagnóza ...........................................................................................................................................................37 4.2.2. Léčba ...................................................................................................................................................................38
5.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ..................................................................................................................... 39 5.1. ÚKONY NUTNÉ PŘED SAMOTNÝM MĚŘENÍM .................................................................................................. 39 5.1.1. Zkontrolování stavu a kompletnosti koagulometrů ..........................................................................39 5.1.2. Čištění .................................................................................................................................................................42 5.1.3. Sestavení funkčního koagulometru .........................................................................................................43 5.2. PRINCIP MĚŘENÍ .................................................................................................................................................44 5.3. PŘÍPRAVA PLAZEM PRO MĚŘENÍ ......................................................................................................................48 5.3.1. Doporučený postup pro odběr a zpracování krve ..........................................................................48 5.4. SAMOTNÉ MĚŘENÍ PT ....................................................................................................................................49 5.4.1. Postup .................................................................................................................................................................49 5.4.2. Výsledek měření .............................................................................................................................................50
6.
SOFTWARE .............................................................................................................................................. 51
ZÁVĚR .............................................................................................................................................................. 52 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY............................................................................................................... 54
vii
Seznam zkratek Přehled koagulačních faktorů: Symbol
význam
FI
Faktor I (fibrinogen)
F II
Faktor II (protrombin)
F III
Faktor III (tkáňový tromboplastin)
F IV
Faktor IV (vápenaté ionty Ca2+)
FV
Faktor V (proakcelerin)
F VI
Faktor VI
F VII
Faktor VII (prokonvertin)
F VIII
Faktor VIII (antihemofilický faktor)
vWF
von Willebrandův faktor
F IX
Faktor IX (Christmasův faktor)
FX
Faktor X (Stuartův-Prowerův faktor)
F XI
Faktor XI (Plasma Thromboplastin Antecedent)
F XII
Faktor XII (Hagemanův faktor)
F XIII
fibrin stabilizující faktor
HMWK
High Molecular Weight Kininogen
F XIV
Faktor XIV (protein C)
Ca2+
Vápenaté kationty
PT
Protrombinový čas
Fbg
fibrinogen
APTT
aktivovaný parciální tromboplastinový čas
CPU deska
Procesorová deska (Central Processing Unit)
RAM
Paměť s přímým přístupem (random-access memory)
A/D převodník
Analogově-digitální převodník
FFT
Rychlá Fourierova transformace (Fast Fourier Transformation)
vii
Úvod K vybrání této práce mne vedl zájem o problematiku hemokoagulace, kterou ve mne probudil otec svým vyprávěním o DIC (diseminovaná intravaskulární koagulopatie) Tento týmový projekt by měl vyústit do bakalářské a diplomové práce. Na jeho základě by měly být vytvořeny učební pomůcky pro studenty Fakulty biomedicínského inženýrství a na těchto učebních pomůckách by měli studenti pochopit, že i takto sofistikovaný přístroj se dá sestavit takříkajíc „na koleně“ a měli by pochopit, že to co je uvnitř přístrojů není nic záhadného a magického, ale že jsou to pouze části, které již znají a během svého studia (z části i vlastním zájmem a pílí se o problematice, probírané na přednáškách a cvičeních, dozvědět i z jiných zdrojů) se o nich dozvídají veškeré potřebné informace pro jejich obsluhu či opravu. Ještě v úvodu bych si dovolil citovat definice hemostázy a hemokoagulace, aby čtenář této práce byl s rozdílností obou pojmů seznámen hned na začátku (a ulehčil jsem mu tak orientaci v následujícím textu) a hned poté vysvětlit, k čemu je dobré se zabývat problematikou hemokoagulace. Hemostáza čili zástava krvácení je životně důležitý děj, který chrání organismus před přílišnou ztrátou krve či dokonce vykrvácením při poranění. Hemostáza spočívá v realizaci a vzájemné souhře těchto dějů: 1. Reakce cév v místě poranění (vazokonstrikce) 2. Činnost krevních destiček (jejich nahromadění v místě poranění a změny, které vedou k vytvoření hemostatické zátky. 3. Srážení krve (interakce plazmatických faktorů končící vytvořením fibrinu a definitivního trombu) K těmto třem základním dějům můžeme připojit čtvrtý, časově vzdálenější, kdy se trombus odstraní fibrinolýzou a aktivitou fibroblastů a hladkých svalových buněk se poranění zahojí. [1] Hemokoagulace je soubor mechanismů, při kterých se zejména uplatňuje plazmatický koagulační systém. [2] Hemokoagulace a její měření je důležitou součástí vyšetření krve, ať už celkového krevního obrazu nebo přímo specializovaného hemostatického či hemokoagulačního vyšetření.
9
Význam znalosti hemokoagulace je jak preventivní, tak i diagnostický, neboť na základě použité metody jsme schopni zjistit, zda-li (a případně co) je v nepořádku v naší koagulační kaskádě. Díky vyšetřením si tak lékaři mohou potvrdit své domněnky ohledně nemocí jako je thrombofilie, DIC a dalších.
10
Historie Pravděpodobně první odkaz na koagulaci byl vytvořen Hippokratem. Zjistil, že krev získaná z obětovaného zvířete ztuhla po ochlazení. Pokud bylo krví třeseno během odběru a odstranila se vznikající vlákna, krev zůstala tekutá. William Harvey, který objevil krevní oběh, připsal její srážení tzv „smrti“ krve. Roku 1718 C. Helveticus pronesl, že krev mimo tělo je vystavená vzduchu, který způsobí srážení. Vpichoval vzduch do žil zvířat a poté nacházel thromby. Teplotu a srážení krve k sobě opět přiblížil Von Haller, který vyslovil domněnku, že teplo udržuje krev tekutou. J. Butt tento výrok nevyvrátil, jen jej upravil na tvar, že krev v odstraněné žíle se nezačne srážet, dokud nebude schlazená. Konečně nějaké vyvrácení dosavadních myšlenek přinesl až Moscati, který vyvrátil výroky, že ochlazení způsobí srážení a pohyb zabraňuje srážení. Významnější objev pak uskutečnil Polli, jež objevil, že krev se normálně sráží jak na vzduchu, tak v kyslíku či dusíku. Koagulace ale byla oddálena oxidem uhličitým obsaženým v atmosféře. [3] V roce 1832 identifikoval Johannes Muller nerozpustnou substanci v krevní sraženině „fibrin“ a známý patolog Rudolf Virchow pojmenoval jeho hypotetický solubilní plazmatický prekurzor „fibrinogen“. Fibrinogen byl poprvé izolován Prosperem Sylvainem Denisem v roce 1856. Alexander Schmidt poté demonstroval, že transformace fibrinogenu na fibrin je enzymatický proces a enzym, který se na něm podílí, pojmenoval trombin; ve Virchovowě duchu také nazval jeho plazmatický prekurzor protrombin. [5] V roce 1890 Nicolas Maurice Arthus objevil antikoagulační efekt citrátu a oxalátu a ukázal, že nezbytnou podmínkou srážení krve je přítomnost iontů vápníku. Některé procesy, které vedou ke srážení krve se povedlo vysvětlit až ve 20. století. [3, 5] V roce 1905 navrhl Morawitz základní hemostatické schéma, ve kterém se uplatňovali 4 koagulační faktory (Morawitz, 1905): Fibrinogen (F I), Protrombin (F II), Tromboplastin (F III), Ca2+ (F IV) V této první ucelené představě o srážení krve vystupují pouze 4 faktory. Později byla objevena řada dalších koagulačních faktor. Bylo sjednoceno jejich názvosloví a většina jich 11
byla označena římskými číslicemi (které však nevyjadřují sled dějů). U aktivovaných faktorů se připojuje k číslici malé a. [2] Na základě této teorie vyvinul Armand Quick na začátku 30. let tzv. „protrombinový čas“ - dnes široce rozšířený test v klinické praxi, který se používá jako screeningový test a pro monitorování efektu warfarinové terapie. Quickův test také přispěl k objevu plazmatických koagulačních faktorů V, VII a X. Další testy vyvinuté ve stejném období vedly k poznání, že přímým proteolytickým aktivátorem protrombinu je enzym faktor Xa. Další práce pak ukázaly, že několik kroků koagulační kaskády se normálně odehrává na povrchu krevních destiček, může k nim však docházet i na povrchu dalších buněk. [5] MacFarlene rozšířil představu Morawitzovu o další cestu aktivace. V systémech in vitro vytvářel umělé podmínky, při kterých předpokládal odhalení subendotelových struktur. Kontaktem s těmito strukturami při tzv. kontaktní fázi se aktivoval F XII. Tato aktivní složka (F XIIa) spustila následnou kaskádovitou reakci, během které se aktivovaly další faktory (F XI, F IX a F X). Proces srážení MacFarlene chápal jako sérii reakcí, která vedla k tvorbě trombinu a následně k přeměně fibrinogenu na fibrin (MacFarlene 1964). Složky, které se na hemostáze podílely, označil jako faktory plazmatického koagulačního systému. Krevní srážení bylo posuzováno jako komplexní děj, ve kterém se plně uplatňují vzájemné interakce buněčných a plazmatických systémů, jež jsou přítomny v krvi a cévní stěně. Krevní srážení je dáno především interakcí mezi systémem krevních destiček, systémem plazmatických a koagulačních faktorů, systémem inhibitorů krevního srážení, fibrinolýzou a cévní stěnou. Kromě těchto základních systémů se na srážení krve podílí i erytrocyty, leukocyty, systémy adhezivních molekul a integrinů a dále produkty lipidového metabolismu. Celý proces vytváří řetězce reakcí, založených na vzájemné aktivaci a inhibici, ovlivněný a kontrolovaný více mechanismy. Účelem těchto dějů je udržení dynamické rovnováhy, neboť její rozkolísání může vést ke vzniku závažných klinických projevů. [2]
12
1. Cíle práce Cílem práce bylo prostudování principů koagulace krve, možností jejího ovlivnění a klinický význam jejího stanovení. Dalším cílem pak bylo prostudování současných možností měření faktorů koagulace krve a komerčně dostupné koagulometry. V experimentální části je cílem navrhnutí a vytvoření jednoduchého přípravku pro stanovení koagulačních faktorů krve v laboratorních podmínkách. Tím pádem bylo nutné navrhnout: •
Výběr a použití vhodných reaktantů
•
navrhnout vhodnou metodu pro jejich automatickou detekci
•
vytvořit software, který by umožňoval automatickou detekci
13
2. Současný stav v oblasti detekce koagula 2.1. Metody stanovení 2.1.1. Koagulační Jednotlivé složky koagulačního systému jsou přítomny v plazmě většinou ve formě neaktivních složek - proenzymů (zymogenů). Aby mohl proběhnout srážecí proces je nutné tyto složky aktivovat. Používají se tyto aktivátory: • Nefyziologické: silika, kaolin, celit •
Fyziologické:
tkáňové extrakty nebo čištěné či rekombinantní aktivované koagulační faktory •
Specifické:
zmijí enzymy (jedy). Tyto mají svá omezení. Některé hadí enzymy nejsou závislé na inhibitorech a aktivují nejen proenzymy (zymogeny), ale i PIVKA formy těchto koagulačních faktorů. Hadích jedů je možné využít i k inaktivaci inhibitorů proteáz, které by jinak v systému běžných koagulačních testů mohly interferovat s některými složkami systému a vykazovat prodloužené hodnoty koagulačních časů. Enzymatické cesty (zejména oblast působení serinových proteáz) vyžadují nejen aktivované faktory, ale i aktivované kofaktory a dále fosfolipidy a vápníkové ionty. Jedná se tedy většinou o velmi komplexní směsi relativně nestabilních proteinů. Takovýto nestabilní systém lze jen obtížně standardizovat. Princip Techniky využívané u koagulačních vyšetření spočívají v tom, že se měří reakční čas od spuštění reakce až po vytvoření zjistitelného koagula nebo fibrinového vlákna. Naměřené časy se porovnávají s časy standardní poolové normální kontrolní plazmy v komerčním provedení (ISO 9001) [2] Detekce • • • •
Vizuální Optické
Elektrické
Magnetické
14
15
2.2. Principy stanovení Koagulační čas je doba, která uplyne od přidání reagencie až po vytvoření prvního fibrinového vlákna.
2.2.1. Manuální metody •
Naklánění zkumavky
pozorujeme vznik sraženiny, používá se např. pro rekalcifikační čas plazmy nebo plné krve •
Rotace zkumavky
Rychlé otáčení zkumavky kolem vlastní osy. Pozorujeme vznik obláčku (hada) uprostřed zkumavky. Tato metoda je přesnější než naklánění zkumavky, ale přesto je stále velmi nepřesná. Používá se např. pro stanovení indexu tolerance heparinu. •
Háčkování
Jde o první skutečně laboratorně použitelnou metodu s dostatečnou citlivostí a přesností. Reakční směsí (která je v teplé lázni) protahujeme háček a pozorujeme vznik koagula na háčku. Výhodou je jednoduché a levné vybavení, nevýhodou pak velká spotřeba reagencií, subjektivní ovlivnění a velký vliv koncentrace fibrinogenu.
2.2.2. Přístrojové elektromechanické principy •
Háčkové
Využívají vyšší vodivosti fibrinového vlákna. Jedna elektroda je pohyblivá, druhá statická. Při pohybu se vytvoří fibrinové vlákno, které vodivě spojí obě elektrody a zaznamená se čas. Výhody: relativně přesné, málo citlivé na koncentraci fibrinogenu, detekují opravdu první fibrinové vlákno. Nevýhody: komplikovaná a jemná mechanika, pracné čištění, velký objem reagencií. •
Viskozitní
Měří se změna viskozity reakční směsi, která ovlivňuje průchod detektoru. Citlivost je nepřímo úměrná hybnosti detektoru. •
Vibrační
Snímá se frekvence vibrujícího plátku pomocí elektromagnetické detekce. Výhodou jsou malá závislost na koncentraci fibrinogenu a poměrně velká citlivost. Nevýhodami jsou pracná manipulace s plátky, nebezpečí kontaminace vzorků a drahý provoz.
16
•
Kuličkové
Většinou jsou detektorem ocelové kuličky, které někdy mají specifický potah na povrchu. U ocelových kuliček je velké riziko zmagnetizování a tím získání nereprodukovatelných výsledků. Je více způsobů použití kuliček jako detektoru. Jejich přehled společně s příkladem koagulometru, který jej využívá je v následující tabulce (Tabulka 1 - Varianty použití kuličky jako detektoru).
17
Varianty použití kuličky jako detektoru
Přístroj
Kulička
Pohyb
Detekce
kývavý, pomalý Hyland
velká
nahoru/dolů
magnetická
ve zkumavce
pomalý Amelung KC
Benk CL
velká
malá
rotující kyveta
magnetická
malá
- kulička prochází celým objemem - nejsou mrtvá místa v kyvetě
- kulička prochází většinou objemu
s trnem uprostřed
- odolné proti rušení
rychlý
- nižší objem reagencií
rotující kulička
optická
rychlý, kývavý Stago ST
Výhody
ze strany na stranu „kolejničky pro pohyb kuličky
elektromagnetická
Tabulka 1 - Varianty použití kuličky jako detektor
18
- střední citlivost na fibrinogen (od 1,2 g/l - nižší objem reagencií - vysoká citlivost na fibrinogen (0,3 g/l)
Nevýhody - obrovská spotřeba reagencií - malá citlivost (Fibrinogen od 1,5 g/l) - velká spotřeba reagencií - malá citlivost (Fibrinogen od 1,5 g/l) - citlivý na rychlost tvorby koagula - kulička se pohybuje na okraji reakčního objemu (tuneluje) - „prokluzování“ u silně lipemických vzorků
2.2.3. Přístrojové optické principy Neměří vznik samotného koagula, ale měří pouze vznik zákalu. Jejich princip spočívá v průchodu světelného záření kyvetou, která na fotodetektor propouští / odráží jen určité množství záření. K výpočtu času se používá různých algoritmů. Konečný bod měření se počítá ze změny absorbance a odrazu světelného paprsku, nebo se využívá jen předdefinované změny absorbance (30mA nad základní linii optické hustoty), nebo se vychází z derivace křivky světelné hodnoty, popřípadě se určuje rozdíl předa po koagulaci Koagulometry používající derivaci k určení konečného bodu měření detekují velmi časné koagulační změny a poskytují relativně krátké časy srážení. Vzhledem
k nepohyblivým
částem
jsou
konstrukčně
jednodušší
než
mechanické
koagulometry a mají také menší riziko poruchy, naopak jsou kladeny velké požadavky na udržování optiky v naprosté čistotě a mají problém při pomalém vzniku koagula. Jsou citlivé na rychlost tvorby koagula (nízký fibrinogen, přítomnost inhibitorů - heparin). Problém také nastává při zabarvení plasmy (ikterické, chylózní, hemolytické či lipemické). [2], [4], [6]
19
3. Koagulace krve a možnosti jejího ovlivnění V úvodu této kapitoly je přehled faktorů, které se vyskytují při koagulační kaskádě (popsaná níže) a které můžeme pomocí různých metod a principů (viz kap. 2) za použití testů (viz kap. 4) detekovat a měřit.
3.1. Přehled koagulačních faktorů: •
Faktor I - fibrinogen - je velký rozpustný protein.
•
Faktor II - protrombin - je α2-globulin. Při aktivaci je z něj odštěpován lehký Nterminální řetězec.
•
Faktor III - tkáňový tromboplastin neboli tkáňový faktor je transmembránový apoprotein, který nabude koagulační aktivity spojením s membránovým fosfolipidem. Vyskytuje sen a buňkách, s nimiž přijde krev vyroněná z protržené cévy do styku.
•
Faktor IV - vápenaté ionty (Ca2+) - tvoří asi 50% plazmatického kalcia. Jsou nezbytné pro většinu interakcí v koagulační kaskádě.
•
Faktor V - proakcelerin - je kofaktorem v komplexu aktivátoru protrombinu.
•
Faktor VI - neuvádí se, původně šlo o aktivovaný faktor V
•
Faktor VII - prokonvertin - aktivuje v komplexu zevního systému faktor X.
•
Faktor VIII - bývá označován jako antihemofilický faktor. Chybění této složky je nejčastější vrozenou poruchou koagulace a označuje se jako hemofilie A. Uplatňuje se jako regulační faktor (kofaktor) ve vnitřním systému koagulační kaskády.
•
Von Willebrandův faktor - velký glykoprotein, který se váže na povrch aktivovaných destiček a účastní se jejich adheze na kolagen.
•
Faktor IX - Christmasův faktor - je proenzym, který po aktivaci v komplexu s F VIIIa, F X, F 3 a Ca2+ přeměňuje F X na F Xa.
•
Faktor X - Stuartův-Prowerův faktor - je centrem v řetězu reakcí při tvorbě protrombinového aktivátoru.
•
Faktor XI - Plasma Thromboplastin Antecedent - patří mezi proenzymy kontaktního systému.
•
Faktor XII - Hagemanův faktor - stojí na začátku vnitřního systému (tzv. fáze kontaktu).
20
•
Faktor XIII - fibrin stabilizující faktor - podněcuje tvorbu kovalentních vazeb mezi molekulami fibrin-monomeru a tím vytvoření fibrinové sítě.
•
Prekalikerin - Je součástí kontaktního systému. Jako enzym podporuje další aktivaci F XII a i F XI.
•
HMWK = High Molecular Weight Kininogen (kininogen o vysoké molekulové hmotnosti) - je kofaktorem ve fázi kontaktu na začátku vnitřního systému.
•
Faktor XIV - takto někdy bývá označován protein C (spolu s proteinem S). Protein C je proenzym antikoagulační serinové proteázy, protein S je jeho kofaktor.
Všechny koagulační faktory (kromě F III a F IV) jsou glykoproteiny a patří mezi plazmatické globuliny. Tvoří se v játrech (v. W. Faktor je syntetizován endotelovými buňkami a megakaryocyty) a tvorba faktorů II, VII, IX, X a XIV je závislá na vitaminu K. [1]
3.2. Koagulace krve 3.2.1. Vnitřní systém: Začátek řetězu dějů ve vnitřním systému (viz obr. 1) představuje kontakt s negativně nabitým povrchem: se strukturami, obnaženými při poranění nebo poškození cévní stěny (kolagen, bazální membrána), ale i s fosfolipidy destiček. Fáze kontaktu spočívá v komplexní interakci mezi tímto povrchem a čtyřmi proteiny: Hagemanovým faktorem (XII), prekalikreinem, faktorem XI a HMW-kininogenem. Stykem s negativně nabitým povrhem dojde k autoaktivaci faktoru XII; XIIa aktivuje prekalikrein na kalikrein, který recipročně aktivuje další F XII. Tím se vytvoří dostatečné množství XIIa pro rychlou aktivaci faktoru XI. Úloha HMW-kininogenu spočívá v tom, že přináší do tohoto místa prekalikrein a faktor XI. Úkolem faktoru XIa je aktivovat F IX. Faktor IX může být aktivován za přítomnosti Ca2+ nejen faktorem XIa, ale i aktivačním komplexem zevního systému (viz obr. 1). Faktor IXa pak aktivuje faktor X v aktivačním komplexu (viz obr. 1), jehož členy jsou F IXa, F VIIIa, destičkové fosfolipidy (d. f. 3) a Ca2+. Tento komplex konvertuje Stuartův-Prowerův faktor (X) na Xa. K celému ději aktivace faktoru X v uvedeném komplexu může dojít nejen na povrchu destiček, ale i na buňkách cévního endotelu. [1] 21
Obrázek 1 - sled dějů při srážení krve. Obrázek převzat z [1]
3.2.2. Zevní systém (viz obr. 1) Zatímco aktivace F X ve vnitřním systému zahrnuje celou řadu interakcí mezi více faktory a je relativně pomalá, je přeměna X na Xa účinkem zevního systému rychlá. Zevní systém je tvoře F III (tkáňovým tromboplastinem), faktorem VII a vápenatými ionty. Tkáňový faktor je kofaktorem pro F VII a váže se s ním v komplex. Tato vazba je potřebná pro aktivaci F VII. [1]
3.2.3. Společný systém Vnitřní a zevní systém konvergují (viz obr. 1) do jednotného sledu dějů, který začíná aktivací F X. Faktor Xa je jediný známý enzym, který štěpí peptidické vazby protrombinu a přeměňuje ho na trombin. Optimální funkce F Xa probíhá v asociaci s dalšími složkami: s F V, fosfolipidy (d. f. 3) a Ca2+. Enzymem v tomto komplexu je Xa, proteinovým potencujícím kofaktorem je Va, který má vysokou afinitu ke kyselým membránovým fosfolipidům (d. f. 3). Trombin čili IIa je účinný proteolytický enzym s velmi úzce vymezenou substrátovou specifitou. Je to klíčový a terminální enzym celého koagulačního mechanismu (viz obr.1 a obr. 2) Trombin nejen přeměňuje fibrinogen na fibrin, ale aktivuje i faktory VIII, V a XIII, účastní se aktivace krevních destiček a vazbou na membráně endotelových buněk umožňuje aktivovat 22
hlavní antikoagulační faktor - protein C na C aktivní (který pak inaktivuje faktory Va a VIIIa) [1]
Obrázek 2 - Přehled účinků trombinu při hemostáze (upraveno podle Besta a Taylora, 1991). Převzato z [1]
3.2.4. Poslední fáze koagulačních dějů Zahrnuje štěpení fibrinogenu na fibrin a jeho stabilizaci. Trombin atakuje aminoterminální části α- a β-řetězců a uvolňuje dvojici malých fibrinopeptidů A a B. Řetězec γ se tohoto děje neúčastní (viz obr. 3). Zbylá molekula α2β2γ2) se nazývá fibrin-monomer. Odstraněním fibrinopeptidů se zpřístupní komplementární místa molekul a umožní se spontánní polymerace fibrinových monomerů nekovalentními vazbami. Tento fibrin-polymer se ještě může depolymerovat. Nyní zasahuje aktivní fibrin stabilizující faktor čili F XIIIa, který stabilizuje za přítomnosti Ca2+ fibrinový polymer tvorbou kovalentních vazeb mezi γ- a α-řetězci sousedních molekul. Faktor XIII se aktivuje vlivem trombinu za přítomnosti Ca2+. Stabilizovaný fibrin je pevnější, elastičtější a odolnější vůči působení fibrinolytických činidel. Síť fibrinových vláken pak zpevňuje destičkový trombus a vytvoří „definitivní“ hemostatickou zátku. Do prostorové fibrinové sítě se zachycují krvinky. Ukládání fibrinu v místě poranění přispívá k tkáňovým reparačním procesům. Jestliže necháme krev srazit v nádobě, nastane po určité době retrakce koagula a z huspeninovité tmavočervené sraženiny se vytlačí krevní sérum. Sérum má stejné složení jako plazma, ale postrádá některé faktory (I, II, VIII a XIII), které byly při srážení konzumovány. Retrakci působí v energeticky dependentní reakci kontraktilní elementy destiček. [1]
23
Obrázek 3 - Schéma molekuly fibrinogenu. Převzato z [1]
3.3. Řízení hemokoagulace Celý koagulační komplex závisí na soustavě chemických signálů, které modulují příslušné odpovědi ve smyslu zachování tekuté krve v intaktních cévách a prevence jejích ztrát při zranění. Hovoříme o fluido-koagulační rovnováze. To znamená, že řídící mechanismy operují nejen spouštěcími, ale i inhibičními signály, které musejí být s aktivačními v rovnováze. Krevní sraženina musí zůstat omezena na místo poranění a srážení nesmí pokračovat ani v prostoru, ani v čase. Porucha tohoto vysoce integrovaného systému vede buď k trombóze, nebo ke krvácení. Inhibiční systém: •
Proud krve
sám o sobě omezuje propagaci sraženiny, ředí koagulační faktory a odplavuje je z místa poranění. •
Souvislý neporušený cévní endotel
neumožňuje spuštění sledu dějů ani v zevním, ani ve vnitřním systému. Produkuje látky s vasodilatačním, antiadhezním a antikoagulačním účinkem. •
Nejdůležitější a nejpřesnější je inhibice humorální,
která zahrnuje řadu negativních zpětných vazeb a specifické inhibitory. Smyslem protisrážlivých dějů je odstranění a inaktivace koagulačních faktorů, především trombinu. Toto spočívá v jeho vazbě na destičky, endotelové a jiné buňky v místě poranění, v jeho inkorporaci do fibrinové sraženiny a v jeho inaktivaci plazmatickými inhibitory proteáz. 24
Vazba trombinu na fibrin a jeho inkorporace do sraženiny je příkladem zpětné vazby, kdy konečný produkt celého procesu srážení-fibrin-má silnou afinitu pro trombin a reverzibilně jej váže. [1]
3.4. Umělé ovlivnění srážení krve Pro laboratorní účely, nebo za určitých, zejména chorobných okolností musí lékař hemokoagulaci omezit nebo zcela znemožnit. K tomu se používají protisrážlivá činidla: •
Defibrinace
je umělé odstranění fibrinu z krve in vitro (mechanicky například šleháním; též se používají preparáty některých hadích jedů) •
Zamezení kontaktu
pomocí nádobky s nesmáčivým povrchem. •
Dekalcifikace
Působením šťavelanu draselného (nebo amonného) se vysrážením vápenatých solí vyřadí Ca2+. Podobným dekalcifikačním činidlem je citrát (sodný, amonný nebo draselný). S plazmatickým kalciem tvoří nedisociované vápenaté sloučeniny a vyvolává tak nedostatek Ca2+. Citráty jsou výhodnější než oxaláty, protože nejsou toxické. •
Hirudin
je látka ze slinných žláz pijavic (Hirudo medicinalis). Je to protein účinkující jako vysoce specifický inhibitor trombinu. •
Podání heparinu
které je ovšem účinné pouze tehdy, je-li v krvi přítomen antitrombin III •
Kumarin a jeho deriváty
Blokují v játrech fyziologické účinky vitamínu K (viz obr. 4); syntéza faktorů II, VII, IX a X je defektní, faktory se dostávají do krve, ale jsou neúčinné, protože nemohou vázat Ca2+. Krevní srážení naopak podporují: přidání tkáňového faktoru, trombinu, pektinových látek, některých hadích jedů, hypertonické roztoky, zvýšení teploty aj. [1]
25
Obrázek 4 - Význam vitaminu K pro tvorbu koagulačních faktorů. Obrázek převzat z [1]
26
4.
27
Test y ke stanovení koagulačního času V tradičním pohledu na koagulaci je koagulační kaskáda zahajována ve dvou téměř nezávislých systémech, které se podílejí na aktivaci faktoru X. Vnější koagulační systém se spouští uvolněním tkáňového faktoru a lze ho sledovat protrombinovým časem. Vnitřní koagulační systém je aktivován kontaktem se smáčivou plochou a laboratorně je hodnotitelný aktivovaným parciálním tromboplastinovým časem. Aktivace faktoru X, která zahajuje tvorbu fibrinu, je společnou částí koagulační kaskády. Přirozené inhibitory koagulace slouží k restrikci koagulačního procesu, k lokalizaci cévního poškození a chrání nepoškozené cévy proti trombóze. [7]
28
Obrázek 5 - Schéma aktivace plazmatických koagulačních faktorů. Obrázek převzat z [2]
4.1. Tromboplastinový test (Protrombinový test - PT, Quickův test) Test zavedl v roce 1935 Armand Quick. Sledovaný systém: vnější cesta aktivace přeměny protrombinu na trombin (viz obr. 5 část B). Zachycuje tyto složky koagulačního systému: faktory II, V, VII, X a fibrinogen. Reakční směsí je vyšetřovaná plasma, do které se jako startovací reagenci přidává tromboplastin smíchaný s kalciem. Hodnoty kontrolní plasmy jsou v rozmezí 12-15 sekund. Fyziologické hodnoty kontrolní plasmy jsou ± 20 %. [2]
4.1.1. Reagencie: •
Rekombinantní PT reagencie
obsahují: rekombinantní tkáňový faktor, ionty Ca2+, fosfolipidy, pufr a stabilizátory. •
Tkáňové tromboplastiny
obsahují relativně málo čištěný extrakt z tkání bohatý na tkáňový faktor (většinou z králičího mozku nebo lidské placenty) a ionty Ca2+. •
Kombinované tromboplastiny
obsahují: tkáňový tromboplastin (např. z hovězího mozku ředěný ve fibrinogenové frakci 29
(bohaté nebo chudé na f.F V)), obvykle obsahují absorbovanou hovězí plazmu a ionty Ca2+. Tyto preparáty se většinou využívají při antikoagulační terapii. [2]
4.1.2. Abnormální hodnoty PT se nachází: •
U vrozených nebo získaných nedostatečností faktorů: II, V, VII, X a fibrinogenu
•
Při orální antikoagulační léčbě
•
Při nedostatku vitaminu K
•
U jaterních nemocí (z poklesu faktorů protrombinového komplexu)
•
Jsou-li přítomny protilátky proti faktorům nebo lupus antikoagulans
[2]
30
4.2. APTT (APTT - aktivovaný parciální tromboplastinový test) APTT uvedl do klinické praxe Proctor a Raparot (1961) Sledovaný systém: vnitřní cesta aktivace přeměny protrombinu na trombin (viz obr. 8 část A). Zachycuje tyto složky koagulačního systému: faktory II, V, VIII, IX, X, XI, XII, fibrinogen, prekalikerin a HMWK. •
Reakční směs
vyšetřovaná plasma, fosfolipidy, aktivátor •
Startovací reagencie
chlorid vápenatý •
Hodnoty kontrolní plasmy
24-42 sekund podle použitého systému (povrchový aktivátor + fosfolipidy) [2] Aktivátor
Čas [s]
kaolin
36-42
silica
30-36
polyfenoly
28-34
kyselina elagová
24 - 30
4.2.1. Reagencie: •
Kontaktní aktivátory
zahrnují: negativně nabité povrchy, jako jsou kaolin, křemičitany, elagová kyselina, polyfenoly nebo sulfatidy (negativně nabité sulfátové lipidy) kombinované s kaolinem. •
Fosfolipidy
zahrnují: syntetické fosfolipidy, fosfolipidy izolované ze zvířecích tkání (např. králičí mozek) nebo fosfolipidy z rostlin (např. sója). Obvykle se používají směsi různých fosfolipidů, které mají optimální složení a zastoupení hlavně fosfatidylserinu. Typ a koncentrace fosfolipidů je pro provedení důležitější, než negativně nabité povrchy. Reagenční profil však určuje spíše kombinace obou složek společně s iontovou silou pufrovacího systému a stabilizátory. •
Ca2+
důležitou úlohu může hrát i molarita roztoku chloridu vápenatého. [2] 31
4.2.2. Odlišení mezi nedostatečností faktorů a inhibitory nebo LA (lupus antikoagulans) Je-li zvýšená hodnota APTT testu, provede se směsný test s normální plasmou (1:1). Dojde-li k normalizaci času, jedná se nejspíše o nedostatečnost některého z faktorů. (snížená koncentrace nebo změna v molekule faktoru). Je-li čas APTT i po směsném testu abnormální, může jít o přítomnost inhibitorů proti některému z faktorů vnitřní cesty aktivace přeměny protrombinu na trombin nebo o přítomnost protilátek typu lupus antikoagulans. [2]
4.2.3. Abnormální hodnoty APTT •
Zkrácené časy
•
Trombotické stavy
•
Prodloužené časy
•
Vrozené nebo získané nedostatečnosti F VIII (mohou být i při deficitu vWF)
•
Nedostatečnost faktorů IX, XI, případně i dalších, vyjma faktory VII a XIII
•
Terapie nefrakcionovaným heparinem, hirudinem a aprotininem
•
Disfibrinogenemie nebo afibrinogenemie
[2]
32
5. Možnosti ovlivnění koagulačních vyšetření Možnost ovlivnění výsledků koagulačních vyšetření je téměř na každé úrovni od odběru vzorku až po jeho vyhodnocení a předání lékaři. „60% falešných laboratorních výsledků v koagulační analytice má za příčinu nesprávně provedený odběr“ Lechner 1980 [9]
5.1. Nejčastější chyby při odběrech krve • Dlouhodobé stažení paže nebo cvičení se staženou paží dochází ke zvyšování koncentrace draslíku, mění se poměr vody a rozpuštěných látek • Dlouhá doba mezi odběrem a oddělením krevních buněk od plazmy řada látek včetně enzymů může přejít z krvinek do plazmy, dochází k částečnému rozrušení krvinek. • Hemolýza vadí většině hematologických vyšetření. Může být vyvolána: použitím nestandardní nebo prošlé odběrové soustavy • Použitím tenké jehly Kterou se krev násilně nasává • Prudkým třepáním krve např. ve zkumavce nebo během transportu (potrubní pošta) • Uskladněním krve v lednici • Dlouhou dobou mezi odběrem a dodáním materiálu do laboratoří [8] Další, velmi „nenápadnou“ chybou, která ale může velmi závažně ovlivnit výsledky, je odběr krve ve špatném poměru k antikoagulačnímu činidlu (nejčastěji se používá citrát sodný)
33
Obrázek 6 - Příklad odběru pro stanovení tzv. velké koagulace – PT, aPTT, TT, Fbg, AT III a D-dimerů. Obrázek převzat z [9]
Obrázek 7 - Porovnání správného a chybného odběru po centrifugaci. Obrázek převzat z [9]
34
5.2. aPTT (28,0 – 40,0 s) Na grafu je jasně viditelné, že nedodržení správného poměru protisrážlivého činidla a krve 1:10 pro vyšetření aPTT vede ke zkreslení výsledků a to směrem k hodnotám patologickým. [9] Změna je v tomto případě téměř o 10% směrem k patologickým hodnotám
Obrázek 8 - Porovnání výsledků měření aPTT pro různé poměry odběru. Obrázek převzat z [9]
6. Klinický význam Klinický význam znalosti krevní srážlivosti je především v prevenci a léčbě poruch hemostázy, při předoperačních vyšetřeních a dalších vyšetřeních, která lékaři provádějí. V této kapitole se budu zabývat některými nemocemi, které mi přišli zajímavé a týkají se srážlivosti krve.
6.1. Diseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) představuje získanou koagulační poruchu, při které dochází k významné k ativaci hemostázy s tvorbou nitrocévních mikrotrombů v tkáních, spotřebě koagulačních faktorů, aktivaci sekundární fibrinolýzy a tendenci ke krvácení nebo k významnému klinickém krvácení. Syndrom DIC je průvodním jevem závažných stavů v řadě lékařských oborů a je výsledkem významného rozkolísání fluidokoagulační rovnováhy. 35
DIC je limitujícím faktorem pro nemocném v šokovém stavu, neboť nepříznivě působí svými patofyziologickým mechanizmy na rozvoj krvácivého stavu, současnou blokádu mikrocirkulace a blokádu retikuloendotelového systému. Přítomnost známek DIC u nemocných v šokovém stavu významně zvyšuje mortalitu. V patofyziologii syndromu DIC hraje podstatnou roli přítomnost trombinu a plazminu v cirkulaci. [7]
36
6.1.1. Onemocnění s častým výskytem DIC: •
Porodnické a gynekologické komplikace
•
Úrazy - crush syndrom
•
Reakce antigen-protilátka
•
Infarkt myokardu, plicní embolie a další
[7]
6.1.2. Diagnostika: DIC představuje dynamicky se vyvíjející stav. Diagnostika DIC se opírá o řádné zhodnocení anamnézy, klinického nález a provedení poměrně jednoduchých laboratorních testů. Diagnóza DIC musí být stanovena rychle, a proto všechny testy, které se k diagnostice DIC používají, musí mít povahu statimových testů. [7]
6.2. Trombofilní stavy Trombofilní stavy, charakterizované příhodami intravaskulární trombózy, představují opak stavů krvácivých, při kterých se hemostatická rovnováha narušuje směrem protipólným. Obecně jejich příčina může tkvět v postižení cévní stěny, v poruše hemodynamiky, destičkových funkcí a v narušení hemostatických činitelů plazmatických. Vrozené trombofilní stavy jsou přesně definované a jejich klinický obraz je charakterizován především žilními trombózami v neobvyklých místech, žil nitrolebečních, vena hepaticae, vena portae a jejich přítokových větví. Arteriální trombózy bývají vzácnější. Žilní trombózy se zde dostavují již v mladším věku, před 45. rokem a často recidivují. Bývá pozitivní rodinná anamnéza. Příčinou vrozených trombofilních stavů bývá defekt koagulačních faktorů. Se získanými trombofilními stavy, které často bývají komplexnější geneze, se setkáváme u pokročilých jaterních onemocnění (defekt syntézy), nefrotického syndromu, u zhoubných nádorových procesů, pooperačním období... [7]
6.2.1. Diagnóza trombofilních stavů se zakládá na laboratorních vyšetřeních. [7]
37
6.2.2. Léčba trombofilních stavů, zvláště vrozených, tkví v prevenci. U lehčích forem, za rizikových situací (operace, těhotenství a porod) jsou podávána antikoagulancia nebo heparin. U těžkých forem může být prevence celoživotní. [7]
38
7. Experimentální část K provedení měří jsme použili 2 vyřazené nekompletní koagulometry ST4 (Diagnostica STAGO, Francie). Veškeré úkony na těchto přístrojích byly prováděny v rukavicích, čištění a samotné měření pak bylo vykonáváno i v plášti.
7.1. Úkony nutné před samotným měřením 7.1.1. Zkontrolování stavu a kompletnosti koagulometrů K tomu nám sloužil servisní manuál [10], který nám zapůjčila firma A.L.Instruments, Český Těšín, podle kterého jsme dokázali určit chybějící díly, jejich vlastnosti a zapojení. Největším problémem hned ze začátku byla absence spínaného zdroje, který nebyl ani v jednom z koagulometrů. Další nedostatky v hardwerovém vybavení obou koagulometrů již nebyly tak závažné, neboť byly přítomny alespoň v jednom z obou strojů, takže jsme mohli následně poskládat 1 funkční koagulometr.
Obrázek 9 - Vnitřek nekompletního koagulometru (chybí trafo, tiskárna...)
39
Před dalším krokem bylo nutné zjistit, v jakém funkčním stavu jsou veškeré komponenty v obou přístrojích. Největší překážkou v tomto ohledu byla absence spínaného zdroje, který jsme ovšem nahradili stejnosměrným zdrojem Agilenet E3631A. Řešení tohoto problému bylo následující - rozebrání přívodních kabelů, které měly být zapojeny do chybějícího spínaného zdroje a jejich vyvedení na zdroj Agilent E3631A.
Obrázek 10 - příprava náhradního zdroje pomocí přístroje Agilent E3631A
Úskalí tohoto řešení bylo ovšem v nedostatečné energii pro koagulometr, což bylo patrné na málo kontrastním displeji. Přístroj po zapnutí provádí rychlý scan vybavení.
Obrázek 11 - Vlastní test přístroje - úspěšný
40
Druhý koagulometr jsme zprovoznili bypassem z prvního, abychom nerozebírali do té doby fungující přístroj.
Obrázek 12 - Zprovoznění druhého koagulometru pomocí bypassu
41
7.1.2. Čištění Vzhledem k použití koagulometrů v infekčním prostředí hematologických laboratoří, bylo nutné provést čištění vnitřku i vnějšku koagulometrů pomocí přípravku Skinsept F (čistícího nepolárního vodou ředitelného přípravku na bázi alkoholu), abychom minimalizovali možnost nakažení. Veškeré komponenty byly vyjmuty, popsány (aby nedošlo k chybnému zapojení při jejich zpětné montáži) a očištěny. Tato práce byla vykonávána v rukavicích a ochranných prostředcích.
Obrázek 13 - extrakce dílů z koagulometru ST4 pro následující očištění
42
7.1.3. Sestavení funkčního koagulometru Vzhledem k úspěšnému dokončení veškerých předcházejících úkonů, jsme v tomto okamžiku mohli začít sestavovat z veškerých dostupných komponentů funkční koagulometr. Díky ochotě a spolupráci s Mgr. Michalem Kyselem se nám podařilo získat jeden funkční originální spínaný zdroj, který jsme mohli hned namontovat do koagulometru a mít tak naprosto kompletní přístroj připravený k měření.
Obrázek 14 - pohled na kompletní, již vyčištěný, sestavený a připravený koagulometr
43
Princip měření
7.2.
Je založen na detekci změny viskozity testované plazmy. Jako detektor slouží ocelová kulička (ball), která se rovnoměrným kývavým pohybem pohybuje (osciluje) po zakřiveném dnu kyvety (cuvette). K dosažení rovnoměrného pohybu slouží 2 excitační cívky (driving coil), které jsou napájeny střídavým napětím které tvoří elektromagnetické pole, skrze které se rozkmitá kulička. Jako senzor pro snímání pohybu jsou použity 2 cívky, které jsou zapojeny jako vysílač a přijímač (transmitting coil, receiving coil). [10]
44
Tyto 4 cívky dohromady tvoří 1 měřící hlavu.
Obrázek 15 - Uspořádání cívek v měřící hlavě. Obrázek převzat z
[10]
V okamžiku, kdy plasma začne koagulovat (což je výsledkem koagulačního procesu, který byl aktivován přidáním startovacích reagencií) se začne zvyšovat viskozita plasmy což ovlivňuje pohyblivost kuličky. Kulička se začne zpomalovat a také se zmenšuje amplituda její oscilace. Celou dobu je kulička snímaná detekčními cívkami a její pohyb je vyhodnocován algoritmem, který poté vypočte příslušnou hodnotu koagulačního času. [10]
45
Obrázek 16 - Oscilace a změna amplitudy v čase T při koagulaci. Obrázek převzat z [10]
Signály získané na přijímací cívce prochází řetězcem zpracování signálu před převodem do desky CPU, která signál vyhodnotí. Signály procházejí nejprve dvojí filtrací a pak selektivním zesílením. Pro některá měření, v našem případě pro měření P Ta APTT, musí být reagencie i plazma vytemperovány na 37°C. K tomu sloužá komory, které ovládá teplotní deska. Tyto komory se vyhřejí na definovanou teplotu, která je závislá na zvolené metodě testu a pak tuto teplotu udržují teplotní senzory. [10]
46
Obrázek 17 - Měřící blok (inkubace 16 kyvet se vzorky, 4 kyvety měření)
47
7.3. Příprava plazem pro měření Plazmu pro naše testovací měření (byla použita metoda PT) jsme získali z odběru vlastní krve do zkumavky Vacuette s 0,129M citrátem sodným
Obrázek 18 - Odběr krve pro první měření PT
Centrifugování proběhlo na centrifuze MIKRO 200R od firmy Hettich Zentrifugen při 2500g. Centrifugace byla provedena ve 4 micro-zkumavkách Eppendorf o objemu 1,5ml. Pro pipetování krve byla použita pipeta FINNPIPETTE F2 od firmy Thermo Scientific (dávkování 10-100μl). Pro další měření jsme použili standardní plazmy (splňující ISO 9001).
7.3.1. Doporučený postup pro odběr a zpracování krve K odběrům pro přípravu plazem se používá výhradně nádobek z umělé hmoty (polyetylén, polypropylén) nebo silikonované sklo. Nesilikonované sklo nelze použít, protože skleněný povrch je významných aktivátorem funkce krevní destičky a plazmatického koagulačního systému. Citrátová plazma chudá na obsah krevních destiček (Plateled poor plasma - PPP) Příprava PPP z odběru citrátové krve (koagulační vyšetření). Do zkumavky s 1 dílem 0,129 (0,106) mol/l citrátu sodného se odebere 9 dílů krve.
48
Obsah zkumavky se několikerým převrácením promísí a centrifuguje standardním způsobem (20 °C, 2500 g, 15 min). Plazma se oddělí od sedimentovaných krvinek a pokud se nepoužije bezprostředně k vyšetření je možné plazmu zamrazit při teplotě -60 až -80 °C. Zamražená plazma musí být nejméně 15 min před testem vytemperována na laboratorní teplotu a jemně promísena. [8]
7.4. Samotné měření PT K měření jsme použili naši připravenou plazmu (viz kap. 7.2) a sadu činidel Néoplastine® Cl Plus, což obsahuje • Činidlo 1: Néoplastine® Cl Plus • Činidlo 2: rozpouštědlo, které obsahuje vápník
7.4.1. Postup Předehřáli jsme činidlo 1 na 37°a následně jsme ho smíchali s činidlem 2 tak, že jsme lahvičku s činidlem 2 přelili do lahvičky s činidlem 1. Výsledný roztok jsme nechali 30 minut stabilizovat při pokojové teplotě a pak lehce promíchali k získání homogenní suspenze. 0,1 ml plazmy jsme napipetovali do kyvet a nechali inkubovat přibližně 2 minuty. Poté jsme zahájili start měření, což rozpohybovalo detekční kuličky a přidali jsme 0,2 ml namíchaného roztoku z lahvičky pro činidlo 1 automatickou pipetou. Viděli jsme, jak po krátké době začal roztok koagulovat (tuhnout) až se kuličky zastavili úplně zastavili a koagulometr vytiskl výsledek měření.
Obrázek 19 - Zkoagulovaná plazma (kyvety otočeny dnem vzhůru)
49
Obrázek 20 - Výsledná zpráva o koagulačním čase pro PT pro 1. měření
7.4.2. Výsledek měření Odměřili jsme PT s časem 15,1 sekundy, což je hodnota, která je stále v normě dle kap. 4.1 normální hodnota, která je ovšem ji žna hranici horní meze pro patologický stav
Diskuse Tyto hodnoty mohl způsobit např. fakt, že jsme použili koncentrovanější roztok citrátu sodného než je uvedený pro námi použité reagencie, nepřesnost při prvním měření (z důvodu nervozity a nedostatečných zkušeností). Další možnou chybou měření může být i neprovedení kalibrace přístroje, které ovšem není v našem případě možné a mělo by být provedené zkušeným servisním technikem.
50
8. Software Software na snímání signálů z cívek (přiložen na CD) pro PC byl vytvořen pomocí programovacího nástroje LABVIEW 2011 (National Instruments, Texas, USA). Software obsahuje sběr dat ze 4 kanálů, které snímají napětí v cívkách (2 kanály pro excitační cívky a 2 kanály pro detekční cívky). Graf „Faz. posuv“ nám ukazuje fázový posuv mezi jednotlivými kanály. Graf „FFT“ nám signál po úpravě Fourierovou transformací (FFT) vykreslí, takže je možné porovnávat jednotlivá napětí. Graf „Phase“ nám ukazuje opět fázi mezi signály (opět jsou všechny signály upravené pomocí FFT) Start a konec snímání signálů se nastavuje pomocí triggeru (trigger delay), který slouží jako obsluha digitálních portů, v našem případě vstupů.
Obrázek 21 - Software na snímání signálů z příravku
51
Závěr Povedlo se mi sestavit a zprovoznit jeden funkční koagulometr ST4, který jsem sestavil z dílů 2 koagulometrů stejného typu. Zároveň jsem ověřil jeho funkčnost a princip jeho detekce při jeho zapojení a odměření kontrolního vzorku. Dokázal jsem použít vyšetřovací metodu, stanovení protrombinového času, ve školních podmínkách s relevantním výsledkem, který vyšel (viz Obrázek 20) 15,1 sekundy. Do bakalářské práce bych rád sestavil koagulometr tak, aby byla vidět celá cesta, která je potřeba k měření a detekci a studentům ji tak náztorně ukázat, aby jim bylo umožněno nahlédnout do „útrob“ přístroje. Studenti by poté měli vidět veškeré bloky, které se na detekci podílejí a měli by pochopit, že přístroj není pouze „blackbox“, který vykoná práci, kterou mu zadáme, ale že je sestaven z obvodů a částí, které již znají, a že při troše snažení si mohou podobný přístroj sestavit téměř „na koleně“.
52
Seznam příloh TABULKA 1 - VARIANTY POUŽITÍ KULIČKY JAKO DETEKTOR ................................................................................................................18 OBRÁZEK 1 - SLED DĚJŮ PŘI SRÁŽENÍ KRVE. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [1] ..............................................................................................22 OBRÁZEK 2 - PŘEHLED ÚČINKŮ TROMBINU PŘI HEMOSTÁZE (UPRAVENO PODLE BESTA A TAYLORA, 1991). PŘEVZATO Z [1] ............................................................................................................................................................................................................23 OBRÁZEK 3 - SCHÉMA MOLEKULY FIBRINOGENU. PŘEVZATO Z [1] ...................................................................................................24 OBRÁZEK 4 - VÝZNAM VITAMINU K PRO TVORBU KOAGULAČNÍCH FAKTORŮ. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [1] .................................... 26 OBRÁZEK 5 - SCHÉMA AKTIVACE PLAZMATICKÝCH KOAGULAČNÍCH FAKTORŮ. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [2] .................................. 29 OBRÁZEK 6 - PŘÍKLAD ODBĚRU PRO STANOVENÍ TZV. VELKÉ KOAGULACE – PT, APTT, TT, FBG, AT III A D-DIMERŮ. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [9] ................................................................................................................................................................34 OBRÁZEK 7 - POROVNÁNÍ SPRÁVNÉHO A CHYBNÉHO ODBĚRU PO CENTRIFUGACI. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [9] ............................. 34 OBRÁZEK 8 - POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ MĚŘENÍ APTT PRO RŮZNÉ POMĚRY ODBĚRU. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [9] ......................... 35 OBRÁZEK 9 - VNITŘEK NEKOMPLETNÍHO KOAGULOMETRU (CHYBÍ TRAFO, TISKÁRNA...) .............................................................39 OBRÁZEK 10 - PŘÍPRAVA NÁHRADNÍHO ZDROJE POMOCÍ PŘÍSTROJE AGILENT E3631A...............................................................40 OBRÁZEK 11 - VLASTNÍ TEST PŘÍSTROJE - ÚSPĚŠNÝ .............................................................................................................................40 OBRÁZEK 12 - ZPROVOZNĚNÍ DRUHÉHO KOAGULOMETRU POMOCÍ BYPASSU ..................................................................................41 OBRÁZEK 13 - EXTRAKCE DÍLŮ Z KOAGULOMETRU ST4 PRO NÁSLEDUJÍCÍ OČIŠTĚNÍ .....................................................................42 OBRÁZEK 14 - POHLED NA KOMPLETNÍ, JIŽ VYČIŠTĚNÝ, SESTAVENÝ A PŘIPRAVENÝ KOAGULOMETR .......................................... 43 OBRÁZEK 15 - USPOŘÁDÁNÍ CÍVEK V MĚŘÍCÍ HLAVĚ. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [10] ...........................................................................45 OBRÁZEK 16 - OSCILACE A ZMĚNA AMPLITUDY V ČASE T PŘI KOAGULACI. OBRÁZEK PŘEVZAT Z [10]....................................... 46 OBRÁZEK 17 - MĚŘÍCÍ BLOK (INKUBACE 16 KYVET SE VZORKY, 4 KYVETY MĚŘENÍ) .....................................................................47 OBRÁZEK 18 - ODBĚR KRVE PRO PRVNÍ MĚŘENÍ PT ............................................................................................................................48 OBRÁZEK 19 - ZKOAGULOVANÁ PLAZMA (KYVETY OTOČENY DNEM VZHŮRU) ................................................................................49 OBRÁZEK 20 - VÝSLEDNÁ ZPRÁVA O KOAGULAČNÍM ČASE PRO PT PRO 1. MĚŘENÍ ........................................................................50 OBRÁZEK 21 - SOFTWARE NA SNÍMÁNÍ SIGNÁLŮ Z PŘÍRAVKU ............................................................................................................51
53
Seznam použité literatury [1]
TROJAN, Stanislav. Lékařská fyziologie. 4. vyd. přepr. a dopl. Praha: Grada
Publishing, 2003, 771 s. ISBN 80-247-0512-5. [2]
PECKA, Miroslav, William L NICHOLS a E BOWIE. Laboratorní hematologie v
přehledu: fyziologie a patofyziologie hemostázy. 1. vyd. Český Těšín: FINIDR, 2004, 237 s. ISBN 80-866-8203-X. [3]
OWEN, Charles A, William L NICHOLS a E BOWIE. A history of blood coagulation:
pro nelékařské zdravotnické obory. 1. vyd. Rochester, Minn.: Mayo Foundation for Medical Education and Research, c2001, 355 s. ISBN 18-930-0590-9. [4]
KYSEL M.: Principy detekce koagula 2009, Hematologický seminář, Plzeň,
18.9.2009
[5]
Historie, současnost a budoucnost antikoagulační léčby – 1. část - Kardiologie - ZDN.
VĚTROVSKÝ, Tomáš. Zdravotnické noviny [online]. 5.12.2003 [cit. 2011-11-9]. Dostupné z: http://www.zdn.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/historie-soucasnost-a-budoucnostantikoagulacni-lecby-1-
[6]
N. A. Dobrovol'skii, P. R. Kostritso, T. A. Labinskaya, V. V. Makarov and A. S.
Parfenov, et al. Biomedical Engineering, 1999, Volume 33, Number 1, Pages 44-47 [7]
NAVRÁTIL, Leoš. Vnitřní lékařství: pro nelékařské zdravotnické obory. 1. vyd. Praha:
Grada, 2008, 424 s. ISBN 978-802-4723-198. [8] PECKA, Miroslav: Přehled laboratorní hematologie IV. Český Těšín: FINIDR, 2000, 142 s. ISBN 80-7262-076-2
[9]
Přednášky z odborných akcí | Dialab. MALÍKOVÁ, I, D DRÁBKOVÁ a P
LINHARTOVÁ. Dialab [online]. 31.10.2007 [cit. 2011-11-9]. Dostupné z: http://www.dialab.cz/data/sharedfiles/Prednasky_z_odbornych_akci/I_Malikova_2.ppt 54
[10] DIAGNOSTICA STAGO. Service manual ST4 BIO. 1.0. 1994 [cit. 2011-11-19]. Cat. No.: 28214.
55
