Abiotický stres v proteomu rostlin Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav molekulární biologie a radiobiologie

Abiotický stres v proteomu rostlin Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Mgr. Martin Černý, Ph.D.

Veronika Čotková

Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Abiotický stres v proteomu rostlin vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu použité literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

Dne ....................................... Podpis studenta .......................................

PODĚKOVÁNÍ Tímto bych ráda poděkovala vedoucímu své bakalářské práce Mgr. Martinovi Černému, Ph.D. za obrovskou trpělivost a cennou pomoc při zpracování této bakalářské práce a prof. RNDr. Břetislavu Brzobohatému, CSC. za přínosné informace při odborných konzultacích. Dále pak všem pracovníkům Ústavu molekulární biologie a radiobiologie Mendelovy univerzity v Brně za cenné rady, zvláště pak Bc. Janu Skalákovi za pomoc při překonávání prvotních obtíží. A své rodině a blízkým přátelům za psychickou podporu při studiu.

ABSTRAKT Bakalářská práce „Abiotický stres v proteomu rostlin“ se zabývá využitím metod proteomiky ke studiu molekulárních mechanismů odpovědí na abiotický stres u rostlin. Teoretická část zahrnuje shrnutí současných poznatků o vnímání různých abiotických stresů rostlinami s detailnějším zaměřením na mechanismy vnímání teplotního stresu, možnosti jejich propojení se signálními drahami fytohormonů, zvláště pak cytokininů, a poskytuje přehled současných proteomických metod pro analýzu proteinů. Experimentální část navazuje na výzkum ÚMBR MENDELU. Pro analýzu byly použity klíční

rostliny

cytokininoxidázu

Arabidopsis

thaliana

s indukovatelnou

expresí

genu

pro

CaMV35S>GR>HvCKX2, kultivované při různé intenzitě světla

a vystavené stresu zvýšenou teplotou (35 °C). Byla provedena analýza proteomu pomocí 2D elektroforézy. Celkově bylo nalezeno 55 regulovaných proteinových spotů, z nichž 25 bylo nalezeno při standardní intenzitě světla a 40 při intenzitě snížené. Pouze 10 bylo regulováno v obou případech. Základní analýzou se podařilo ukázat souhru mezi vnímáním teploty, cytokininů a intenzity světla. Klíčová slova: tepelný stres, cytokininy, intenzita světla, proteomika

ABSTRACT This bachelor thesis focuses on methods suitable for proteomic analysis of molecular mechanisms in the abiotic stress responses in plants. The theoretical part reviews current knowledge and describes in details known signaling pathways involved in response to temperature stress, possible roles of phytohormones and especially the role of cytokinin, and describes approaches used in modern proteomic analysis. The experimental part is based on previous work at LPMB MENDELU and studies effects of heat stress (35 °C) at different light intensities on proteome of Arabidopsis thaliana with inducible expression of cytokinin oxidase CaMV35S>GR>HvCKX2. Altogether, 55 significantly regulated protein spots were found, 25 and 40 at standard light and low light intensity, respectively. Only 10 spots were found to be regulated at both light intensities. Results illustrate interplay between temperature, cytokinin and light intensity. Key words: heat stress, cytokinin, light intensity, proteomics

OBSAH 1

ÚVOD ................................................................................................................ 7

LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 8 1.1 Abiotický stres .................................................................................................. 8 1.1.1 Světlo jako stresor ................................................................................... 9 1.1.2 Deficit kyslíku - anoxie ........................................................................... 9 1.1.3 Stres zasolením...................................................................................... 10 1.1.4 Vodní deficit a stres suchem ................................................................. 10 1.2 Vnímání teploty a teplotní stres ...................................................................... 12 1.2.1 Chladový stres a aklimatizace ............................................................... 12 1.2.2 Stres vysokými teplotami ...................................................................... 13 1.2.3 Role proteomu v teplotním šoku ........................................................... 18 1.3 Rostlinné hormony a teplota ........................................................................... 20 1.4 Cytokininy ...................................................................................................... 22 1.4.1 Struktura cytokininů .............................................................................. 22 1.4.2 Biosyntéza a metabolismus cytokininů ................................................. 23 1.4.3 Signální dráhy cytokininů ..................................................................... 26 1.4.4 Interakce cytokininů a světla ................................................................. 27 1.5 Proteomika a metody ...................................................................................... 28 1.5.1 Dvou-dimenzionální elektroforéza........................................................ 30 1.5.2 Hmotnostní spektrometrie ..................................................................... 31 1.5.3 Modifikace 2D PAGE a alternativní metody ........................................ 33 2

MATERIÁL A METODIKA ........................................................................... 34 2.1 Rostlinný materiál a jeho kultivace ................................................................ 34 2.2 Izolace celkového proteomu s odstraněním Rubisco ...................................... 34 2.3 Izoelektrická fokusace a SDS-PAGE ............................................................. 35 2.4 Barvení proteinů ............................................................................................. 36 2.5 Decodon Delta 2D .......................................................................................... 36 2.6 Vyhodnocení dat ............................................................................................. 36

3

VÝSLEDKY A DISKUZE .............................................................................. 37 3.1 Kultivace a tepelný stres ................................................................................. 37 3.2 Izolace a 2D elektroforéza .............................................................................. 37 3.3 Analýza 2D map proteomu ............................................................................. 40

3.4 Analýza účinku tepelného šoku, snížené hladiny cytokininů a snížené intenzity světla na proteom Arabidopsis thaliana ...................................................... 40 4

ZÁVĚR ............................................................................................................ 47

5

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.............................................................. 48

6

SEZNAM OBRÁZKŮ ..................................................................................... 53

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .............................................................. 54

1 ÚVOD

Rostliny jsou svým přisedlým způsobem života často vystaveny stresujícím podmínkám prostředí a to v přírodních i zemědělských podmínkách. Stres je pak často determinuje jak půdní a klimatické podmínky limitují rozšíření rostlinných druhů. Proto je pochopení fyziologických procesů při stresovém poranění, mechanismů adaptace a aklimatizace ke stresům prostředí má nesmírný význam jak pro zemědělství, tak pro životní prostředí. Jedním z nejvýznamnějších abiotických faktorů, které mohou stresově působit na rostlinu, je teplota. Předešlé studie ÚMBR MENDELU odhalily možné propojení signalizace teploty a signální dráhou fytohormonů cytokininů (ČERNÝ et al., 2011a). Jedním z hlavních cílů bakalářské práce bylo navázat na tyto výsledky a zjistit míru odpovědi proteomu modelové rostliny Arabidopsis thaliana na tepelný stres, porovnat tuto odpověď s reakcí transgenních rostlin s modulovanou hladinou endogenních cytokininů a sledovat účinek teploty a hladiny endogenních cytokininů při různých intenzitách světla.

7

LITERÁRNÍ PŘEHLED 1.1 Abiotický stres Rostliny jsou v průběhu svého života vystaveny velmi proměnlivým podmínkám okolního prostředí. Ty však mohou zpomalovat životní funkce rostlin, poškozovat jejich orgány a v krajním případě vedou i k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy okolního prostředí, které takto nepříznivě působí na rostlinu, se nazývají stresové faktory (stresory). Termín stres se pak používá pro souhrnné označení stavu, kdy se rostlina nachází

pod

nevýhodným

vlivem

těchto

stresových

faktorů

(Obr.

1)

(PROCHÁZKA, 1998).

Obr. 1: Přehled nejdůležitějších stresových faktorů (PROCHÁZKA, 1998) Některé z vnějších faktorů, jako například teplota vzduchu, se mohou stát pro rostlinu stresujícími již po několika minutách. Jiné, jako například obsah vody v půdě, se stanou stresovými po několika dnech či týdnech a faktor jako deficit minerálních prvků v půdě se může stát stresujícím až po několika měsících. Koncept stresu je úzce spojen s konceptem tolerance ke stresu, tedy schopnosti rostliny vyrovnat se s nepříznivými podmínkami. Pokud se tolerance zvyšuje po vystavení předchozímu stresu, tvrdíme o rostlině, že se aklimatizuje. Aklimatizaci je nutno oddělit od adaptace, která obvykle odkazuje na geneticky determinovanou úroveň odolnosti získanou procesem selekce během fylogenetického vývoje (TAIZ a ZEIGER, 2006). Adaptace i aklimatizace k stresům v prostředí vychází z propojených událostí objevující se na všech organizačních úrovních, od úrovně anatomické a morfologické po úroveň buněčnou, biochemickou a molekulární. Buněčné odpovědi zahrnují změny v buněčném cyklu, endomembránovému systému a vakuolizaci buněk a změny 8

v architektuře buněčné stěny. Na biochemické úrovni rostliny pozměňují metabolismus, aby se stresu přizpůsobily, například produkcí osmoregulačních sloučenin. V současné době jsou pro objasnění molekulární podstaty stresové odpovědi velmi intenzivně využívány především transkriptomické studie (TAIZ a ZEIGER, 2006). 1.1.1 Světlo jako stresor Přestože růst rostliny je závislý na světle, přebytek světla pro ni může být stresující. Velké množství světla produkuje přebytek energie z fotosyntézy, která musí být rozptýlena, aby se zabránilo fotooxidačnímu zranění. Nejcitlivější na vysokou intenzitu jsou chloroplasty, obzvlášť fotosystém II. Prvotní reakcí na vysokou intenzitu světla, která se objeví v řádech několika sekund či minut, je snížení pH v lumenu tylakoidů způsobené přebytkem elektronů. Mechanismy rozptýlení elektronů zahrnují fotoredukci kyslíku ve fotosystému I, xantofylový cyklus a zvýšenou fotorespiraci. Opačný extrém – nízká intenzita světla – je detekován fytochromy a vyústí v morfologické a růstové změny a změny v životním cyklu. Ultrafialové záření, zejména UV-B poškozuje DNA a proteiny. Rezistence k UV poškození vyvíjí speciální rostlinné metabolity, které fungují jako ochrana proti záření (např. flavonoidy a sinapoyl estery) a morfologické adaptace (SMITH a ZEIGER, 2010). 1.1.2 Deficit kyslíku - anoxie Nedostupnost kyslíku pro kořeny rostlin je typická pro utužené či zaplavené a podmáčené půdy, kde voda vyplní póry v půdě a tak blokuje difúzi kyslíku z plynné fáze. Při vyšších teplotách jak 20°C může být kyslík z půdy zcela odčerpán kořeny, půdní faunou a mikroorganismy (TAIZ a ZEIGER, 2006). Po vytěsnění kyslíku z kapilár se snižuje jeho transport a koncentrace v rostlině. Rostlina reaguje na nedostatek kyslíku již v případě, že jeho koncentrace v mezibuněčných prostorách poklesne pod 2­4%. V tomto okamžiku se začnou zastavovat aerobní respirační procesy; nejprve dojde k zastavení funkce elektronových dýchacích řetězců v mitochondriích a dojde k hromadění NADH (nikotinamid adenin dinukleotid), jehož hromadění pak inhibuje činnost Krebsova cyklu. To vede k nižší energetické výtěžnosti a zároveň hromadění toxických látek jako je ethanol a kyselina mléčná (BLÁHA, 2006). Hypoxie pak stimuluje produkci prekurzoru ethylenu ACC (1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina) a zvyšování obsahu ethylenu v rostlině. Ten poté vede ke smrti a rozkladu buněk kůry kořenů a tvorbě tzv. aerenchymů. Tyto původně vyplněné buňky pak

9

vytvoří vzduchem vyplněné dutiny, které usnadňují pohyb kyslíku. Tato adaptace je častá u rostlin přizpůsobených životu v zaplavených půdách, jako je např. rýže nebo bažinné a mokřadní rostliny (TAIZ a ZEIGER, 2006). 1.1.3 Stres zasolením Stres zasolením je způsoben akumulací solí v půdě. Halofytní druhy jsou k vysokým koncentracím solí tolerantní, ale u citlivých druhů způsobuje zasolení potlačení růstu a fotosyntézy. Rostliny jsou poškozovány sníženou dostupností vody, která je dána poklesem vodního potenciálu půdy, a toxicitou specifických iontů nahromaděných ve škodlivých koncentracích. Mechanismy odpovědi na stres z nadbytku solí jsou podobné mechanismům na vyrovnání stresu suchem. Zahrnují syntézu

osmolytů (povahy

nukleových kyselin, terciálních sulfonových kyselin, kvarterních amonných solí a polyolů), LEA proteinů (akumulované v pozdní fázi embryogeneze), jejichž geny jsou indukovány osmotickým stresem, a aquaporinů, které zajišťují propustnost vody plasmatickou membránou. Vnímání a přenos stresového signálu stejně jako u stresu suchem vyvolává signální dráhy na kyselině abscisové (ABA) závislé a na ABA nezávislé. Odpověď zahrnuje navýšení cytosolického vápníku a SOS3, který kóduje vazebný protein objevený při studiích mutantů Arabidopsis thaliana se zvýšenou citlivostí na sůl (sos mutanti). Tím je spuštěna kaskáda proteinových kináz aktivující antiport v plasmatické membráně, který následně exportuje přebytečné ionty z buňky a zachová se tak homeostáze iontů. Dalším mechanismem zabránění poškození ionty je jejich sekvestrace ve vakuolách (SMITH a ZEIGER, 2010; TAIZ a ZEIGER, 2006) 1.1.4 Vodní deficit a stres suchem Vodní deficit je determinován jako jakýkoliv obsah vody v buňce nebo tkáni, který je pod nejvyšším možným obsahem vody v hydratovaném stavu. Při snížen vodní složky v rostlině se její buňky zmenší a buněčné stěny ochabnou. Snížení obsahu vody vede ke snížení turgoru, které je nejrannějším signifikantním biofyzikálním efektem vodního deficitu. Proto jsou vodním deficitem jako první zasaženy pochody na turgoru závislé, jako je růst listové plochy či elongace kořenů (TAIZ a ZEIGER, 2006) Již při malých změnách turgoru o 0,1 – 0,2 MPa dochází k měřitelnému úbytku růstu a při poklesu vodního potenciálu na -0,3 ­ -0,4 MPa dochází již k zastavení růstu. Pokles vodního potenciálu do hodnot -0,2 až -0,8 MPa vede k rychlým změnám aktivity enzymů, snížení syntézy proteinů a cytokininů a zpomaluje se buněčné dělení

10

(BLÁHA, 2006). Menší listová plocha vytranspiruje méně vody a rostlina tak lépe využívá limitovaný obsah vody v půdě, proto je redukce transpirace a následně listové plochy první obranou proti suchu. Snížení transpirace je dosaženo buď hydropasivním uzavíráním průduchů v důsledku snížení turgoru, nebo hydroaktivním zavíráním průduchů, které je řízeno kyselinou abscisovou, jejíž koncentrace v listech se zvýší až padesátkrát. Abscise listů je výsledkem syntézy rostlinného hormonu etylenu a citlivosti rostliny na něj. Pro udržení záporného vodného potenciálu, který umožňuje příjem i hůře dostupné vody z půdy, dochází k osmotickému vyrovnávání pomocí osmolytů, kterými je například aminokyselina prolin (Pro), cukerné alkoholy (sorbitol, manitol) a kvarterní aminy (glycin betain) (TAIZ a ZEIGER, 2006). Dalším význačným stresorem je působení extrémních teplot a tato problematika je detailněji probrána v samostatné kapitole 1.2.

11

1.2 Vnímání teploty a teplotní stres Rostliny vykazují širokou škálu reakcí na teplotu jejich prostředí. Některé z těchto reakcí jsou rychlé, jiné shromažďují údaje o teplotách v průběhu několika dní až týdnů, např. porušení dormance pupenů nebo jarovizace. Rostliny reagují odpověďmi už při malých změnách teploty a tu jsou schopny vnímat velmi přesně. Některé z klíčových vývojových pochodů rostlin jsou schopny vnímat už změny o 1 °C (Obr. 2) (PENFIELD, 2008).

Obr. 2: Schematické znázornění teplotních rozsahů hlavních charakterizovaných rostlinných odpovědí na okolní teplotu (PENFIELD, 2008) 1.2.1 Chladový stres a aklimatizace Chladové a mrazové poškození se vyskytuje u tropických a subtropických plodin vystavených podmínkám mírného pásma. Genetická adaptace na chladnější teploty je spojena s nadmořskou výškou. Odolnost se také často zvyšuje, jsou-li rostliny nejprve aklimatizovány nízkou, ale nezraňující teplotou. Poškození chladem se vyskytuje při teplotách, které jsou nad bodem mrazu, ale neumožňují normální růst rostliny. Na druhou stranu mrazové poškození se objevuje za teplot nižších, než je bod zmrznutí vody. Listy rostlin zraněných chladem vykazují inhibici fotosyntézy, pomalejší translokaci sacharidů, nižší míru dýchání, inhibici proteosyntézy a zvýšenou degradaci stávajících proteinů. Všechny tyto odpovědi zřejmě závisí na společném základním mechanismu 12

zahrnujícím ztrátu membránové funkce v důsledku změn jejích biofyzikálních vlastností. Poškození mrazem je primárně spojeno s formováním ledových krystalů v buňkách a orgánech, které prorazí a zničí subcelulární struktury. Při vzniku ledových krystalů také dochází k dehydrataci buněk, která je způsobena přesunem vody do extracelulárních prostor v důsledku vyrovnávání osmotických potenciálů mezi ledem a tekutou vodou (TAIZ a ZEIGER 2006). O podstatě chladového stresu lze získat informace i ze studií chladové aklimatizace. Během té dochází ke změnám v genové expresi. Studie rozvíjené na základě tohoto zjištění vedly o objevení skupiny transkripčních aktivátorů CBF/DREB1, které se váží na specifickou regulační oblast DNA CRT/DRE (C­repeat ­ CRT, dehydratation responsive element ­ DRE) kódující geny, které hrají klíčovou roli v chladové aklimatizaci. Geny s touto regulační oblastí kódují proteiny, které se podílejí na stabilizování membrán. Zároveň byly pozorovány zvýšené obsahy prolinu a cukrů, které se zřejmě přispívají k chladové toleranci díky stabilizaci membrán. Z tohoto důvodu se zdají být regulační proteiny CBF/DREB1 hlavními „spínači“, které integrují aktivaci velkého množství komponent odpovědi na chladovou aklimatizaci (THOMASHOW, 2001) 1.2.2 Stres vysokými teplotami Většina pletiv vyšších rostlin není schopná přežít prodlouženou expozici teplotám vyšším jak 45 °C. Nerostoucí buňky nebo dehydratované pletiva (např. semena a pyl) mohou přežít mnohem vyšší teploty než hydratované vegetativní rostoucí buňky. Aktivně rostoucí buňky jen zřídka odolají teplotám nad 45 °C, ale suchá semena mohou snést 120 °C a pylová zrna některých druhů i 70 °C (TAIZ a ZEIGER 2006). Přestože dosud není známý přímý receptor teploty u rostlin, bylo nalezeno několik mechanismů, jakými rostliny tepelný stres vnímají a vyrovnávají se s ním. Současné výzkumy

ukazují,

že

vzrůst

teploty

je

vnímán

plasmatickou

membránou

a v signalizačních drahách se podílí ionty vápníku (HOFMANN, 2009). 1.2.2.1 Proteiny teplotního šoku Proteiny teplotního šoku se objevují při teplotním vzrůstu o 5-10 °C a v buňce se chovají jako molekulární chaperony. Když se při tepelném stresu některý z mnoha buněčných proteinů fungující jako enzym nebo strukturní komponent rozbalí nebo špatně sbalí a tím ztratí svoji správnou strukturu a funkci, může se shlukovat a srážet, čímž poškozuje buňku. HSP jako molekulární chaperony slouží k dosažení správného

13

sbalení proteinů a k opravě rozložených a agregovaných proteinů a zabránění opětovného rozbalení (TAIZ a ZEIGER 2006).

Obr. 3: Cyklus faktorů tepelného šoku (HSF) aktivuje syntézu mRNA proteinů tepelného šoku. V nestresovaných buňkách existují HSF v monomerním (1) stavu asociované s HSP70 proteiny. Po tepelném stresu HSP70 disociují z HSF, které vytvoří trimery (2). Aktivní trimer se naváže na elementy tepelného šoku (HSE) v promotérové oblasti genů pro proteiny tepelného šoku (HSP)(3) a aktivuje transkripci mRNA HSP vedoucí k translaci HSP, mezi kterými jsou také HSP 70 (4). Trimery HSF připojené na HSE jsou fosforylovány (5) a následně jsou na ně navázány HSP70(6). Komplex trimerů HSP70 (7) disociuje od HSE, rozpadne se a defosforyluje na HSF monomery (8), které se následně vážou na HSP a vytvoří klidový komplex HSP70/HSF. (TAIZ a ZEIGER, 2006) Genové rodiny HSP genů jsou v rostlinách komplexní, protože velké množství z nich je nezbytné také pro normální růst a vývoj. Mezi nejvíce exprimované HSP patří vysoce konzervované rodiny molekulárních chaperonů Hsp101, Hsp90, Hsp70/40, Hsp60 a malé HSP (sHSP)(Tab. 1). HSP100 jsou ATP-ázy zapojené v resolubilizaci agregátů proteinů a jsou nezbytné pro toleranci rostlin k vysokým teplotám. Studie v Arabidopsis thaliana ukazují, že HSP101 interaguje s sHSP svými doménami při rozpouštění agregátů vzniklých při tepelném šoku. sHSP jsou nejkomplikovanější skupinou HSP a jsou lokalizovány v cytosolu jaderných kompartmentů, chloroplastech, mitochondriích, endoplasmatickém retikulu a peroxizomech. Vážou se na částečně rozbalené proteiny a předchází jejich nevratnému sražení (KOTAK et al., 2007).

14

Třída HSP HSP100 HSP90 HSP70

Velikost (kDa) 100-114 80-94 69-71

Buněčná lokalizace cytosol, mitochondrie, chloroplasty cytosol, endoplasmatické retikulum cytosol/jádro, mitochondrie, chloroplasty

HSP60 sHSP

57-60 15-30

mitochondrie, chloroplasty cytosol jádra, mitochondrie, chloroplasty, endoplasmatické retikulum, peroxizomy

Tab. 1: Pět tříd TAIZ a ZEIGER, 2006)

HSP

proteinů

nalezených

v rostlinách

(převzato

Transkripty všech hlavních sHSP jsou dramaticky akumulovány během tepelného šoku. Faktory teplotního šoku (HSF) slouží jako konečné komponenty přenosu signálu, zprostředkování exprese HSP a jiných transkriptů indukovaných tepelným šokem. Rostlinné HSF zahrnují tři konzervované evoluční třídy, které tvoří regulační síť (KOTAK et al., 2007). 1.2.2.2 Specifický tok vápníku přes membránu a role sekundárních poslů Stimuly jako je chlad, teplo a osmotický stres mohou dramaticky měnit fyzikální vlastnosti biologických membrán. Membrány přizpůsobují svoje lipidové složení podle vzrůstu teploty a mohou tak regulovat teplo-vnímající složky v nich uzavřené. Studie Saidi et al. (2009) v mechu Physcomitrella patens ukázaly, že v plasmatické membráně jsou přítomny specifické Ca2+ propustné kanály, které zřejmě fungují jako nejranější komponenty vnímání teploty v rostlinné reakci na tepelný šok. Mírný teplotní vzrůst generuje přechodný Ca2+ signál (Obr. 4), který zajišťuje specifickou následnou expresi HS genů. Již po několika minutách po vzrůstu teploty byl pozorován prudký vzrůst intracelulárního vápníku, jehož koncentrace následně pozvolna klesala, až se navrátila téměř na základní úroveň, i přestože teplota zůstávala vysoká. Působení vyšších teplot přineslo také více intenzivní a rychlejší přísun vápníku, který proporcionálně zvýšil reakci na tepelný šok. Míra tepelného šoku závisela mimo samotné šokové teploty také na iniciální teplotě, přičemž větší rozdíl mezi kultivační teplotou a teplotou tepelného šoku vyústil ve větší reakci na tepelný šok (SAIDI et al., 2009; SAIDI et al., 2011). .

15

Obr. 4: Schéma předpokládané vápníkové signalizace v odpovědi na tepelný stres. Tepelný stres způsobuje snížení cytosolického pH z normální slabě alkalické hodnoty, pravděpodobně inhibicí proton čerpajících ATP-áz a pyrofosfatáz, které čerpají protony přes plasmatickou membránu nebo do vakuol. Navíc tepelný stres způsobuje změnu vápníkové homeostázy uvnitř buňky ovlivněním přílivu vápníku do cytosolu buď přes plasmatickou membránu nebo vakuolární vápníkové kanály, nebo působením ATP­áz nebo protonových ko-transporterů. Tato změna v cytosolickém vápníku vede k aktivaci kalmodulinu (CaM), který se váže na glutamát dekarboxylázu (GAD), čímž ji převede do aktivované formy. Konverze glutamátu na γ­aminobutyrovou kyselinu (GABA) je pak uskutečněna pohlcením protonů v procesu a zprostředkováním vzrůstu cytosolického pH. CAX1 a CAX2 jsou transportní proteiny, ACA: Ca2+ ATP­áz. (TAIZ a ZEIGER, 2006) Teplosenzitivní kanály, na rozdíl od jiných receptorů, které mohou používat stejné sekundární

posly,

pravděpodobně

závisí

na

specifických

Ca2+-dependentních

efektorech, jako jsou kalmoduliny (CaM)(SAIDI et al., 2011). Kalmoduliny jsou nejpodrobněji prostudované ze senzorů a jsou také nejvíce konzervovanými proteiny přítomnými ve všech eukaryotických organismech. Rostliny mají ve svém genomu množství CaM genů kódujících identické CaM nebo jejich izoformy. Jde o malé proteiny, které se ukázaly být klíčovým senzorem Ca2+ po dobu reakce na tepelný stres. Protein AtCaM3 se rychle hromadí účinkem tepelného stresu a studie na transgenních rostlinách bez funkčního AtCaM3 ukázali sníženou termotoleranci. Naopak nadprodukce AtCaM3 vykazovala zvýšenou termotoleranci (DEFALCO et al., 2010).

16

Objevují se také důkazy, že tepelný šok je doprovázen oxidačním stresem a že jejich signalizační dráhy jsou překříženy. Nárůst H2O2 se objevil již po velmi krátkém působení vysoké teploty, očividně důsledkem aktivity NADPH oxidázy. Dalším sekundárním poslem zapojeným v množství biotických a abiotických stresů je oxid dusnatý (NO), jehož hladina se zvyšuje po vystavení tepelnému šoku a pravděpodobně existuje

propojení

mezi

hladinou

NO

a

termotolerancí

(KOTAK et al., 2007;

SAIDI et al., 2011).

Obr. 5: Přehled známých signálních drah a faktorů podílejících se na termotoleranci Obrázek ukazuje signalizační komponenty zapojené do odpovědi na tepelný šok a ochranné faktory vedoucí k termotoleranci. Nejlépe charakterizovanou součástí dráhy zahrnuje transkripční faktory tepelného stresu (HSF), které regulují geny kódující proteiny teplotního šoku (HSP), které vystupují jako molekulární chaperony. Červené šipky označují propojení experimentálně potvrzené, prázdné šipky pak hypotetické propojení. Otazníky představují dosud nedefinované faktory příslušné signální dráhy. Rámečky s červenými přerušovanými čárami představují kolekci genových produktů, které jsou známé ovlivněním termotolerance, ale jejichž přesná funkce v síti jsou stále neznámé (KOTAK et al., 2007). Reakce na tepelný stres a jeho přežití jsou tedy komplikovaným fenoménem v rostlinách (Obr. 5). Indukce klasických HSP prostřednictvím sítě HSF je bezesporu důležitá, ale na organizaci reakce tepelného šoku se podílejí také další transkripční

17

faktory a více signalizačních drah, reguluje se množství efektorových komponentů, z nichž

všechny

přispívají

v přežití

pod

vysokým

teplotním

stresem

(KOTAK et al., 2007). 1.2.3 Role proteomu v teplotním šoku V současnosti je k dispozici celá řada proteomických studií zabývající se stresem rostlin u různých druhů a za různých stresových podmínek. Z těchto studií je jasné, že stres nízkou a vysokou teplotou způsobuje různé molekulární odpovědi v rostlinných pletivech. Odpověď na stres vysokou teplotou je charakterizován množstvím HSP, zatímco stres chladem je charakterizován velkými účinky na chloroplastové

Proteiny v odpovědi na tepelný stres

Proteiny v odpovědi na chladový stres

komponenty, ROS detoxifikaci a produkci energie (Tab. 2)(NEILSON et al, 2010). Proteiny pozitivně regulované 2,3 – bisfosfoglycerát-independentní fosfoglycerát mutáza, 20S proteozom, akonitát hydratáza, adenylát kináza A, askorbát peroxidáza, ATPáza, ATP syntáza CFI, kalretikulin, kataláza, chaperonin, cystein proteináza, inhibitor cystein proteinázy, elongační faktor, enoláza, glutathion S-transferáza, HSP (26a, 70, 90-podobné), izoflavon reduktáza, LEA protein, malát dehydrogenáza, nukleosid difosfát kináza, oxalyl-CoA dekarboxyláza, fosfoglukonát dehydrogenáza, RAB protein, ribonukleoprotein, ribozomální protein, RNA/mRNA vazebný protein, Rubisco, S-adenosylmethionin syntetáza, thioredoxin, UDP-glukóza pyrofosforyláza Proteiny negativně regulované askorbát peroxidáza, ATPáza, ATP syntáza, kalretikulin (prekurzor), elongační faktor, HSP, Rubisco, protein vázající Rubisco podjednotky, UDP-glukóza pyrofosforyláza Proteiny pozitivně regulované ATP sulfuryláza, ATP syntáza, chaperonin, elongační faktor EF-Tu, glutathion S-transferáza, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, GTPvázající jaderný protein RAN, malé HSP (prekurzory, izoformy, 17, 17.3, 17.4, 17.6A, 17.6B, 17.7, 17.9, 18, 18.1, 19.2, 21, 22 kDa), HSP (66.2, 70, 70b, 79.5, 80, 82, 83, 90, příbuzný 80 kDa), thioredoxin h, UDP glukóza pyrofosforyláza Proteiny negativně regulované adenosylhomocysteináza, ATP syntáza, methionin syntáza, peroxidáza, pyrofosfatáza

Tab. 2: Příklad exprimovaných proteinů v odpovědi na chladový a tepelný stres (NEILSON et al., 2010)

18

Exprese určitých genů a syntéza specifických proteinů je společná pro tepelný i chladový stres, ale některé aspekty chladem indukované genové exprese se liší od těch produkovaných tepelným stresem. Zatímco během chladu je syntéza „housekeeping“ proteinů (proteinů potřebných pro zkladní metabolické dráhy, vytvářených za absence stresu) není výrazně snížená, během tepelného stresu je tato syntéza v podstatě ukončena. Na druhou stranu je syntéza některých HSP pozitivně regulována během chladového stresu stejně jako u tepelného stresu. To ukazuje, že destabilizace proteinů provází jak tepelný tak chladový stres, a že mechanismus stabilizace proteinových struktur je během tepelných i chladových stresů je důležitá pro přežití rostliny (TAIZ a ZEIGER, 2006).

19

1.3 Rostlinné hormony a teplota Fytohormony, jako je abscisová kyselina (ABA), salicylová kyselina (SA) a ethylen, jsou u různých rostlinných druhů zapojeny do signalizace reakce na tepelný šok. Pozorován byl přechodný vzrůst ABA v reakci na tepelný šok v rostlinách hrachu a zároveň při zotavování z tepelného šoku. Rostliny Arabidopsis thaliana s mutací v signalizaci ABA abscisic acid isensitive 1 (abi1) and abi2 vykázali sníženou životaschopnost po tepelném šoku, přestože v těchto mutantech nebyla ovlivněna akumulace proteinů teplotního šoku. Podobný vzrůst hladiny v reakci na tepelný šok byl pozorovaný také u SA a zdá se, že SA pracuje v návaznosti na ABA. Stejně jako ABA však není SA potřebná k syntéze HSP (KOTAK et al., 2007) Rostoucí množství důkazů také ukazuje, že rostliny používají endogenní hormony pro propojení tempa růstu s teplotou okolí. Trpasličí variety pšenice s defektem v signální dráze giberelinů (GA) nebyly schopny obnovit normální růst při přechodu z nízkých do normálních teplot. Teplotou indukované prodlužování stonku je spojeno se změnou metabolismu GA. Nízké teploty ovlivňují expresi genů metabolismu GA, převážně expresi GA 2­oxidázy. Zvýšené tempo růstu závisí však mimo GA také na zvýšeném obsahu indol­3­octové kyseliny (IAA), která je nejznámějším nativním auxinem. Působením vysoké teploty byl v hypokotylech Arabidopsis thaliana pozorován vzrůst IAA, naopak snížení teploty vedlo k snížení exprese reportéru odpovídajícího na auxin, což ukazuje, že teplotní signály mohou modifikovat syntézu a distribuci auxinů. Zdá se tedy, že GA a auxiny se společně podílejí na rytmickém růstpodporujícím výstupu, který je silně závislý na okolní teplotě (PENFIELD, 2008) Cytokininy se zdají být také úzce propojené s teplotou. Je známo, že vnímání teploty u některých sinic (např. Synechocystis) je uskutečňováno pomocí histidinových kináz, které jsou součástí dvou­komponentální signální dráhy (SUZUKI et al., 2000). Podobná signální dráha je také hlavním doposud známým receptorem cytokininového signálního řetězce v rostlinách (viz kap. 1.4.3). Role cytokininů v teplotní signalizaci je také podporována několika dalšími pracemi. Za chladových teplot dochází ke snížení cytokininové signalizace (ARGUESO et al., 2009). Jsou také pozorovány snížení v hladinách endogenních cytokininů v rostlinách podrobených tepelnému šoku (HARE et al., 1997) a zvýšení cytokininových účinků za působení vysoké teploty na Arabidopsis thaliana (BURKHANOVA et al., 2001). Jeon et al. (2010) zjistili, že chlad výrazně indukoval expresi genů skupiny regulátorů odpovědi na cytokininy (typ A) 20

a mutanti v místech genů histidinových kináz, které expresi regulátorů typu A zprostředkovávají, vykazovali zvýšenou toleranci proti chladu. Dobrá et al. (2010) pozorovali přechodné zvýšení bioaktivních cytokininů a změnu v jejich poměru, konkrétně zvýšení obsahu iP doprovázené snížením tZ v rostlinách tabáku se zvýšeným obsahem osmoprotektantu prolinu za tepelného stresu. Bylo také prokázáno, že během teplotního stresu roste hladina cytokinin oxidázy. Ta se podílí na snižování hladiny endogenních cytokininů a exprese genů pro oxidázu se zdá být indukována vzrůstem kyseliny abscisové (BRUGIÈRE et al., 2003).

Černý et al. (2011a) pak našli

pravděpodobné propojení proteinů a fosfoproteinů účastnících se rychlé odpovědi na cytokininy a vnímáním teploty a odpovědí na stres.

21

1.4 Cytokininy Cytokininy byly objeveny jako jeden z faktorů, které stimulují buněčné dělení. Reprezentují důležitou třídu rostlinných fytohormonů, u nichž byla prokázána důležitá role při mnoha jiných fyziologických a vývojových procesech, jako je například senescence, mobilizace živin, apikální dominance, tvorba a aktivita apikálního meristému, vývoj květů, porušení dormance pupenů a klíčení semen. Také se zdá, že zprostředkovávají mnoho aspektů světlem regulovaného vývoje, zahrnující diferenciaci chloroplastů,

vývoj

autotrofního

metabolismu

a

rozvoj

listů

a

děloh

(TAIZ a Zeiger, 2006). 1.4.1 Struktura cytokininů V přírodních formách se vyskytují isoprenoidní a aromatické cytokininy. K běžným zástupcům přírodních isoprenoidních cytokininů patří N6 – (∆2 –izopentyl)-adeniny (iP), trans-zeatiny (tZ), cis-zeatiny (cZ)a dihydrozeatiny (DZ) (Obr. 6).

Obr. 6: Isoprenoidní cytokininy (SAKAKIBARA, 2006) Za nejhojněji zastoupené se považovali tZ a iP a také jejich cukerné deriváty, ale je prokázána spousta variací v závislosti na rostlinném druhu, pletivu či vývojovém stádiu. Například cytokininy typu tZ a iP jsou považovány za hlavní formy v Arabidopsis thaliana, kdežto podstatné množství cytokininů typu cZ bylo nalezeno v rýži, kukuřici a cizrně. Aromatické cytokininy ortho-topolin (oT), meta-topolin (mT), jejich methoxyderiváty (meoT, memT) a benzyladenine (BA)(Obr. 7) byly nalezeny pouze u některých rostlinných druhů.

22

Několik syntetických derivátů se vykazuje cytokininovou aktivitou, nebyly však dosud v přírodě objeveny (SAKAKIBARA, 2006).

Obr. 7: Aromatické cytokininy (SAKAKIBARA, 2006)

1.4.2 Biosyntéza a metabolismus cytokininů Hlavním místem syntézy cytokininů jsou apikální meristémy kořenů. Z kořenů jsou poté transpiračním proudem vedeny spolu s vodou a minerály do nadzemních částí rostliny. Kořeny ale nejsou jediným místem syntézy cytokininů. Syntéza cytokininů byla například pozorována u embryí kukuřice, mladých vyvíjejících se listů, mladých plodů

a

pravděpodobně

se

dá

očekávat

v mnoha

dalších

pletivech

(TAIZ a ZEIGER, 2006). Biosyntéza cytokininů de novo může probíhat mevalonovou cestou (MVA), která se týká preferenčně cZ, nebo methylerythritol fosfátovou cestou (MEP) – preferenčně syntetizující iP a tZ (Obr. 8). Prvním krokem syntézy isoprenoidních cytokininů je přenos

isopentylové

skupiny z DMAPP

(dimethylallyldifosfátu)

na

N6­konec

adenosin­5´­fosfátu (ATP/ADP/AMP). Tento transfer je katalyzován enzymem adenosinfosfát­isopentyltransferázou (IPT, EC 2.5.1.27). Poprvé byl gen ipt, který kóduje tento enzym, nalezen u půdní bakterie

Agrobacterium tumafeciens

(AKIYOSHI et al., 1984). Geny kódující IPT byly objeveny poté u vyšších rostlin (SAKAKIBARA, 2006). Produktem tohoto kroku jsou isopentyladeninribotidy (iPR). V Arabidopsis thaliana jsou iP nukleotidy konvertovány na tZ nukleotidy cytochrom P450 mono-oxygenázami CYP735A1 a CYP735A2. Aby se staly biologicky aktivními, 23

jsou iP- a tZ- nukleotidy transformované na příslušné nukleové báze defosforylací a deribosylací (HIROSE et al., 2008)

Obr. 8: Schéma biosyntézy a metabolismu cytokininů (SAKAKIBARA, 2006) Cytokininy mohou také vznikat drahou spojenou s metabolismem tRNA, která v rostlinách obsahuje modifikovaný adenosinový zbytek, který je po hydrolýze schopen tvořit cytokininy. Tento pochod je katalyzován tRNA – isopentyltransferázou. Role tRNA­IPT však byla prokázána teprve po analýze mutantních rostlin Arabidopsis thaliana, u nichž byly funkčně vyřazeny geny AtIPT2 a 9. Biosyntéza aromatických cytokininů zůstává v současné době neobjasněna (KASAHARA et al., 2004; MIYAWAKI et al., 2006). Inaktivace cytokininů probíhá pomocí degradace nebo konjugace. Místy konjugace je dusík adeninového kruhu nebo hydroxylová skupina na postranním řetězci. Glukosylací

hydroxylové

skupiny

postranního

řetězce

vznikají

O-glukosidy

a O­xylosidy. Tento proces je reverzibilní a deglykosylace je katalyzována β­glukosidázou. Na pozici N3, N7 a N9 purinové složky byla pozorována glukosylace za tvorby N-glukosidů. Tyto konjugáty nejsou efektivně štěpeny β­glukosidázou, proto je N-glukosilace prakticky nevratná. Přestože v současnosti nejsou fyziologické 24

důsledky v rozdílné stabilitě N-glukosidů a O-glukosidů plně pochopeny, předpokládá se, že snadno štěpitelné O-glukosidy reprezentují inaktivní zásobní formu cytokininů (MOK a MOK, 2001). Na snižování hladiny aktivních cytokininů jejich degradací se podílí cytokinin oxidáza/dehydrogenáza (CKX). Tento enzym nevratně konvertuje cytokininy a jejich ribonukleotidy s nenasyceným postranním řetězcem na adenin nebo adenosin a odpovídající aldehyd (Obr. 9). Ačkoliv byl enzym objeven a popsán jako oxygenáza, ukázalo se, že během jeho katalytické reakce není třeba kyslík a nevzniká peroxid vodíku jako u běžných oxidáz, CKX se tedy chová jako dehydrogenáza. Dehydrogenázový charakter enzymu je také potvrzen přítomností kovalentně vázaného FAD (GALUSZKA et al., 2001).

Obr. 9: Pravděpodobný reakční mechanismus degradace iP pomocí CKX v pšenici (GALUSZKA et al., 2001). Mezi iP (I) a jeho ketiminem (II) existuje rovnováha; ketimin může být oxidován na aldimin (III) a poté hydrolyzován na 3-methyl-2-butenal (IV) a adenin (V). Elektronový akceptor (A) odčerpá dva elektrony přes flavinový kofaktor paralelně s dehydrogenací substrátové ketiminové formy. Rovnováha mezi jednotlivými formami cytokininů má velký vliv na biologickou aktivitu a je do značné míry určen jejich afinitou k metabolickým enzymům. Například tZ a iP jsou snadno degradovány CKX různých druhů rostlin, kdežto cZ obecně méně podléhá degradacím. A protože CKX rozeznávají dvojnou vazbu na postranním řetězci, jsou DZ a aromatické cytokininy vůči tomuto enzymu rezistentní (SAKAKIBARA, 2006).

25

1.4.3 Signální dráhy cytokininů Model přenosu signálu cytokininů se ukázal být podobný dvou-komponentní kaskádě, s níž bakterie vnímají a odpovídají na stimuly životního prostředí. U rostlin je dvou-komponentní kaskáda nejlépe popsána u modelové rostliny Arabidopsis thalianna a zde je přenos signálu zajištěn čtyřmi po sobě jdoucími fosforylacemi (Obr. 10) (TO a KIEBER, 2008).

Obr. 10: Model cytokininové signalizace (TO a KIEBER, 2008) Cytokininy jsou vnímány receptorem, kterým je histidinová kináza (AHK, ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE) AHK2, AHK3 a AHK4 (původně izolován jako receptor

cytokininů

CRE1

-

CYTOKININE

RESPONSE

1)

v membráně

endoplasmatického retikula. Signál přijme extracelulární CHASE doména (cyclase/His kinase-associated sensing extracellular) a vyvolá autofosforylaci histidinového (His) zbytku na kinázové doméně. Fosforylová skupina je přenesena přes konzervovaný zbytek kyseliny asparagové (Asp) na doméně příjmače na konzervovaný His fosfotransferového proteinu (AHP).

Tyto AHP se pak translokují do jádra, kde

přenesou fosfátovou skupinu k příjmačové Asp doméně regulárotů odpovědi typu­B (ARR). Ty jednak zprostředkovávají transkripci v odpovědi na cytokininy, ale také

26

aktivují druhou skupinu regulátorů odpovědi typu­A, které jsou negativními regulátory cytokininů (TO a KIEBER, 2008). Poruchou podrodin genů ARR typu­A ovlivňuje více aspektů rozvoje, zahrnující velikost květu, prodlužování květů, fylotaxi, funkci meristému a embryonální vývoj. Čtyři typy-A ARR jsou přímo potlačovány meristémovým transkripčním faktorem a porucha těchto regulátorů vede ke snížení funkce apikálního meristému Další typy genů ARR typu­A jsou regulovány auxinem a hrají roli v determinaci kmenových buněk embrya.Mezi různými regulátory typu­B existuje rozsáhlé funkční překrývání, které lze prokázat na základě porovnání jejich expresních profilů. Rostliny s mutací v genech typu­B ARR se vykazovaly snížením obsahu chlorofylu a s tím spojenou citlivostí na světlo a produkcí antokyanů jako fotoprotektantů. Další studie ukazují, že ARR typu­B jsou potřebné k zprostředkování negativního vlivu cytokininů na dělení buněk v kořenech (ARGUESO et al., 2009; ARGYROS et al., 2008). 1.4.4 Interakce cytokininů a světla Signální cesty pro světlo a cytokininy jsou evidentně provázány. Změny objevující se v etiolizovaných klíčních rostlinách v odpovědi na světlo, tzv. fotomorfogeneze, můžou být částečně napodobeny růstem klíčních rostlin za přítomnosti exogenních cytokininů nebo zvýšením hladiny endogenních cytokininů. Rostliny s mutací v genech pro ARR typu-A jsou více citlivé k červenému světlu, což ukazuje, že regulátory odpovědi typu-A jsou negativními regulátory fytochromu, který je fotoreceptorem červeného světla a klíčový mediátor v mnoha světelných reakcích. Také je známo, že degradace cytokininů pomocí CKX je spojena s odpovědí na zastínění u Arabidopsis thaliana. Rostliny rostoucí pod zastíněním získávají malý poměr červeného/dalece červeného světla (red/far red – R/FR). Vystavení tomuto nízkému poměru R/FR vede k rapidnímu nárůstu auxinové signalizace, která vede k vzrůstu exprese CKX (ARGUESO et al., 2009).

27

1.5 Proteomika a metody Termín „proteom“ byl poprvé použil Marc Wilkins roku 1994 a pochází ze slov protein a genom. Proteom je definován veškerých proteinů kódovaných genomem v organismu. Proteomika se tedy zabývá pochopením struktury, funkce a vzájemných vztahů veškerého obsahu proteinů v organismu (MISHRA, 2010). Proteiny tvoří podstatnou součást buněčných struktur a podílejí se na prakticky všech buněčných funkcích: převádějí a zpracovávají biologickou informaci, uskutečňují výměnu látek a energie (metabolismus). Množství jednotlivých proteinů však může v eukaryotické buňce kolísat v rozmezí 106 molekul a dosahuje až 1030 v séru (KOVÁŘOVÁ, 2005). Proteomika může být rozdělena do několika odvětví. Za prvé může jít o tzv. mikrocharakterizaci proteinů určenou pro identifikaci proteinů a jejich posttranslačních modifikací. Diferenční proteomika

porovnává rozdíly v expresi

proteinů s potencionálním využitím např. v hledání biomarkerů pro široké spektrum chorob. Třetí oblastí jsou studie zabývající se interakcemi proteinů. Protože není vždy možné určit funkci proteinu jen na bázi homologie s jiným proteinem nebo jejich prostorové struktuře, je důležitá funkční proteomika (PANDEY a MANN, 2000). V porovnání s genomem, který je téměř neměnnou částí organismu, je transkriptom a proteom vysoce proměnný a závisí na podmínkách a aktivitách organismu. Proteomika doplňuje transkriptomická data o době a místu syntézy a akumulace stejně jako i informace o posttranslačních modifikacích. Exprese genu nemusí znamenat, že je protein syntetizován a také neříká, jak rychle je protein přeměněn (GROTEWOLD, 2003). Navíc jeden gen nemusí znamenat jeden transkript, z nějž vychází jen jeden protein. Alternativní sestřih mRNA může mít za výsledek mnoho transkriptů z jednoho genu. Alternativní počátek translace může produkovat rozdílné proteiny z těchto transkriptů a tyto proteiny mohou být cíleny v různých buněčných kompartmentech a/nebo mít rozdílné funkce (PECK, 2005). Míru syntézy proteinu není možno odhadovat pouze podle zastoupení mRNA, protože to může a nemusí korelovat se zastoupením proteinů. Hladiny proteinů kódované mRNA, která byla zastoupena v přibližně stejném množství, se mohou lišit až 30-násobně (GYGI et al., 1999). Nedávná studie Baginského et al. (2010) porovnávající vztah mezi transkriptomem a produkovanými proteiny odhalila, že až 20 % sledovaných genů/proteinů se lišilo výrazně v zastoupení (Graf 1). Je proto patrné, že proteomika je

28

komplementární ke genomice a v mnoha ohledech ji překonává, protože se soustředí na produkty genů, tedy skutečné aktivní složky buňky.

Graf 1: Korelační analýza 345 genů na úrovni transkriptů a proteinů v listech Arabidopsis thaliana (BAGINSKY et al., 2010) Další z unikátních vlastností proteomiky je schopnost analyzovat posttranslační modifikace (PTM) proteinů. Fosforylace, glykosilace, methylace, oxidace či acetylace jsou extrémně důležité pro funkci proteinu, protože determinují jeho aktivitu, stabilitu, lokalizace a míru přeměny. Tyto modifikace však nejsou patrné z genomické sekvence či expresní analýzy mRNA (PANDEY a MANN, 2000). PTM jsou často také reverzibilní, což znamená, že ačkoliv je v danou chvíli protein modifikován, nemusí se v tomto stavu nacházet po celou dobu své existence. Takovouto dynamickou modifikací je fosforylace, která je také jednou z nejprostudovanějších PTM. Může „zapínat“ anebo „vypínat“ proteiny, cílit proteiny pro degradaci anebo je vést k formaci nových proteinových komplexů (PECK, 2005). Proteom je velmi komplexní, proto je třeba snížit množství vysokoabundantních proteinů, které mohou maskovat přítomnost méně zastoupených proteinů. V rostlinách tuto roli má hlavní fotosyntetický enzym ribulosabisfosfátkarboxyláza/oxygenáza (Rubisco, EC. 4.1.1.39). Skládá se z 8 velkých a 8 malých podjednotek a jeho obsah může dosáhnout až 60% veškerých proteinů v buňce a představuje také jeden z nejčastěji identifikovaných proteinů v analýzách proteomu. Proto je potřeba Rubisco

29

odstranit, ideálně spolu s dalšími vysoce abundantními chloroplastovými proteiny (ČERNÝ, 2011b). 1.5.1 Dvou-dimenzionální elektroforéza Dvou-dimenzionální elektroforéza (2-DE) má dlouhou historii využití v lékařských, klinických, biologických, genetických nebo toxikologických studiích. Po svém prvotním vzestupu v druhé polovině 70.let 20. stolení, který nastal na základě objevení 2-DE O’Farrellem, došlo ke konci 80.let k jejímu pomalému ústupu. Nicméně díky vývoji metod sekvenování genomů a hmotnostní spektrometrie pro analýzu proteinů a peptidů se 2-DE stala opět oblíbenou a běžně používanou metodou separace proteinů v proteomickém výzkumu (GÖRG et al., 2009). 2-DE spojuje izoelektrickou fokusaci (IEF) v první dimenzi a polyakrylamidovou gelovou elektroforézu za denaturujících podmínek (SDS-PAGE) v druhé dimenzi, čímž umožňuje separaci kompexních směsí proteinů na základě jejich izoelektrického bodu (pI) a relativní molekulové hmotnosti (Mr). V závislosti na použité velikosti gelu a použitém pH gradientu je možné pomocí 2-DE rozeznat až 5000 proteinů a je možno detekovat až 1 ng proteinu na spot (GÖRG et al. 2009). 1.5.1.1

Izoelektrická fokusace (IEF)

Izoelektrická fokusace využívá jedné z fyzikálních charakteristik proteinů – izoelektrického bodu. Ten je dán jejich amfoterním charakterem, díky němuž získá protein kladný nebo záporný náboj v závislosti na pH prostředí. Pokud pak umístíme proteiny do imobilizovaného pH gradientu v elektrickém poli, budou nabité proteiny migrovat k opačně nabité elektrodě, dokud nedosáhnou pH odpovídající hodnotě svého izoelektrického bodu. Imobilizovaný pH gradient je zajištěn gelovou matricí s deriváty polyakrylamidu nazývané imobiliny obsahujícími pufrovací skupiny, které mají charakter slabých kyselin nebo slabých bazí (WESTERMEIER a NAVEN, 2002). 1.5.1.2 Polyakrylamidová

gelová

elektroforéza

za

denaturujících

podmínek

(SDS­PAGE) Po rozdělení podle svého pI jsou proteiny rozděleny v druhém rozměru pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) za přítomnosti denaturačního činidla dodecylsulfátu sodného (SDS). To se naváže na rozbalenou molekulu proteinu průměrně na každou druhou aminokyselinu proteinu, zamaskuje povrchový náboj proteinu a dá mu negativní náboj sulfátové skupiny. Poměr velikost/náboj je stejný pro

30

všechny proteiny, proto separace probíhá převážně jen na bázi velikosti. Proteiny o malé molekulové hmotnosti putují gelem rychleji než vysokomolekulární proteiny (AHMED, 2005). 1.5.1.3 Barvení proteinů Po elektroforéze jsou proteiny na gelu detekovány různými způsoby barvení. Mezi nejběžnější a také nejrychlejší patří barvení pomocí Coomassie Blue. Toto modré barvivo se váže na pozitivně nabité aminokyseliny (jako např. lysin a arginin) a je s ním možno detekovat s až 0,1 μg proteinu. Dále je používáno barvení stříbrem, které je oproti barvení Coomasie více časově náročné. Je však několikanásobně citlivější díky své schopnosti detekovat až 0,1 ng proteinu (AHMED, 2005). 1.5.2 Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie je ústřední metodou pro výzkum proteinů a studium biomolekul obecně. Její princip spočívá v ionizaci molekul a následné separaci těchto nabitých molekul podle jejich poměru velikosti k náboji. Výsledek nám podá informaci o molekulové hmotnosti a chemické struktuře proteinu (MISHRA, 2010). Hmotnostní spektrometrie byla dlouhou dobu omezena na malé a termostabilní molekuly, kvůli nedostatku účinných technik jemné ionizace a transferu ionizovaných molekul z kondenzovaného stavu do plynného, aniž by došlo k jejich fragmentaci. Na konci 80. let 20. století byly vyvinuty dvě techniky pro tvorbu iontů neporušených molekul – ionizace pomocí elektrospreje (ESI) a laserová desorpce/ionizace za přítomnosti matrice (MALDI) – které dramaticky změnily situaci a zpřístupnili polypeptidy analýze hmotnostní spektrometrií (DOMON a AEBERSOLD, 2006). 1.5.2.1 MS - ESI Princip této metody spočívá v rozpuštění analytu v těkavém organickém rozpouštědle a poté protlačen kapilární jehlou pod vysokým napětím. Rozpouštědlo obsahující ionizovaný analyt vychází z kapiláry v podobě tzv. Taylorova kuželu (obr. 11), v němž se těkavé rozpouštědlo odpařuje, dokud kapičky neobsahují čistý analyt. Proces odpařování rozpouštědla je urychlen vstřikováním neutrálního plynu, jako je dusík. Ionizované molekuly jsou poté přeneseny k detektoru analyzátorem na základě jejich poměru hmotnost/náboj (MISHRA, 2010).

31

Obr. 11: Schéma ionizace pomocí elektrospreje (GATES, 2004a) 1.5.2.2 MS - MALDI V této metodě se využívá krystalizace analytu s matricí absorbující UV záření. Matrice obsahující analyt je poté vystavena pulzu laserového paprsku. Během tohoto procesu matrice absorbuje většinu energie a s pouze část předá analytu. Výsledkem je jemná ionizace analytu (Obr. 12)(MISHRA, 2010).

Obr. 12: Schéma ionizace pomocí MALDI (GATES, 2004b)

32

1.5.3 Modifikace 2D PAGE a alternativní metody 1.5.3.1 Blue native PAGE (BN-PAGE) Tato metoda byla poprvé popsána roku 1991 pro separaci membránových proteinových komplexů dýchacího řetězce z lidských mitochondrií. Jde o speciální verzi nativní elektroforézy, která je využívána pro separaci enzymaticky aktivních proteinových komplexů, jako jsou například membránové proteiny, které jsou díky svému hydrofóbnímu charakteru težce detekovatelné pomocí standardní 2D PAGE. Princip separace spočívá v navázání barviva Coomassie Blue G250 k proteinům, čímž jim udělí negativní náboj. Během elektroforézy jsou poté komplexy rozdělovány převážně podle své velikosti a vysoké rozlišení je zajištěno zmenšování velikostí pórů v gradientovém polyakrylamidovém gelu (REISINGER a EICHACKER, 2006). 1.5.3.2 Dvou-rozměrná kapalinová chromatografie (2D LC) V současnosti je v mnoha laboratořích využívána kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií 2D LC/MS k identifikaci proteinů z komplexních vzorků. Nejčastějšími metodami jsou techniky chromatografie se silnou kationtovou výměnou v prvním rozměru a chromatografie s reverzní fází v druhém rozměru. Pro zvýšení citlivosti separace na reverzní fázi je obvykle prováděna v nanoprůtokovém měřítku. Tyto vysoce účinné techniky kapalné chromatografie doplňují nedostatky gelových 2D technik. To platí zejména pro separaci hydrofóbních membránových proteinů (NÄGELE et al., 2004). 1.5.3.3 iTRAQ iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation) je alternativa 2D PAGE založená pouze na hmotnostní spektrometrii. Využívá se při ní sada značek, které se specificky vážou na peptidy ve vzorku a jsou poté identifikovatelné pomocí MS/MS. Tyto značky se vážou na všechny peptidy ve vzorku bez ohledu na třídy a zahrnují tak i posttranslační modifikace (APPLIED BIOSYSTEMS, 2004).

33

2 MATERIÁL A METODIKA 2.1 Rostlinný materiál a jeho kultivace Pro studium interakcí snížené hladiny cytokininů, snížené intenzity světla a teplotního šoku v proteomu byly použity rostliny Arabidopsis thaliana (L.) nesoucí transgen CaMV35S>GR>HvCKX2 na pozadí Col-0 s nadprodukcí enzymu CKX z ječmene (HvCKX2), které je dosaženo dexamethasonem (DEX) indukovanou expresí (ŠÁMALOVÁ et al., 2005) genu CKX2. Semena Arabidopsis thaliana byly nejprve povrchově vysterilizovány v 75% ethanolu po dobu cca 5-7 minut a následně vyseta v biohazard-boxu (Aura vertical S.D.4, Bioair instrument) na sterilizované síťky umístěné do čtvercových Petriho misek (12,5 × 12,5 cm) na živné 1× Murashige – Skoogovo médium (Duchefa) s 1,2% agarem (Duchefa), jehož pH bylo upraveno na 7,8 přídavkem 1 M KOH před autoklávováním. Po sterilizaci byla média obohacena o 10 μM dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma). Po vysetí byly misky oblepeny polopropustnou náplastí Medipor, čímž se dosáhlo zachování sterility uvnitř misky a zároveň umožňuje výměnu plynů s okolím. Připravené misky byly 3 dny ponechány v lednici, aby došlo k vernalizaci semen. Po třech dnech byly misky vertikálně umístěny do kultivačního boxu. Klíční rostliny byly kultivovány po dobu 7 dnů při dvou světelných podmínkách: nízké intenzitě světla 20 μmol.m-2.s-1 a standardní intenzitě 80 μmol.m-2.s-1 v režimu dlouhého dne (16 hod./21 °C světlo; 8 hod./19 °C tma). V 5. dnu kultivace byly rostliny přeneseny na nové MS medium obsahující 10 M DEX či opět DMSO (kontrola). Po uplynutí 48 hodin od aktivace pomocí DEX byly rostliny podrobeny tepelnému stresu teplotou 35 °C po dobu 0, 15, 30 a 180 minut. Dále byl proveden experiment pro sledování zotavení rostlin 120 min po tepelném stresu 35 °C, 60 min. Rostliny byly následně ihned zmraženy v tekutém dusíku a do analýzy skladovány při -80 °C.

2.2 Izolace celkového proteomu s odstraněním Rubisco Přibližně 150-180 mg vzorku bylo homogenizováno za pomoci tekutého dusíku a drcení v třecí misce. Extrakce byla provedena pomocí 0,5 ml pufru TBST (10mM Tris­HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) s přídavkem 7-8 μl inhibitorů proteáz (Sigma­Aldrich) a PVPP (Sigma-Aldrich). Nesolubilizovaná část byla odstraněna centrifugací (5min, 20 000 rpm, 4 °C). Supernatant byl přenesen na kolonku Seppro

34

IgY-Rubisco Spin Column (Sigma-Aldrich) a zpracován podle instrukcí výrobce. Ze vzorků po afinitním ochuzení o Rubisco byl vysrážen celkový protein pomocí TCA/acetonové extrakce: vzorek byl převeden do centrifugační kyvety, kde se z něj pomocí v 8 ml ledově vychlazeného roztoku A (200 ml aceton, 20 g TCA - kyselina trichloroctová, 140 μl 1,2-merkaptoetanol) přes noc při -20 °C vysrážel protein. Poté následovalo několik purifikačních kroků, při kterých byl vzorek vždy zcentrifugován (15 min, 25 000 g, 4 °C) a po odsání supernatantu byl pelet resuspendován. Nejprve v 8 ml roztoku B (200 ml aceton, 20 g TCA, 140 μl 1,2-merkaptoetanol, 149 mg EDTA – ethylendiamintetraoctová kyselina) a poté ponechán 1 hodinu srážet při -20 °C. Poté byl pelet resuspendován v 8 ml roztoku C (200 ml aceton, 140 μl 1,2­merkaptoetanol). Po tomto kroku byl přenesen do 1,5 ml mikrozkumavek a následně vysušen ve vakuové odparce (SpeedVac System). K vysušenému vzorku byl poté přidán solubilizační roztok (SOL) (7 M močovina, 2 M thiomočovina, 2% CHAPS, 90mM dithiothreitol) v poměru 200 μl SOL na 5 mg vzorku. Poté byl vzorek solubilizován pod dobu 2 hodin na třepačce při 30 °C a 500 rpm (počet otáček za minutu). Následně byl pomocí centrifugace (15 min, 35 000 g, 4 °C) odstraněn nesolubilizovaný protein a byla změřena koncentrace proteinů metodou M. Bradfordové (BRADFORD, 1976). Solubilizační protein byl zředěn v poměru 1:1 rehydratačním roztokem (SOL s přídavkem 1% směsi amfolytů pH 3-10 a 0,2% bromfenolové modři). Poté byl ponechán rehydratovat v množství 150 μg proteinu na strip (7cm, nelineární gradient pH 3-10) po dobu 16 hodin.

2.3 Izoelektrická fokusace a SDS-PAGE Po 16 hodinách rehydratace byly vzorky podrobeny izoelektrické fokusaci na PROTEAN IEF Cell Unit (Bio-Rad). Fokusace proběhla při 22 °C v těchto krocích: 150V (20 min), 300 V (20 min), 600 V (20 min), 1500 V (20 min), 3000 V (20 min) a 4000 V stoupající na 12000 V za hodinu. Stripy byly poté ošetřeny pufrem obsahujícím DDT a iodoacetamid (Sigma-Aldrich) k redukci

a

alkylaci

proteinů.

Následně

byly

podrobeny

separaci

8-20%

polyakrylamidovou SDS-PAGE s nastavením: 100 V (10min) a 150 V (60 min) na Mini-PROTEAN 3 Dodeca Cell (Bio-Rad).

35

2.4 Barvení proteinů Po ukončení druhé části 2D PAGE byly gely 3× promyty destilovanou vodou a následně obarveny koloidní Bio-Safe Coomasie G-250 (Bio-Rad). Následovalo opětovné promytí v destilované vodě a skenování Bio-Rad GS-800 kalibrovaným Densitometrem (700 dpi). Gely byly analyzovány Decodon Delta 2D softwarem (http://www.decodon.com/).

2.5 Decodon Delta 2D Software Decodon Delta 2D je standardním programem k analýze 2D map. Gely byly vyhodnoceny podle následujícího postupu: 1) warping (překrytí gelů) - nastavení překrytí 2D map spotů na jednotlivých gelech pomocí warpovacích vektorů; nalezení vektorů spojujících dva spoty u přímo propojených gelů, pro odstranění rozdílů mezi gely, které vznikly v průběhu migrace proteinů, a rozdílů při digitalizaci obrazu. 2) vytvoření fúzního gelu - vytvoření průměrného gelu ze všech vybraných gelů a potlačení pozadí (zredukování signálu šumu a nečistot). 3) detekce spotů - automatická detekce detekuje spoty na základě nastavených prahových kritérií průměrné velikosti spotu, intenzity pozadí; manuální kontrola poté zahrnuje odstranění špatně označených spotů, případné přidání neoznačených či rozdělení směsných spotů. 4) statistické zpracování - výběr signifikantně regulovaných spotů, které jsou statisticky významné. 5) ověření - vizuální prověření každého signifikantně regulovaného spotu na gelu.

2.6 Vyhodnocení dat Proteomická odpověď na teplotní stres za normální i snížené hladiny endogenních cytokininů byla považována za signifikantní, pokud se shodně projevila alespoň ve 2 biologických opakováních. Za signifikantní projev byla stanovena hodnota poměru relativního objemu proteinových spotů aktivovaný:kontrolní vzorek 1,4x pro proteinové spoty splňující hodnotu T-testu 95%. Signifikantně regulované spoty byly vyhodnoceny analýzou hlavních komponent (R software; http://www.r-project.org/).

36

3 VÝSLEDKY A DISKUZE Teplota je klíčovým faktorem prostředí, který dalekosáhle ovlivňuje metabolismus, vývoj a růst rostliny. Suchozemské rostliny jsou často vystaveny velkým výkyvům teplot a to v denních i sezónním měřítku. Na rozdíl od živočichů však rostliny nemohou uniknout těmto nepříznivým teplotním podmínkám a chtějí-li je přežít, musí být schopny dostatečně včas reagovat na molekulární úrovni. Teplota svými výkyvy může negativně ovlivnit produktivitu plodin, čímž se přímo dotýká moderního zemědělství závislého na vysokých výnosech. Značné ekonomické ztráty jsou ročně způsobeny nepříznivými teplotními extrémy a zvýšením intenzity, rozsahu a frekvence vln horka. Mezivládní panel pro klimatickou změnu (Intergovernmental Panel on Climate Change – IPCC) navíc předpokládá, že hromadění skleníkových plynů povede ke zvýšení globální teploty a zároveň častějším teplotním extrémům. Hlavní vliv na výnos plodin pak bude mít vliv zvýšené teploty na fotosyntézu (LONG a ORT, 2010; SAIDI, 2010; ŠETLÍK et al., 2004). V rámci bakalářské práce byl pozorován účinek tepelného šoku 35 °C na sedmidenní klíční rostliny modelové rostliny Arabidopsis thaliana s normální a sníženou hladinou endogenních cytokininů za podmínek standardní a nízké intenzity světla.

3.1 Kultivace a tepelný stres Sedmidenní klíční rostlinky Arabidopsis thaliana s normální a sníženou hladinou endogenních cytokininů, které bylo dosaženo DEX (10 M, 48 h) indukovanou expresí CKX, byly pěstovány na standardní intenzitě světla (80 μmol.m-2.s-1) a nízké intenzitě světla (20 μmol.m-2.s-1). Po vystavení tepelnému stresu 35 °C byly odebírány vzorky v intervalech 0 minut, 15 a 30 minut pro analýzu rychlé odpovědi a 180 minut pro analýzu pozdní odpovědi na tepelný stres. Dále byl proveden pokus za cílem sledovat zotavení rostlin vystavených tepelnému stresu po dobu 60 min a následně přenesených zpět na teplotu optimálních kultivačních podmínek 21 °C.

3.2 Izolace a 2D elektroforéza Jedním z největších problémů proteomických studií je obsah vysokoabundantních proteinů, které znesnadňují nalezení a identifikaci proteinů důležitých pro signální dráhy. Studium proteomu fotosyntetizujících rostlin je takto limitováno obsahem Rubisco. Pro snížení vysokého obsahu Rubisco ve vzorcích tepelně stresovaných rostlin

37

byly proto použity kolony s protilátkami na afinitní depleci Rubisco z extraktu. Tato metoda může snížit obsah Rubisco z původních 30-35% na přibližně 10% (ČERNÝ et al., 2011b). Takto získané celkové proteomy ochuzené o Rubisco byly rozděleny pomocí 2D elektroforézy (Obr. 13, 14) a analyzovány, jak je popsáno v kapitole 3 - Materiál a metodika.

Obr. 13: Schéma 2D analýzy proteomu rostlin Arabidopsis thaliana za stresu vysokou teplotou

38

(1)

(2)

Obr. 14: Sledování účinků tepelného šoku na rostlinách Arabidopsis thaliana. Ukázková mapa proteomu kontrolních rostlin pěstovaných na standardní intenzitě (80 μmol.m-2.s-1)(1) a snížené intenzitě světla (20 μmol.m-2.s-1)(2). 2D mapy získané rozdělením 150 μg proteinu v rozsahu pI 3-10 a molekulové hmotnosti 10-250 kD vizualizované koloidní Bio-Safe Coomasie G-250. Označeny jsou jednotlivé signifikantně regulované proteinové spoty.

39

3.3 Analýza 2D map proteomu Analýza 2D map proteomu proběhla pomocí programu Decodon Delta 2D, jak je popsáno v kapitole 3. Pro zpracování programem bylo celkem použito 118 2D gelů, vždy tedy alespoň 2 ze 3 technických opakování pro každé biologické opakování (Obr. 13). Bylo nalezeno průměrně 416 detekovaných spotů (Obr. 15). Porovnáním relativních objemů spotů vzorek:kontrola (rostlina neošetřená DEX, 0 min tepelný šok) v proteomu rostlin kultivovaných na standardní intenzitě bylo nalezeno 25 signifikantně regulovaných proteinových spotů, což zhruba odpovídá 6 %

z celkového

počtu detekovaných spotů na gelu (Obr. 14/1). Na nízké intenzitě světla bylo

nalezeno

regulovaných, přibližně

10

detekovaných

40

signifikantně

které

reprezentují

%

celkového

spotů

na

počtu gelu

(Obr. 14/2). Pouze 10 proteinových spotů se zdá být přítomno jak na nízké, tak na standardní intenzitě světla. Definitivní

potvrzení,

zda

jde

Obr. 15: Vennův diagram. Schematické zobrazení nalezených regulovaných spotů na jednotlivých světelných intenzitách a jejich překryv.

o totožné proteiny, bude možné až po analýze regulovaných proteinových spotů pomocí hmotnostní spektrometrie.

3.4 Analýza účinku tepelného šoku, snížené hladiny cytokininů a snížené intenzity světla na proteom Arabidopsis thaliana V dalším kroku bylo spočítáno množství regulovaných proteinů pro jednotlivé varianty experimentu standardní a nízké intenzity u kontrolních i aktivovaných rostlin. Nejvíce regulovaných spotů bylo nalezeno u rostlin s normální hladinou endogenních cytokininů vystavených stresu 180 minut a v rostlinách v pokusu o zotavení a to na standardní i nízké intenzitě (Tab. 3).

40

Počet regulovaných spotů pro

Časové intervaly

jednotlivé varianty experimentu – rostliny s normální hladinou

15 minut

30 minut

180 minut

zotavení

Standardní intenzita

13

10

19

16

Nízká intenzita

22

22

30

27

Standardní a nízká intenzita

1

1

7

5

endogenních cytokininů

Tab. 3: Účinek tepelného stresu na proteom Arabidopsis thaliana s normální hladinou endogenních cytokininů. Počet jednotlivých signifikantně regulovaných spotů (T­test ≥ 95%) v brzké (15 a 30 minut) a pozdní (180 minut) odpovědi na tepelný šok a po aklimatizaci. U rostlin se sníženou hladinou endogenních cytokininů díky DEX indukované expresi cytokininoxidázy CKX bylo nalezeno na standardní intenzitě světla podstatně méně regulovaných spotů jak na intenzitě nízké. Největší množství regulovaných spotů bylo opět v čase 180 minut po tepelném šoku a v pokuse o zotavení, navíc bylo větší množství pozorováno také v časné odpovědi 15 minut. Počty regulovaných proteinů v různých variantách experimentu při nízké intenzitě světla byly mimo 30. minuty velmi podobné (Tab. 4). Počet regulovaných spotů pro

Časové intervaly

jednotlivé varianty experimentu - rostliny se sníženou hladinou

15 minut

30 minut

180 minut

zotavení

Standardní intenzita

8

14

13

16

Nízká intenzita

27

23

32

32

Standardní a nízká intenzita

0

3

5

6

endogenních cytokininů

Tab. 4: Účinek tepelného stresu na proteom Arabidopsis thaliana se sníženou hladinou endogenních cytokininů. Počet jednotlivých signifikantně regulovaných spotů (T­test ≥ 95%) v brzké (15 a 30 minut) a pozdní (180 minut) odpovědi na tepelný šok a po aklimatizaci.

41

Při detailnějším porovnání regulací se ukázalo, že u všech variant experimentu převažovala negativní regulace, tedy zřejmě degradace proteinů, oproti jejich nárůstu tj. pozitivní regulaci (Graf 2). U rostlin kultivovaných na standardní intenzitě světla (1, 2) nebyl mezi jednotlivými variantami tento rozdíl tak výrazný, výjimkou je poměr mezi množstvím spotů v 15 minutě po tepelném šoku u rostlin se sníženou hladinou endogenních cytokininů (2), kdy je tento poměr podobný jako u rostlin kultivovaných na nízké intenzitě světla (3, 4). (1)

(2)

(3)

(4)

Graf 2: Porovnání množství pozitivně a negativně regulovaných proteinových spotů. Na jednotlivých sloupcových grafech jsou zobrazeny počty regulovaných proteinových spotů u rostlin kultivovaných na standardní intenzitě světla s normální hladinou endogenních cytokininů (1) a se sníženou hladinou endogenních cytokininů (2), a rostlin kultivovaných na nízké intenzitě světla s normální hladinou endogenních cytokininů (3) a se sníženou hladinou endogenních cytokininů (4). Celkový přehled profilů regulovaných spotů je poměrně složitý. Mimo celkové bilance regulací v jednotlivých variantách experimentu (Graf 2) byl proto proveden i pokus o nalezení základních časových profilů v odpovědi na tepelný stres (15, 30 a 180 min), které by napomohly lepšímu porozumění nalezených regulací (Obr. 16). Byly nalezeny 4 nejčastěji zastoupené expresní profily regulovaných spotů. Nejvíce zastoupena byla skupina proteinů se střídavou odpovědí (3) a to pro všechny varianty experimentů. Dále byly přibližně stejně zastoupeny skupiny proteinů s pozdní odpovědí (4) a s okamžitou odpovědí (1). Nejméně zastoupenou skupinou byla skupina proteinů s opožděnou odpovědí (2). 42

(5)

(1)

Nízká intenzita

Standardní intenzita

.

(2)

(3)

(4)

Obr. 16: Přehled regulovaných proteinů a základní směry regulace v odpovědi na tepelný stres. Ukázky nejčastěji zastoupených expresních profilů (1) skupiny proteinů s okamžitou odpověďí, (2) proteiny s opožděnou odpověďí, (3) proteiny se střídavou odpovědí, (4) proteiny s pozdní odpovědí, a (5) celkový přehled všech profilů. Změna relativního objemu proteinových spotů je vztažena ke kontrole (0 min, neaktivovaná), NORMAL - rostliny s normální hladinou endogenních cytokininů, DEX rostliny se sníženou hladinou endogenních cytokininů. Čísla odpovídají označení proteinových spotů na obr. 14. 43

Jedním z hlavních cílů bakalářské práce bylo porovnat účinky světla a hladiny cytokininů v reakci na tepelný stres. I když lze již z uvedených poměrů a profilů dedukovat jisté závěry (Graf 2; Tab. 3, 4; Obr. 16), vztahy mezi jednotlivými variantami experimentů nejlépe vystihuje analýza hlavních komponent (Obr. 17). Pro dostatečné vyjádření variability systému stačí použití komponent PC1, PC2 a PC3, které pro experimenty při nízké i standardní intenzitě světla pokrývají přes 80 % variability.

Obr. 17: Porovnání jednotlivých variant experimentu metodou analýzy hlavních komponent (PCA). V rámci jednotlivých intenzit světla bylo možno sadu charakterizovat v 10 rozměrech, pro dostatečné pokrytí však stačí PC1, PC2 a PC3. Černou barvou jsou označeny kontrolní rostliny s normální hladinou endogenních cytokininů, červenou jsou označeny rostliny se sníženou hladinou endogenních cytokininů pomocí DEX indukované exprese CKX. Jednotlivé varianty experimentu jsou označeny: 0, 15, 30, 180 (délka tepelný stres v min), 60* pokus o sledování zotavení po 60 min. tepelného stresu. Pro analýzu byly použity poměry objemů regulovaných spotů vztažené na kontrolní rostlinu (neaktivovaná, 0 min stres), obdobně jako pro Obr. 16.

44

Analýza velmi dobře demonstruje podobnost odpovědi proteomu na tepelný stres v rostlinách s normální hladinou endogenních cytokininů bez ohledu na použitou intenzitu světla. Zatímco krátkodobý šok - 15 min - se viditelně odlišuje, dlouhodobé vystavení tepelnému stresu 30 min je podobné působení zvýšené teploty 180 min a kupodivu se obdobně chová i experiment zamýšlený demonstrovat zotavení po 60 min tepelného stresu. Na základě podobnosti obou analýz je možno usuzovat, že i když se na odpovědi k tepelnému stresu podílejí jiné proteiny (Obr. 14-16), obecný mechanizmus reakce na tepelný stres není ovlivněn intenzitou světla. Manipulace s hladinou endogenních cytokininů se také při dlouhodobé expozici tepelnému stresu výrazně neodlišuje od rostlin s normální hladinou cytokininů. Rozdíl je však v krátkodobé expozici. Při standardní intenzitě světla se DEX indukovaná rostlina nevystavená tepelnému stresu i rostlina po 15 min šoku chová obdobně jako kontrolní rostliny exponované zvýšené teplotě po dobu 30 min a 180 min. Při nízké intenzitě je situace v 15. minutě podobná, nicméně 0 min se projevuje stejně, jako kontrolní rostlina vystavená 15 min tepelného šoku. Zde je tedy patrný výrazný efekt intenzity světla a lze se domnívat, že souvisí s prokázaným propojením signální dráhy cytokininů a fotorecepční signalizace (ARGUESO et al., 2009). Fakt, že se krátkodobá (žádná) expozice tepelnému stresu rostlin se sníženou hladinou endogenních cytokininů podobá efektu dlouhodobého stresu kontrolních rostlin lze vyložit dvěma způsoby: 1)

Efekt snížení endogenních cytokininů je pro překonání tepelného stresu pozitivní

Snížení cytokininů připraví rostlinu na tepelný stres. Kontrolní rostliny se s tepelným stresem za 30 min vyrovnají, ale snížení endogenních cytokininů je pro odolnost výhodné, jelikož rostlina neregistruje žádný významný rozdíl (standardní intenzita), či se přizpůsobí rychleji (15 min při nízké intenzitě světla) 2)

Efekt snížení endogenních cytokininů je pro překonání tepelného stresu negativní

Kontrolní rostlina není schopna překonat tepelný stres, 30 i 180 min se projevuje jako stresující. Snížení hladiny endogenních cytokininů je pro rostlinu obdobný stresový faktor, jako tepelný stres, proto není pozorován výrazný efekt délky 45

tepelného stresu (standardní intenzita), či chybí krátké období, kdy se rostlina snaží stresu čelit (15 min při nízké intenzitě světla). Rozhodnout se mezi těmito variantami není bez znalosti regulovaných proteinů možné. Bohužel ani pokus o pozorování zotavení (60 min stres 35 °C, 120 min kultivace při 21 °C) nepomohl k rozuzlení této otázky. Jelikož se tento experiment jeví shodně jako stres po 30 či 180 min, nelze jednoduše říci, zda se rostlina skutečně s tepelným stresem vyrovnala, či zda 60 min bylo natolik stresující, že ji to trvale poškodilo. Jednoznačný závěr, který ale z této analýzy již teď plyne, je to, že cytokininy mají prokazatelný efekt při vnímání teploty a bližší povaha tohoto efektu by měla být zřejmá po analýze regulovaných proteinových spotů pomocí hmotnostní spektrometrie.

46

4 ZÁVĚR Z environmentálních faktorů, které mohou stresově působit na rostlinu, má velký význam teplota. Přestože dosud nebyl u rostlin nalezen žádný přímý receptor teploty, je popsáno několik mechanismů jakými by mohla rostlina teplotu vnímat. Možností objasnění této problematiky pomocí proteomických metod se zabývala i tato bakalářská práce. Při sledování rychlé odpovědi organismu na okolní stimuly je stále více patrné, že významná část této reakce probíhá na úrovni proteomu. Mimo posttranslačních modifikací proteinů pak lze na úrovni proteomu pozorovat také reakce organismu na různé druhy abiotických stresů (tepelný a chladový stres, osmotický stres aj.). Přestože rostlinná proteomika má jisté limitace v množství proteinů, které je schopná pokrýt, lze vhodnou kombinací technik zjistit o proteomu cenné informace. Experimenty realizované v rámci bakalářské práce měly za cíl sledovat krátké působení tepelného stresu, ale i jeho delší dopady na proteom rostliny a jak se projeví ve vnímání tepelného stresu snížené hladiny cytokininů. Celkově bylo nalezeno 55 regulovaných proteinových spotů, z nichž 25 bylo nalezeno při standardní intenzitě světla a 40 při intenzitě snížené. Pouze 10 bylo regulováno v obou případech. Podařilo se ukázat, že intenzita světla vyvolá odpověď sice u různých proteinů, ale celkový časový průběh reakce na tepelný stres je podobný. Manipulace v hladině cytokininů se projevila jako zásadní, nicméně interpretace je bez znalosti regulovaných proteinů nemožná. Další studie bude zaměřená na identifikaci signifikantně regulovaných proteinových spotů pomocí hmotnostní spektrometrie a úspěšná analýza proteinů pak bude určovat směr dalšího výzkumu.

Tato práce vznikla za podpory grantů GAČR 206/09/2062, GAČR P305/12/2144, projektu CZ.1.07/2.3.00/30.0017 a projektu CEITEC - Středoevropský technologický institut (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) z Evropského fondu pro regionální rozvoj (ERDF).

47

5 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY AHMED H. (2005): Principles and reactions of protein extraction, purification, and characterization, CRC Press, 387 s. AKIYOSHI D. E., H.KLEE, R. M. AMASINO, E.W. NESTER a M. P. GORDON (1984): T­DNA of Agrobacterium tumefaciens Encodes an Enzyme of Cytokinin Biosynthesis: Activity, Biosynthesis, and Translocation, Proceedings of the National Academy of Science, roč. 81, č. 19, str. 5994-5998 APPLIED BIOSYSTEMS (2004):

iTRAQ™ Reagents : Amine-specific Labeling

Reagents for Multiplexed Relative and Absolute Protein Quantitation. Applied Biosystems. ARGUESO C.T., F.J. FERREIRA, J.J. KIEBER, N. IMIN a P.A. HAYNES (2009): Environmental perception avenues: the interaction of cytokinin and environmental response pathways, The Plant Cell, roč. 32, č. 9, s. 1147-1160 ARGYROS, R. D., D. E. MATHEWS, Y-H. CHIANG, C. M. PALMER, D. M. THIBAULT, N. ETHERIDGE, D. A. ARGYROS, M. G. MASON, J. J. KIEBER a G. E. SCHALLER (2008): Type B Response Regulators of Arabidopsis Play Key Roles in Cytokinin Signaling and Plant Development, The Plant Cell, roč. 20, č. 8, s. 2102-2116 BAGINSKY S., L. HENNIG, P. ZIMMERMANN a W. GRUISSEM (2010): Gene Expression Analysis, Proteomics, and Network Discovery, Plant physiology, roč. 152, č. 2, s. 402-410 BLÁHA L. (2003): Rostlina a stres, Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, 1. vyd. 156 s. BRADFORD, M. M. (1976): A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, roč. 72, s. 248-254 BRUGIÈRE N., S. JIAO, S. HANTKE, C. ZINSELMEIER, J.A. ROESSLER, X. NIU, R.J. JONES a J.E. HABBEN (2003): Cytokinin Oxidase Gene Expression in Maize Is Localized to the Vasculature, and Is Induced by Cytokinins, Abscisic Acid, and Abiotic Stress, Plant Physiology, roč. 132, č. 3, s. 1228-1240

48

BURHKANOVA, E. A., T. P. MIKULOVICH, N.V. KUDRYAKOVA, I. M. KUKINA, A. R. SMITH, M. A. HALL a O. N. KULAEVA (2001): Heat shock pre-treatment enhances the response of Arabidopsis thaliana leaves and Cucurbita pepo cotyledons to benzyladenine, Plant Growth Regulation, roč. 33, č. 3, s. 195-198 ČERNÝ M., F. DYČKA, J. BOBÁĹOVÁ a B. BRZOBOHATÝ (2011a): Early cytokinin response proteins and phosphoproteins of Arabidopsis thaliana identified by proteome and phosphoproteome profilig, Journal of Experimental Botany, roč. 62, č. 3, s. 921­937. ČERNÝ M., J. SKALÁK, B. KURKOVÁ, E. BABULIAKOVÁ a B. BRZOBOHATÝ (2011b): Využití komerční metody imunochemického odstranění RUBISCO v analýze rostlinného proteomu, Chemické listy, roč. 105, s. 640-642 DEFALCO T., K. W. BENDER a W. A. SNEDDEN (2010): Breaking the code: Ca2+ sensors in plant signalling, Biochemical Journal, roč. 425, č. 1, str. 27­40 DOBRÁ J., V. MOTYKA, P. DOBREV, J. MALBECK, O. PRÁŠIL, D. HAISEL, A. GAUDINOVA, M. HAVLOVÁ, J. GUBIŠ, R. VAŇKOVÁ a J. KIM (2010): Comparison of hormonal responses to heat, drought and combined stress in tobacco plants with elevated proline kontent, Journal of Plant Physiology, roč. 167, č. 16, s. 1360-1370 DOMON B. a R. AEBERSOLD (2006): Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science, roč. 312, č. 5771, s. 212-217 GALUSZKA P., I. FRÉBORT, M. ŠEBELA, P. SAUER, S. JACOBSEN a P. PEČ (2001): Cytokinin oxidase or dehydrogenase? Mechanism of cytokinin degradation in cerals, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, roč. 268, s. 450-461 GATES P. (2004a), Mass spectrometry resource, [cit. 2012-02-21]. Dostupné na: . GATES P. (2004b), Mass spectrometry resource, [cit. 2012-02-21]. Dostupné na: GÖRG A., O. DREWS, C. LÜCK, F. WEILAND a W. WEISS (2009): 2-DE with IPGs, Electrophoresis, roč. 30, s. 1-11 GROTEWOLD E. (2003): Plant functional genomics, Humana Press, 449 s., Methods in molecular biology, vol. 236

49

GYGI S. P., Y. ROCHON, B. R. FRANZA a R. AEBERSOLD (1999): Correlation between protein and mRNA abundance in yeast, Molecular and cellular biology, roč. 19, č. 3, s. 1720-1730 HARE, P. D., W. A. CRESS a J. VAN STADEN (1997): Involvement of cytokinins in plant responses to enviromental stress, Plant Growth Regulation, roč. 23, s. 79-103 HIROSE N., K. TAKEI, T. KUROHA, T. KAMADA-NOBUSADA, H. HAYASHI, H. SAKAKIBARA (2007): Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation, Journal of Experimental Botany, roč. 59, č. 1, s. 75-83 HOFMANN, Nancy R. (2009): The Plasma Membrane as First Responder to Heat Stress, The Plant Cell, roč. 21, č. 9, s. 2544-2544 JEON J., N. Y. KIM, S. KIM, N. Y. KANG, O. NOVÁK, S.-J. KU, C. CHO, D. J. LEE, E.-J. LEE, M. STRNAD a J. KIM (2010): A Subset of Cytokinin Two-component Signaling System Plays a Role in Cold Temperature Stress Response in Arabidopsis, Journal of Biological Chemistry, roč. 285, č. 30, s. 23371-23386 KASAHARA H., K. TAKEI, N. UEDA, S. HISHIYAMA, T. YAMAYA, Y. KAMIYA, S. YAMAGUCHI‡, a H. SAKAKIBARA (2004): Distinct Isoprenoid Origins of cis- and trans-Zeatin Biosyntheses in Arabidopsis, Journal of Biological Chemistry, roč. 279, č. 14, s. 14049-14054 KOTAK, Sachin, Jane LARKINDALE, Ung LEE, Pascal VON KOSKULL-DÖRING, Elizabeth VIERLING a Klaus-Dieter SCHARF (2007): Complexity of the heat stress response in plants, Current Opinion in Plant Biology, roč. 10, č. 3, s. 310-316 KOVÁŘOVÁ H. (2005): Proteomika v postgenomové době, Chemické listy, roč. 99, s. 886-889 LONG S. P. a D. R. ORT (2010): More than taking the heat: crops and global change, Current Opinion in Plant Biology, roč. 13, s. 241 - 248 MISHRA N. C. (2010): Introduction to proteomics: principles and applications, John Wiley & Sons, Hoboken, 300 s. MIYAWAKI K., P. TARKOWSKI, M. MATSUMOTO-KITANO, T. KATO, S. SATO, D. TARKOWSKA, S. TABATA, G. SANDBERG a T. KAKIMOTO (2006): Roles of Arabidopsis ATP/ADP isopentenyltransferases and tRNA isopentenyltransferases in 50

cytokinin biosynthesis, Proceedings of the National Academy of Sciences, roč. 103, č. 44, s. 5994-5998 MOK D. WS a M. C. MOK (2001): Cytokinin Metabolism and Action, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, roč. 52, č. 1, s. 89-118 NÄGELE E., M. VOLLMER, P. HÖRTH a C. VAD (2004): 2D-LC/MS techniques for the identification of proteins in highly complex mixtures, Expert Review of Proteomics, roč. 1, č. 1, s. 37-46 NEILSON, K. A., C.G. GAMMULLA, M. MIRZAEI, N. IIMIN a P. A. HAYNES (2010): Proteomic analysis of temperature stress in plants: Ca2+ sensors in plant signalling, Proteomics, roč. 10, č. 4, s. 828-845 PANDEY A. a M. MANN (2000): Proteomics to study genes and genomes, Nature, roč. 405, s. 837-846 PECK, S. C. (2005): Update on Proteomics in Arabidopsis. Where Do We Go From Here?, Plant Physiology, roč. 138, č. 2, s. 591-599 PENFIELD S. (2008): Temperature perception and signal transduction in plants, New Phytologist, roč. 179, č. 3, s. 615-628 PROCHÁZKA, S. (1998): Fyziologie rostlin, Academia Praha, Vyd. 1., 484 s. REISINGER V. a L.A. EICHACKER (2006): Analysis of Membrane Protein Complexes by Blue Native PAGE, Proteomics, roč. 6, s. 6-15 SAIDI, Y., A. FINKA, M. MURISET, Z. BROMBERG, Y. G. WEISS, F. J. M. MAATHIUS a P. GOLOUBINOFF (2009): The Heat Shock Response in Moss Plants Is Regulated by Specific Calcium-Permeable Channels in the Plasma Membrane, The Plant Cell, roč. 21, č. 9, s. 2829-2843 SAIDI, Y., A. FINKA a P. GOLOUBINOFF (2011): Heat perception and signalling in plants: a tortuous path to thermotolerance, New Phytologist, roč. 190, č. 3, s. 556-565 SAKAKIBARA H. (2006): Cytokinins: Activity, Biosynthesis, and Translocation, Annual Review of Plant Biology, roč. 57, č. 1, s. 431-449 SMITH, A. M. a E. ZEIGER (2010): Plant biology, Garland Science, New York, 4. vyd., 664 s.

51

SUZUKI I., D. A. LOS, Y. KANESAKI, K. MIKAMI a N. MURATA (2000): The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis, The EMBO Journal, roč. 19, č. 6, s. 1327-1334 ŠÁMALOVÁ M., B. BRZOBOHATÝ a I. MOORE (2005): POp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for Tobago, The Plant Journal, roč. 41, č. 6, s. 919-935 ŠETLÍK I., F. SEIDLDOVÁ a J. ŠANTRŮČEK (2004): Fyziologie rostlin, učební text Biologické

fakulty

Jihočeské

univerzity,

dostupný

na:

TAIZ L. a E. ZEIGER (2006): Plant physiology, Sinauer Associates Sunderland, 4. vyd., 764 s. THOMASHOW M. F. (2001): So What's New in the Field of Plant Cold Acclimation? Lots!, Plant Physiology, roč. 125, č. 1, s. 89-93 TO J. P. C. a J. J. KIEBER (2008): Cytokinin signaling: two-components and more, Trends in Plant Science, roč. 13, č. 2, s. 85-92 WESTERMEIER R. a T. NAVEN (2002): Proteomics in practice: a laboratory manual of proteome analysis, Wiley-VCH, Weinheim, 316 s.

52

6 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Přehled nejdůležitějších stresových faktorů Obr. 2: Schematické znázornění teplotních rozsahů hlavních charakterizovaných rostlinných odpovědí na okolní teplotu Obr. 3: Cyklus faktorů tepelného šoku (HSF) aktivuje syntézu mRNA proteinů tepelného šoku Obr. 4: Schéma předpokládané vápníkové signalizace v odpovědi na tepelný stres Obr. 5: Přehled známých signálních drah a faktorů podílejících se na termotoleranci Obr. 6: Isoprenoidní cytokininy Obr. 7: Aromatické cytokininy Obr. 8: Schéma biosyntézy a metabolismu cytokininů Obr. 9: Pravděpodobný reakční mechanismus degradace iP pomocí CKX v pšenici Obr. 10: Model cytokininové signalizace Obr. 11: Schéma ionizace pomocí elektrospreje Obr. 12: Schéma ionizace pomocí MALDI Obr. 13: Schéma 2D analýzy proteomu rostlin Arabidopsis thaliana za stresu vysokou teplotou Obr. 14: Sledování účinků tepelného šoku na rostlinách Arabidopsis thaliana Obr. 15: Vennův diagram Obr. 16: Přehled regulovaných proteinů a základní směry regulace v odpovědi na tepelný stres Obr. 16: Porovnání jednotlivých variant experimentu metodou analýzy hlavních komponent (PCA)

53

7 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ABA

kyselina abscisová

ACC

1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina

ADP

adenosindifosfát

AHP

His-obsahující protein

AMP

adenosinmonofosfát

ARR

regulátor odpovědi

Asp

kyselina asparagová

ATP

adenosintrifosfát

BA

benzyladenin

CaM

kalmodulin

CKX

cytokininoxidáza/dehydrogenáza

CRT

C-opakující

cZ

cis-zeatin

DMAPP

dimethylallyl difosfát

DRE

element odpovědi na dehydrataci

DZ

dihydrozeatin

ESI

ionizace pomocí elektrospreje

FAD

flavinadenindinukleotid

GA

kyselina giberelová (gibereliny)

His

histidin

HSF

transkripční faktory tepelného šoku

HSP

proteiny tepelného šoku

HSR

odpověď na tepelný šok

IAA

kyselina indol-3-octová

IEF

izoelektrická fokusace

iP

N6 – (∆2-izopentyl)-adenin

iPR

isopentyladeninribotidy

IPCC

Mezivládní panel pro změnu klimatu

IPT

isopentyladenin transferáza

LC

kapalinová chromatografie

LEA

akumulované v pozdní fázi embryogeneze

54

MALDI

ionizace laserem za přítomnosti matrice

MEP

methylerythritolfosfátová cesta

MVA

mevalonová cesta

MS

hmotnostní spektrometrie

NADH

nikotinamid adenin dinukleotid

mT

meta-topolin

oT

ortho-topolin

PAGE

polyakrylamidová gelová elektoforéza

PTM

posttranslační modifikace

ROS

reaktivní formy kyslíku

SDS

sodium dodecyl sulfát

tRNA

transferová ribonukleová kyseliny

tRNA-IPT

tRNA isopentyltransferáza

tZ

trans-zeatin

55