AKTUALITY ŠUMAVSKÉHO VÝZKUMU
s. 129–133
Srní 2.– 4. dubna 2001
Elektroforetická laboratoř NP Šumava, její role a výsledky při výzkumu genetické diverzity smrku ztepilého na Šumavě a v ČR Jiří Mánek Správa NP a CHKO Šumava, 1. máje 260, CZ–385 01 Vimperk, Česká republika
Úvod Koncem roku 1998 byla v Kašperských Horách uvedena do provozu elektroforetická laboratoř za účelem výzkumu genetické diverzity populací lesních dřevin. Ačkoli je Správa NP Šumava nakloněna výzkumu v celé jeho šíři a také se jej snaží podporovat, není apriori výzkumným ústavem, který by ze své podstaty měl provádět výzkum na úrovni molekulární genetiky. Z této skutečnosti se také odvíjela mimořádná náročnost prvotního získávání finančních prostředků na budování laboratoře a dále také smysluplných projektů. Přesto se díky sdružení finančních prostředků z několika zdrojů podařilo laboratoř zprovoznit. Na prvním místě je třeba jmenovat grant GEF (ROUDNÁ & PRCHALOVÁ 1996), ze kterého se podařilo získat rozhodující částku. Svým podílem samozřejmě přispěla Správa NP Šumava, dále některé drobné granty MŽP, ale podíl na spuštění laboratoře má také Správa KRNAP. Ačkoli byla laboratoř budována především (možná výhradně) pro účely studia genetické diverzity lesních dřevin v rámci Šumavy, pracujeme dnes v celorepublikovém měřítku. Na této skutečnosti se významně podílí fakt že ještě v roce 1998 nebyla v ČR jediná laboratoř, která by se věnovala problematice molekulární genetiky aplikované na divoce rostoucí a hospodářsky využitelné lesní dřeviny. Proto byly veškeré informace o genetické struktuře populací lesních dřevin ČR naprosté tabu a to i přes významný fakt, že v ostatní Evropě se těchto metod používalo již téměř tři desítky let! Vyjímkou v poznání genetické variability lesních dřevin ČR bylo několik jednotlivých studií, kdy materiál z českých populací studovali zahraniční kolegové (LONGAUER 1996, VYŠNÝ & al. 1994). Nebo se jednalo o drobné studie našich vědců jako třeba (BUSINSKÝ & WEGER 1995). Vedle našeho pracoviště se této problematice plným úvazkem v ČR věnují laboratoře při VÚLHM Jíloviště–Strnady, kde zatím sledovali smrk, borovici, lípu a třešeň (IVANEK 2000). Dalším subjektem je laboratoř VÚKOZ Silva Tarouca v Průhonicích, kde se v současnosti věnují studiu topolu a dubu prostřednictvím mikrosatelitových DNA markerů (POSPÍŠKOVÁ & al. 2000). Díky smluvní spolupráci mezi Správou NP Šumava a Zemědělskou fakultou JU v Českých Budějovicích, je do výzkumu genetické diverzity smrkových populací v ČR (analýzy DNA založené na RAPD) zapojena také genetická laboratoř katedry pícninářství této fakulty.
129
Řešené úkoly V laboratoři v Kašperských Horách se od roku 1999 řeší úkol „Genetická diverzita smrku ztepilého ve ZCHÚ ČR a identifikace ohrožených populací jako podklad pro záchranná opatření.“ Cílem tohoto krátkého sdělení je referovat o výsledcích získaných především z oblasti Šumavy. V roce 2000 přibyl naší laboratoři úkol „Inventarizace a genetická diverzita tisu červeného ve ZCHÚ ČR jako podklad pro záchranná opatření a pro jeho reintrodukci“ (ZATLOUKAL & MÁNEK 2000, MÁNEK 2001). Oba zmíněné projekty jsou řešeny v rámci grantu MŽP VaV/610/1/99. V roce 2001 se dále zaměříme na studium genetické diverzity borovice na území NP Šumava (okruh P. rotundata, P. x. pseudopumilio, P. mugo, P. sylvestris). Materiál a metodika V průběhu projektu studující genetickou diverzitu smrku v ČR by mělo být zmapováno více než 50 populací ze všech ZCHÚ ČR, kde se smrk přirozeně vyskytuje. Sledují se především autochtonní porosty a každá z populací je zastoupena minimálně 50, maximálně 100 jedinci. Za dva roky řešení bylo již zmapováno celkem 33 populací smrku ztepilého. Sledované populace reprezentují Šumavu (5), Slavkovský les (2), Krušné hory (2), Labské pískovce (2), Křivoklátsko (2), Jizerské hory (4), Krkonoše (6), Posázaví (1), Jeseníky (2), Beskydy (4), Žďárské vrchy (1), Moravský kras (1), Podyjí (1). Na Šumavě se v rámci tohoto projektu zmapuje 13 populací; k dnešnímu dni jsou k dispozici výsledky z 5 populací. Metodou, kterou ke studiu genetické variability používáme je analýza isoenzymového polymorfismu sledovaného elektroforézou enzymových extraktů získaných z tkáně dormantních pupenů. (Isoenzymy je možno definovat jako genové márkery, které jsou elektroforeticky separovatelné). Nesporné výhody metody spočívají v dokonalé rozpracovanosti pro mnohé dřeviny a pro velký počet enzymových systémů. Umožňuje během krátké doby analyzovat velmi rozsáhlý soubor jedinců. A ačkoli jsme dnes svědky rozmachu genetických metod (RFLP, PCR, RAPD), zkoumající přímo proměnlivost DNA, zůstává isoenzymová analýza pro jednodušší interpretaci výsledků, jako relativně laciná metoda pro masovou analýzu frekvence alel, stále významným zdrojem dat (MÁNEK 1999). V případě šumavským populací bylo sledováno a hodnoceno 11 enzymových systémů, které kódují celkem 17 interpretovatelných isoenzymových lokusů. Jak vyplývá z četných studií zahraničních kolegů, veškeré
Tabulka 1. – Seznam enzymových systémů sledovaných v této studii Enzymový systém
zkratka
E.C. kod
počet lokusů
Isocitrátdehydrogenasa Fluorescenční esterasa Glutamátdehydrogenasa Glutamát–oxalacetáttransaminasa Leucinaminopeptidasa Malátdehydrogenasa Phosphoglukomutasa Phosphoglucoisomerasa Peroxidasa Phosphoenolpyruvátkarboxylasa Šikimátdehydrogenasa
IDH FEST GDH GOT LAP MDH PGM PGI PX PEP SKDH
1.1.1.42 3.1.1.1 1.4.1.2 2.6.1.1 3.4.11.1 1.1.1.37 2.7.5.1 5.31.9 1.11.1.7 4.1.1.31 1.1.1.25
2 1 1 2 2 2 1 2 1 1 2
130
Tabulka 2. – Charakteristika genetické struktury sledovaných populací populace Trojmezná pod Trojmeznou Radvanovic. hřbet Boubín jezero Laka
zkratka
lesní správa
nadm. výška
ppl ppa/ l
TRO POT RAD BOU PLE
Plešný Plešný České žleby CHKO Prášily
1250 – 1320 1100 – 1200 800 – 960 1000 – 1100 1160 – 1200
82,4 52,9 76,5 88,2 82,4
2,2 1,8 1,9 2,4 2,2
He
Ho
0,124 0,098 0,139 0,146 0,136
0,136 0,112 0,139 0,200 0,138
ppl podíl polymorfních lokusů (jako polymorfní se uvažuje takový lokus, kde bylo detekováno více alel než jediná) ppa/l průměrný počet alel na lokus, He = očekávaná heterozygotnost, Ho= pozorovaná heterozygotnost
námi sledované allozymové variace jsou skutečně založeny na genetickém podkladě a nejedná se o změny epigenetické povahy. Přehled sledovaných enzymů viz Tab. 1. Na Šumavě bylo zatím sledováno 5 populací (4 původní – Trojmezná, Plesná, Radvanovický hřbet a Boubínský prales a 1 nepůvodní – pracovně nazvaná pod Trojmeznou). Celkem bylo pozorováno 45 alelických variant. Ze získaných výsledků alelických frekvencí byly vypočítány základní parametry genetické variability sledovaných populací, které je možno vyčíst z tabulky 2. V zásadě je možné říci, že u pravděpodobně původních populací smrku (Trojmezná, Radvanovický hřbet a Plesná) jsou alelické frekvence velmi podobné. (Blíže viz MÁNEK 1999A). Výsledky rovněž ukazují, že gradient nadmořské výšky a s ním spojené ekologické podmínky mohou hrát určitou roli v genetické struktuře smrkových populací i na tak plošně malém území jako je NP Šumava. Výsledky také ukázaly, že je do určité míry možné odlišit populace původní od vysazené monokultury (MÁNEK 1999B). Výrazně specifické postavení v dosud sledovaných pěti šumavských populacích smrku ztepilého má smrk z Boubínského pralesa. Populace vykazuje největší sledovanou variabilitu (88 % lokusů bylo polymorfních). Navíc byly u této populace detekovány velmi vzácně se vyskytující alely, jejichž četnost je vzácná také v celoevropském měřítku. Jsou to především alely enzymu leucinaminopeptidásy (LAP). U žádné ze sledovaných šumavských populací není příliš rozšířena alela LAP–A1, ovšem u boubínských smrků byla detekována u 13 stromů! Alela LAP–B3, která téměř nevyskytuje v celoevropském měřítku byla nalezena dokonce u 10 % sledovaných jedinců! Alela LAP–B5 byla pozorována u třech jedinců. (celkem bylo sledováno 51 stromů). Kromě těchto alel se oproti ostatním sledovaným populacím ze Šumavy u boubínského smrku hojně vyskytují alely GOT–A1, PX1, PX3, PGM1 a SKD3. Naopak s menší frekvencí oproti ostatním populacím byla zastoupena alela PGI–B1 (veškeré alelické frekvence možno dohledat u autora). Čemu je možno přisoudit tyto rozdíly, je zatím nejasné. Pro detailní posouzení bude třeba lépe zmapovat genofond šumavského smrku a zjistit zda je takto specifický pouze boubínský smrk, nebo zda jsou to znaky v dosud nesledovaných populacích šumavského smrku frekventovanější. To však bude předmětem studia mimo tento projekt, kdy bude nejlépe rozšířit spektrum sledovaných enzymů. Rozdíly smrku z Boubínského pralesa jsou graficky zobrazeny na grafech obrázku 1. Poděkování: Především děkuji Správě NP Šumava, že mi umožnila provozovat laboratoř. Za uvedení laboratoře do chodu, její provoz a konzultace nad získanými výsledky bych touto cestou rád poděkoval také několika jednotlivcům. Jsou jimi: Dr. Marie Prchalová (MŽP ČR – Praha), Ing. Vladimír Hladilin a Ing. Vladimír Zatloukal (Správa NP Šumava), Ing. Otakar Schwarz (Správa KRNAP), Prof. Ladislav Paule a Doc. Dušan Gömöry (Lesnická fakulta TU ve Zvolenu) a Ing. Roman Longauer (Výzkumný ústav lesnický ve Zvolenu). Práce je dotována grantem MŽP VaV/610/1/99.
131
frekvence výskytu alely LAP-A1
frekvence výskytu alely PGM1 0,01
0,14 0,12
0,008
0,1 0,08
0,006
0,06
0,004
0,04
0,002
0,02 0
Tro
pod
Rad
Boubín
Ple
0
Tro
frekvence výskytu alely LAP-B3
Boubín
Ple
0,04 0,035
0,04
0,03
0,03
0,025
0,02
0,015
0,02 0,01
0,01
0,005 Tro
pod
Rad
Boubín
Ple
0
Tro
frekvence výskytu alely GOT-A1 0,03
0,03 0,025
0,02
0,02
0,015
0,015
0,01
0,01
0,005
0,005 Tro
pod
Rad
Boubín
pod
Rad
Boubín
Ple
frekvence výskytu alely SKD3
0,025
0
Rad
frekvence výskytu alely LAP-B5
0,05
0
pod
Ple
0
Tro
pod
Rad
Boubín
Ple
Obr. 1 – Specifický genofond smrku ztepilého z Boubínského pralesa (Přítomností některých vzácně se vyskytujících alel se Boubínský smrk odlišuje nejen od šumavských, českých, ale také evropských populací).
Literatura BUSINSKÝ R. & WEGER J., 1995: Genetická analýza jedinců přirozené hybridní populace borovic (Pinus sylvestris x P. Rotundata) na rešeliništi Podkovák metodou elektroforézy isoenzymů. Acta Průhoniciana 62: 47 – 52. IVANEK O., 2000: Využití isoenzymových analýz v lesnictví. Lesnická práce 12/2000. LONGAUER R., 1996: Genetic diversity of European silver fir (Abies alba Mill.) – PhD thesis depon in TULF. Zvolen. 154 pp. MÁNEK J., 1999A: Genetic structure of three natural Norway spruce population in the Bohemian forest determined by isoenzyme analysis. Silva Gabreta 3: 173–182. MÁNEK J., 1999B: Genetická diverzita čtyř smrkových populací Šumavy sledovaná isoenzymovou analýzou. Sborník z konf.: Monitoring, výzkum a management ekosystémů NP Šumava: 93–97. Kostelec n. Č. l. MÁNEK J., 2001: Isoenzymová variabilita populace tisu červeného (Taxus baccata) ze šumavského Ktišska v kontextu populací z ČR. Tento sborník POSPÍŠKOVÁ M., BENETKA V. & BARTÁKOVÁ I., 2000: Využití DNA polymorfismu k určení genetické diversity rodu Topol
132
(Populus) a dub (Quercus) pro rešení strategie konzervace in situ a reintrodukce ohrožených druhů. Výroční zpráva grantu VaV/640/4/00. Depon in MŽP ČR. ROUDNÁ M. & PRCHALOVÁ M., 1996: Biological diversity and a project of its conservation in the Šumava National Park. Silva Gabreta 1: 285–287. VYŠNÝ J., VACEK S., GÖMÖRY D., PAULE L., COMPS B. & THIÉBAUT B., 1994: Genetická premenlivosť vybraných populácií buka lesného (Fagus sylvatica L.) vo východných čechách. ZATLOUKAL V. & MÁNEK J., 2000: Inventarizace a genetická diverzita tisu červeného ve ZCHÚ ČR, jako podklad pro záchranná opatření a jeho reintrodukci. Výroční zpráva grantu VaV/610/1/99. Depon in MŽP ČR, Praha
133
