Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin
Kyselina askorbová a její role v reakcích rostlin na stres Martina Malinová Bakalářská práce
Brno, Česká republika 2009
Na tomto místě bych ráda poděkovala paní Mgr. Haně Cempírkové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a vstřícný přístup během zpracování této práce.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití pramenů a literatury uvedených v seznamu.
V Brně 26. února 2009
...........................................................................
Abstrakt Kyselina askorbová je jedním z hlavních metabolitů v rostlinách. Je to důležitý antioxidant a ve spolupráci s ostatními složkami antioxidačního sytému chrání rostliny proti poškození reaktivními formami kyslíku, jejichž tvorba je důsledkem aerobního metabolismu rostlin, fotosyntézy a působení patogenů, sucha, extrémních teplot nebo dalších fyzikálních i chemických jevů. Kromě antioxidační funkce a funkce enzymového kofaktoru se kyselina askorbová podílí na buněčném dělení, na kontrole roztahování buněčné stěny, redukci iontů některých přechodných kovů, regeneraci α-tokoferolu a mimo jiné hraje také důležitou roli při absorpci NO2. Biosyntéza kyseliny askorbové v rostlinách ještě nebyla zcela objasněna, ale poznatky týkající se pravděpodobné biosyntetické cesty byly shrnuty a sepsány. Člověk je jedním z mála živočichů, kteří si nedokáží kyselinu askorbovou syntetizovat, přestože je pro člověka tato látka naprosto nepostradatelná. Člověk je tedy závislý na příjmu kyseliny askorbové v potravě.
Abstract Ascorbic acid is one of the main metabolites in plants. It is an important antioxidant, and in cooperation with other components of the antioxidant system, protects plants against damage caused by reactive oxygen species. Reactive oxygen species are produced during aerobic metabolism, photosynthesis and owing to pathogens, drought, extreme temperatures or the other physical and chemical factors. In addition to antioxidant function and the function as an enzyme cofactor, it has been implicated in cell division, the control of cell wall expansion, the reduction of some transition metal ions, the regeneration of α-tocopherol and it also plays an important role in the NO2 uptake. The biosynthetic pathway of ascorbic acid in plants has not been identified yet and evidence for the proposed pathways is reviewed. Man is one of the few animals who are not able to synthesize ascorbic acid, although it is absolutely indispensable for humans. So man is dependent on the intake of ascorbic acid in the diet.
Obsah 1
ÚVOD .................................................................................................................. 1
2
CHEMICKÉ VLASTNOSTI A STRUKTURA KYSELINY ASKORBOVÉ............................................................................... 2
3
SYNTÉZA KYSELINY ASKORBOVÉ........................................................... 5 3.1
BIOSYNTÉZA V ROSTLINÁCH ....................................................................................................5
3.2
BIOSYNTETICKÁ CESTA S VYUŽITÍM L-GALAKTONO-1,4-LAKTONU .........................................7
3.3
BIOSYNTETICKÁ CESTA S VYUŽITÍM D-GLUKOSONU A L-SORBOSONU .....................................7
3.4
BIOSYNTÉZA U OBRATLOVCŮ ..................................................................................................8
3.5
PRŮMYSLOVÁ VÝROBA ............................................................................................................8
4
VÝSKYT A SUBBUNĚČNÁ LOKALIZACE KYSELINY ASKORBOVÉ............................................................................. 10
5
FUNKCE KYSELINY ASKORBOVÉ V ROSTLINÁCH ........................... 11 5.1
KYSELINA ASKORBOVÁ V ROLI ENZYMOVÉHO KOFAKTORU ..................................................11
5.2
FUNKCE KYSELINY ASKORBOVÉ PŘI BUNĚČNÉM DĚLENÍ ........................................................11
5.3
VLIV KYSELINY ASKORBOVÉ NA RŮST ROSTLINY A OCHRANA PŘED OZÓNEM ........................12
5.4
ROLE KYSELINY ASKORBOVÉ PŘI ABSORPCI NO2 ...................................................................12
5.5
KYSELINA ASKORBOVÁ JAKO PROOXIDANT ...........................................................................13
5.6
KYSELINA ASKORBOVÁ A REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU .........................................................13
6
REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU A ZPŮSOB JEJICH ODSTRANĚNÍ .................................................................................. 14
7
ASKORBÁT-GLUTATIONOVÝ CYKLUS ................................................. 16
8
KYSELINA ASKORBOVÁ A JEJÍ REAKCE PŘI STRESOVÝCH SITUACÍCH ................................................................. 19 8.1
TEPLOTNÍ STRES ....................................................................................................................19
8.2
VLIV NESTRESUJÍCÍ TEPLOTY .................................................................................................20
8.3
SVĚTELNÝ STRES ...................................................................................................................20
8.4
VODNÍ STRES .........................................................................................................................20
8.5
ZVÝŠENÉ MNOŽSTVÍ OZÓNU ..................................................................................................21
8.6
PATOGENY .............................................................................................................................21
8.7
STRES ZNEČIŠTĚNÍM ROSTLIN PRACHEM ................................................................................22
8.8
VLIV LISTOVÉ APLIKACE KYSELINY ASKORBOVÉ PO STRESU ZASOLENÍM ..............................22
9
KYSELINA ASKORBOVÁ A ČLOVĚK ...................................................... 24 9.1
HISTORIE ...............................................................................................................................24
9.2
FUNKCE V TĚLE .....................................................................................................................25
9.3
ZDROJE VITAMINU C..............................................................................................................27
9.4
VLIV ZPRACOVÁNÍ POTRAVIN NA VITAMIN C.........................................................................28
9.5
DENNÍ POTŘEBA.....................................................................................................................29
10
ZÁVĚR .............................................................................................................. 30
11
LITERATURA ................................................................................................. 31
Seznam zkratek ABA
kyselina abscisová
AO
askorbátoxidasa
APX
askorbátperoxidasa
CAT
katalasa
DHA
dehydroaskorbová kyselina
DHAR
dehydroaskorbátreduktasa
GAL
L-galaktono-1,4-lakton
GR
glutationreduktasa
GSH
glutation
GSSG
glutation disulfid
GUL
L-gulono-1,4-lakton
HP
hydroxyprolin
Km
míra afinity enzymu a substrátu
MDHA
monodehydroaskorbát
MDHAR
monodehydroaskorbátreduktasa
NAD(H)
nikotinamid adenin dinukleotid
NADP(H)
nikotinamid adenin dinukleotid fosfát
1
singletový kyslík
O2
O2·-
superoxidový anion-radikál
OH·
hydroxylový radikál
OO
oxalátoxidasa
PM
plazmatická membrána
ROS
reaktivní formy kyslíku
QC
klidové centrum
SOD
superoxiddismutasa
soz-1
starší název pro vtc-1
vtc-1
mutant rostliny Arabidopsis thaliana se sníženým množstvím kyseliny askorbové
vtc-2
mutant rostliny Arabidopsis thaliana se sníženým množstvím kyseliny askorbové
1 Úvod Většina rostlin získává energii pro své metabolické procesy ze slunečního záření a veškerý uhlík z oxidu uhličitého. Jsou to tedy fotoautotrofní organismy. Díky těmto schopnostem mají rostliny důležité postavení v celé biosféře, protože ostatní (heterotrofní) organismy, včetně člověka, využívají organické látky vytvořené rostlinami. Lidský organismus se od většiny živočichů odlišuje tím, že si nedovede sám syntetizovat kyselinu askorbovou. Rostliny tuto schopnost mají. Člověk je tedy odkázán na příjem kyseliny askorbové z potravy. Nejen z tohoto hlediska jsou pro člověka rostliny velmi významnou složkou potravy. Díky genetickému inženýrství je možné uměle zvýšit obsah kyseliny askorbové v rostlinách (Zhang et al., 2007). Kyselina askorbová je jedním z hlavních antioxidantů rostlin, k jejím dalším funkcím patří například regulace fotosyntézy. Kyselina askorbová dále hraje významnou roli při fotoprotekci a je i významným tzv. sekundárním antioxidantem redukujícím oxidovanou formu α-tokoferolu (Noctor et Foyer, 1998). U člověka vitamin C (název vitamin C je synonymum pro rovnovážnou směs kyseliny askorbové a dehydroaskorbové) zasahuje do řady biochemických a biologických dějů, které ovlivňuje různou měrou (Hlúbik, 2002). Kyselina askorbová navíc snižuje toxicitu řady xenobiotik, tedy sloučenin těžkých kovů, dusitanů a dusičnanů, a potlačuje některé typy rakoviny. Tato bakalářská práce shrnuje dosavadní poznatky o kyselině askorbové. Zaměřuje se hlavně na funkci této látky v rostlinách a na její reakci na stresové situace. Nemalou měrou se také tato práce zabývá významem kyseliny askorbové pro člověka. Bylo by přínosné této molekule lépe porozumět, protože je zapojena do velkého množství důležitých funkcí, od antioxidační ochrany a fotosyntézy, po regulaci růstu (Smirnoff, 1996).
1
2 Chemické vlastnosti a struktura kyseliny askorbové Kyselina askorbová C6H8O6 (2,3-endiol γ-laktonu kyseliny 2-oxo-L-gulonové) (obr. 1) tvoří bezbarvé, ve vodě rozpustné krystaly. Je to látka dosti nestálá, rychle se rozkládá a ztrácí účinnost. Patří mezi biochemické reverzibilní oxidačně-redukční systémy (2,3-endiol ↔ 2,3-dioxo). Rozklad kyseliny askorbové urychluje teplo, světlo, vzdušný kyslík a styk s některými kovy, zejména s Cu a Fe. Škodí mu i zásadité prostředí a vyluhování do vody. Příznivější je kyselé prostředí, neboť organické kyseliny, obsažené např. v ovoci, brání rozkladu vitaminu C. Působí většinou nepřímo jako nespecifický donor vodíku (zabraňuje např. oxidaci Fe2+ na Fe3+ v různých oxygenasách) (http://apple.webpark.cz/Apple/Vitaminy/C.htm, Hampl et Paleček, 2002).
Obrázek 1: Struktura molekuly kyseliny L-askorbové Redukující vlastnosti kyseliny askorbové vyplývají z reaktivní ene-diolové skupiny na uhlíku C2/3. Kyselé vlastnosti jsou způsobeny ionizací hydroxylové skupiny na uhlíku C3 (pKa = 4,17). Oxidací kyseliny askorbové nejprve vzniká monodehydroaskorbátový radikál (MDHA). Z MDHA se tvoří kyselina askorbová a kyselina dehydroaskorbová (DHA) (obr. 2). DHA je nestabilní při pH vyšším než 7, takže je většina askorbátu udržována v redukovaném stavu jako obrana před jeho ztrátami. Veškerý askorbát je za normálních podmínek z 90 % v redukovaném stavu. To je způsobeno dvěma enzymy: monodehydroaskorbátreduktasou (MDHAR), která používá NAD(P)H jako redukční činidlo, a dehydroaskorbátreduktasou (DHAR), která používá jako redukční činidlo glutation. Glutation je dalším důležitým rozpustným antioxidantem v rostlinných buňkách. Tyto reakce společně představují askorbátglutationový (Foyer-Halliwell–Asadův) cyklus. Oxidaci askorbátu katalyzují dva enzymy: askorbátoxidasa a askorbátperoxidasa.
2
Obrázek 2: Vztahy mezi kyselinou askorbovou a jejími oxidovanými formami (upraveno podle Smirnoff, 1996) MDHA i DHA jsou molekuly s bicyklickou strukturou, ve kterých uhlíky C3 a C6 1,4–laktonového cyklu tvoří poloacetaly. MDHA je primární produkt oxidace askorbátu a je to výjimečně nereaktivní volný radikál. Tato vlastnost je důležitá pro funkci askorbátu jako biologického antioxidantu. MDHA je přeměňován na DHA a kyselinu askorbovou. DHA je ve vodných roztocích nestabilní a přeměňuje se na 2,3-diketo-L-gulonovou kyselinu a další produkty (Smirnoff, 1996).
Biochemické funkce kyseliny askorbové mohou být rozděleny do 4 kategorií: 1. Antioxidant: Kyselina askorbová velmi rychle reaguje se superoxidem, s kyslíkem v singletovém stavu, s ozónem a peroxidem vodíku. Kyselina askorbová se účastní odstraňování těchto reaktivních forem kyslíku, které jsou generovány během aerobního metabolismu a při vystavení látkám znečišťujícím prostředí a herbicidům. MDHA a DHA jsou během askorbát-glutationového cyklu redukovány na kyselinu askorbovou. Kyselina askorbová regeneruje lipofilní antioxidant α-tokoferol (vitamin E) z α-chromanoxylového radikálu. 2. Enzymový kofaktor: Kyselina askorbová je kofaktorem pro řadu hydrolas, například pro prolyl- a lysylhydroxylasy zapojené do hydroxyprolinové (HP) a hydroxylysinové syntézy. Glykoproteiny bohaté na HP, jako např. extensin, jsou proteiny strukturní – tvořící stěnu buňky. Posttranslační úpravy prolylu zbylého v těchto proteinech jsou důležité pro vnitrobuněčnou kyselinu askorbovou, která hraje důležitou roli při růstu buněk. Kyselina askorbová je také důležitá in vitro pro enzym tvořící ethylen. Tento enzym má homologické sekvence s ostatními hydrolasami závislými na kyselině askorbové. 3
3. Elektronový transport: Kyselina askorbová in vitro je dobře známá jako elektronový donor pro fotosyntetický a mitochondriální transport elektronů. Výzkumy z poslední doby ukazují, že MDHA může působit jako akceptor elektronů z fotosystému II in vivo a že by mohl působit jako obojí – jako donor elektronů i akceptor elektronů v transmembránovém elektronovém transportu. 4. Syntéza šťavelanu (oxalátu) a vínanu: Kyselina askorbová může být rozštěpena a může tvořit šťavelan a vínan. Na syntéze šťavelanu mohou mít podíl i jiné způsoby vzniku, ale kyselina askorbová je pravděpodobně hlavním zdrojem vínanu v hroznech (Smirnoff, 1996).
4
3 Syntéza kyseliny askorbové Biosyntéza kyseliny askorbové v rostlinách ještě nebyla zcela objasněna, ale poznatky týkající se pravděpodobné biosyntetické cesty byly shrnuty a sepsány (Smirnoff, 1996). Za obecně uznávanou biosyntetickou cestu platí výsledky vědecké skupiny kolem Smirnoffa. Ve prospěch této teorie hovoří i analýza rostliny Arabidopsis thaliana, konkrétně jejího mutantu s nedostatkem kyseliny askorbové, a následná analýza několika jejich genů (Hancock et al., 2003).
3.1 Biosyntéza v rostlinách Biosyntéza kyseliny askorbové probíhá v mitochondriích. Odtud se usnadněnou difúzí nebo protonovým elektrochemickým gradientem dostává do ostatních buněčných komponent (Shao et al., 2008 a). Protože nám chybí dostatek poznatků o biosyntéze kyseliny askorbové v rostlinách, nemáme ani mnoho informací o regulaci těchto pochodů (Smirnoff, 1996). Přestože se několik laboratoří intenzivně věnovalo problému biosyntézy kyseliny askorbové v rostlinách, klasické biochemické přístupy nám neposkytují dostatečné a uspokojivé informace. Je pravděpodobné, že průlom v řešení tohoto problému poskytnou další molekulárně-genetické výzkumy společně s výzkumy biochemickými. K těmto výzkumům se v poslední době používají mutanti s abnormálním množstvím kyseliny askorbové (a s tím související hypersenzitivitou nebo rezistencí vůči ozónu), jako například vtc-1 mutant Arabidopsis thaliana.
Byly navrženy dvě pravděpodobné cesty biosyntézy kyseliny L-askorbové v rostlinách (obr. 3): 1. Biosyntetická cesta s využitím L-galaktono-1,4-laktonu 2. Biosyntetická cesta přes D-glukoson a L-sorboson Neexistuje však žádný nezvratný důkaz, že biosyntéza probíhá jednou z výše zmíněných cest (Smirnoff, 1996).
5
Obrázek 3: Biosyntéza kyseliny L-askorbové v rostlinách (upraveno podle Smirnoff, 1996)
6
3.2 Biosyntetická cesta s využitím L-galaktono-1,4-laktonu Tato biosyntetická cesta, známá i pod názvem „inverzní cesta“, navrhuje za přímého prekurzora kyseliny askorbové L-galaktono-1,4-lakton (GAL) (Isherwood et Mapson, 1962). Analogií této reakce u zvířat je oxidace L-gulono-1,4-laktonu (GUL) na kyselinu askorbovou za účasti L-gulono-1,4-laktonoxidasy. Tato reakce je u rostlin podporována rychlou přeměnou vnějšího GAL na kyselinu askorbovou a také mitochondriálním enzymem (GAL dehydrogenasou), který katalyzuje oxidaci GAL na kyselinu askorbovou. Další podporou pro tento pochod je reakce lykorinu. Tento alkaloid dokáže u živočichů vyvolat kurděje a u rostlin snížit hladinu kyseliny askorbové. De Gara et al. (1994) předpokládá, že lykorin inhibuje GAL dehydrogenasu a GUL oxidasu. Účinek lykorinu byl testován in vivo a jeho vliv na čištěnou GAL dehydrogenasu nebyl prokázán (Smirnoff, 1996). Tato sloučenina musí být tedy i nadále zkoumána.
3.3 Biosyntetická cesta s využitím D-glukosonu a L-sorbosonu Druhá biosyntetická cesta je tzv. „neinverzní cesta“. Dochází při ní k oxidaci glukózy na uhlíku C2 a vzniká D-glukoson. Ten je dále epimerizací na uhlíku C5 převeden na L-sorboson. Následuje oxidace uhlíku C3 a laktonizace za vzniku kyseliny L-askorbové. Důkazem pro tuto biosyntetickou cestu je objevení enzymu sorbosondehydrogenasy, který s pomocí NADP převádí L-sorboson na kyselinu L-askorbovou. Tento enzym byl objeven ve špenátu a v listech fazolí.
7
3.4 Biosyntéza u obratlovců Narozdíl od rostlin, u obratlovců probíhá biosyntéza jednodušeji (obr. 4).
Obrázek 4: Biosyntéza kyseliny askorbové u obratlovců a u rostlin (převzato z Lapčík, 2001) Zkratky: GDP – guanosindifosfát, UDP – uridindifosfát
3.5 Průmyslová výroba Průmyslová výroba kyseliny askorbové (obr. 5) vychází z D-glukosy, která se katalytickou hydrogenací převede na D-sorbitol. Ten mikrobiální oxidací (Acetobacter suboxidans) poskytne L-sorbosu. L-sorbosa s acetonem v přítomnosti kyseliny sírové poskytne 2,3:4,6-bis-(Oisopropyliden)-α-L-sorbofuranosu, jejíž oxidací manganistanem draselným se v alkalickém prostředí získá kyselina diaceton-2-oxo-L-gulonová. Ta následně po hydrolýze chránících skupin (ketalů) poskytne vitamin C (Hampl et Paleček, 2002).
8
Obrázek 5: Průmyslová výroba kyseliny askorbové (upraveno podle Hampl et Paleček, 2002)
9
4 Výskyt a subbuněčná lokalizace kyseliny askorbové Kyselina askorbová a askorbátperoxidasa (peroxidasa se specificitou ke kyselině askorbové jako reduktantu) se jeví jako univerzální sloučeniny ve fotosyntetizujících eukaryotech zahrnujících řasy a bryofyta. Askorbátperoxidasa se vyskytuje v některých cyanobakteriích patřících mezi prokaryota. Není známo, zda je u cyanobakterií přímá souvislost mezi nedostatkem askorbátperoxidasy a kyseliny askorbové. Kyselina
askorbová
se
vyskytuje
v cytoplazmě,
v chloroplastech,
ve
vakuolách,
v mitochondriích a v buněčné stěně (Smirnoff, 1996). Koncentrace v chloroplastech může být vysoká (ve špenátu až 50 mM) a je pravděpodobně spojená s jeho rolí při fotosyntéze. Výskyt v buněčné stěně není náhodný, protože na plazmatické membráně (PM) protoplastů listů ječmene je vysoká afinita přenašečů kyseliny askorbové (Km = 90 µM) i dehydroaskorbové (Km = 20 µM). Kyselina dehydroaskorbová (DHA) je přenášena do buňky rychleji než kyselina askorbová. Účinky ionoforů a blokátorů iontových kanálů na příjem kyseliny askorbové naznačují potřebu protonového elektrochemického gradientu skrze plazmatickou membránu. Naopak transport do izolovaných vakuol je pomalý a není zprostředkovaný přenašečem. Izolované chloroplasty špenátu vážou kyselinu askorbovou s překvapivě nízkou afinitou (Km = 18-40 mM) skrze saturovatelného přenašeče. Příjem do chloroplastů je inhibován kyselinou dehydroaskorbovou. Vysoká afinita přenašečů na plazmatické membráně by mohla usnadnit pohyb kyseliny askorbové do buněčné stěny a povolit pohyb z buňky do buňky skrze apoplast.
10
5 Funkce kyseliny askorbové v rostlinách Kromě antioxidační funkce a funkce enzymového kofaktoru se kyselina askorbová podílí na buněčném dělení, na kontrole růstu a roztažitelnosti buněčné stěny, na stabilitě genomu a částečně také na syntéze hormonů a extracelulárních strukturních proteinů obsahujících hydroxyprolin (Smirnoff, 2005). Redoxní stav apoplastické kyseliny askorbové je kontrolován askorbátoxidasou, což může ovlivnit růst a rezistenci vůči ozónu. Kyselina askorbová se také může chovat jako prooxidant redukcí iontů přechodných kovů.
5.1 Kyselina askorbová v roli enzymového kofaktoru Jedna z nejlépe prozkoumaných funkcí kyseliny askorbové je její role při enzymatických reakcích (Davey et al., 2000). Mezi enzymy, které jsou ovlivňovány kyselinou askorbovou, patří například prolinhydroxylasa, lysinhydroxylasa, 2-oxoglutarát-3-dioxygenasa, cholesterol-7-αmonooxygenasa a další. Tyto enzymy jsou typicky mono- nebo dioxygenasy, které jako centrální kovový iont obsahují železo nebo měď a které vyžadují kyselinu askorbovou k dosáhnutí maximálního výkonu. Funkcí kyseliny askorbové je udržovat ion přechodného kovu v redukovaném stavu. V případě, že je přítomné nějaké jiné redukční činidlo ve vyšší koncentraci, může být kyselina askorbová tímto činidlem částečně nahrazena. Kyselina askorbová je také kofaktorem deepoxidasy, jejíž aktivita je stimulována silným zářením nebo nízkou teplotou (Smirnoff, 1996). Deepoxidasa enzymaticky převádí neúčinný violaxanthin a antheroxanthin na zeaxanthin. Zeaxanthin je nejúčinnější z xantofylů, které mají ochrannou funkci při přeměně nadbytku radiační energie na teplo (tzv. fotoprotekce). Zeaxanthin tedy vzniká postupnou deepoxidací violaxanthinu, což je součást xantofylového cyklu ve světlosběrných komplexech.
5.2 Funkce kyseliny askorbové při buněčném dělení Výzkumy kyseliny askorbové a dehydroaskorbové v buňkách tabáku ukazují, že DHA inhibuje buněčné dělení, zatímco kyselina askorbová tento děj stimuluje (Smirnoff, 2005). Klidové centrum (QC), oblast meristému s nedělivými buňkami v kořeni kukuřice, obsahuje pouze málo kyseliny askorbové a glutationu, ale velké množství askorbátoxidasy. To také souvisí se zvýšenou produkcí superoxidu a peroxidu vodíku v této oblasti meristému. Důkaz pro tvrzení, že buněčné dělení je bržděno oxidovanými formami kyseliny askorbové, se provádí odstraněním kořenové čepičky. Tímto procesem se zvýší koncentrace redukované formy kyseliny askorbové a glutationu a dojde k očividnému nárůstu buněčného dělení v QC. 11
Dalším důkazem pro tvrzení, že kyselina askorbová ovlivňuje dělení buněk, je barvení kořenového meristému cibule dusičnanem stříbrným (Smirnoff, 1996). Po nabarvení preparátu dokážeme určit, které oblasti meristému obsahují velké množství kyseliny askorbové. Části meristému s vysokým obsahem kyseliny askorbové (kyselina askorbová může pocházet například z vnějšího prostředí) rychleji postupují z G1 fáze do S fáze buněčného cyklu.
5.3 Vliv kyseliny askorbové na růst rostliny a ochrana před ozónem Vtc-1 (původně nazývaný soz-1) a vtc-2 jsou mutanti rostliny Arabidopsis thaliana, kteří jsou hypersenzitivní vůči ozónu. Vtc-1 obsahuje o 70 % méně kyseliny askorbové (a naopak o něco více DHA) v listech než divoký kmen. Nízký obsah kyseliny askorbové v mutantu vtc-1 je spojen nejen s citlivostí na ozón, ale také se sníženým růstem rostliny. To znamená, že tento mutant produkuje daleko méně biomasy než divoký kmen (Veljovic-Jovanovic et al., 2001). V rostlinách s nízkým obsahem kyseliny askorbové totiž dochází k peroxidativnímu zesíťování polysacharidů a proteinů buněčné stěny a k zvýšené lignifikaci (Smirnoff, 2005). Tyto pochody vedou ke snížené roztažnosti buněčné stěny. Další výsledky výzkumu pracovní skupiny Veljovic-Jovanovic poukazují na to, že je v mutantu vtc-1 vyvolána aktivita blíže neurčené peroxidasy a že rovnováha mezi chloroplastovou a cytoplazmatickou askorbátperoxidasou (APX) je u mutantu posunuta ve prospěch cytoplazmatické APX. Snížený růst rostliny však nemůže být jednoznačně přisuzován pouze nízkému obsahu kyseliny askorbové (Smirnoff, 2005). Je zajímavé, že vtc-1 obsahuje větší množství kyseliny abscisové (ABA) než divoký kmen (Pastori et al., 2003). Tento hormon obecně inhibuje růst.
5.4 Role kyseliny askorbové při absorpci NO2 Oxid dusičitý (NO2) je běžný plyn vyskytující se v atmosféře. Hraje mimo jiné důležitou roli při tvorbě ozónu, smogu a kyseliny dusičné v ovzduší. Regulace výměny tohoto plynu mezi listem rostliny a atmosférou je popsaná pouze u několika druhů rostlin (Teklemariam et Sparks, 2006). Mezi významné regulátory patří průduchy, ultrafialové záření a parciální tlakový gradient mezi vnitřním prostředím listu a jeho okolím. Teklemariam et Sparks (2006) zkoumali absorpci NO2 u čtyř důležitých zemědělských plodin. Ověřovali hypotézu, že kyselina askorbová v listech funguje jako významný regulátor příjmu oxidu dusičitého. Díky tomuto výzkumu došlo k objevu, že existuje vztah mezi koncentrací kyseliny askorbové v listech a absorpcí i emisí NO2. U rostlin s vyšším obsahem NO2 dochází i k vyšší emisi NO2. Rostliny s vyšším obsahem kyseliny askorbové prokazují vyšší absorpci NO2. Tyto výsledky potvrzují, že obsah NO2 i kyseliny askorbové v listech opravdu regulují další příjem atmosférického NO2. Je totiž pravděpodobné, že rostliny s vyšším obsahem kyseliny askorbové mají větší 12
schopnost reagovat s NO2 vznikajícím během dusíkaté redukce, čímž dojde k snížení emitovaného NO2.
5.5 Kyselina askorbová jako prooxidant Kyselina askorbová redukuje ionty přechodných kovů (železa, mědi a manganu) (Smirnoff, 2005). Davey et al. (2000) v těchto souvislostech hovoří pouze o železe (FeIII) a mědi (CuII). Takto redukované formy přechodných kovů mohou v přítomnosti peroxidu vodíku generovat hydroxylové radikály tzv. Fentonovou reakcí: Fe3+ + kyselina L-askorbová → Fe2+ + monodehydroaskorbát Fe2+ + H2O2 → OH· + OH- + Fe3+ Tyto hydroxylové radikály mohou způsobit oxidativní poničení DNA. Apoplastická kyselina askorbová reakcí s mědí produkuje hydroxylové radikály, které mohou porušit polysacharidy buněčné stěny. Tato skutečnost by se dala využít při změkčování a umělém dozrávání ovoce (Fry et al., 2001).
5.6 Kyselina askorbová a reaktivní formy kyslíku Kyselina askorbová může nejen reagovat se superoxidovým radikálem a hydroxylovým radikálem, ale je také schopna neenzymaticky redukovat další radikály (viz kapitola 6 a 7). Zvláštní význam je přisuzován regeneraci α-tokoferolu (vitaminu E) z α-chromanoxylového radikálu (Davey et al., 2000). α-tokoferol se ve vysokých koncentracích nachází ve fotosyntetických membránách, kde plní úlohu hlavního lipofilního antioxidantu, který reaguje s peroxidovými radikály lipidů a se superoxidy. Kyselina askorbová se v chloroplastech vyskytuje až o koncentraci 10-50 mM. Proto může být využita pro odstranění vysoce škodlivých peroxyradikálů.
13
6 Reaktivní formy kyslíku a způsob jejich odstranění V rostlinách i živočiších reaguje kyselina askorbová se škodlivými radikály kyslíku a jeho deriváty, takzvanými reaktivními formami kyslíku (ROS) (Davey et al., 2000). Tyto detoxifikační reakce mohou být považovány za základní část hospodaření nutné pro aerobní existenci v eukaryotických buňkách. Vysoká intracelulární koncentrace kyseliny askorbové poukazuje na důležitost těchto funkcí v eukaryotickém organismu. Schopnost rostlinné kyseliny askorbové reagovat s fyziologicky vzniklými ROS má za následek změnu procesů, jako jsou lignifikace, buněčné dělení a hypersenzitivní reakce. Biologická důležitost antioxidativních účinků kyseliny askorbové je odlišná od ostatních nízkomolekulárních antioxidantů (α-tokoferol, kyselina močová, karotenoidy, flaviny...). Kyselina askorbová je schopná ukončit radikálové řetězové reakce převedením molekuly na netoxické, neradikálové produkty, například DHA a 2,3diketogulonovou kyselinu. Kyselina askorbová je pouze mírně elektronegativní, takže může být donorem elektronů široké škále substrátů. Jeden z nejdůležitějších rysů neenzymatické antioxidační aktivity kyseliny askorbové je její účast na obnově lipofilních membránových radikálů. Reaktivní formy kyslíku zahrnují sloučeniny jako superoxidový anion-radikál (O2·-), singletový kyslík (1O2), peroxid vodíku (H2O2) a vysoce reaktivní hydroxylový radikál (OH·) (Tabulka 1).
Tabulka 1: Příklady aktivních forem kyslíku v rostlinách (upraveno podle Buchanan et al., 2000, laboranti.ic.cz/Biochemie/DR%20(11.p%F8edn.).ppt) Název
Zkratka
superoxidový anion-radikál
O2
singletový kyslík
1
peroxid vodíku
H2O2
hydroxylový radikál
OH
Struktura
·-
O2
·
Reaktivní formy kyslíku jsou produkovány chloroplasty, mitochondriemi a peroxizómy. Jde o vedlejší produkty buněčného metabolismu, jejichž produkce je zvýšená při stresu. Jako stresová situace může být pro rostlinu například nedostatek vody (sucho), nedostatek živin v půdě, poranění rostliny, vysoká salinita, nadměrné záření, vystavení polutantům (např. ozónu) apod. Hlavní příčinou toxicity reaktivních forem kyslíku je jejich schopnost zahájit radikálovou řetězovou reakci, která vede k produkci hydroxyradikálů a dalších molekul s ničivými účinky (Davey et al., 2000). Tyto molekuly způsobují poškození bílkovin, peroxidaci lipidů, poškození 14
DNA a mohou způsobit i smrt celé buňky. Aerobní organismy mají proto vyvinuté množství účinných mechanismů, které slouží k detoxikaci, a to buď enzymatickou nebo neenzymatickou cestou. Nízkomolekulární antioxidanty, jako glutation, kyselina L-askorbová, α-tokoferol (vitamin E), karotenoidy a fenolické molekuly, jsou schopné neenzymaticky interagovat přímo s reaktivními formami kyslíku. Mezi enzymatické mechanismy detoxikace patří například askorbátperoxidasa, glutationperoxidasa a superoxiddismutasa (SOD) katalyzující dismutaci superoxidového anion-radikálu na peroxid vodíku: 2 O2·- + 2H+ → H2O2 + O2 Schopnost odstranění H2O2 vyžaduje synchronní činnost několika antioxidačních enzymů současně. V organelách, jako jsou například chloroplasty, dochází k rychlé redukci O2·- přímo, díky vysoké hladině kyseliny askorbové. Katalasy (CAT) převádí H2O2 na vodu a molekulární kyslík. Tyto enzymy mají nízkou afinitu k substrátu, a tak reakce vyžaduje současný přístup dvou molekul H2O2 k aktivnímu místu. Jiný způsob odbourání H2O2 je prostřednictvím peroxidas, které nacházíme ve všech částech buňky a které mají mnohem větší afinitu k H2O2 než CAT. Fotosyntetizující
organismy jsou
aktivními
formami kyslíku
zranitelné obzvláště
v bezprostřední blízkosti oxidačně redukčního systému schopného redukce O2 na O2·-. Příčinou produkce reaktivních forem kyslíku chloroplasty vyšších rostlin je přenos elektronů o vysoké energii z redukované formy ferredoxinu na kyslík místo na NADP (Davey et al., 2000). Tato fotoredukce kyslíku ve fotosystému I se nazývá Mehlerova reakce. Po vzniku superoxidového anion-radikálu (O2·-) reakce pokračuje za účasti SOD jako katalyzátoru a vzniká H2O2. Tato jednoduchá přeměna jedné reaktivní formy kyslíku v druhou a její následná detoxikace H2O2 je životně důležitá podmínka pro normální funkci chloroplastů. Pro chloroplasty s nedostatkem katalas (tedy chloroplasty, které se nacházejí v peroxizómech a glyoxyzómech) je kyselina L-askorbová esenciální. Slouží jako substrát pro askorbátperoxidasu, která zneškodňuje H2O2 vzniklý v tylakoidech:
H2O2 + 2 L-kyselina askorbová → 2 H2O + 2 MDHA
15
7 Askorbát-glutationový cyklus Askorbát-glutationový cyklus, zvaný také Foyer-Halliwell-Asadův cyklus, je sled reakcí, při kterém dochází k přeměně nebezpečného peroxidu vodíku na vodu (obr. 6).
Obrázek 6: Askorbát-glutationový cyklus (upraveno podle Noctor et Foyer, 1998) Zkratky: AA – kyselina askorbová, APX – askorbátperoxidasa, DHA – dehydroaskorbová kyselina, DHAR – dehydroaskorbátreduktasa, GR – glutationreduktasa, GSH – glutation, GSSG – glutation disulfid, MDHA – monodehydroaskorbát, MDHAR – monodehydroaskorbátreduktasa, NADP(H) - nikotinamid adenin dinukleotid fosfát, SOD – superoxiddismutasa. V rostlinných buňkách je kyselina askorbová nejdůležitějším substrátem zajišťujícím odstranění H2O2 (Noctor et Foyer, 1998). Askorbátperoxidasa (APX) je prvním enzymem cyklu a používá dvě molekuly kyseliny askorbové k redukci H2O2. Následně vznikají dvě molekuly mono16
dehydroaskorbátu (MDHA). Radikál MDHA, pokud není zpětně redukován, se přeměňuje na kyselinu askorbovou a dehydroaskorbovou (DHA). V plazmalemě nebo na tylakoidní membráně může být poté MDHA redukován přímo na kyselinu askorbovou. Donorem elektronu pro redukci MDHA může být cytochrom b, redukovaný ferredoxin nebo NAD(P)H. Jestliže je kyselina askorbová oxidována v listech a ostatních tkáních, nějaký DHA je vždy produkován, o čemž značí rychlá disproporcionace MDHA radikálu. DHA je redukován na kyselinu askorbovou pomocí DHA-reduktasy za použití glutationu (GSH) jako redukčního činidla. Tato reakce probíhá za vzniku glutation disulfidu (GSSG), který může být pomocí NADPH zpětně převeden na GSH. Tato reakce je katalyzována glutationreduktasou (GR). Kyselina askorbová a glutation nejsou touto cestou spotřebovávány, pouze se účastní cyklických redoxních reakcí za použití 4 enzymů, které dovolují redukci H2O2 na vodu s využitím elektronů získaných z NAD(P)H.
Obrázek 7: Vztahy mezi askorbátem, monodehydroaskorbátem a dehydroaskorbátem v cytoplazmě a buněčné stěně (upraveno podle Smirnoff, 1996) Zkratky: AO – askorbátoxidasa, APX – askorbátperoxidasa, Asc – askorbát, Cyt b – cytochrom b, DHA – dehydroaskorbát, DHAR – dehydroaskorbátreduktasa, GR – glutationreduktasa, GSH – glutation, GSSG – oxidovaný glutation, MDA – monodehydroaskorbát, MDHAR – monodehydroaskorbátreduktasa, NAD(H) – nikotinamid adenin dinukleotid, NADP(H) – nikotinamid adenin dinukleotid fosfát, OO – oxalátoxidasa, PM – plazmatická membrána. 17
V rostlinných buňkách může být kyselina askorbová transportována pomocí přenašečů dovnitř buněčné stěny. Askorbátoxidasa (AO) katalyzuje oxidaci askorbátu a vzniká tak monodehydroaskorbátový radikál (MDHA) (obr. 7). MDHA přijímá elektrony z cytochromu b. Cytoplasmatický askorbát je pravděpodobně donorem elektronu. Depolarizace membrány způsobená transmembránovým transportem elektronů stimuluje H+-ATPasu a vede k roztahování buněčné stěny (Smirnoff, 1996). Askorbát inhibuje peroxidativní zesíťování polysacharidů stěny a polymerizaci ligninu odklízením peroxidu vodíku a monolignolových radikálů. Dehydroaskorbát (DHA) může reagovat s aminokyselinovou stranou řetězců polypeptidů buněčné stěny a předejít zesíťování polysacharidů matrix. DHA (nebo askorbát) vede k oxalátu, který podporuje roztahování buněčné stěny vázáním vápníku. DHA je transportován přenašeči do cytoplazmy, kde je DHA-reduktasou (DHAR) redukován na kyselinu askorbovou v askorbát-glutationovém cyklu. Oxalát je odstraněn oxalátoxidasou (OO) a uvolnění peroxidu vodíku a vápníku může prospět pevnosti buněčné stěny. Ostatní cesty tvorby H2O2 buněčné stěny nejsou v tomto schématu zobrazeny. Askorbát v buněčných stěnách také detoxikuje ozón. Askorbát-glutationový cyklus a MDHA-reduktasa spolu s askorbátperoxidasou se také vyskytují v chloroplastech a složky cyklu byly zaznamenány i v mitochondriích a peroxizómech.
18
8 Kyselina askorbová a její reakce při stresových situacích Jednou z nejrychlejších odpovědí rostlin na vliv patogenů, sucha, extrémních teplot nebo fyzikálních i chemických jevů je akumulace reaktivních forem kyslíku. Takto vzniklý oxidativní stres je rozšířeným jevem, který je dobře prozkoumán v pšenici a dalších rostlinách, které jsou vystaveny většině biotickým a environmentálním stresům (Shao et al., 2008 b). V závislosti na velikosti oxidativního poškození může dojít k aklimatizaci na stres nebo až k buněčné smrti. Stresem nazýváme situaci, kdy na rostlinu působí nějaké nepříznivé faktory. V přírodě na rostlinu obvykle působí více stresorů současně. Stresorem neboli stresovým faktorem označujeme určitou odchylku od optimálních podmínek pro růst rostliny. Stres může být u rostlin vyvolán abiotickými nebo biotickými faktory. Mezi biotické faktory patří vliv patogenních organismů, býložravců a také konkurence jiných rostlin. Naopak mezi abiotické faktory ovlivňující rostliny zahrnujeme například změnu vlhkosti vzduchu a množství srážek, změnu teploty, změnu slunečního záření, pH půdy a toxicitu prostředí.
8.1 Teplotní stres Odezva rostliny na stres vysokou teplotou je u každého rostlinného druhu odlišná a je závislá na fyziologických předpokladech daného druhu (Zavorueva et Ushakova, 2004). Na teplotní stres jsou obzvláště citlivé například fotosyntetické pochody, neboť dochází ke zvýšenému fotooxidativnímu poškození. Guo et al. (2006) zkoumali vliv vysoké teploty na růst dvou druhů citrusovníků. Po stresu vysokou teplotou (38 ˚C) byly rostliny ošetřeny kyselinou askorbovou, čímž došlo k opětovnému navýšení chlorofylů, superoxiddismutasy (SOD), askorbátperoxidasy (APX), dehydroaskorbátreduktasy (DHAR) a ke snížení množství reaktivních forem kyslíku (ROS). Příznaky oxidativního stresu způsobeného růstem rostliny mimo optimální teplotu zkoumali také Kaminska-Rozek et Pukacki (2005). Tato skupina pracovala se semenáčky norské jedle, které byly po 45 dní vystaveny teplotám -3 ˚C a -10 ˚C. Vlivem stresu došlo ke zvýšené produkci reaktivních forem kyslíku a ke snížení množství kyseliny askorbové. K opačným výsledkům se dopracovali Keles et Oncel (2002). Ve své práci uvádějí, že v klíčních rostlinách Triticum durum po prodělaném stresu nízkou teplotou (5 ˚C) došlo ke zvýšení množství kyseliny askorbové. Dále uvádějí, že v rostlinách, které prodělaly stres vysokou teplotou (40 ˚C), nedošlo k žádné větší změně množství kyseliny askorbové. Kumar et al. (2008) zkoumali vliv aplikace kyseliny abscisové na stres nízkou teplotou a na množství kyseliny askorbové. Po vnějším ošetření kyselinou abscisovou došlo k výraznému 19
zmírnění poranění způsobených tímto teplotním stresem. Rostliny ošetřené kyselinou abscisovou prokazovaly menší oxidativní poškození a vyšší množství kyseliny askorbové než rostliny takto neošetřené.
8.2 Vliv nestresující teploty Paolacci et al. (1997) ve své studii porovnávali stav antioxidantů a fotosyntézy u rostlin rostoucích při optimální teplotě 25 ± 0,4 ˚C a při mírně zvýšené teplotě 30 ± 0,3 ˚C, vždy za úměrného světla a dostatku zálivky. Rostliny rostoucí při 30 ± 0,3 ˚C nevykazovaly symptomy typické pro odezvu na stres vysokou teplotou, jako bývá zrychlený vývoj, snížený růst, ztráta fotosyntetických pigmentů a redukce fotochemických schopností fotosystému II. Tato mírně zvýšená teplota způsobila 60-80 % navýšení obsahu kyseliny dehydroaskorbové a glutation disulfidu. Výsledky zjištěné v tomto experimentu dokazují, že fotosyntetický výkon zkoumaných rostlin může být negativně ovlivněn dokonce i mírně zvýšenou nestresující teplotou, která by mohla vést k upřednostňování fotooxidativního uhlíkatého cyklu nad fotoreduktivním cyklem. To by dále mohlo vést k nadprodukci reaktivních forem kyslíku (ROS), kde působí jako antioxidační ochrana kyselina askorbová a glutation. Podobné výsledky byly dosaženy s dřívějšími daty týkajícími se stejného rostlinného materiálu a teplot pro růst nestresujících, jen mírně snížených.
8.3 Světelný stres Bartoli et al. (2006) zkoumali vliv extrémního osvětlení na množství kyseliny askorbové v rostlinách. Rostliny vyrůstaly za nízkého (50 µmol fotonů m-2s-1) a intenzivního osvětlení (250 µmol fotonů m-2s-1). Množství kyseliny askorbové v rostlinách rostoucích ve tmavším prostředí bylo nižší než v rostlinách, které rostly za intenzivního osvětlení. Podobných výsledků dosáhli i Smirnoff et Pallanca (1996), kteří publikovali, že množství kyseliny askorbové v listech se zvyšuje při růstu za větší sluneční intenzity a nízké teploty. Touto problematikou se zabývali i Cano et al. (2006). Ve své studii se pokusili monitorovat změny antioxidantů nastávající v rostlinách Avena sativa L. a Triticum aestivum L. po prodělání stresu nadměrným osvětlením. Stres rostliny byl vyvolán 2800 µmol fotony m-2s-1 a způsobil snížení množství kyseliny askorbové v rostlině, obzvláště v mladých listech. Množství kyseliny askorbové se vrátilo do původního stavu po 60 minutách ve tmě.
8.4 Vodní stres Augusti et al. (2001) zkoumali množství kyseliny askorbové v listech poikilohydrické rostliny Ramonda serbica Panc. (Gesneriaceae) během dehydratace a následné rehydratace. Bylo zjištěno, že snížením relativního množství vody v rostlině dojde k značnému zvýšení množství kyseli20
ny askorbové. Hladiny kyseliny askorbové se příliš neměnily, dokud rostlina nedosáhla pouze 40 % relativního množství vody. Následně došlo k pozvolnému zvyšování kyseliny askorbové, až rostlina dosáhla maximální dehydratace listů (kdy relativní množství vody představovalo 10 %). V počáteční fázi rehydratace bylo množství kyseliny askorbové stále poměrně vysoké, ale postupem času (zhruba během 10 hodin) došlo k opětovnému snížení množství až na původní hodnotu. Opačného výsledku dosáhli Sairam et al. (1998). Zkoumali roli kyseliny askorbové v listech tří různých genotypů pšenice (Triticum aestivum L.) při vodním stresu. Na listy působili během dvou různých etap po odkvětu. Podle výsledků této pracovní skupiny mělo sucho za následek snížení hladiny kyseliny askorbové v listech.
8.5 Zvýšené množství ozónu Vystavení rostlin zvýšeným koncentracím ozónu (O3) je doprovázeno zvýšeným množstvím hydroxylových radikálů, superoxidových radikálů a H2O2. K těmto pochodům dochází nejprve v apoplastu a později i v symplastu buněk listů rostlin (Robinson et Britz, 2000). Peroxidativní pochody v buněčné stěně způsobí značné snížení množství kyseliny askorbové v apoplastu a zvýšení monodehydroaskorbátu taktéž v apoplastu. Pokud není působení ozónu velmi intenzivní, jsou změny množství kyseliny askorbové pouze mírné. Je dokázáno, že rostliny s vyšším množstvím kyseliny askorbové v listech jsou více odolné vůči ozónu (Robinson et Britz, 2000).
8.6 Patogeny Paradoxní je, že vtc-1 mutant (se sníženým množstvím kyseliny askorbové) je hypersenzitivní vůči ozónu, ale daleko více odolný vůči patogenům (Smirnoff, 2005). Tato hypotéza byla testována za použití virulentní bakterie Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 a virulentní houby Peronospora parasitica pv. Noco (Conklin et Barth, 2004). Růst patogenů u vtc-1 mutantu byl značně nižší než u divokého kmene. Podobný pokus prováděli Barth et al. (2004), kteří zkoumali vtc-2 mutant (také mutant se sníženým obsahem kyseliny askorbové). Tento mutant byl taktéž infikován P. parasitica a opět byla prokázána větší rezistence vůči patogenům. Borbala et al. (2008) zkoumali vliv patogenu Blumeria graminis f. sp. hordei race A6 na různé genotypy ječmene (Hordeum vulgare). Celkové množství kyseliny askorbové nebylo u žádného genotypu naočkováním tohoto patogenu nijak ovlivněno. Kyselina jasmonová je důležitý rostlinný hormon uvolňovaný v rostlinách při stresu, včetně stresu napadením patogeny. Je dokázáno, že methyljasmonát (ester kyseliny jasmonové) vyvolává zvýšení syntézy kyseliny askorbové v rostlině (Wolucka et al., 2005). Důkazy byly provedeny 21
na Arabidopsis thaliana a Nicotiana tabacum Bright Yellow-2. Jde o první případ hormonální regulace syntézy kyseliny askorbové v rostlinách. Pokusy regulovat syntézu kyseliny askorbové za použití některých jednoduchých enzymů (zejména enzymů hrajících roli při biosyntéze) byly zatím neúspěšné (Ishikawa et al., 2006). Infekce listů Arabidopsis thaliana spórami patogenu Botrytis cinerea má za následek snížení množství kyseliny askorbové a tím i oxidativní poškození (Muckenschnabel et al., 2002). Tyto výsledky se shodují s výsledky Kuzniak et Sklodowské (2005), kteří studovali odezvu oxidativního stresu vzniklého infekcí Botrytis cinerea na Lycopersicon esculentum Mill. Vlivem tohoto patogenu došlo opět ke snížení množství kyseliny askorbové.
8.7 Stres znečištěním rostlin prachem Zhodnocení schopnosti různých druhů rostlin zachycovat prachové částečky je spojeno i s výzkumem účinku prachového povlaku na obsah kyseliny askorbové v listech rostlin. Prajapati et Tripathi (2008) ve svém experimentu zjistili, že u všech jimi zkoumaných druhů (Ficus religion, Ficus benghalensis, Mangifera indica, Dalbergia sissoo, Psidium guajava a Dendrocalamus strictus) dochází k maximálnímu ukládání nánosu prachu v zimním období. Obsah kyseliny askorbové se zvyšuje se zvýšeným ukládáním prachu. Jde tedy o vzájemný pozitivní vztah mezi obsahem kyseliny askorbové a stresem, který je způsobený prachem. Maximální schopnost zachycování prachu byla zjištěna u Dalbergia sissoo a minimální u Dendrocalamus strictus. Závěrem výzkumu bylo, že by se některé rostliny mohly využít k zachycování prachových částic, které jsou pro zdraví člověka škodlivé.
8.8 Vliv listové aplikace kyseliny askorbové po stresu zasolením Vysoká salinita je běžným abiotickým stresorem. V některých částech světa představuje vážný problém, neboť výrazně ovlivňuje úrodu (obzvláště v aridních a semiaridních oblastech). Při stresu zasolením, stejně jako při jiných stresech, dochází ke vzniku aktivních forem kyslíku (ROS). Mahmud et al. (1999) zkoumali rostliny Pak Choi (Brassica rapa ssp. Chinensis L.). Zjistili, že množství kyseliny askorbové v rostlinách, které prodělaly stres zasolením, je nižší. Dolatabadian et al. (2008) zkoumali vliv listové aplikace kyseliny askorbové na rostlinu po prodělaném stresu zasolením. Zajímali se především o vliv na množství proteinů, prolinu, chlorofylu, peroxidaci lipidů a aktivitu superoxiddismutasy (SOD), katalas a peroxidas. Čtyři týdny po zasetí byly rostliny vystaveny stresu zasolením aplikací roztoku chloridu sodného (200 mM). Rostliny byly takto stresovány po šest dnů a následujících šest dnů podstupovaly listovou aplikaci roztoku kyseliny askorbové (25 mM). 22
Výsledky výzkumu dokazují, že stres zasolením ovlivnil všechny sledované parametry, kromě chlorofylu b, aktivity SOD v listech a obsahu MDHA v kořenech. Stres zasolením způsobil zvýšení aktivity všech sledovaných antioxidačních enzymů kromě SOD v kořenech. Množství proteinů se po prodělání stresu v listech a kořenech snížilo. Aplikace kyseliny askorbové způsobila zpětné snížení aktivity antioxidačních enzymů v listech, ale na jejich aktivitu v kořenech neměla vliv. Množství proteinů se po ošetření kyselinou askorbovou opětovně zvýšilo, a to jak v listech, tak v kořenech. Měření ukazují, že během stresu zasolením (interakcí s ROS) došlo k zvýšené peroxidaci lipidů. Následným ošetřením kyselinou askorbovou došlo k poklesu peroxidace lipidů pouze v listech. Výsledky této studie ukazují, že kyselina askorbová snižuje škodlivé účinky zasolení a mohla by nadále zvyšovat toleranci k salinitě.
23
9 Kyselina askorbová a člověk Vitamin C je pro lidský organismus naprosto nepostradatelná látka. Většina zvířat si dokáže vytvořit vlastní vitamin C v játrech nebo nadledvinkách z glukózy. To člověk nedokáže, chybí mu důležitý enzym L-gulonolaktonoxidasa, bez kterého přeměna glukózy ve vitamin C nemůže proběhnout. Lidé mají totiž poškozený gen pro tvorbu tohoto enzymu. Různí autoři odhadují, že k poškození genu retrovirem došlo u společného předka člověka a všech opic někdy před 70-45 miliony let (Lapčík, 2001). V přírodě se tak nedokáže zásobovat vitaminem C pouze člověk, některé druhy primátů, morčata a indický netopýr. Mezi ptactvem pak červení bulbulové a z vodní říše pstruh duhový a losos (Čapek, 2005). Člověk je také spolu s opicemi jediným živočišným druhem, který trpí nachlazením (Lapčík, 2001).
9.1 Historie K jednomu z nejznámějších důsledků nedostatku vitaminu C patří kurděje (skorbut), jejichž následky byly pozorovány už na kosterních nálezech z doby kamenné a bronzové (Jebas, 2003). O možnosti chránit se před kurdějemi dietou vědí lékaři od 18. století. V roce 1754 James Lind vydal knihu s názvem A Treatise on Scurvy, v níž navrhl citrony jako prevenci proti kurdějím. Pánové Holst a Fröhlich použili v roce 1907 při studiu nemoci beri-beri morčata, která v důsledku chudé diety dostala kurděje (předtím se soudilo, že kurdějemi může onemocnět pouze člověk). O čtyři roky později přišel Kazimír Funk s hypotézou, že příčinou některých závažných chorob může být nedostatek určitých nezbytných stopových látek – vitaminů ve výživě. Prvními nemocemi, jejichž příčina byla hledána v avitaminóze, byly xeroftalmie (šeroslepost), beri-beri a kurděje. Hypotetické vitaminy byly označeny A, B a C (Lapčík, 2001). Vitamin C jako první izoloval v roce 1927 v cambridgské biochemické laboratoři z hovězí nadledvinkové kůry maďarský biochemik Albert Szent-Gyšrgyi, který se zajímal o omezování mechanismů oxidace v lidském těle. Objevenou látku (se vzorcem C6H8O6) pojmenoval kyselina hexuronická. Později se mu podařilo tutéž látku izolovat ze šťáv pomeranče a zelí. Za svůj objev získal, po několika neúspěšných nominacích, v roce 1937 Nobelovu cenu za medicínu. Ve stejné době jako Albert Szent-Gyšrgyi se o izolaci vitaminu z citronové šťávy snažilo za pomoci velkého množství pokusných zvířat hned několik skupin vědců. V roce 1932 ohlásil úspěch svého týmu Charles Glen King z Pittsburské univerzity a dodal, že jeho krystaly mají všechny vlastnosti, které Szent-Gyšrgyi oznámil u své kyseliny hexuronické. Maďar tedy dokázal izolovat vitamin C a po celá čtyři léta jej měl k dispozici, aniž si to vůbec uvědomil. V témže 24
roce, kdy dostal Nobelovu cenu za medicínu Albert Szent-Gyšrgyi, ji v oboru chemie obdržel Norman Haworth z britské Birminghamské univerzity, který dokázal vypracovat přesnou strukturu Szent-Gyšrgyiho krystalů a dokázal vyrobit vitamin C syntetickou cestou. K hlavním propagátorům užívání vysokých dávek vitaminu C v pozdější době patřil například dvojnásobný laureát Nobelovy ceny Linus Pauling (Čapek, 2005).
9.2 Funkce v těle Vitamin C hraje roli v životně důležitých funkcích všech žláz a orgánů. Posiluje pojivovou tkáň a je nutný pro řádnou funkci nadledvinek a štítné žlázy. Je nezbytný pro dobrý stav kolagenu, i pro vývin a uchování zdravých zubů, dásní a kostí. Vitamin C pomáhá při hojení ran, posiluje imunitní systém a chrání tělo proti infekcím. Zvlášť důležitou roli hraje v ochraně nervových buněk před poškozením volnými radikály. Vitamin C chrání proti všem formám stresu, jak fyzického, tak duševního. Působí jako všeobecné přirozené antibiotikum. Specificky pomáhá při horečkách, všech druzích infekcí a při trávicích problémech. Stimuluje tvorbu interferonu, což je látka narušující proces tvorby virů. Interferon rovněž napomáhá destrukci nádorů (http://www.magazinzdravi.cz/modules.php?name=e Magazine&file=article&emsid=615).
● Tvorba kolagenu - vitamin C je velice důležitý pro tvorbu kolagenu, který tvoří strukturu kostí, chrupavek, svalů a cévních tkání. Mimo to přispívá k dobrému stavu zubů a dásní, a také dopomáhá k rychlejšímu hojení pooperačních ran. Zjednodušeně se dá říci, že kolagen dává pevnost a pružnost potřebnou pro konstrukci lidských orgánů. Pokud není vitaminu C v těle dostatečné množství, trpí tím soudržnost a pohyblivost podpůrných tkání. To, že je kolagen potřebný k hojení ran, ukazují i symptomy kurdějí (např. krvácení z dásní), které po podání vitaminu C mizí. ● Metabolismus - vitamin C se účastní celé řady metabolických procesů v organismu, např. metabolismu žlučových kyselin, vápníku a železa, syntézy některých hormonů a neurotransmitérů, podílí se na metabolismu kyseliny listové, nadledvinových steroidů a některých aminokyselin. ● Imunitní systém - vitamin C je nepostradatelný pro správnou funkci imunitního systému. Nedokáže sice zabránit propuknutí nemoci, ale výrazně zkracuje dobu nemoci a zmírňuje průvodní příznaky.
25
● Prevence kardiovaskulárních onemocnění - vitamin C působí v této oblasti (společně s vitaminem E a beta-karotenem) jako antioxidant. Jeho úkolem je chránit lipidy buněčných membrán před oxidací i regenerace vitaminu E. ● Prevence proti nitrosoaminům - vitamin C předchází tvorbě nežádoucích nitrosoaminů v žaludku. Nitrosoaminy jsou konečné produkty reakčního řetězce dusičnan - dusitan - nitrosoamin. Dusičnany jsou pro rostliny důležitou živinou a mohou se z nich za přítomnosti baktérií tvořit dusitany. Z těch se v kyselém prostředí žaludečních šťáv mohou (za přítomnosti aminů) tvořit nitrosoaminy, které se považují za rakovinotvorné. Vitamin C však může s dusitany reagovat rychleji než aminy, což v důsledku znemožní tvorbu nitrosoaminů (Jebas, 2003). ● Bílé krvinky - fagocytická aktivita bílých krvinek závisí na množství vitaminu C, které se nachází v krvi a ve tkáních. Při boji s infekcí se vitamin C ničí. Pokud je hladina kyseliny askorbové příliš nízká, bílé krvinky nenapadnou baktérie útočící na organismus a nedokáží je zneškodnit. ● Vstřebávání železa – minerály, jako například vápník a fosfor, jsou skladovány v těle. Pokud není přítomen vitamin C, kostní tkáň nedokáže tyto minerály použít, a tak jsou ztraceny. Lidé, kteří pravidelně pijí pomerančovou šťávu, dokáží zvýšit vstřebávání železa až o 400 %, protože v ní obsažený vitamin C zvyšuje dostupnost železa (http://www.magazinzdravi.cz /modules.php?name=eMagazine&file=article&emsid=615). ● Zvýšení odolnosti proti chladu - při pokusech na zvířatech bylo dokázáno, že podáváním vitaminu C se zvyšuje odolnost vůči chladu. To je významné zjištění, protože nemoci z nachlazení jsou zapříčiněny většinou souběhem stresu z chladu a infekce. ● Těžké kovy - vitamin C chrání organismus před těžkými kovy. Má totiž schopnost vázat určité škodlivé látky, čímž je odstraní z koloběhu látek a organismus je následně vyloučí. Cigaretový kouř obsahuje vysoký podíl těžkých kovů, jedním z těchto toxických kovů je olovo. Vitamin C může toto olovo vázat a usnadnit jeho vyloučení. ● Stres - stresové situace jsou spojeny s vyšší spotřebou vitaminu C. To je částečně způsobeno zvýšenou tvorbou stresových hormonů, které jsou závislé na vitaminu C (Jebas, 2003). ● Ochrana oční čočky - kyselina askorbová je v oku hlavním antioxidantem (ve vodné složce tkáně a ve sklivci je kyseliny askorbové 160 a 360 mg/kg vlhké váhy). V očním lékařství se v poslední době ukazuje význam volných radikálů a antioxidantů u řady nemocí. Oko přijímá světlo včetně UV paprsků, které jsou absorbovány rohovkou a čočkou a jen jejich malé množství proniká do retiny. Spojivky jsou místem, kde krev není chráněna před světlem a do jisté míry ani před škodlivinami z okolního prostředí. To vše přispívá ke zvýšené tvorbě 26
volných radikálů a tím ke škodám následkem jejich účinku. Poškození oka je větší, není-li chráněno před UV paprsky filtry slunečních brýlí a je-li malý příjem antioxidantů v potravě. Vysoký příjem kyseliny askorbové chrání čočku před poškozením účinkem UV nebo horkem. Kyselina askorbová může účinkovat i jako prooxidant a generovat volné radikály v přítomnosti kovů (Racek et Holeček, 2000).
9.3 Zdroje vitaminu C Vitamin C se vyskytuje nejčastěji ve formě kyseliny askorbové zejména v ovoci a zelenině. Hlavními zdroji vitaminu C jsou šípky, hroznové víno, meruňky, citrusové plody, černý rybíz, paprika, jahody, rajčata, brokolice, brambory a zelí. Množství vitaminu C kolísá v závislosti na odrůdě (Tabulka 2), klimatu, způsobu sklizně, skladování a způsobu zpracování surovin (Jebas, 2003). Vitamin C se vyrábí také uměle, ale nejlepší je přijímat jej z přirozených zdrojů, protože se zde nalézá i s dalšími látkami, jako jsou např. bioflavonoidy rutin, citrin a hesperidin (http://www. magazinzdravi.cz/modules.php?name=eMagazine&file=article&emsid=615).
Tabulka 2: Množství vitaminu C ve http://apple.webpark.cz/Apple/Vitaminy/C.htm) Potravina (100 g)
vybraných
(upraveno
podle
Množství [mg]
bezinky kiwi
37,1 36,7
pomeranč
35,4
citron s dužinou
34,0
citronová šťáva
28,2
maliny
27,7
grepová šťáva
26,3
ředkve, cibule
26,2
špenát, brokolice
26,1
zelený hrách
26,0
kedluben
25,8
chřest
23,7
zelí
23,6
játra
22,2
ostružiny
21,2
sójové boby
18,5
brambory
18,0
rajská jablíčka
16,9
artyčoky
10,9
jablka
potravinách
8,8
27
Červená paprika obsahuje jedenapůlnásobek množství vitaminu C než zelená paprika, současně jedenáctkrát více karotenoidů, které tělo převádí na vitamin A. Kyselina askorbová je jednou z prvních látek, které se vytvářejí v klíčícím semeni. Klíčky fazolí obsahují vitamin C, zatímco nenaklíčené fazole nikoli (http://www.magazinzdravi.cz/modules.php?name=eMagazne& file=article&emsid=615). Vitamin C ovšem najdeme i jinde než v říši rostlin, například v syrových telecích nebo hovězích játrech, v syrových ústřicích, tresčích jikrách, smažených jehněčích játrech, opečeném jehněčím srdci, v mateřském mléku nebo v kozím mléku (Čapek, 2005). Malé množství naopak poskytují ryby, drůbež, vejce a mléčné výrobky. Téměř žádný vitamin C není obsažen v celozrnných výrobcích (http://apple.webpark.cz/Apple/Vitaminy/C.htm).
9.4 Vliv zpracování potravin na vitamin C Již jednou bylo zmíněno, že množství vitaminu C v potravině závisí na způsobu jejího skladování a zpracování. Vitamin C totiž velice citlivě reaguje na světlo, teplo i vlhko. Můžeme říci, že ztráty vitaminu C jsou obecně o tolik vyšší, o kolik déle a při vyšších teplotách se potraviny skladují (Jebas, 2003). Zelenina a ovoce by měly být také co nejméně krájeny, v ideálním případě bezprostředně před podáváním. Vitamin C je rozpustný ve vodě, a tak při vaření brzy zmizí. Je tedy vhodné zeleninu vařit v co nejmenším množství vody, nebo ještě lepší je dusit ji v páře (http://apple.web park.cz/Apple/Vitaminy/C.htm). Změny nutričních hodnot, barvy i chuti jsou způsobeny různými enzymy v ovoci a zelenině za přítomnosti vzduchu. Listová zelenina, vyloupaný hrášek a zelené fazolky jsou nejvíce citlivé na ztrátu vitaminu C bezprostředně po sklizni a ztrácí až 20 % celkového množství vitaminu C (Davey et al., 2000). Během jednoho dne při 20 °C ztratí kapusta asi 12 % obsahu svého vitaminu C, což je víc, než kdyby byla uskladněna jeden týden v chladničce. Je třeba zmínit, že zelenina reaguje z hlediska ztráty vitaminu C různě citlivě. Hlávkové zelí lze uchovávat dokonce několik měsíců beze ztráty vitaminu C. Teplo však odbourávání vitaminu C podporuje. To způsobují rovněž speciální enzymy, které jsou zvlášť účinné při teplotách kolem 40 °C. Při 70 °C dochází však ke zničení těchto enzymů. Proto by se měla zelenina rychle přivést do vyšších teplot a poté pomalu připravovat. Ztráta vitaminu sice přitom nadále pokračuje, ale značně pomaleji. Při kuchyňské úpravě se může obsah vitaminu C v potravinách snížit o dalších až 70 %. Vařením oloupaných brambor se sníží obsah vitaminu C o 30-50 % a pokud k tomu připočteme vliv skladování (při pokojové teplotě se obsah vitaminu C u brambor každý měsíc sníží o 15 %), vychází nám velmi nízká čísla. Krátké omytí syrové, nenakrájené zeleniny většinou nezpůsobuje 28
žádné změny v obsahu vitaminu. Naproti tomu namáčení, které se často používá ve velkokapacitních kuchyních, vede ke ztrátám vitaminu C vyluhováním. Čím déle toto vyluhování trvá, tím jsou ztráty vitaminu C větší. Při rozmělňování, krájení, strouhání nebo mixování ovoce a zeleniny se díky takto zvýšenému množství ploch a zároveň díky porušení buněčné tkáně urychluje enzymatické odbourávání vitaminu C. Při rychlém a pečlivém zmrazení lze ztráty vitaminu udržet relativně nízké, takže hluboko zmrazená zelenina často vykazuje více vitaminu C než čerstvé ovoce a zelenina, které je skladováno mnohem kratší dobu (Jebas, 2003).
9.5 Denní potřeba Denní doporučená dávka vitaminu C závisí na věku, pohlaví, životním stylu a na mnoha dalších faktorech (Tabulka 3). V ČR je průměrná denní doporučená dávka pro běžné nesportující jedince 60 mg na den. Potřeba vitaminu C však výrazně stoupá při vyšší tělesné zátěži, infekčních onemocněních, stresu a při kouření (kuřák potřebuje o 120 až 130 mg vyšší denní přísun vitaminu C) (Jebas, 2003).
Tabulka 3: Denní potřeba vitaminu C v závislosti na fyzickém stavu člověka (upraveno podle http://apple.webpark.cz/Apple/Vitaminy/C.htm) Stáří/stav člověka
Množství [mg]
děti 0-1/2 roku
30
děti 1/2-1 rok
35
děti 1-3 roky
40
děti 4-14 let
50
dospělí 15 a více let
60
těhotné ženy
70
kojící ženy
90
Nedostatek vitaminu C vede ke skorbutu – kurdějím. Název kyseliny askorbové je odvozen z a-scorbutic, což znamená proti-skorbutová. Mezi charakteristické příznaky kurdějí patří poškození kapilár a krvácení, zánět dásní a viklání zubů. Na ochranu proti této nemoci stačí 10 mg vitaminu C denně. To ale není dost na to, aby nám vitamin C pomohl jako antioxidační činidlo. Lidské tělo naráz využije jen malé množství přijatého vitaminu C, jednorázově využitelná dávka se v různých literaturách udává v rozmezí 30-70 mg (větší dávky jsou vyloučeny stolicí a močí). Většina lidí je schopna snášet dávky vysoké až do 1 g bez obtíží, zatímco jiní mohou trpět průjmy a bolestmi žaludku (http://apple.webpark.cz/Apple/Vitaminy/C.htm).
29
10 Závěr Ve své bakalářské práci jsem se pokusila formou literární rešerše shrnout dosavadní poznatky o kyselině askorbové a jejích funkcích v rostlinách. Součástí této práce byla i role kyseliny askorbové v reakcích rostlin na stres i nepostradatelnost této látky pro člověka. Jako jeden z mála organismů si člověk tuto látku nedokáže sám syntetizovat a je tak závislý na jejím příjmu z potravy. Při shromažďování a překládání literatury k této práci jsem se mnohokrát setkala s připomínkou autora daného článku, že je nutné kyselinu askorbovou dále zkoumat a sbírat o této látce další důležité poznatky, které by mohly vést k jejímu širšímu a lepšímu využití. Proto bych se i já chtěla během následujícího studia aktivně zapojit k chystanému výzkumu kyseliny askorbové na naší Přírodovědecké fakultě.
30
11 Literatura Augusti A, Scartazza A, Navari-Izzo F, Sgherri CLM, Stevanovic B, Brugnoli E (2001) Photosystem II photochemical efficiency, zeaxanthin and antioxidant contents in the poikilohydric Ramonda serbica during dehydration and rehydration, Photosynthesis Research 67 (1-2), 79-88. Barth C, Moeder W, Klessig DF, Conklin PL (2004) The timing of senescence and response to pathogens is altered in the ascorbate-deficient Arabidopsis mutant vitamin c-1, Plant Physiology 134 (4), 1784-1792. Bartoli CG, Yu JP, Gomez F, Fernandez L, Mc Intosh L, Foyer CH (2006) Interrelationships between light and respiration in the control of ascorbic acid synthesis and accumulation in Arabidopsis thaliana leaves, Journal of Experimental Botany 57 (8), 1621-1631. Borbala D, Harrach BD, Fodor J, Pogany M, Preuss J, Barna B (2008) Antioxidant, ethylene and membrane leakage responses to powdery mildew infection of near-isogenic barley lines with various types of resistance, European Journal of Plant Pathology 121 (1), 21-33. Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL, Eds. (2000) Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Pp. 1190, Courier Companies, Inc., USA. Cano A, Hernandez-Ruiz J, Arnao MB (2006) Changes in hydrophilic antioxidant activity in Avena sativa and Triticum aestivum leaves of different age during de-etiolation and high-light treatment, Journal of Plant Research 119 (4), 321-327. Conklin PL, Barth C (2004) Ascorbic acid, a familiar small molecule intertwined in the response of plants to ozone, pathogens, and the onset of senescence, Plant Cell and Environment 27 (8), 959-970. Čapek R, Chřipka versus vitamin C 1:1, Science [online] 1/2005 [cit. 29. října 2008] Dostupné na http://www.vtm.cz/Modules/VTM/StoryDetail.aspx?Id=739&SubportalId=5&BackURL=http %3a%2f%2fwww.vtm.cz%2fModules%2fVTM%2fSearching.aspx Davey MW, Van Montagu M, Inze D, Sanmartin M, Kanellis A, Smirnoff N, Benzie IJJ, Strain JJ, Favell D, Fletcher J (2000) Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing, Journal of the Science of Food and Agriculture 80 (7), 825-860. De Gara L, Paciolla C, Tommasi F, Liso R, Arrigoni O (1994) In vivo inhibition of galactonoγ-lactone conversion to ascorbate by lycorine, Journal of Plant Physiology 144:649-653, In Smirnoff N (1996) The function and metabolism of ascorbic acid in plants, Annals of Botany 78 (6), 661-669. Dolatabadian A, Sanavy SAMM, Chashmi NA (2008) The effects of foliar application of ascorbic acid (Vitamin C) on antioxidant enzymes activities, lipid peroxidation and proline accumulation of canola (Brassica napus L.) under conditions of salt stress, Journal of Agronomy and Crop Science 194 (3), 206-213.
31
Fry SC, Dumville JC, Miller JG (2001) Fingerprinting of polysaccharides attacked by hydroxyl radicals in vitro and in the cell walls of ripening pear fruit, Biochemical Journal 357, 729737, In Smirnoff N (2005) Ascorbate, tocopherol and carotenoids: metabolism, pathway engineering and function, Pp. 53-66, In Smirnoff N (ed.) Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants, Blackwell Publishing Ltd, Oxford. Guo YP, Zhou HF, Zhang LCh (2006) Photosynthetic characteristics and protective mechanisms against photooxidation during high temperature stress in two citrus species, Scientia Horticulturae 108 (3), 260-267. Hampl F, Paleček J (2002) Farmakochemie, 1. vyd., Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha. Hancock RD, McRae D, Haupt S, Viola R, Synthesis of L-ascorbic acid in the phloem, BMC Plant Biology [online] 2003, 3:7 [cit. 15. prosince 2008] Dostupné na http://www.biomedcent ral.com/1471-2229/3/7 Hlúbik P, Vitamin C – esenciální mikronutrient, Interní medicína pro praxi [online] 2002/4 [cit. 3. prosince 2008] Dostupné na http://www.zdravcentra.cz/cps/rde/xbcr/zc/470.pdf Isherwood FA, Mapson LW (1962) Ascorbic acid metabolism in plants: Part II. Biosynthesis, Annual Review of Plant Physiology 13:329-350, In Smirnoff N (1996) The function and metabolism of ascorbic acid in plants, Annals of Botany 78 (6), 661-669. Ishikawa T, Dowdle J, Smirnoff N (2006) Progress in manipulating ascorbic acid biosynthesis and accumulation in plants, Physiologia Plantarum 126 (3), 343-355. Jebas M, Vitamín C – všechno, Internetový magazín Ronnie [online] září 2003 [cit. 29. října 2008] Dostupné na http://kulturistika.ronnie.cz/c-251-vitamin-c-vsechno.html Kaminska-Rozek E, Pukacki PM (2005) Effect of freezing desiccation on cold hardiness, ros, membrane lipid levels and antioxidant status in spruce seedlings, Acta Societatis Botanicorum Poloniae 74 (3), 219-228. Keles Y, Oncel I (2002) Response of antioxidative defence system to temperature and water stress combinations in wheat seedlings, Plant Science 163 (4), 783-790. Kumar S, Kaur G, Nayyar H (2008) Exogenous application of abscisic acid improves cold tolerance in Chickpea (Cicer arietinum L.), Journal of Agronomy and Crop Science 194 (6), 449456. Kuzniak E, Sklodowska M (2005) Fungal pathogen-induced changes in the antioxidant systems of leaf peroxisomes from infected tomato plants, Planta 222 (1), 192-200. Lapčík O, Komu hrozí kurděje, Vesmír [online] Vesmír 80, 2001/9 [cit. 30. října 2008] Dostupné na http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=4715 Mahmud TMM, Atherton JG, Wright CJ, Ramlan MF, Ahmad SH (1999) Pak Choi (Brassica rapa ssp. Chinensis L.) quality response to pre-harvest salinity and temperature, Journal of the Science of Food and Agriculture 79 (12), 1698-1702.
32
Muckenschnabel I, Goodman BA, Williamson B, Lyon GD, Deighton N (2002) Infection of leaves of Arabidopsis thaliana by Botrytis cinerea: changes in ascorbic acid, free radicals and lipid peroxidation products, Journal of Experimental Botany 53 (367), 207-214. Noctor G, Foyer CH (1998) Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49:249-279. Paolacci AR, Badiani M, Dannibale A, Fusari A, Matteucci G (1997) Antioxidants and photosynthesis in the leaves of Triticum durum Desf seedlings acclimated to nonstressing high temperature, Journal of Plant Physiology 150 (4) 381-387. Pastori GM, Kiddle G, Antoniw J et al. (2003) Leaf vitamin C contents modulate plant defense transcripts and regulate genes that control development through hormone signaling, The Plant Cell 15, 939-951, In Smirnoff N (2005) Ascorbate, tocopherol and carotenoids: metabolism, pathway engineering and function, Pp. 53-66, In Smirnoff N (ed.) Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants, Blackwell Publishing Ltd, Oxford. Prajapati SK, Tripathi BD (2008) Seasonal variation of leaf dust accumulation and pigment content in plant species exposed to urban particulates pollution, Journal of Environmental Quality 37 (3), 865-870. Racek J, Holeček V, Volné radikály a antioxidanty v očním lékařství, Finclub [online] LG 3/2000 [cit. 30. října 2008] Dostupné na http://www.finclub.cz/web/print.php?src=ref&id=225 Robinson JM, Britz SJ (2000) Tolerance of a field grown soybean cultivar to elevated ozone level is concurrent with higher leaflet ascorbic acid level, higher ascorbate-dehydroascorbate redox status, and long term photosynthetic productivity, Photosynthesis Research 64 (1), 77-87. Sairam RK, Deshmukh PS, Saxena DC (1998) Role of antioxidant systems in wheat genotype tolerance to water stress, Biologia Plantarum 41 (3), 387-394. Shao HB, Chu LY, Lu ZH, Kang CH (2008 a) Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells, International Journals of Biological Sciences 4 (1), 8-14. Shao HB, Chu LY, Shao MA, Cheruth AJ, Mi HM (2008 b) Higher plant antioxidants and redox signaling under environmental stresses, Comptes Rendus Biologies 331(6), 433-441. Smirnoff N (1996) The function and metabolism of ascorbic acid in plants, Annals of Botany 78 (6), 661-669. Smirnoff N, Pallanca JE (1996) Ascorbate metabolism in relation to oxidative stress, Biochemical Society Transactions 24: 472-478, In Smirnoff N (1996) The function and metabolism of ascorbic acid in plants, Annals of Botany 78 (6), 661-669. Smirnoff N (2005) Ascorbate, tocopherol and carotenoids: metabolism, pathway engineering and function, Pp. 53-66, In Smirnoff N (ed.) Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants, Blackwell Publishing Ltd, Oxford. Teklemariam TA, Sparks JP (2006) Leaf fluxes of NO and NO2 in four herbaceous plant species: The role of ascorbic acid, Atmospheric Environment 40 (12), 2235-2244.
33
Veljovic-Jovanovic SD, Pignocchi C, Noctor G, Foyer CH (2001) Low ascorbic acid in the vtc-1 mutant of Arabidopsis is associated with decreased growth and intracellular redistribution of the antioxidant system, Plant Physiology 127 (2), 426-435. Wolucka BA, Goossens A, Inze D (2005) Methyl jasmonate stimulates the de novo biosynthesis of vitamin C in plant cell suspensions, Journal of Experimental Botany 56 (419), 2527-2538. Zavorueva EN, Ushakova SA (2004) Characteristics of slow induction curve of chlorophyll fluorescence and CO2 exchange for the assessment of plant heat tolerance at various levels of light intensity, Russian Journal of Plant Physiology, 51 (3), 294-301 In Guo YP, Zhou HF, Zhang LCh (2006) Photosynthetic characteristics and protective mechanisms against photooxidation during high temperature stress in two citrus species, Scientia Horticulturae 108 (3), 260267. Zhang L, Wang ZN, Xia Y, Kai GY, Chen WS, Tang KX (2007) Metabolic engineering of plant L-ascorbic acid biosynthesis: recent trends and applications, Critical Reviews in Biotechnology 27 (3), 173-182.
34
