MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Změny proteomu révy vinné vyvolané stresovými faktory Diplomová práce
Barbora Kurková
Vedoucí práce: Mgr. Jan Lochman, Ph.D.
Brno 2013
Bibliografický záznam
Autor:
Bc. Barbora Kurková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Změny proteomu révy vinné vyvolané stresovými faktory
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Jan Lochman, Ph.D.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
72
Klíčová slova:
abiotické a biotické stresové faktory; obranná reakce; Vitis vinifera cv. Gamay; proteiny spojené s patogenezí; proteom; elektroforéza; kyselina salicylová
Bibliographic entry
Author
Bc. Barbora Kurková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
Changes in Vitis vinifera proteome triggered by stress factors
Degree programme:
Biochemistry
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Jan Lochman, Ph.D.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
72
Keywords:
abiotic and biotic stress factors; plant defence; Vitis vinifera cv. Gamay; pathogenesis-related proteins; proteom; electrophoresis; salicylic acid
Abstrakt U révy vinné dochází během obranné reakce ke zvýšení exprese proteinů, které se podílejí na aktivní obraně vůči patogenům. Je obecně známo, ţe biotický i abiotický stres zvyšují expresi pathogenesis-related (PR) proteinů. Změny v expresi i aktivitě PR proteinů (chitinas, glukanas a thaumatin-like proteinů) byly u révy vinné (Vitis vinifera L.) pozorovány po působení abiotického stresu i po napadení houbovými patogeny. Cílem diplomové práce bylo porovnání kvalitativních a kvantitativních změn v extracelulárním a intracelulárním proteomu suspenzní kultury Vitis vinifera v odpovědi na působení biotického a abiotických stresových faktorů. Suspenzní kultury révy vinné (Vitis vinifera cv. Gamay), které byly podrobeny působení biotického stresového faktoru v podobě patogenu Botrytis cinerea (Plíseň šedá) a abiotickým stresovým faktorům ve formě mechanického poškození a teplotního šoku. Pro separaci intracelulárního proteomu byly optimalizovány
podmínky
2D
elektroforézy
na
fokusačních
stripech
s imobilizovaným gradientem pI 3-11 NL s následnou SDS PAGE v 12 % gelu a barvením pomocí barviva SYPRO RUBY. V případě extracelulárních proteinů bylo médium zkoncentrováno na cut-off kolonce a následně analyzováno pomocí LCMS/MS analýzy. Na jednotlivých gelech bylo pomocí softwaru PDQuest identifikováno přibliţně 450 spotů, kdy mezi kontrolou a biotickým stresem bylo nalezeno 34 spotů se signifikantně rozdílnou expresí a mezi kontrolou a mechanickým stresem 20 spotů se signifikantně rozdílnou expresí. Celkem 20 spotů se podařilo úspěšně identifikovat pomocí LC-MS/MS metody, kdy většina identifikovaných proteinů jiţ byla dříve popsána v souvislosti s obrannou reakcí. U extracelulárního proteomu v současné době probíhá optimalizace derivatizace proteinů a jejich analýzy pomocí LC-MS/MS metody.
Abstract Within the defense reaction of grapevine, the expression of proteins playing role in an active defence against pathogens is enhanced. It´s generally known that biotic and abiotic stresses induce the expression of pathogenesis-related (PR) proteins. Changes in the expression and activity of PR proteins (chitinases, glucanases and thaumatin-like proteins) have been reported in grapevine (Vitis vinifera L.) after exposure to abiotic stress and attack by fungal pathogens. The aim of this study was to compare the qualitative and quantitative changes in the extracellular and intracellular proteom of suspension culture of Vitis vinifera in response to the action of biotic and abiotic stress factors. The cell suspensions of grapevine (Vitis vinifera cv. Gamay) were subjected to biotic stress factor using pathogen B. cinerea (gray mold) and abiotic stress factors using mechanical damage and thermal shock. The conditions of 2D electrophoresis were optimized for the separation of intracellular proteome. Immobilized pH gradient gel strips (pI 3-11 NL) were used followed by SDS PAGE in 12% acrylamide gel and they were stained by SYPRO RUBY stain. Extracellular proteins in the culture media were concentrated using 3 kDa membrane and subsequently analyzed using LC-MS/MS analysis. At the individual gels were identified approximately 450 spots using software PDQuest when 34 spots significantly differed between the gel of the control sample and the gel of the sample after exposure to biotic stress. Further 20 spots were significantly differed between the gel of the control sample and the gel of the sample after exposure to mechanical stress. Consequently 20 spots were successfully identified by LC-MS/MS method when the most of the identified proteins have been previously described in relation to defence reaction in plants. Today, derivatization and analysis of the extracellular proteins by LC-MS/MS method is being optimized.
Poděkování Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu mé diplomové práce, panu Mgr. Janu Lochmanovi, Ph.D., především za jeho vstřícnost, čas a odborné rady. Velké poděkování patří rovněţ odborné konzultantce, paní Mgr. Kateřině Dadákové, za její ochotu, zájem a čas, které mi věnovala při zpracování diplomové práce. Dále děkuji své rodině a blízkým za podporu během studia.
Čestné prohlášení Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
V Brně dne:
…………………….. Barbora Kurková
OBSAH 1 Seznam zkratek .................................................................................. 11 2 Teoretická část .................................................................................... 12 2.1 Reakce rostlin na stres.......................................................................................... 12 2.1.1 Raná fáze stresové reakce............................................................................. 13 2.1.2 Pozdní fáze stresové reakce .......................................................................... 13 2.1.2.1 PR proteiny ........................................................................................... 14 2.1.3 Hormony ....................................................................................................... 15 2.2 Reakce rostlin na abiotický stres .......................................................................... 16 2.2.1 Teplotní stres ................................................................................................ 16 2.2.1.1 Vysoké teploty ...................................................................................... 16 2.2.1.2 Chlad ..................................................................................................... 17 2.2.2 Oxidační stres ............................................................................................... 18 2.2.3 Mechanický stres .......................................................................................... 19 2.2.4 Zasolení ........................................................................................................ 20 2.2.5 Těţké kovy ................................................................................................... 21 2.3 Reakce rostlin na biotický stres............................................................................ 22 2.3.1 Obranná reakce proti patogenům ................................................................. 22 2.3.1.1 Konstitutivní obrana ............................................................................. 22 2.3.1.2 Indukovaná obrana ............................................................................... 23 2.3.1.3 Systémová rezistence ............................................................................ 24 2.4 Réva vinná............................................................................................................ 25 2.4.1 Nejvýznamnější houbové choroby révy vinné ............................................. 25 2.4.1.1 Plíseň révová......................................................................................... 26 2.4.1.2 Padlí révové .......................................................................................... 27 2.4.1.3 Plíseň šedá ............................................................................................ 28 2.4.2 Proteomické změny vyvolané stresem u révy vinné .................................... 29 2.5 Cíle praktické části diplomové práce ................................................................... 31
3 Experimentální část ........................................................................... 32 3.1 Biologický materiál .............................................................................................. 32 3.2 Izolace intracelulárních proteinů .......................................................................... 32 3.2.1 Homogenizace .............................................................................................. 32 3.2.2 Přesráţení kyselinou trichloroctovou (TCA) ............................................... 33 9
3.2.3 Solubilizace proteinů .................................................................................... 33 3.3 Extracelulární proteiny ......................................................................................... 33 3.3.1 Zakoncentrování proteinů na cut-off kolonkách .......................................... 33 3.4 Izoelektrická fokusace a SDS-PAGE ................................................................... 33 3.5 Barvení ................................................................................................................. 35 3.6 Stanovení ţivotaschopnosti buněk fluorescenční mikroskopií ............................ 35 3.7 Stanovení salicylátu ............................................................................................. 35 3.7.1 Izolace salicylátu .......................................................................................... 35 3.7.2 Analýza salicylátu pomocí HPLC ................................................................ 36
4 Výsledky .............................................................................................. 37 4.1 Stanovení ţivotaschopnosti buněk fluorescenční mikroskopií ............................ 37 4.2 Izolace intracelulárních a extracelulárních proteinů ............................................ 38 4.3 Změny intracelulárního proteomu révy vinné vyvolané působením stresových faktorů ........................................................................................................................ 40 4.4 Stanovení salicylátu ............................................................................................. 55 4.4.1 Optimalizace separace pomocí HPLC .......................................................... 55 4.4.2 Stanovení salicylátu ve Vitis vinifera cv. Gamay pomocí HPLC................. 55
5 Diskuse................................................................................................. 57 6 Závěr .................................................................................................... 64 7 Seznam literatury ............................................................................... 66
10
1 Seznam zkratek
AOS (active oxygen species)
reaktivní formy kyslíku
BS
biotický stres
CTR
kontrola
DAD (diode array detector)
detektor s diodovým polem
DTT
dithiotreitol
FLD
fluorescenční detektor
HR
hypersenzitivní reakce
HSP (heat-shock protein)
protein teplotního šoku
IAA
jodoacetamid
JA (jasmonic acid)
jasmonová kyselina
LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry)
kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií
MeJA
methyl jasmonát
MS
mechanický stres
PGIP (polygalacturonase-inhibiting protein)
protein inhibující polygalakturonasu
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)
fenylmethansulfonyl fluorid
PR proteiny (pathogenesis-related proteins)
proteiny spojené s patogenezí
RT-qPCR
reverzní transkripce-kvantitativní polymerázová řětězová reakce
SA (salicylic acid)
salicylová kyselina
SAR (systemic acquired resistance)
systémově získaná rezistence
SDS-PAGE (sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)
polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného
SSP sample spot protein
číslo spotu
TCA (trichloroacetic acid)
trichloroctová kyselina
TS
teplotní stres 11
2 Teoretická část 2.1 Reakce rostlin na stres Rostliny jsou v průběhu svého ţivota vystaveny velmi proměnlivým podmínkám vnějšího prostředí. Ty mohou zpomalovat jejich ţivotní funkce, poškozovat jednotlivé orgány a v krajním případě vést i k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy vnějšího prostředí, které ohroţují ţivot rostliny, nazýváme stresovými faktory. Abiotické stresové faktory jsou povahy fyzikální a chemické, zatímco biotické faktory mají povahu biologickou (Obrázek 1). Mechanismy odolnosti proti stresu se dělí do dvou kategorií: První způsob obrany je schopnost úniku před stresem (stress aviodance), která má pasivní a dlouhodobý charakter. Zahrnuje mechanickou bariéru bránící pronikání stresových faktorů do vnitřního prostředí (např. silná kutikula na listech, impregnace buněčných stěn, rezervoáry vody a snadno rozloţitelných organických látek). Druhou skupinu obranných mechanismů tvoří aktivní odolnost (stress tolerance), která omezuje negativní dopad stresorů aţ po jejich proniknutí k plazmatické membráně a do symplastu. V takovém případě se spouští stresová reakce. Často na rostlinu působí více stresových faktorů současně, coţ můţe podstatně měnit charakter stresové reakce ve srovnání s působením kaţdého faktoru odděleně (Procházka et al., 1998).
Obrázek 1: Přehled nejčastějších stresových faktorů pro rostliny (Procházka et al., 1998). 12
2.1.1 Raná fáze stresové reakce Několik málo minut po působení stresového faktoru se u rostliny aktivuje tzv. raná fáze stresové reakce (Obrázek 2). Nejprve dochází k depolarizaci plasmatické membrány a mění se koncentrace iontů (zvýší se koncentrace K+ a Cl- v extracelulární tekutině a volných Ca2+ v cytosolu). Následně dochází k fosforylaci proteinů a syntéze oxidu dusnatého (NO). Jedním z prvních známých projevů obranné reakce je tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS) aktivací plazmatické NADPH-oxidasy, která katalyzuje vznik superoxidového radikálu (O2● -). Superoxid je dále metabolizován superoxiddismutasou na peroxid vodíku (H2O2), který můţe procházet plasmatickou membránou a vstupovat do buněk. Za normálních podmínek je H2O2 přeměněn na vodu působením enzymů katalasy, askorbát peroxidasy nebo glutathion peroxidasy. Během stresové reakce je však vlivem NO aktivita těchto enzymů sníţena a ROS mohou podstatně měnit redoxní stav buněk a tím regulovat aktivitu specifických rostlinných transkripčních faktorů (Piterková et al., 2005; Buchanan et al., 2000).
Obrázek 2: Průběh rané fáze obranné reakce, ↑ značí aktivaci, ┬ inhibici.
2.1.2 Pozdní fáze stresové reakce Pozdní fáze obranné reakce můţe trvat aţ několik dní. Během tohoto procesu se u hostitelské rostliny aktivují tzv. obranné geny, které kódují proteiny zapojené především do aktivní obrany vůči patogenu. Tyto proteiny se však v rostlinách hromadí ve velkém mnoţství také vlivem environmentálních stresových faktorů. Do skupiny těchto proteinů patří inhibitory proteas, enzymy nezbytné pro syntézu fytoalexinů a dalších sekundárních metabolitů a také PR proteiny (Buchanan et al., 2000). V případě
13
silné obranné reakce můţe u napadených buněk a buněk v nejbliţším okolí dojít aţ k nekróze nebo programované buněčné smrti. 2.1.2.1 PR proteiny PR proteiny byly poprvé objeveny v roce 1970 v listech tabáku, kde byla pozorována hypersenzitivní reakce na virus tabákové mozaiky (TMV) (Suo a Leung, 2002). Vyznačují
se
specifickými
biochemickými
vlastnostmi.
Jedná
se
o
nízkomolekulární proteiny (6-43 kDa), které jsou snadno extrahovatelné, termostabilní, vysoce odolné vůči proteasam a nízkým hodnotám pH (Edreva, 2005). PR proteiny mají dvojí buněčnou lokalizaci – vakuolární a apoplastickou, přičemţ hlavním místem jejich akumulace je apoplast. Kromě toho je můţeme najít v primární a sekundární buněčné stěně infikovaných rostlin. PR proteiny jsou také přítomny v papilách na vnitřní straně buněčné stěny v reakci na napadení plísní. V současné době je jejich přítomnost prokázána ve všech rostlinných orgánech – listy, stonky, kořeny, květy (Edreva, 2005). Známými činiteli biotického původu, kteří vyvolávají produkci PR proteinů, jsou patogeny, hmyz, hlísti a býloţravci. Vliv na indukci PR proteinů mají také fyzikální podmínky (poranění, UV-B záření, nízká teplota, osmotický šok, nedostatek či nadbytek vody). Kromě toho můţe být syntéza PR proteinů spouštěna endogenními vývojovými podněty rostlin. Syntéza PR proteinů je vývojově řízená, coţ dokazuje vztah PR proteinů ke klíčení semen, somatické embryogenezi, a také přítomnost PR proteinů v různých fázích kvetení. Mezi známé induktory exprese PR proteinů patří signální látky, jako jsou kyselina salicylová (SA), kyselina jasmonová (JA) a etylen, kdy byly prokázány signální dráhy indukce PR proteinů závislé na SA a nezávislé na jasmonátu a naopak (Edreva, 2005). Společným a důleţitým rysem většiny PR proteinů je jejich antifugální účinek. Některé PR proteiny mají také baktericidní, insekticidní, nematocidní a antivirální účinky. Toxicitu PR proteinů lze obecně připsat jejich schopnosti hydrolýzy buněčné stěny, inhibice proteáz a permeabilizace membrány (Edreva, 2005). Klasifikovány mohou být na základě struktury, enzymových vlastností, sérologických nebo enzymových vlastností, molekulové hmotnosti, podobnosti s dříve popsanou skupinou proteinů nebo mechanismu účinku. Nejvýznamnější antifugální
14
proteiny se člení do pěti základních tříd (PR-1, PR-2, PR-3, PR-4 a PR-5). K těmto pěti základním skupinám se řadí ještě další skupiny (Heřmanová et al., 2006). Hydrolytické enzymy (β-1,3-glukanasy, chitinasy a proteinasy) mohou být nástrojem k oslabení a rozloţení buněčných stěn hub obsahujících glukan, chitin a proteiny, zatímco PR-8 proteiny mohou narušovat gram-pozitivní bakterie vzhledem k jejich lysozymové aktivitě (Van Loon a Van Strien, 1999). Skupina proteinů PR-6 je schopna inaktivace proteináz sekretovaných parazity v napadených rostlinných pletivech a vykazuje tak anti-insekticidní a anti-nematodické účinky. Schopnost PR-5, PR-12, PR-13 a PR-14 proteinů permeabilizovat plazmatické membrány se podílí na plazmolýze a poškození houbových a bakteriálních patogenů inhibicí jejich růstu a vývoje (Abad et al., 1996). Proteiny skupin PR-15 a PR-16 mají schopnost přestavby buněčné stěny a tudíţ mohou mít ochrannou úlohu. Peroxidasová aktivita PR-9 pak přispívá k rigidifikaci buněčné stěny rostlin v reakci na útok patogenu. PR proteiny mají i další významné funkce kromě obrany proti patogenům. Základní glukanasa tabáku PR-2d umoţňuje klíčení semen oslabením endospermu. Chitinasy homologní k PR-3 a PR-4 proteinům působí jako morfogenetické faktory v embryogenezi mrkve a některé PR proteiny se akumulují v rostlinách v době kvetení a stárnutí. PR-5 (osmotiny) jsou hojně indukované v buňkách rajčete a tabáku vlivem osmotického stresu. Funkce nejhojnější rodiny PR proteinů, PR-1, zůstávají nejasné (Edreva, 2005). 2.1.3 Hormony Rostlinné hormony, nazývané téţ fytohormony (Obrázek 3), jsou definovány jako organické sloučeniny syntetizované v jedné části rostliny, transportované do jiné části, kde ve velmi malé koncentraci způsobují fyziologickou reakci (Gloser, 1998). Ovlivňují všechny fáze ţivotního cyklu rostlin. Mezi základní fytohormony se řadí: auxin, cytokinin, ethylen, gibereliny, abscisová kyselina a nedávno identifikované brassinosteroidy, kyselina jasmonová a kyselina salicylová. Jejich syntéza a akumulace jsou přísně regulované. Z místa syntézy jsou transportovány xylémem nebo floémem do ostatních částí rostliny. V cílových buňkách jsou rozpoznávány transmembránovými nebo intracelulárními
receptory.
Hormonální
signalizace,
zejména
signalizace
zprostředkovaná kyselinou salicylovou a jasmonovou, je rozhodující v obraně rostlin proti abiotickým i biotickým stresům (Shanker a Venkateswarlu, 2011). SA přenáší v rostlině informaci o napadení její části patogenem, je tedy endogenní signální látkou 15
odpovědnou za vyvolání systémově získané rezistence (SAR = systemic acquired resistance).
Obrázek 3: Důleţité fytohormony (Heldt a Piechulla, 2011).
2.2 Reakce rostlin na abiotický stres Abiotické stresové faktory mohou podstatně ovlivnit kvalitu rostlin. K hlavním abiotickým stresovým faktorům, které negativně ovlivňují růst a produktivitu rostlin, patří horko, chlad, sucho, koncentrace solí (salinita) a toxické látky. Za takovýchto stresových podmínek se v rostlinách aktivuje řada obranných procesů, aby se staly tolerantními nebo odolnými vůči těmto podmínkám (Jellouli et al., 2008). 2.2.1 Teplotní stres 2.2.1.1 Vysoké teploty Při vysokých teplotách bývají u rostlin nejprve poškozeny thylakoidní membrány v chloroplastech (Gloser, 1998). Při teplotách nad 40 °C přechází lipidová vrstva membrán do tzv. superfluidního stavu, kdy nemůţe plnit svoje základní funkce (stává se propustnou pro ionty, neposkytuje dostatečně pevnou oporu pro membránové proteiny). Dále se mění konformace proteinů, které tak ztrácejí svoji funkci. Ke zvýšení 16
odolnosti rostlin přispívá vyšší podíl nasycených mastných kyselin (v poměru k nenasyceným) a sterolů v lipidové vrstvě (Heldt a Piechulla, 2011). Při poklesu teploty pod kritickou teplotu okamţitě dochází k obnovení struktury a funkce lipidové vrstvy. Mnohdy nevratné je však poškození termolabilních proteinů, které zahrnují také enzymy účastnící se metabolických a transportních procesů. V případě, ţe jsou rostliny vystaveny teplotám alespoň 5 °C nad optimem jejich růstových podmínek, dochází k poklesu v syntéze standartních proteinů, doprovázené zrychlenou transkripcí a translací nové sady proteinů známých jako proteiny teplotního šoku (heat-shock proteins, HSPs) (Buchanan et al., 2000). HSPs zahrnují proteiny velkých, středních i malých molekulových hmotností a jsou rozděleny do šesti tříd na základě podobnosti DNA sekvence, zkříţené imunologické reaktivity a intracelulární lokalizace (Süle et al., 2004). Kromě změn v genové expresi způsobuje vysoká teplota také poškození buněčné stěny včetně organel a cytoskeletu, a narušuje funkci membrán. Teplotní šok můţe vést od zpomalení růstu k poškození orgánů a buněčné smrti. K teplotnímu šoku můţe dojít například při nedostatečné transpiraci nebo při částečném/úplném uzavření průduchů za silné radiace (Buchanan et al., 2000). 2.2.1.2 Chlad Nízké teploty u rostlin citlivých na chlad způsobují špatný růst aţ úhyn rostlin, coţ má za následek ztráty na výnosech. Rostliny různých druhů, ale i různých fenotypů nesou různou toleranci k chladu (Řepková a Relichová, 2001). Velmi důleţitá je také doba, po kterou chlad na rostlinu působí. U většiny proteinů nedochází následkem nízkých teplot k poškození, avšak mění se fyzikálně-chemické vlastnosti membrán. Lipidová vrstva přechází do stavu pevného gelu a v důsledku oslabení vazby lipidů k membránovým proteinům není dokonale zachována celistvost membrány. Membrány se stávají volně propustnými pro ionty, dochází ke ztrátě membránového potenciálu, zastavení selektivního a aktivního transportu i osmotických procesů. Po určité době trvání takového stavu jsou energetické zdroje buňky vyčerpány a buňka odumírá. Při nízkých teplotách dochází také k určitým strukturálním změnám v cytoskeletu (depolymerizace tubulů). Dále bylo zjištěno, ţe z organel jsou na nízké teploty nejcitlivější chloroplasty. Rostliny mají schopnost určité chladové aklimatizace, na které se podílejí některé fytohormony. Je spojena se syntézou stresových proteinů (coldinduced proteins), s akumulací osmoticky aktivních látek a změnami chemického
17
sloţení lipidové vrstvy membrán (zvýšené zastoupení nenasycených mastných kyselin). (Procházka et al., 1998). 2.2.2 Oxidační stres K oxidačnímu stresu dochází vlivem podmínek podporujících tvorbu reaktivních forem kyslíku, které poškozují nebo usmrcují buňky. Faktory prostředí, které zapříčiňují oxidační stres (Obrázek 4), zahrnují znečištěné ovzduší (zvýšené mnoţství ozonu nebo oxidu siřičitého), oxidanty-tvořící herbicidy, těţké kovy, sucho, tepelný a chladový stres, poranění, UV záření a velmi intenzivní světelné podmínky, které stimulují fotoinhibici. Oxidační stres se u rostlin vyskytuje také při napadení patogenem či během senesence (Buchanan et al., 2000). Kyslíkové radikály jsou neodvratné vedlejší produkty aerobních chemických reakcí, které probíhají během normálního buněčného metabolismu (Pessarakli, 1999; Fahnenstich et al., 2008). Tvorba singletového kyslíku (O2) následně stimuluje produkci dalších AOS, jako je peroxid vodíku (H2O2), superoxidový anion (O2●−) a hydroxylový (HO●) či perhydroxylový radikál (O2H●). Superoxidové anionty jsou tvořeny v chloroplastech při přímém transportu elektronů z fotosystému I (PSI) na kyslík (Buchanan et al., 2000). Právě fotosyntetický elektronový transportní řetězec je jeden z hlavních zdrojů AOS u rostlin (Semchuk et al., 2009). Tyto reaktivní molekuly, zvláště pak HO●, jsou vysoce destruktivní pro barviva, lipidy, nukleové kyseliny a proteiny (Pessarakli, 1999), coţ vede k ireverzibilnímu poškození a nakonec k nekróze tkáně (Fahnenstich et al., 2008; Mahalingam et al., 2006). Vysoké koncentrace H2O2 způsobují buněčnou smrt, zatímco nízké koncentrace H2O2 a také O2●− jsou potřebné pro lignifikaci a působí jako signály v obranné reakci (Fahnenstisch et al., 2008; Mahalingam et al., 2006). Rostliny se AOS zbavují uţitím antioxidačních obranných systémů přítomných v několika subcelulárních kompartmentech (Buchanan et al., 2000). Antioxidační obranné systémy u rostlin zahrnují neenzymatické a enzymatické antioxidanty (Fahnenstich et al., 2008). Mezi rostlinné antioxidanty patří askorbát (vitamin C), redukovaný glutathion (GSH), α-tokoferol (vitamin E) a karotenoidy (Buchanan et al., 2000; Fahnenstich et al., 2008). Polyaminy a flavonoidy mohou také poskytnout určitou ochranu před volnými radikály. Askorbát-glutathionový cyklus je hlavní antioxidační dráhou v plastidech, kde jsou AOS generovány během normálních biochemických procesů, které zahrnují fotosyntetický přenos elektronů (Buchanan et al., 2000; Pessarakli, 1999). Dodatečnou ochranu fotosyntetického aparátu před 18
oxidačním poškozením poskytuje exotermická produkce xantofylového zeaxanthinu. AOS jsou produkovány v kořenových nodulech fixujících dusík a jsou odstraňovány enzymatickými antioxidanty. Regulace koncentrací antioxidantů a enzymatických antioxidantů představuje důleţitý mechanismus pro zabránění oxidačnímu stresu (Buchanan et al., 2000).
Obrázek 4: Environmentální faktory, které zvyšují koncentrace reaktivních forem kyslíku v rostlinných buňkách (Buchanan et al., 2000).
2.2.3 Mechanický stres Rostlinám ve volné přírodě kontinuálně hrozí poškození environmentálními stresovými faktory, jako je vítr, písek, kroupy a déšť. Narušení pletiva způsobené mechanickým poraněním je potenciálním místem infekce pro patogeny, tudíţ exprese obranných genů v místě rány představuje bariéru proti mikroorganismům. Rostliny reagují na mechanické zranění indukcí celé řady genů. Prvními identifikovanými indukovanými obrannými proteiny v odpovědi na mechanický stres jsou proteinasové inhibitory I a II z bramboru a rajčete (Reymond et al., 2000). Velká část mnohobuněčných eukaryot se ţiví rostlinami. Zejména častou příčinou zranění rostlin je herbivorní hmyz. Je však málo dostupných informací o tom, jak rostliny rozlišují a reagují na velmi odlišné hrozby představované mechanickým zraněním herbivorií (Reymond et al., 2000). Centrální signální látkou v rámci reakcí rostlin na poranění je kyselina jasmonová. Nicméně v signální kaskádě hraje regulační roli několik dalších strukturálně 19
odlišných molekul, včetně oligopeptidu systeminu (Pearce et al., 1991), oligosacharidů uvolněných z poškozené buněčné stěny (Bishop et al., 1981) a dalších fytohormonů jako je kyselina abscisová a ethylen (O´Donnell et al., 1996). Reakce aktivované poraněním jsou zaměřeny především na hojení poškozených pletiv a aktivaci obranných mechanismů, které předcházejí dalšímu poškození. K indukci odpovědi dochází v časovém rámci několika minut aţ několika hodin po zranění a zahrnují vznik, uvolnění, vnímání a přenos specifických signálů z rány pro následnou aktivaci obranných genů. Proteiny kódované poraněním-indukovanými geny mohou zastávat některou z následujících funkcí: (i) opravy poškozených rostlinných tkání; (ii) produkce látek, které inhibují růst hmyzu (predátora), např. sníţení stravitelnosti rostlinné tkáně nebo produkce toxinu; (iii) účast na aktivaci obranných signálních drah nebo (iv) nastavení rostlinného metabolismu k uloţení nutričních poţadavků (León et al., 2001). Nedávno byly identifikovány a částečně charakterizovány různé, na kyselině jasmonové závislé i nezávislé dráhy přenosu signálu. Komponenty těchto signálních drah jsou většinou podobné těm zapojeným i v jiných signálních kaskádách u eukaryot a zahrnují kroky reverzibilní fosforylace proteinů, vápníkem/kalmodulinem regulované děje a produkci reaktivních forem kyslíku. Některé z těchto komponent mají funkci také v signalizaci dalších obranných reakcí rostlin (León et al., 2001). 2.2.4 Zasolení Zasolené půdy mohou být mokré nebo suché. Mokré jsou v blízkosti moří, suché se týkají především oblastí pouští a polopouští (Pessarakli, 1999). Některé anionty jsou pro rostliny ve vysokých koncentracích toxické (Na+, Cl-, SO42-, Mg2+), ale také způsobují nízký vodní potenciál a zhoršené fyzikální vlastnosti půdy (Buchanan et al., 2000; Procházka et al., 1998). Vegetace zasolených oblastí se označuje jako halofytní, zatímco vegetace rostoucí na nezasolených půdách bývá někdy označována jako glykofytní (Pessarakli, 1999). Salinita negativně ovlivňuje celosvětovou rostlinnou produkci skrz četné škodlivé účinky na buňky včetně membránové dezorganizace, generování toxických metabolitů a reaktivních forem kyslíku a také sníţení fotosyntézy (Srivastava et al., 2004). Vysoké koncentrace iontů v buňkách způsobují nefunkčnost enzymů a následně dochází k zastavení růstu a k odumření celé rostliny. Značné zasolení půdy snášejí bez poškození halofytní rostliny. Příjem solí je buď dokonale regulován vysokou 20
selektivitou plazmatické membrány, nebo se soli hromadí v listech (Procházka et al., 1998). Za hlavní rysy tolerance rostlin k salinitě mohou být povaţovány regulace koncentrace a sloţení a distribuce iontů v buňce (Buchanan et al., 2000). 2.2.5 Těţké kovy Kontaminace těţkými kovy je závaţným environmentálním problémem, který nejen ţe omezuje produktivitu rostlin, ale ohroţuje také lidské zdraví. V důsledku pouţívání různých zemědělských a průmyslových postupů dochází k akumulaci těţkých kovů v zemědělských půdách a obecně k zatěţování ţivotního prostředí (Tuteja et al., 2011). Ke kovům nebezpečným pro biotiku patří především Cu, Zn, Cd, Hg, Pb, Cr, Ni, Mn, Fe a navíc polokovy Se a As. Ačkoli je mnoho kovů ve stopových koncentracích pro organismy nezbytných - například měď, zinek, chrom a ţelezo jsou součástí některých enzymů - ve vyšších koncentracích mohou být pro rostlinu toxické (Hall, 2002; Kafka a Punčochářová, 2002). Kadmium omezuje růst rostlin a biomasy a v extrémních případech způsobuje smrt rostlin. Způsobuje zpomalení růstu výhonků a kořenů, dezorganizaci gran a redukci biosyntézy chlorofylu. Zasahuje tak do fotosyntézy a respirace. Dále například inhibuje aktivitu enzymů zapojených do dráhy asimilace nitrátu. Zinek je nezbytnou ţivinou pro ţijící organismy, vyšší koncentrace jsou však pro normální růst a vývoj rostlin toxické a vedou k inhibici růstu a produktivity. Měď hraje důleţitou roli v asimilaci CO2 a syntéze ATP. Je také nezbytnou součástí plastocyaninu a cytochromoxidázy, enzymu dýchacího elektronového transportního řetězce. Je široce pouţíváným pesticidem v zemědělství a její vysoké koncentrace jsou škodlivé, a dokonce smrtelné pro většinu rostlin. Nejvýznamnějšími místy inhibice mědi jsou fotosyntetické reakce. Rtuť je nejnebezpečnějším kovem ţivotního prostředí, který můţe u rostlin způsobit oxidační stres spuštěním tvorby reaktivních forem kyslíku AOS (Hall, 2002; Tuteja et al., 2011). Moţnými mechanismy toxicity jsou změny v permeabilitě buněčné membrány, reakce se sulfhydrylovými (-SH) skupinami proteinů vedoucí k inhibici činnosti nebo narušení struktury (Hall, 2002), fosfátovými skupinami nebo aktivními skupinami ADP či ATP či nahrazení základních iontů. Navíc způsobuje obstrukci vodního toku. Vlivem akumulace rtuti se v rostlinách sniţuje obsah chlorofylu a proteinů, coţ můţe mít negativní vliv na fotosyntézu. 21
Hliník je nejhojnější kov zemské kůry a jeho toxicita je hlavním faktorem limitujícím výnosy plodin na kyselých půdách. Způsobuje narušení signálních drah, inhibici buněčného dělení a toku iontů, narušení dynamiky cytoskeletu, indukci tvorby AOS a poruchy stability a funkce plazmatické membrány (Tuteja et al., 2011). Nedávné důkazy objevily buněčné/molekulární mechanismy, které mohou být zapojeny v rezistenci a toleranci rostlin k vysokým koncentracím těţkých kovů v ţivotním prostředí. Strategie rostlin obecně směřují k zabránění akumulace vysokých koncentrací kovů v cytosolu (Hall, 2002). 2.3 Reakce rostlin na biotický stres Choroby rostlin jsou způsobovány celou škálou patogenních organismů. Mohou to být viry, bakterie, houby, ale i parazitující hmyz (Řepková a Relichová, 2001). Z tohoto důvodu se u rostlin vyvinuly četné morfologické a morfogenetické adaptace (trichomy, sklerenchymatická pletiva či schopnost regenerace) a dále biochemické adaptace, které se zakládají na produkci sekundárních metabolitů odpudivých aţ toxických pro patogeny) (Gloser, 1998). 2.3.1 Obranná reakce proti patogenům Pasivní obrana rostliny se opírá o takzvané pre-existující struktury (trichomy, kutikula, krycí a vnitřní pletiva), které brání průniku patogenu do rostliny (do pletiva, do buňky). Tato obrana rostliny vůči patogenu však není zcela nepřekonatelná, proto se u rostlin vyvinula obrana aktivní. Ta spočívá ve tvorbě látek, které patogena usmrtí nebo alespoň zbrzdí jeho vývoj. Pre-existující struktury s látkami produkovanými nezávisle na infekci patogenem představují tzv. konstitutivní obranu rostliny. Indukovaná obrana se rovněţ zakládá na produkci antimikrobiálních látek (fytoalexinů), ovšem závisí na rozpoznání patogenu rostlinným receptorem (Walters, 2010). 2.3.1.1 Konstitutivní obrana Hlavní mechanicky odolnou bariérou rostlin je kutikula. Je tvořena z kutinu, hydrofobního materiálu obsahujícího mastné kyseliny a jejich estery, který sniţuje úspěšnost klíčení spor. Pod kutikulou leţí epidermální buňky, které v případě dostatečně silných a tuhých buněčných stěn nabízejí téměř neprostupnou bariéru pro mnoho houbových patogenů (Walters, 2010). Neméně významnou mechanickou bariéru tvoří
22
vnější periderm, který vzniká druhotným tloustnutím rostlin. Je tvořen odumřelými tlustostěnnými buňkami a vykazuje vysokou odolnost vůči působení enzymů a toxinů patogenů. Rostliny obsahují rozmanité spektrum antimikrobiálních látek (produkty sekundárního metabolismu), které syntetizují nezávisle na napadení patogeny. K těmto látkám řadíme např. fytoanticipiny (Buchanan et al., 2000). 2.3.1.2 Indukovaná obrana Indukovaná obrana rostliny spočívá ve vytváření nepříznivých podmínek pro růst a reprodukci patogenu. Při této obraně často dochází k aktivaci hypersenzitivní reakce, která se projevuje vznikem nekrotických skvrn. V místě napadení patogenem dochází k rychlému odumírání rostlinných buněk (Obrázek 5), které izolují patogen od ţivých tkání rostliny. Patogen tak nemá přístup k ţivinám potřebným pro růst a mnoţení (Govrin a Levine, 2000). Usmrcené buňky navíc produkují toxické látky, které patogenu brání v dalším rozvoji, případně jej usmrtí (Buchanan et al., 2000). Jestliţe však buňky neprodukují dostatečné mnoţství toxických látek, můţe naopak dojít k podpoře růstu nektrotrofích patogenů (Poinssot et al., 2003). Některé antimikrobiální látky jsou v buňce uloţeny ve formě inaktivních prekurzorů a stávají se biologicky aktivními aţ pomocí enzymů syntetizovaných rostlinou v odpovědi na útok patogenu (Walters, 2010). V místě infekce se vytvářejí korkové vrstvy, které omezují průnik patogenu tkáněmi a omezují rozptýlení některých, patogenem produkovaných toxických látek, dále zabraňují přísunu vody a ţivin do místa infekce a způsobí tak vyhladovění patogenu. V okolí rány můţe také docházet ke změnám ve sloţení buněčné stěny vedoucích k jejímu zpevnění a zbytnění (ukládáním kalosy), čímţ se průnik patogenu do rostliny ztíţí. Obrovskou bariéru pro patogeny představuje tvorba ligninu, který je pro ně obtíţně metabolizovatelný a chrání tak buněčnou stěnu před rozkladem (Walters, 2010).
23
Obrázek 5: Hypersenzitivní reakce bramboru k napadení plísní bramborovou (Phytophthora infestans) (Ţiva, 2009)
2.3.1.3 Systémová rezistence Několik hodin po napadení rostliny se látky způsobující rezistenci rozšiřují do zdravých tkání, a dokonce i do sousedních rostlin. Jedná se o schopnost hostitelské rostliny potlačit nebo alespoň oddálit aktivitu patogenu. Vznik systémové rezistence je pravděpodobně podmíněný tvorbou nekrotických lézí, které jsou buď součástí hypersenzitivní reakce (HR) nebo se jedná o příznak choroby (Buchanan et al., 2000). Existují dvě základní formy systémové rezistence. Prvním typem je Systemic Acquired Resistance (SAR). V tomto případě signál aktivizující rostlinu k obranným reakcím je přenášen kyselinou salicylovou (Obrázek 6A). SAR je typická zvýšenou expresí SAR genů kódujících PR proteiny. V důsledku SAR se u hostitelské rostliny zvýší rezistence vůči biotorofním patogenům (Buchanan et al., 2000; Hamiduzzaman et al., 2005). Druhý typem je
Induced Systemic Resistance (ISR) spouštějící se při
napadení rhizobakteriemi. (Poinssot et al., 2003). V tomto případě jsou za přenos signálu zodpovědné kyselina jasmonová a ethylen (Obrázek 6B, 6C) a důsledkem je rezistence vůči nekrotrofním patogenům (Hamiduzzaman et al., 2005).
24
Obrázek 6: Kyselina salicylová (A), kyselina jasmonová (B), ethylen (C).
2.4 Réva vinná Systematické zařazení révy vinné: Vitis vinifera (rod Vitis, čeleď Vitaceae, řád Rhamnales, třída Rosopsida, oddělení Magnoliophyta, podříše Tracheobionta, říše Plantae). Čeleď Vitaceae zahrnuje asi 700 druhů zařazených do 14 rodů. K hospodářsky nejvýznamnějším rodům patří Vitis. Ten se dále dělí na dva odlišné podrody Muscadinia a Euvitis. Oba podrody se od sebe vzájemně odlišují počtem chromozomů a morfologickými vlastnostmi (Pavloušek, 2011). Vhodnější pro výrobu vína je podrod Euvitis, který má cca 70 druhů pocházejících ze tří areálů rozšíření. Největší počet druhů pochází se Severní Ameriky (americké révy), menší počet z Asie (asijské révy) a pouze jediný druh z Evropy. Evropská réva, nazývaná také ušlechtilá réva, má botanický název Vitis vinifera. Tento druh (species) se dělí na dva poddruhy (subspecies), Vitis vinifera ssp. silvestris (předchůdce dnešních odrůd, réva lesní) a Vitis vinifera ssp. sativa (představuje nepřeberné mnoţství pěstovaných odrůd neboli kultivarů evropské révy) (Kraus et al., 2000). 2.4.1 Nejvýznamnější houbové choroby révy vinné Choroby révy vinné způsobují převáţně houbové organismy z říše Fungi a Chromista. Poškozují ji však i další skupiny patogenů: viry, bakterie i ţivočišní škůdci (Kraus et al., 2000). Nejvýznamnější houbové choroby révy vinné jsou Plíseň révová (Plasmopara viticola), Padlí révové (Uncinula necator) a Plíseň šedá (Botrytiona fuckeliana). Postihují révu vinnou zejména ve vegetačním období (Pavloušek, 2005). Mezi další
25
houbová onomecnění révy vinné patří například Hniloba kořenů révy, Bílá hniloba, Černá skvrnitost révy či Červená spála (Ackermann et al., 2004).
2.4.1.1 Plíseň révová Plasmopara viticola (řád Peronosporales, podtřída Peronosporomycetidae, třída Peronosporomycetes, oddělení Oomycota, říše Chromista) je obligátně biotrofní parazit révy vinné (Váňa, 1998). Choroba se šíří především za teplého počasí s relativní vlhkostí vzduchu nad 90% a riziko infekce se zvyšuje s intenzitou sráţek. Patogen napadá všechny vegetativní orgány révy, jako jsou listy, vegetační vrcholy, květy, hrozny a letorosty. Po napadení patogenem se na horní straně listové čepele révy vytvářejí ţlutavé olejovité skvrny (Obrázek 7A), na rubu listů můţeme pozorovat svazečky sporangioforů (Obrázek 7B) (Váňa, 1998). Takto napadená místa na listu hnědnou a zasychají. Na květech se tvoří bílé povlaky houby, které se zbarvují světle zeleně a později hnědnou (Obrázek 8A) (Pavloušek, 2005). K nejvýznamnějším škodám dochází v případě napadení mladých bobulí či třapiny mladých hroznů. Napadené bobule a hrozny hnědnou, zasychají (Obrázek 8B) a zčásti opadávají. Plíseň révová je jedním z nejnebezpečnějších patogenů všech evropských oblastí pěstování vinné révy (Perret, 2001). Jednotlivé odrůdy révy jsou vůči plísni révové více či méně citlivé (Hluchý et al., 1997). Plíseň révová se rozšířila v roce 1878 do evropských vinic ze Severní Ameriky (Pavloušek, 2005).
Příznaky na listech:
Obrázek 7: Olejové skvrny na svrchní straně listu (A), porost sporangioforů a sporangií na spodní straně listů (B) (Hluchý et al., 2008).
26
Příznaky na květenství a hroznech:
Obrázek 8: Napadení květenství (A), napadení mladých hroznů (B) (Hluchý et al., 2008).
2.4.1.2 Padlí révové Uncinula
necator
(řád
Erysiphales,
podtřída
Erysiphomycetidae,
třída
Leotiomycetes, pododdělení Pezizomycotina, oddělení Ascomycota, říše Fungi) je obligátní ektoparazit révy vinné, který byl do Evropy zavlečen z Orientu a dlouho byl znám pouze jako Oidium tuckeri. (Váňa, 1998). V sušších letech bývá hospodářsky nejškodlivějším houbovým onemocnění révy, které způsobuje výrazné sníţení výnosu a kvality hroznů (Marsh et al., 2010). Na letorostech, listech, květenství i hroznech se vytvářejí bělavé moučnaté povlaky mycelia (Obrázek 10A). Postiţené části v důsledku poškození povrchových buněk šednou, dochází k omezení růstu a k deformacím (Ackerman et al., 2004). Houba se k ţivinám dostává penetrací kutikuly (Hoffman, 2006). Na listech vznikají světle zbarvené matné skvrny (Obrázek 9) (Hluchý et al., 2008), které jsou později pokryté šedobílým povlakem houby (Pavloušek, 2005). Květenství sprchávají, mladé bobule zasychají, u starších dochází v důsledku poškození povrchových buněk při dalším růstu k praskání bobulí a tzv. „výhřezu semen“ (semenné průtrţe) (Obrázek 10B). Letorosty jsou kratší a vznikají na nich tmavé skvrny. U jednotlivých odrůd vinné révy pozorujeme výrazný rozdíl v náchylnosti k této chorobě (Hluchý et al., 2008). Původce Padlí révového byl rozšířen do evropských vinic, podobně jako Plíseň révová, z Ameriky (Pavloušek, 2005).
27
Příznaky Padlí révového na listech:
Obrázek 9: Světlé skvrny na listu (Hluchý et al., 2008).
Příznaky Padlí na hroznech révy:
Obrázek 10: Bělavé povlaky na hroznech (A), praskání bobulí v důsledku Padlí (B) (Hluchý et al., 2008).
2.4.1.3 Plíseň šedá Botryotinia fuckeliana (řád Helotiales, podtřída Leotiomycetidae, třída Leotiomycetes, pododdělení Pezizomycotina, oddělení Ascomycota, skupina oddělení Eumycota, říše Fungi), známá i jako Botrytis cinerea, je patogen i saprofyt napadající celou řadu pěstovaných i divoce rostoucích rostlin (Váňa, 1998). Plíseň šedá napadá všechny nadzemní části révového keře, tedy réví, mladé letorosty, listy, květenství a hrozny (Hluchý et al., 1997). Letorosty vadnou, listy 28
ztrácejí barvu, květenství zasychají (Obrázek 11A), bobule za sucha usychají, za vlhka se pokrývají svazčitými konidiofory s chomáči konidií na postranních větvích a odpadávají (Obrázek 11B) (Hluchý et al., 2008; Váňa, 1998). Na zrajících a zralých hroznech vznikají tmavší hnilobné skvrny, pokoţka praská a odlupuje se (Hluchý et al., 2008).
Příznaky napadení hroznů a květenství révy plísní šedou:
Obrázek 11: Květenství révy napadené plísní šedou (A), pokročilé stadium napadení hroznu (B) (Hluchý et al., 2008).
2.4.2 Proteomické změny vyvolané stresem u révy vinné U révy vinné byla po napadení patogenem, elicitaci nebo za stresových podmínek pozorována indukce celé řady PR proteinů (konkrétně chitinas, glukanas, thaumatin-like a osmotin-like proteinů a proteinů třídy PR-10) a jiných proteinů spojených s obrannou reakcí (např. proteinu inhibujícího polygalakturonasu). Chitinasy narušují chitinové polymery buněčné stěny hub, přičemţ antifugální aktivita rostlinných endochitinas je in vitro synergisticky zvyšována přítomností glukanas (Heřmanová et al., 2006). K expresi některých izoforem chitinas u révy vinné došlo vlivem nadbytku i nedostatku vody (Grimplet et al., 2009; Di Carli et al., 2011). Glukanasy hydrolyzují strukturu β-1,3-glukanů přítomných v buněčných stěnách hub vedoucí k lýze buněk (Heřmanová et al., 2006). Indukce některých izoforem glukanas byla u révy vinné pozorována v podmínkách zaplavení i vodního deficitu (Grimplet et al., 2009; Di Carli et al., 2011) a po aplikaci kyseliny salicylové. (Bézier et al., 2002).
29
Pro thaumatin-like a osmotin-like proteiny je charakteristická funkce permeabilizace membrány (Heřmanová et al., 2006). Silná indukce thaumatin-like proteinů byla pozorována po napadení révy bakterií Xylella fastidiosa a bylo zjištěno, ţe jejich exprese bývá vyšší u rezistentních druhů (Yang et al., 2011). Thaumatin-like a osmotin-like proteiny se v révě indukují také po napadení houbovými patogeny (např. Fomitiporia mediteranea) (Spagnolo et al., 2012). K expresi osmotin-like proteinů dochází taktéţ po působení environmentálních stresových faktorů (Di Carli et al., 2011). U proteinů třídy PR-10 byla prokázána ribonukleasová aktivita (Heřmanová et al., 2006). Proteiny třídy PR-10 jsou v rostlinách konstitutivně exprimovány a indukce různých izoforem PR-10 byla pozorována vlivem různých fyzikálních a chemických stresových faktorů (zranění, UV záření, chlad; zasolení, sucho, zaplavení, polutanty, těţké kovy, elicitory) (Ferri et al., 2009; Grimplet et al., 2009; Jellouli et al., 2008; Martinez-Esteso et al., 2011; Yang et al., 2011). Tyto proteiny se však v révě indukují i po působení patogenu (Jellouli et al., 2008; Marsh et al., 2010; Milli et al., 2012; Yang et al., 2011) či vlivem některých signálních molekul (SA, JA, ethylen, H2O2) (Jellouli et al., 2008). Protein inhibující polygalakturonasu (PGIP) inhibuje aktivitu polygalakturonas vylučovaných fytopatogenními houbami a ukázalo se, ţe by mohl být důleţitým aspektem indukované obrany révy vinné proti B. cinerea. Indukce genu PGIP byla pozorována po infekci révy nekrotrofním patogenem (Bézier et al., 2002).
30
2.5 Cíle praktické části diplomové práce příprava suspenzních kultur révy vinné (Vitis vinifera cv. Gamay) aplikace biotického a abiotických stresových faktorů izolace intracelulárních a extracelulárních proteinů z buněk optimalizace separačních podmínek a následná separace pomocí 2-D elektroforézy sledování vlivů biotického a abiotických stresových faktorů na proteom suspenzní kultury révy vinné (Vitis vinifera cv. Gamay) porovnání
kvantitativních
a
kvalitativních
změn
v intracelulárním
extracelulárním proteomu vyvolaných aplikovanými stresovými podmínkami
31
a
3 Experimentální část 3.1 Biologický materiál Buněčná suspenze Vitis vinifera cv. Gamay byla odvozena z kalusu získaného od S. Jeandroz (UMR, PME Plante-Microbe-Environnement, Dijon, Francie) v roce 2010. Tato suspenzní kultura byla pěstována v Nitsch Nitsch mediu na třepačce (125 rpm) při konstantní teplotě (25 °C) s intenzitou světla 80 µE m-2 s-1. Buněčné suspenze byly vţdy po 14 dnech přeočkovány a byly pouţívány čtyřdenní buňky v exponenciální fázi růstu. B. cinerea (DSM No.: 5145) byla zakoupena z Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ) a pěstována v kapalném médiu bramborové dextrózy podle pokynů dodavatele. 100 mg mycelia bylo v 1 ml 20% (v/v) glycerolu uskladněno při -20 °C aţ do pouţití. Suspenzní kultury révy vinné (Vitis vinifera cv. Gamay) byly vystaveny jednotlivým stresovým faktorům ve tmě (obaleny alobalem) po dobu 24 hodin. Podmínky byly následující: kontrolní vzorek (CTR): 25 °C, 120 rpm; teplotní stres (TS): 10 °C, 120 rpm; mechanický stres (MS): 25 °C, 200 rpm; biotický stres (BS): 25 °C, 130 rpm, 0,01 mg/ml mycelia Botrytis cinerea (přídavek 8 μl suspenze 0,1 mg/ml v 20% glycerolu). Po 24 hod. vystavení jednotlivým stresovým faktorům byly buněčné suspenze přefiltrovány přes filtrační papír na fritě. Buňky byly zváţeny a zamraţeny na -70 °C. 3.2 Izolace intracelulárních proteinů 3.2.1 Homogenizace V případě intracelulárních proteinů byly buňky tří variant homogenizovány ve 20 ml homogenizačního pufru (Tris-Mes 50 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM, pH 8,0; sacharosa 500 mM; DTT 10 mM; PMSF 1 mM (v DMSO)) a rozmixovány tyčovým mixérem. Homogenizát byl přefiltrován přes několik vrstev gázy a centrifugován (16 000 x g, 20 min., 4 °C). Supernatant byl následně centrifugován na ultracentrifuze (35 000 x g, 35 min., 4 °C), poté byla změřena koncentrace proteinů pomocí RC/DC kitu (Bio-Rad, USA).
32
3.2.2 Přesráţení kyselinou trichloroctovou (TCA) 3 ml od kaţdého vzorku po ultracentrifugaci byly přesráţeny TCA. Kaţdý Vzorek byl smíchán se čtvrtinovým objemem 100% TCA a inkubován 30 minut při 4 °C. Poté následovala centrifugace (15 min., 20 000 x g, 4 °C). Supernatant byl odstraněn a pelet byl promyt 200 μl studeného acetonu a centrifugován (10 min., 20 000 x g). Opět byl odstraněn supernatant, pelet byl promyt 200 μl studeného acetonu a podroben centrifugaci (10 min., 20 000 x g). Supernatant byl odlit a pelet byl vysušen na Speed Vacu (Thermo, USA). 3.2.3 Solubilizace proteinů Jednotlivé pelety byly rozpuštěny v 350 μl rehydratačního pufru (močovina 7 M, thiomočovina 2 M, CHAPS 4%, DTT 60 mM) s 2% amfolyty (Bio-Rad, USA). Vzorky byly 30 min. sonikovány, vortexovány a přes noc třepány při 30°C a 900 rpm. Násedně byly vzorky centrifugovány (10 min., 20 000 x g). V supernatantech byla pomocí RC/DC kitu (Bio-Rad, USA) stanovena koncentrace proteinů a upravena rehydratačním pufrem na stejnou hodnotu. 3.3 Extracelulární proteiny 3.3.1 Zakoncentrování proteinů na cut-off kolonkách V případě
extracelulárních
proteinů
bylo
nejprve
30
ml
média
ultracentrifugováno (35 min., 35 000 x g, 4 °C). Mezi tím byly cut-off kolonky Vivaspin 20 (3 kDa MWCO, GE Healthcare, USA) inkubovány s ne-proteinovým blokovacím pufrem (Pierce Protein-Free, Thermo Scientific) po dobu 20 minut. Následně bylo 14 ml supernatantu po ultracentrifugaci smícháno s 1 ml ne-proteinového blokovacího pufru a koncentrováno pomocí centrifugace na výsledný objem cca 1 ml (8 000 x g, 4 °C). Poté byla změřena koncentrace proteinů pomocí RC/DC kitu (BioRad, USA) a zakoncentrovaná extracelulární média byla přesráţena pomocí TCA (viz kap. 3.2.2) pro přímou analýzu na MS. 3.4 Izoelektrická fokusace a SDS-PAGE Byly pouţity IPG stripy DryStrip s imobilizačním gradientem pH 3-11 NL (GE Healthcare). Rehydratace, kdy proteiny vstupují do gelu pouze absorpcí, byla provedena umístěním IPG stripu gelem dolů do rehydratační vaničky obsahující 450 μl vzorku. Ve všech případech bylo nanášeno 340 μg celkového proteinu ve vzorku v triplikách. 33
Kvůli pozorování procesu hydratace bylo k roztoku vzorku přidáno malé mnoţství bromfenolové modři. Stripy byly převrstveny minerálním olejem, aby se zabránilo odpařování a absorpci CO2. Doba trvání rehydratace byla 18 hodin. Po rehydrataci byly stripy přeneseny do fokusační vaničky. Na kaţdou elektrodu, která byla pouţita, byl umístěn wick a na kaţdý wick bylo před umístěním IPG stripů napipetováno 5-8 μl vody. Stripy byly před spuštěním běhu fokusace opět převrstveny minerálním olejem. IEF byla provedena pouţitím PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad). Podmínky fokusace jsou uvedeny v Tabulce I:
Tabulka I: Podmínky IEF. Krok
Funkce
Max. napětí
Spád napětí
Čas
1
odsolování
100 V
rapidní
odpovídající 100 Vh
2
nárůst napětí
250 V
lineární
odpovídající 250 Wh
3
nárůst napětí
1000 V
linerání
odpovídající 1000 Wh
4
hlavní fokusační krok
3500 V
rapidní
odpovídající 75 000 Wh
5
udrţovací podmínky
500 V
rapidní
15 h
Před samotným postupem SDS-PAGE byly zafokusované IPG stripy ekvilibrovány. Kaţdý strip byl umístěn gelem nahoru do rehydratační vaničky a jednotlivé ţlábky byly postupně naplněny ekvilibračním pufrem. Nejprve byly stripy 15 minut inkubovány za jemného míchání s ekvilibračním pufrem s DTT (DTT 2%; močovina 6 M; SDS 2%; Tris-HCl 0,05 M, pH 8,8; glycerol 20%), poté 15 minut s ekvilibračním pufrem s IAA (IAA 2,5%; močovina 6 M; SDS 2%; Tris-HCl 0,05 M, pH 8,8; glycerol 20%). Po ekvilibraci byly IPG stripy umístěny na předpřipravené 12% akrylamidové 1 mm SDS-PAGE dvojrozměrné gely. Z důvodu ukotvení byly stripy převrstveny 1% rozvařenou agarosou v SDS-PAGE pufru, k níţ bylo přidáno malé mnoţství bromfenolové modři. Gely byly vloţeny do PROTEAN plus Dodeca Cell (Bio-Rad) naplněné SDS-PAGE pufrem a separovány za následujících podmínek: 50 V (120 minut) a potom 100 V za pouţití PROTEAN plus Dodeca Cell (Bio-Rad).
34
3.5 Barvení Po skončení SDS-PAGE byly gely vloţeny na 30 min. do fixačního roztoku (metanol 10%, kyselina octová 7%). Následovalo obarvení fluorescenčním barvivem SYPRO RUBY přes noc, kdy na jeden gel bylo pouţito 150 ml barviva. Poté byly gely promyty 30 minut ve fixačním roztoku a následně byly promyty destilovanou vodou. Gely byly skenovány na přístroji Pharos FX Plus Molecular Imager (Bio-Rad, USA). Následné vyhodnocení gelů a srovnání proteinových map bylo provedeno za pouţití softwaru PD-Quest (Bio-Rad). 3.6 Stanovení ţivotaschopnosti buněk fluorescenční mikroskopií Na buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay byly aplikovány stresové faktory po dobu 24 hodin. Poté byly buněčné suspenze jednotlivých variant jemně promíchány a z kaţdé varianty bylo zprostřed suspenze odpipetováno 50 μl média a přeneseno do mikrozkumavek. Ke vzorkům bylo přidáno 5 μl fluorescein diacetátu a 3 μl propidium jodidu. Po pětiminutové inkubaci bylo 30 μl naneseno na podloţní sklo, a po přiloţení krycího sklíčka byly buňky pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem. Ţivé buňky zeleně fluoreskovaly, u mrtvých buněk bylo pozorováno červené zbarvení. 3.7 Stanovení salicylátu 3.7.1 Izolace salicylátu Do mikrozkumavek bylo naváţeno 0,25 – 0,35 g zmraţených buněk. Do mikrozkumavek se vzorky byly přidány kovové tloučky, zamrazily se tekutým dusíkem a byly intenzivním třepáním rozdrceny v drtiči buněk. Ze stále podchlazených mikrozkumavek byly tloučky opatrně vyndány a k rozdrceným vzorkům byl přidán 1 ml 90% methanolu a 250 ng o-anisic acid (vnitřní standard). Vzniklé směsi byly vortexovány a poté 15 minut sonikovány z důvodu rozrušení membrán a uvolnění buněčného obsahu. Dále byla provedena centrifugace (5 minut, 1 200 x g). Do srdcových baněk byl kvantitativně odebrán supernatant a k peletu byl přidán 1 ml 90% methanolu. Vzorky byly opět vortexovány, na 15 minut vloţeny do sonikátoru a centrifugovány (5 minut, 1 200 x g). Supernatanty byly smíchány s předchozími a postupně vysušeny na vakuové rotační odparce. Ke všem vzorků bylo po vysušení přidáno 500 μl Na-acetátového pufru (100 mM, pH 5,2), poté byly vloţeny na 2 minuty do ultrazvuku. Vzorky byly smíchány s 40 IU β-glukosidasy, promíchány a vloţeny na 1 hodinu do termostatu nastaveného na 37 35
°C. Vzorky byly smíchány s 2,5 ml 5% kyseliny trichloroctové, důkladně promíchány, 2 minuty sonikovány a opět centrifugovány (5 minut, 1 200 x g). Po kvantitativním přenesení supernatantů do dělících nálevek jiţ obsahujících 2,5 ml směsi cyklopentan:ethylacetát (1:1) bylo se směsí cca 3 minuty třepáno. Po ustálení vrstev byly vrchní (organické) fáze odebrány do skleněných zkumavek a zachovány,
spodní
(vodné)
cyklopentan:ethylacetát
(1:1).
fáze
byly
Organické
opět fáze
vytřepány byly
s 2,5
smíchány
ml
směsí
s předchozími
zachovanými, vysušeny dusíkem a odpařené vzorky byly zamraţeny na -80 °C. 3.7.2 Analýza salicylátu pomocí HPLC Ke vzorkům odpařeným v proudu dusíku bylo přidáno 250 μl 90% methanolu a následně byly třepány na třepačce. Směsi byly kvantitativně přeneseny do mikrozkumavek a centrifugovány (10 minut, 10 000 x g). Z kaţdé mikrozkumavky bylo odebráno 230 μl supernatantu do popsaných vialek pro HPLC. Stanovení koncentrace salicylátu pomocí HPLC (HPLC Systém 1 100, Agilent) bylo provedeno na koloně SupelcosilTM LC-18-DB s vyuţitím absorpčního (DAD) detektoru a fluorescenčního (FLD) detektoru. Absorbance byla měřena při vlnové délce 270 nm, přičemţ referenční vlnová délka byla 360 nm a vlnová délka excitačního záření byla 305 nm. Salicylát emituje při 407 nm, o-anisic acid při 365 nm. Při stanovení byla vyuţita gradientová eluce: 80% acetonitril + 2% kyselina octová / 2% kyselina octová (Tabulka II). Průtok byl nastaven na 1 ml.min-1.
Tabulka II: Sloţení mobilní fáze při HPLC. Čas (min)
80% acetonitril, 2% kys. octová
2% kyselina octová
0,0
0,0
100,0
5,0
6,2
93,8
25,0
31,2
68,8
25,1
100,0
0,0
30,0
100,0
0,0
30,1
0,0
100,0
37,0
0,0
100,0
36
4 Výsledky
Vinná réva (Vitis vinifera) je důleţitá ovocná plodina a vhodný modelový druh vzhledem ke své známé struktuře genomu (Benjak et al., 2009). Citlivost révy k několika patogenům zapříčiňuje značné sníţení výnosu a kvality ovoce. Moderní zemědělství vyuţívá k redukci patogenů přirozenou rezistenci rostlin, proto je vysoce hodnotná identifikace molekulárních mechanismů. Mezi nejvýznamnější choroby révy vinné patří plíseň révová, padlí révové a plíseň šedá, které jsou způsobeny patogeny Plasmopara viticola, Erysiphe necator a Botrytis cinerea. V uplynulých letech bylo provedeno několik studií zaměřených na změny proteomu révy vinné po infekci E. necator, P. viticola nebo Xylella fastidiosa (Marsh et al., 2010; Milli et al., 2012; Yang et al., 2011), avšak změny proteomu révy vinné vyvolané infekcí B. cinerea nebyly komplexně zkoumány a dosud není známá ţádná proteomická studie srovnávající vliv infekce patogenu s abiotickým stresem u révy vinné. Buněčná suspenzní kultura je zjednodušený rostlinný modelový systém, který umoţňuje jednoduše oddělit extracelulární a intracelulární proteiny. Cílem diplomové práce bylo prozkoumat vliv abiotického a biotického stresového faktoru, zejména mechanický stres a infekci B. cinerea, na extracelulární a intracelulární proteom buněčné suspenze cv. Gamay, která byla jiţ dříve pouţita ke studiu obranných reakcí na úrovni proteinu (Martinez-Esteso et al., 2009, Martinez-Esteso et al., 2011). 4.1 Stanovení ţivotaschopnosti buněk fluorescenční mikroskopií V první fázi bylo nutné provést optimalizaci působení stresových podmínek na buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay vystavené různým stresovým faktorům. Bylo potřeba nalézt takové podmínky, za kterých bude na jedné straně působení stresového faktoru dostatečné pro indukci obranné reakce a na druhé straně nepovede k velkému poklesu ţivotaschopnosti buněčné suspenze vedoucí k nekróze a následné lýzi buněk. V případě mechanického poškození byly nejprve ke kultuře přidány skleněné kuličky (balotina), protoţe ale došlo k lýze buněk, jako nejvhodnější způsob se následně ukázalo pouze kulturu třepat při vyšších otáčkách (200 otáček/min.). Suspenzní kultura vystavená teplotnímu stresu byla umístěna do chladu (10 °C). Pro biotický stres bylo nutné optimalizovat mnoţství mycelia Plísně šedé (Botrytis cinerea) 37
a dobu inkubace se suspenzní kulturou, aby nedocházelo k masivnímu odumírání buněk a jejich následné lýzi. Byla zvolena koncentrace 0,01 mg/ml mycelia Botrytis cinierea (přídavek 8 μl suspenze (0,1 g/ml) v 20% glycerolu). Optimální podmínky působení jednotlivých stresových faktorů byly zvoleny na základě předešlých publikací a zkušeností v rámci pracoviště. Ţivotaschopnost byla stanovena ve třech opakováních pro všechny vzorky (CTR, TS, MS, BS) ve 24 hodině od aplikace jednotlivých stresových faktorů. Výsledky měření jsou uvedeny v Tabulce III a vyplývá z nich, ţe zvolené podmínky působení jednotlivých stresových faktorů nevedly po 24 hodinách působení k signifikantnímu poklesu ţivotaschopnosti buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay a byly následně pouţity pro vlastní experimenty zkoumající proteomické změny v odpovědi na stres. Tabulka III: Ţivotaschopnost buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay. Ţivotaschopnost buněk byla měřena pomocí fluorescein diacetátu a proprium iodidu ve třech opakováních ve 24 hodině po aplikaci jednotlivých stresových faktorů a je dána poměrem počtu ţivých buněk k počtu buněk celkem. Varianta
CTR
TS
MS
BS
Naváţka [g] 3,8
Počet buněk celkem 222
Počet ţivých buněk 212
Ţivotaschopnost [%] 95,5
3,7
155
152
98,1
3,7
195
183
93,8
3,4
229
217
94,8
3,7
202
196
97,0
3,5
200
178
89,0
3,8
270
254
94,1
4,1
194
190
97,9
4,5
251
239
95,2
3,7
262
257
98,1
3,9
218
212
97,2
3,9
229
226
98,7
CTR – kontrola, TS – teplotní stres, MS – mechanický stres, BS- biotický stres
4.2 Izolace intracelulárních a extracelulárních proteinů V prvním kroku byly buňky po působení jednotlivých stresových faktorů odděleny na fritě od okolního média. Následně byla provedena izolace intracelulárních 38
proteinů, kdy buňky byly rozmixovány v homogenizačním pufru a následně odděleny pomocí ultracentrifugace. Poté byla koncentrace proteinů v homogenizačním pufru změřena pomocí RC/DC kitu (Bio-Rad, USA) (Tabulka IV). Protoţe naměřené koncentrace proteinů v homogenizačním pufru byly příliš nízké, a tudíţ by nedostačovaly pro provedení 2-D elektroforézy, byly přesráţeny pomocí TCA a poté solubilizovány v rehydratačním pufru. Zjištěné koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích po přesráţení jsou uvedeny v Tabulce IV. Extracelulární proteiny byly izolovány z kultivačního média. Nejprve bylo médium zakoncentrováno na 3 kDa cut-off kolonkách na objem 2 ml (CTR, TS, MS) a 3 ml (BS) a poté přesráţeno pomocí TCA pro následnou analýzu pomocí LC-MS/MS metody. Zjištěné koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích po zakoncentrování na cut-off kolonkách jsou uvedeny v Tabulce IV. Na vzorku po teplotním stresu byla vyzkoušena solubilizace proteinů v 2,5% kyselině mravenčí a 50% acetonitrilu, dále bylo přidáno 2,5 μl 500 mM amonium bikarbonátu a 14 μl vody (z důvodu dosaţení pH optima 7,8). Vzorek byl redukován 1 μl 1 M roztoku DTT na termomixéru (25 °C, 750 rpm) a alkylován 2 μl 1 M IAA. Bylo provedeno enzymatické štěpení pomocí trypsinu (2 hod., 40 °C). Při následné analýze však byla ve vzorku zjištěna přítomnost proteinu kaseinu, který byl obsaţen v kultivačním médiu, a jeho přítomnost znemoţnila identifikaci dalších proteinů. V současné době je prováděna optimalizace derivatizace s následnou analýzou pomocí metody LC-MS/MS.
Tabulka IV: Naměřené koncentrace intracelulárních a extracelulárních proteinů. Koncentrace proteinů byla měřena pomocí RC-DC kitu (Bio-Rad, USA). Intracelulární proteiny
Intracelulární proteiny
Extracelulární proteiny
Vzorek
(homogenizační médium)
(po přesráţení)
(po koncentraci)
CTR
0,5 mg/ml
1,0 mg/ml
0,2 mg/ml
TS
0,5 mg/ml
1,0 mg/ml
0,1 mg/ml
MS
0,6 mg/ml
1,1 mg/ml
0,2 mg/ml
BS
0,7 mg/ml
1,0 mg/ml
0,3 mg/ml
CTR-kontrola, TS-teplotní stres, MS-mechanický stres, BS-biotický
39
4.3 Změny intracelulárního proteomu révy vinné vyvolané působením stresových faktorů Optimalizace podmínek pro 2D elektroforetickou separaci proteinů byla prováděna s kontrolními vzorky suspenzní kultury Vitis vinifera cv. Gamay (Obrázek 12A) a poté byla 2D ELFO vyzkoušena ještě s kontrolním vzorkem suspenzní kultury Vitis vinifera cv. Ryzlink rýnský (Obrázek 12B). V případě Ryzlinku rýnského však téměř neproběhla izoelektrická fokusace, proto byly další experimenty prováděny na buněčné suspenzní kultuře Vitis vinifera cv. Gamay, která byla jiţ dříve pouţita ke studiu obranných reakcí na úrovni proteomu (Martinez-Esteso et al., 2009; MartinezEsteso et al., 2011) a na které se nám podařilo optimalizovat podmínky pro 2D separaci.
Obrázek 12: Gel kontrolního vzorku Vitis vinifera cv. Gamay (A), proteiny byly rozděleny v pI 3-11 (nelineární, 18 cm), 12% koncentrace akrylamidu, 340 μg proteinu; gel kontrolního vzorku Vitis vinifera cv. Ryzlink rýnský (B), proteiny byly rozděleny v pI 3-11 (nelineární, 18 cm), 12% koncentrace akrylamidu, 340 μg proteinu.
Pro analýzu intracelulárního proteomu bylo na fokusační stripy s rozmezím pI 3-11NL (GE Healthcare, USA) naneseno 340 μg proteinů solubilizovaných v rehydratačním pufru s přídavkem bromfenolové modři a amfolytů. Stripy byly se vzorkem rehydratovány a následně podrobeny IEF a SDS-PAGE na 12% akrylamidových gelech v aparatuře DodecaCell (Bio-Rad, USA) za podmínek uvedených v kapitole 3.4. Podmínky separace pomocí IEF byly zvoleny na základě předchozích zkušeností na pracovišti se separací proteomu rostlin tabáku a rajčete. Po separaci na SDS-PAGE byly gely obarveny fluorescenčním barvivem SYPRO RUBY a 40
oskenovány. Následná analýza obrazu byla provedena v programu PDQuest (Bio-Rad, USA). V případě 2D-gelů teplotně stresované kultury (Obrázek 13A, 13B) a kultury po biotickém stresu došlo ke špatné fokusaci proteinů, v důsledku čehoţ bylo velmi obtíţné proteinové mapy vyhodnotit obrazovou analýzou v programu PDQuest.
Z tohoto
důvodu musela být celá 2D separace vzorku po biotickém stresu opakována včetně kontroly (Obrázek 14A, 14B). V případě teplotního stresu nebyla 2D separace opakována vzhledem k nedostatečnému mnoţství buněk.
41
Obrázek 13: Špatně zafokusované proteiny na gelu kontrolního vzorku (A) a teplotního stresu (B). Proteiny byly rozděleny v pI 3-11 (nelineární, 18 cm), 12% koncentrace akrylamidu, 340 μg proteinu. 42
Obrázek 14: Gel kontrolního vzorku (A), gel po působení biotického stresu (B). Proteiny byly rozděleny v pI 3-11 (nelineární, 18 cm), 12% koncentrace akrylamidu, 340 μg proteinu. Červeně jsou vyznačená čísla spotů, které vykazují kvalitativní a zároveň kvantitativní a statisticky významnou změnu.
43
Obrazová analýza získaných 2-D gelů byla provedena v programu PDQuest (Bio-Rad, USA), kdy v rámci kvantitativního vyhodnocení byla provedena normalizace na celkovou denzitu gelu. V rámci analyzovaných triplik bylo na gelu kontroly k biotickému stresu detekováno 537 spotů a v případě biotického stresu 441 spotů. Na Obrázku 15 je ukázán graf rozptylu mezi detekovanými spoty na kontrolním gelu a gelu po biotickém stresu se znázorněnými více jak dvojnásobnými rozdíly v denzitně jednotlivých spotů. Celkově v rámci analýzy obrazu bylo nalezeno 109 kvalitativních rozdílů mezi kontrolním gelem a gelem po biotickém stresu a 34 spotů vykazujících více jak dvojnásobnou kvantitativní změnu signifikantní na hladině významnosti 95% ve Studentově T-testu (Tabulka V). Aplikace biotického stresu poté vedla ke kvalitativní změně u 9 spotů a 26 spotů vykazovalo více jak dvojnásobný nárůst signifikantní na hladině významnosti 95% ve Studentově T-testu (Tabulka VI).
Obrázek 15: Graf rozptylu mezi detekovanými spoty na gelu kontrolního vzorku a na gelu po biotickém stresu.
44
Obrázek 16: Grafické znázornění spotů vybraných pro identifikaci, které vykazovaly více jak dvojnásobnou kvantitativní změnu na gelu po biotickém stresu oproti kontrolnímu vzorku. 45
Tabulka V: Souhrn analýz spotů na gelech kontroly k biotickému stresu a na gelech po biotickém stresu. Data zahrnují celkový počet detekovaných spotů na gelu kontroly a na gelu v případě biotického stresu, dále počet spotů vykazujících kvalitativní změny mezi kontrolou a biotickým stresem, počet spotů kvantitativních změn s více jak dvojnásobným nárůstem či poklesem na hladině významnosti 95% ve Studentově T-testu. Souhrn analýz
CTR
BS
spotů celkem
537
441
kvalitativní změny
100
9
> 2-násobný nárůst (95% ve Studentově T-testu)
8
26
> 2-násobný pokles (95% ve Studentově T-testu)
26
8
Tabulka VI: Čísla spotů (SSP) vykazující kvalitativní změny a čísla spotů kvantitativních změn s více jak dvojnásobně vyšší expresí na hladině významnosti 95% ve Studentově Ttestu. Kvalitativní změny SSP
SSP
nárůst
Kvantitativní změny SSP nárůst SSP nárůst
SSP
nárůst
0209
3807
0303
3,3
3505
3,0
5306
4,7
8207
3,5
0704
5203
1305
2,7
3508
2,6
5607
6,3
8413
2,1
1408
2204
2,5
4206
7,7
6205
6,1
9307
2,0
2706
2212
3,2
4301
5,4
6206
2,1
9309
5,4
3210
2401
2,2
4303
2,9
6207
6,8
9402
4,6
3515
2509
2,9
5209
2,5
6905
4,4
3806
3303
2,9
5211
2,7
7204
4,2
Protoţe nás v rámci experimentu zajímaly především proteiny indukované biotickým stresem, byl na základě analýzy obrazu a kvantity vybrán 1 spot vykazující kvalitativní změnu a dále bylo vybráno 18 spotů vykazujících statisticky významnou kvantitativní změnu k identifikaci pomocí metody kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (Tabulka VII, Obrázek 17). Jednotlivé spoty byly vyřezány na zařízení Spot-Cutter (Bio-Rad, USA) a identifikace byla provedena na pracovišti Centrální laboratoř Proteomika, CEITEC.
46
Tabulka VII: Celkem 19 spotů po biotickém stresu vybraných pro identifikaci pomocí LCMS/MS metody. 18 spotů vykazuje statisticky signifikantní kvantitativní změnu a 1 spot vykazuje kvalitativní změnu. Kvantitativní změny SSP 2204 (19) 6205 (5) 2401 (17)
6206 (7)
2509 (15)
6905 (21)
3505 (20)
7204 (1)
3508 (18)
8207 (22)
4206 (14)
8413 (13)
4301 (4)
9307 (8,9)
5209 (6)
9402 (2, 3)
Kvalitativní změny SSP 5203 (26)
5306 (11) 5607 (24) SSP – číslo spotu (sample spot protein); za čísly spotů jsou uvedena čísla v závorce, která odpovídají řezaným spotům na gelu po biotickém stresu znázorněným na Obrázku 17
Obrázek 17: Spoty vyřezané z gelu po biotickém stresu na Spot-Cutteru a poslány na identifikaci pomocí metody LC-MS/MS.
47
Z 19 vyřezaných spotů se podařilo identifikovat 13 spotů, které vykazovaly Mascot skóre vyšší jak 100 (tabulka VIII). Pokud bylo v jednom spotu identifikováno více proteinů, byl vybrán protein, který nejlépe odpovídal svojí molekulovou hmotností (Mr) a hodnotou izoelektrického bodu (pI). Jednotlivé proteiny byly poté také vybírány na základě hodnoty Mascot skóre a procenta pokrytí. Tabulka VIII: Tabulka s nalezenými proteiny v případě biotického stresu na základě analýzy pomocí LC-MS/MS metody. SSP
NCBI
Název proteinu
Taxonomie
Mascot Skóre
pI
Mr [Da]
7204
gi|225431848
hlavní alergen Pru av 1 (PR-10)
Vitis vinifera
549
6,3
17422
4301
gi|225431856
hlavní alergen Pru ar 1 (PR-10)
Vitis vinifera
332
5,7
17211
6205
gi|163914213
PR-10 protein
211
6,0
17098
5209
gi|163914213
PR-10 protein
203
6,0
17098
6206
gi|225431848
hlavní alergen Pru av 1 (PR-10)
Vitis vinifera
303
6,3
17422
9307
gi|225457957
peptidyl-prolyl cis-trans isomerasa isoforma 1
Vitis vinifera
153
8,9
17927
9307
gi|225457957
peptidyl-prolyl cits-trans isomerasa isoforma 1
Vitis vinifera
189
8,9
17927
8413
gi|225441977
pektinesterasa 3
Vitis vinifera
407
8,8
66695
4206
gi|11182126
PR-10 protein
Vitis vinifera
108
5,7
17223
2509
gi|225459591
L-askorbát peroxidasa T, chloroplastová isoforma 1
Vitis vinifera
135
7,1
46849
3508
gi|225428916
cinnamyl alkohol dehydrogenasa 1
Vitis vinifera
327
5,5
38984
2204
gi|147781552
hypotetický protein VITISV_036241
Vitis vinifera
141
5,3
24942
8207
gi|147839797
hypotetický protein VITISV_006270
Vitis vinifera
233
7,1
25975
5607
gi|225426518
kávová kyselina-3-Omethyltransferasa
Vitis vinifera
820
5,7
44354
Vitis hybrid cultivar Vitis hybrid cultivar
SSP – číslo spotu, NCBI – přístupové databázové číslo proteinu do online databáze NCBI, Mascot skóre – statistické skóre, které vypovídá o tom, jak se experimentální data shodují se sekvencí z databáze, pI – izoelektrický bod, Mr – molekulová hmotnost
48
V případě 2-D gelů po mechanickém stresu (Obrázek 18A, 18B) nebyly analyzovány tripliky, nýbrţ dupliky, protoţe na 1 gelu kontroly k mechanickému stresu a na 1 gelu po mechanickém stresu došlo ke špatné fokusaci proteinů a tudíţ tyto gely byly z analýzy vynechány. V rámci analyzovaných duplik bylo na gelu kontroly k mechanickému stresu detekováno 440 spotů a na gelu po mechanickém stresu 398 spotů. Na Obrázku 19 je ukázán graf rozptylu mezi detekovanými spoty na kontrolním gelu a gelu po mechanickém stresu se znázorněnými více jak dvojnásobnými rozdíly v denzitně jednotlivých spotů. Celkově v rámci analýzy obrazu bylo nalezeno 31 kvalitativních rozdílů mezi kontrolním gelem a gelem po mechanickém stresu a 20 spotů vykazujících více jak dvojnásobnou kvantitativní změnu signifikantní na hladině významnosti 95% ve Studentově T-testu (Tabulka IX). Aplikace mechanického stresu poté vedla ke kvalitativní změně u 9 spotů a 12 spotů vykazovalo více jak dvojnásobný nárůst signifikantní na hladině významnosti 95% ve Studentově T-testu (Tabulka X).
49
Obrázek 18: Gel kontrolního vzorku (A), gel vzorku po aplikaci mechanického stresu (B). Proteiny byly rozděleny v pI 3-11 (nelineární, 18 cm), 12% koncentrace akrylamidu, 340 μg proteinu. Červeně jsou vyznačená čísla spotů, které vykazují kvalitativní a zároveň kvantitativní a statisticky významnou změnu.
50
Obrázek 19: Graf rozptylu mezi detekovanými spoty na gelu kontrolního vzorku a na gelu po mechanickém stresu.
Obrázek 20: Grafické znázornění spotů vybraných pro identifikaci, které vykazovaly více jak dvojnásobnou kvantitativní změnu na gelu po mechanickém stresu oproti kontrolnímu vzorku.
51
Tabulka IX: Souhrn analýz spotů na gelech kontroly k mechanickému stresu a na gelech po mechanickém stresu. Data zahrnují počet detekovaných spotů na gelu kontroly a na gelu v případě mechanického stresu, dále počet spotů vykazujících kvalitativní změny mezi kontrolou a mechanickým stresem a počet spotů vykazujících kvantitativní změny s více jak dvojnásobným nárůstem či poklesem na hladině významnosti 95% ve Studentově T-testu. Souhrn analýz
CTR
MS
spotů celkem
440
398
kvalitativní změny
22
9
> 2-násobný nárůst (95% ve Studentově T-testu)
8
12
> 2-násobný pokles (95% ve Studentově T-testu)
12
8
Tabulka X: Čísla spotů (SSP) vykazující kvalitativní změny a čísla spotů kvantitativních změn s více jak dvojnásobně vyšší expresí na hladině významnosti 95% ve Studentově Ttestu. Kvalitativní změny SSP
Kvantitativní změny SSP
nárůst
SSP
nárůst
1649
7630
1408
4,4
6738
3,9
1652
9528
2604
4,2
7343
9,6
2726
3004
3,6
7627
2,5
5640
4114
2,2
8408
6,1
5644
5208
3,8
8474
4,9
6153
5217
3,0
6423
5345
4,6
Na základě analýzy obrazu a kvantity spotu bylo pro identifikaci pomocí metody LC-MS/MS vybráno 7 spotů vykazujících kvalitativní změnu a 4 spoty vykazující statisticky významnou kvantitativní změnu (Tabulka XI, Obrázek 21). Jednotlivé spoty byly rovněţ vyřezány na zařízení Spot-Cutter (Bio-Rad, USA) a identifikace provedena na pracovišti Centrální laboratoř Proteomika, CEITEC.
52
Tabulka XI: Celkem 11 spotů vybráno pro identifikaci pomocí LC-MS/MS metody. 4 spoty vykazují statisticky signifikantní kvantitativní změnu a 7spotů vykazuje kvalitativní změnu. Kvantitativní změny
Kvalitativní změny
SSP
SSP
1408 (10)
1649 (4)
5217 (9)
1652 (2, 3)
6738 (12)
2726 (5)
7627 (8)
5640 (11) 5644 (6) 6153 (7) 9528 (1)
SSP – číslo spotu (sample spot protein); za čísly spotů jsou uvedena čísla v závorce, která odpovídají řezaným spotům po mechanickém stresu znázorněným na Obrázku 21
Obrázek 21: Spoty vyřezané z gelu po mechanickém stresu na Spot-Cutteru a identifikovány pomocí metody LC-MS/MS.
53
Z 11 vyřezaných spotů se podařilo identifikovat 7 spotů, které vykazovaly Mascot skóre vyšší jak 100 (Tabulka XII). V případě, ţe bylo v jednom spotu identifikováno více proteinů, byl vybrán protein, který nejlépe odpovídal svojí molekulovou hmotností (Mr) a hodnotou izoelektrického bodu (pI). Jednotlivé proteiny byly poté také vybírány na základě hodnoty Mascot skóre a procenta pokrytí.
Tabulka XII: Identifikace proteinů v případě mechanického stresu na základě analýzy pomocí LC-MS/MS metody. SSP
NCBI
Název proteinu
gi|359486799
HSP70 isoforma 2
gi|225434984
HSP70 isoforma 1
gi|359486799
HSP70 isoforma 2
Taxonomie
1652
Mascot Skóre
pI
Mr [Da]
1124
5,2
71126
954
5,2
71190
1449
5,2
71126
1131
5,2
71190
Vitis vinifera
1652
Vitis vinifera gi|225434984
HSP70 isoforma 1
1649
gi|147799889
Hypothetický protein VITISV_008818
Vitis vinifera
484
5,0
64949
7627
gi|225445108
NADP-dependentní malátdehydrogenasa
Vitis vinifera
557
6,3
65240
5217
gi|225442729
Necharakterizovaný protein LOC100258273 isoforma 2
Vitis vinifera
235
5,7
30466
1408
gi|225434259
rab GDP disociační inhibitor alfa
Vitis vinifera
581
5,4
49778
gi|225457152
Betain aldehyd dehydrogenasa 2, mitochondriální Serin karboxypeptidasa 42
408
5,5
54586
Vitis vinifera 377
6,0
52269
Hypotetický protein VITISV_025206 (α-xylosidasa isoforma 1)
Vitis vinifera
404
5,8
100886
5640 gi|225457767 6738
gi|147821903
SSP – číslo spotu, NCBI – přístupové databázové číslo proteinu do online databáze NCBI, Mascot skóre – statistické skóre, které vypovídá o tom, jak se experimentální data shodují se sekvencí z databáze, pI – izoelektrický bod, Mr – molekulová hmotnost
54
4.4 Stanovení salicylátu 4.4.1 Optimalizace separace pomocí HPLC Vzorky byly připraveny metodou uvedenou v kapitole 3.7.2 s přídavkem vnitřního standardu (o – anisic acid) tak, aby jeho koncentrace ve vzorku nepřesáhla 5 μg.ml-1. 100 μl vzorku bylo poté analyzováno pomocí HPLC. Bylo zjištěno, ţe při eluci gradientem acetonitrilu s 2% kys. octovou je retenční čas vnitřního standardu cca. 22 min a salicylátu cca. 24,5 min. Modrá šipka v chromatogramu (Obrázek 22) znázorňuje pík vnitřního standardu, červená šipka potom pík salicylátu.
Obrázek 22: Chromatogram vzorku po biotickém stresu. 100 μl vzorku bylo separováno pomocí HPLC na koloně Supelcosil C-18DB s fluorescenční detekcí (ex. 305 nm, em. 407 nm).
4.4.2 Stanovení salicylátu ve Vitis vinifera cv. Gamay pomocí HPLC Salicylát byl stanoven jednou v kaţdém vzorku (CTR, TS, MS, BS). V těchto vzorcích byly stanoveny plochy píků vnitřního standardu a salicylátu, které byly získané z chromatogramů. Ze získaných ploch píků byly vypočítány koncentrace pomocí kalibrační křivky vnitřního standardu a kalibrační křivky kyseliny salicylové, které byly vytvořeny jiţ dříve. Výsledné koncentrace byly získány z výtěţnosti vnitřního standardu a jsou znázorněny v Tabulce XIII a Grafu 1.
55
Tabulka XIII: Koncentrace salicylátu v jednotlivých vzorcích.
vzorek
c (o-ANI) [ng]
Výtěţnost [%]
c (SA) [ng]
c (SA) [ng/g FW]
CTR
89,00
89,0
2,79
23,3
TS
87,10
87,1
2,25
18,8
MS
69,20
69,2
3,41
28,4
BS
87,60
87,6
2,64
22,0
o-ANI – o-anisic acid, CTR – kontrola, TS – teplotní stres, MS – mechanický stres, BS – biotický stres
Graf 1: Koncentrace salicylátu v jednotlivých vzorcích vztaţená na gram čerstvé váhy buněk [ng/g FW]. CTR – kontrola, TS – teplotní stres, MS – mechanický stres, BS – biotický stres.
56
5 Diskuse Vinná réva (Vitis vinifera) je nejen důleţitá ovocná plodina, ale protoţe jiţ byla rozluštěna struktura jejího genomu, jedná se také o vhodný modelový druh (Benjak et al., 2009). Réva je však citlivá k napadení několika patogeny, které negativně ovlivňují její růst, nicméně nejzávaţnějším důsledkem je značné sníţení výnosu a především kvality hroznů, coţ se následně promítá i do kvality vína. Moderní zemědělství vyuţívá k potlačení patogenů přirozené rezistence rostlin, proto jsou informace o objevení molekulárních mechanismů velmi cenné. Rostlina po rozpoznání patogenu aktivuje dráhy signální transdukce a spouští tak obrannou reakci (Spoel a Dong, 2012). Nicméně, reakce révy vinné na abiotické a biotické stresové faktory se do značné míry překrývají, coţ dokazuje například indukce celé řady PR-10 proteinů po napadení patogenem (Yang et al., 2011), ale například také vlivem zasolení (Jellouli et al., 2008). Tyto překrývající se reakce mohou vyplývat z akumulace běţných signálních molekul (vápník) a hormonů (jasmonová kyselina, ethylen), které hrají klíčovou roli v obranné reakci proti patogenům (Nürnberger a Scheel, 2001) a jsou zapojené do signalizace abiotického stresu aktivovaného chladem, salinitním stresem nebo expozicí UV záření u révy vinné (Pontin et al., 2010; Tattersall et al., 2007). Mezi nejvýznamnější houbová onemocnění révy patří plíseň révová, padlí révové a plíseň šedá, které jsou způsobeny patogeny Plasmopara viticola, Erysiphe necator a Botrytis cinerea. V posledních letech se několik proteomických studií zabývalo změnami v proteinech Vitis vinifera po infekci E. necator, P. viticola nebo Xylella fastidiosa (Marsh et al., 2010; Milli et al., 2012; Yang et al., 2011), avšak proteomické změny révy vinné vyvolané infekcí B. cinerea nebyly komplexně zkoumány. Nicméně byla po napadení patogenem popsána indukce několika regulačních genů (Paquis et al., 2011) a genů souvisejících s obrannou reakcí (Bézier et al., 2002). V dalších studiích byly charakterizovány změny proteomu révy vyvolané elicitací, vodním deficitem a salinitním stresem (Ferri et al., 2009; Grimplet et al., 2009; Jellouli et al., 2008; Martinez-Esteso et al., 2009; Martinez-Esteso et al., 2011). Doposud není ţádná proteomická studie srovnávající vliv infekce patogenu s abiotickým stresem u révy vinné. Cílem diplomové práce bylo prozkoumat vliv biotického stresového faktoru v podobě plísně šedé, a dále mechanického poškození a teplotního šoku na extracelulární a intracelulární proteom buněčné suspenze cv. Gamay. 57
Buněčná suspenzní kultura dnes patří mezi nejpouţívanější biologické modely a byla jiţ dříve pouţita ke studiu obranných reakcí na úrovni proteinu (Martinez-Esteso et al., 2009, Martinez-Esteso et al., 2011).
Stanovení životaschopnosti buněk fluorescenční mikroskopií Nejprve bylo stanoveno mnoţství ţivotaschopných buněk fluorescenční mikroskopií. Tato metoda vyuţívá dvojitého barvení pomocí fluorescein diacetátu a propidium jodidu. Fluorescein diacetát je barvivo, které prochází cytoplazmatickou membránou ţivých buněk a následně je buněčnými esterasami hydrolyzováno na fluorescentní sloučeninu fluorescein. Propidium jodid zase naopak snadno prochází přes poškozené membrány buněk, interkaluje se do nukleových kyselin a způsobuje intenzivně červené zbarvení (Amano et al., 2003). Podařilo se optimalizovat vliv stresových faktorů na buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay, které u révy vedly ke spuštění obranné reakce a zároveň nezpůsobily výrazné odumírání buněk. Ve všech případech (kontrola, teplotní stres, mechanický stres, biotický stres) přesahoval počet ţivotaschopných buněk 94%.
Změny intracelulárního proteomu vyvolané působením biotického stresového faktoru Celkově v rámci analýzy obrazu bylo nalezeno 100 spotů vykazujících kvalitativní změny na gelu kontrolního vzorku oproti gelu po biotickém stresu, coţ je poněkud vysoké číslo, které si lze vysvětlit tím, ţe se separace proteinů kontrolního vzorku vydařila lépe neţ separace vzorku po biotickém stresu, a proto byl software PDQuest schopen přiřadit více spotů na gelech kontroly. V rámci experimentu nás však zajímaly spoty, které se indukovaly po aplikaci biotického stresového faktoru, přičemţ u 26 spotů byla pozorována kvantitativní změna s více jak dvojnásobným nárůstem na hladině významnosti více jak 95% ve Studentově T-testu (Tabulka VI) a 9 spotů vykazovalo kvalitativní změny (Tabulka VI). Z těchto kvalitativních a kvantitativních změn bylo pro analýzu LC-MS/MS vybráno celkem 19 spotů, ze kterých se úspěšně podařilo identifikovat 13 proteinů, kterými se následně budu zabývat. V případě, ţe byl protein identifikovaný jako tzv. hypotetický protein, byl pomocí programu BLAST hledán protein z NCBI databáze, který s tímto proteinem vykazoval nejvyšší homologii. 58
U 6 spotů ze 13 identifikovaných proteinů exprimovaných u Vitis vinifera cv. Gamay po biotickém stresu (Botrytis cinerea) byla prokázána 100% identita s proteiny třídy PR-10. Jedná se o velkou skupinu proteinů konstitutivně exprimovaných u několika rostlinných druhů. Jak je zmíněno v kapitole 2.4.2, indukce těchto proteinů byla u révy vinné zjištěna nejen po napadení patogenem, ale také v různých stresových podmínkách (zranění, UV záření, sucho, těţké kovy), coţ naznačuje obecnou obrannou roli této skupiny proteinů. Přestoţe přesná katalytická funkce většiny těchto proteinů v obraně rostlin zatím není známá, některé proteiny PR-10 mají ribonukleasovou aktivitu in vitro a in vivo (Castro et al., 2005; Zhang et al., 2009). Dalším identifikovaným proteinem byla peptidyl-prolyl cis-trans isomerasa. Jedná se o skupinu enzymů, které skládají proteiny do aktivní konfigurace katalýzou pomalé cis/trans izomerizace na vazbách peptid-prolin. Rovněţ hrají důleţitou roli při reaktivaci denaturovaných proteinů, proteinové syntéze de novo a obnovení polypeptidových aktivních struktur. Kromě těchto funkcí jsou součástí velkých chaperonových komplexů, transmembránových kanálů zodpovědných za transport Ca2+ a dalších iontů. Účastní se dále buněčných procesů jako je signální transdukce, sekrece proteinu, regulace buněčného cyklu, apoptózy nebo interakce hostitel-patogen. Tyto proteiny rovněţ mohou hrát důleţitou roli v patogenezi (Kromina et al., 2008), jsou spojovány s rezistencí a některé z nich mají antifugální nebo antivirální aktivitu (Milli et al., 2012). Indukce některých z této skupiny proteinů byla také zjištěna u pšenice vlivem teplotního stresu (Kurek et al., 1999). Další
identifikovaný
protein
vykazoval
100%
shodu
s enzymem
pektineseterasou, coţ je enzym podílející se na degradaci pektinu. Činnost pektinesteras je zapojená do metabolismu buněčné stěny včetně buněčného růstu, do zrání ovoce, senescence nebo patogeneze. Některé z významných projevů pektinolytických enzymů jsou patogenicita rostlin nebo hnití ovoce a zeleniny (Jayani et al., 2005). Askorbát peroxidasa byla dalším z identifikovaných proteinů. Jedná se o antioxidační enzym, jehoţ nárůst byl pozorován u Vitis vinifera L. po napadení Padlím révovým (72 hodin po infekci). V průběhu invaze patogenů je zvýšená produkce reaktivních forem kyslíku, tudíţ je v časovém průběhu infekce pozorován nárůst antioxidačních enzymů, coţ naznačuje potřebu detoxifikace reaktivních forem kyslíku (Marsh et al., 2010). Jedná se tedy o enzym účastnící se askorbát-glutathionového cyklu, čímţ se podílí na detoxifikaci reaktivních forem kyslíku v rámci obranné reakce rostlin. Isoenzymy askorbát peroxidasy se liší s ohledem na strukturu, substrátovou 59
specifitu a tkáňovou distribuci a jejich exprese je vysoce citlivá k podmínkám prostředí a stresu (Zhang et al., 2009). Ve spotu SSP 3508 byla idnetifkována cinnamyl alkohol dehydrogenasa, která je klíčovým enzymem v biosyntéze ligninu (Figueiredo et al., 2008), kdy jeho indukce byla pozorována u fazole (Phaseolus vulgaris L.) po aplikaci fazolového patogenu Colletotrichum lindemuthianum (Grand et al., 1987). Je známo, ţe indukce ligninu je ovlivněna environmentálními stresy (např. ozon, expozice UV-B, těţké kovy, sucho, infekce patogenem, mechanické poškození nebo útok herbivorního hmyzu) (Kaur et al., 2012). Ukládání ligninu během interakce rostlina-patogen hraje roli v obraně rostlin. Lignin se vytváří v místě infekce patogenem, je extrémně rezistentní k mikrobiální degradaci a tím posiluje buněčnou stěnu (Tronchet et al., 2010). Hypotetické proteiny identifikované v rámci spotů SSP 2204 a SSP 8207 vykazovaly nejvyšší homologii s glutathion-S-transferasami, coţ jsou všudypřítomné enzymy, které hrají klíčovou roli v buněčné detoxifikaci. Ačkoli několik glutathion-Stransferas bylo identifikováno a charakterizováno v různých rostlinných druzích, znalosti o jejich úloze při vývojových procesech a reakci na různé podněty jsou však stále velmi omezené. Jedná se o proteiny zapojené do dráhy stresové reakce, zejména oxidačního stresu. Indukce těchto antioxidačních enzymů byla pozorována po infekci Plasmopara viticola u rezistentních i citlivých genotypových rostlin Vitis vinifera ( Milli et al., 2012). Kávová kyselina-3-O-methyltransferasa katalyzuje mnoha-krokové metylační reakce hydroxylovaných monomerů ligninových prekurzorů a zaujímá stěţejní postavení v biosyntéze ligninu (Ma a Xu, 2008). Byla charakterizována například u pšenice nebo u tabáku (Nicotiana tabacum), přičemţ u tabáku byly identifikovány dvě izoformy, kdy druhá izoforma byla velmi inducibilní infekcí (Boudet, 2000).
Změny intracelulárního proteomu vyvolané působením mechanického stresového faktoru Celkově v rámci analýzy obrazu bylo nalezeno 22 spotů vykazujících kvalitativní změny na gelu kontrolního vzorku oproti gelu po mechanickém stresu, kdy v rámci experimentu nás zajímaly především spoty, které se indukovaly po aplikaci mechanického stresového faktoru, přičemţ po aplikaci mechnického stresu byla u 12
60
spotů pozorována kvantitativní změna s více jak dvojnásobným signifikantním nárůstem (Tabulka X) a 9 spotů vykazovalo kvalitativní změny (Tabulka X). Z těchto kvalitativních a kvantitativních změn bylo pro analýzu LC-MS/MS vybráno celkem 11 spotů, ze kterých se úspěšně podařilo identifikovat 7 proteinů, kterými se budu zaobírat níţe. V případě, ţe byl protein identifikovaný jako tzv. hypotetický protein, byl pomocí programu BLAST hledán protein z NCBI databáze, který s tímto proteinem vykazoval nejvyšší homologii. První ze sedmi identifikovaných proteinů vykazoval nejvyšší homologii s proteinem teplotního šoku o velikosti 70 kDa (HSP70). Proteiny teplotního šoku mohou stabilizovat ostatní proteiny a jsou zapojeny do skládání denaturovaných proteinů (Niu et al., 2013). K jejich expresi dochází po působení různých stresových podnětů (např. zvýšená teplota či vodní stres) z důvodu zabránění poškození buněk. HSP70 mohou hrát zásadní roli v obraně rostlin proti stresu obnovením normální konformace proteinu a tedy buněčné homeostázy (Wang et al., 2004). Indukce HSP70 proteinů byla zjištěna v listech rajčete po působení mechanického stresu, teplotního šoku a po infekci houbovým patogenem Oidium nolycopersici (Piterková et al., 2013). Hypotetický protein s číslem spotu SSP 1649 vykazoval nejvyšší homologii s proteinem podobným nukleoredoxinu, coţ je nový, relativně necharakterizovaný člen rodiny thioredoxin proteinů zapojený do buněčného růstu a diferenciace. Byla u něj zjištěna potenciální oxidoreduktasová aktivita a enzymatická aktivita. Rodina thioredoxin proteinů je zapojená do různých biologických procesů tím, ţe reguluje reakci rostlin na oxidační stres a hraje tedy zásadní roli v toleranci rostlin na stres (Vieira Dos Santos a Rey, 2006). Dalším
identifikovaným
proteinem
byla
NADP-dependentní
malátdehydrogenasa, která je důleţitý malát metabolizující enzym, podílející se na ukládání ligninu. Navíc můţe být tento enzym zapojen do mechanismů produkce NADPH k syntéze reaktivních kyslíkových radikálů, které jsou produkovány za účelem usmrcení nebo poškození patogenu. Právě zvýšení hladin tohoto enzymu by mohlo poskytnout energii pro biosyntézu obranných látek, coţ naznačuje roli metabolismu malátu v obraně rostlin (Casati et al., 1999). Indukce tohoto enzymu byla pozorována po zranění nebo po expozici UV-B záření (Liu et al., 2007).
61
Protein identifikovaný pod číslem spotu SSP 5217 dosud nebyl charakterizován a nejsou o něm tedy známy jakékoli informace vztahující se k procesu obranné reakce proti patogenům u rostlin. Protein identifikovaný pod číslem spotu SSP 1408 byl poté identifikován jako Rab GDP disociační inhibitor alfa, který řídí opětovné vyuţití Rab GTPas, jejichţ úloha v rámci obranné reakce byla prokázána u několika rostlinných druhů (Bolte et al., 2000; Speth et al., 2009). Pod číslem spotu SSP 5640 byly identifikované dva proteiny. Prvním z nich byla betain aldehyd dehydrogenasa katalyzující poslední nevratný krok v syntéze osmoprotektantu glycinu betainu (Velasco-García et al., 1999). Nárůst aktivity betain aldehyd dehydrogenasy byl pozorován v podmínkách vodního deficitu u rostliny rodu Laskavec (Amaranthus) a zvýšení mRNAs u čiroku (Wood et al., 1996) a ječmene za podmínek salinity (Flowers et al., 1997). Jako reakce na zranění byl u rajčete (Lycopersicon esculentum Mill.) pozorován nárůst v aktivitě serin karboxypeptidasy, která byla druhým identifikovaným proteinem pod stejným číslem spotu. Přestoţe jsou regulační role sekretované serin karboxypeptidasy u rostlin stále neznámé, ukázalo se, ţe jsou tyto enzymy zapojeny do signální dráhy brassinosteroidů (hormony rostlinného růstu a vývoje) (Ndimba et al., 2003). Posledním identifikovaným proteinem byl hypotetický protein s číslem spotu 6738. V tomto případě se jedná o α-xylosidasu. Indukce α-xylosidasy byla zjištěna u rostliny Arabidopsis thaliana po inokulaci oligogalakturonidy, coţ jsou elicitory obranných reakcí uvolňující se z buněčné stěny rostlin během útoku patogenních mikroorganismů. Tento enzym odstraňuje z xyloglukanů připojené xylosilové zbytky a umoţňuje tak přístup k dalším degradujícím enzymům. Důkazy o tom, ţe exprese tohoto proteinu je potlačena oligogalakturonidy pravděpodobně odráţí potřebu rostliny zpomalit degradaci buněčné stěny během infekce patogenu (Casasoli et al., 2008). Nalezené změny v koncentracích proteinů budou stejně jako v předchozím případě následně ověřeny pomocí analýzy transkriptů metodou RT-qPCR.
Stanovení salicylátu ve Vitis vinifera cv. Gamay pomocí HPLC Kyselina salicylová je jednou ze základních signálních molekul (klíčový hormon) uvolňující se během obranné reakce rostlin v závislosti na napadení patogeny či po elicitaci, a je spojena s akumulací PR proteinů. Na základě výtěţnosti vnitřního 62
standardu byly získány výsledné koncentrace salicylátu v jednotlivých vzorcích uvedené v tabulce XIII. Překvapivé zjištění je, ţe nedošlo k ţádnému výraznému zvýšení koncentrace kyseliny salicylové ani u jedné z pouţitých stresových podmínek, obzvláště po přidání mycelia patogenu Botrytis cinerea k buněčné suspenzi révy. V dřívější studii (Repka et al., 2004) bylo pozorováno zvýšení koncentrace kyseliny salicylové po aplikaci poměrně vysoké koncentrace (50 μM) MeJA na buněčné suspenze révy vinné Vitis vinifera L. cv. Limberger. Byly však pouţity buňky révy vinné s ohledem na jejich jiţ dříve pozorované reakce k různým elicitorům, jako jsou SA, chitosan či elicitor odvozený z mycelia nekrotrofní houby B. cinerea. Dalším faktem je, ţe takto vysoká koncentrace MeJA jiţ vyvolala u listů révy vinné příznaky hypersenzitivní reakce spojené s buněčnou smrtí, která však v rámci našeho experimentu nebyla pozorována. Důvodem různé odpovědi révy by mohlo být i pouţití různých kultivarů révy. Pro naše experimenty byly pouţity buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay, zatímco v práci Repka et al. 2004 byly pouţity buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Limberger.
63
6 Závěr
Diplomová práce se zabývá studiem vlivu biotického (Botrytris cinerea) a abiotických stresových faktorů (mechanické poškození, teplotní šok) na proteom suspenzní kultury Vitis vinifera cv. Gamay a porovnáním kvalitativních a kvantitativních změn v extracelulárním a intracelulárním proteomu. Na základě obrazové analýzy 2-D gelů pomocí softwaru PDQuest bylo v rámci analyzovaných triplik na gelu kontroly k biotickému stresu detekováno 537, zatímco na gelu vzorku stresovaného patogenem bylo detekováno 441 spotů. Celkově v rámci analýzy obrazu, bylo nalezeno 109 kvalitativních rozdílů mezi gelem kontroly a gelem po biotickém stresu a 34 spotů se signifikantní více jak dvojnásobnou kvantitativní změnou. Po aplikaci biotického stresového faktoru došlo ke kvalitativní změně u 9 spotů a k signifikantnímu více jak dvojnásobnému nárůstu u 26 spotů. Na základě analýzy obrazu a kvantity byl vybrán 1 spot vykazující kvalitativní změnu a dále bylo vybráno 18 spotů, které vykazovaly statisticky významnou kvantitativní změnu, k identifikaci pomocí metody kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií. Z 19 vyřezaných spotů se podařilo identifikovat 13 spotů. Identifikovány byly proteiny PR-10, peptidy-prolyl cis-trans isomerasa, pektinesterasa, askorbát peroxidasa, cinnamyl alkohol dehydrogenasa, glutathion-S-transferasy a kávová kyselina-3-O-methyltransferasa. V rámci analyzovaných duplik umoţnila obrazová analýza 2-D gelů pomocí softwaru PDQuest na gelu kontrolního vzorku k mechanickému stresu detekci 440 spotů a na gelu po mechanickém vystresování detekci 398 spotů. Celkově bylo v rámci analýzy obrazu mezi kontrolním gelem a gelem po mechanickém stresu nalezeno 31 kvalitativních rozdílů a 20 spotů vykazujících signifikantní více jak dvojnásobnou kvantitativní změnu. Aplikace mechanického stresu poté vedla u 9 spotů ke kvalitativní změně a 12 spotů vykazovalo signifikantní, více jak dvojnásobný nárůst. Opět na základě analýzy obrazu a kvantity spotu bylo pro následnou identifikaci pomocí LCMS/MS vybráno 7 spotů, které se měnily kvalitativně a 4 spoty, u kterých byla pozorována statisticky významná kvantitativní změna. Z 11 vybraných spotů se podařilo identifikovat 7 spotů, mezi nimiţ byl protein teplotního šoku o velikosti 70 kDa, nukleoredoxin
patřící
do
rodiny
thioredoxin
proteinů,
NADP-dependentní
malátdehydrogenasa, zatím necharakterizovaný protein a rab GDP disociační inhibitor 64
alfa. Dále byly mezi identifikovanými proteiny betain aldehyd dehydrogenasa se serin karboxypeptidasou a α-xylosidasa. Bylo zjištěno, ţe většina identifikovaných proteinů úzce souvisí s obrannou reakcí révy vinné či jiných plodin. Nalezené změny v koncentracích proteinů budou následně ověřeny pomocí analýzy transkriptů metodou RT-qPCR. Po aplikaci stresových faktorů na buněčné suspenze Vitis vinifera cv. Gamay nebylo pozorováno přílišné zvýšení koncentrace kyseliny salicylové. Důvodem můţe být odlišná reakce různých kultivarů révy, protoţe v dřívější studii Repka et al., 2004 bylo pozorováno zvýšení koncentrace kyseliny salicylové po aplikaci MeJA na buněčné suspenze Vitis vinifera L. cv. Limberger. Faktem je, ţe v této práci byla aplikována poměrně vysoká koncentrace MeJA a byly pouţity buňky révy vinné s ohledem na jejich jiţ dříve pozorované reakce k různým elicitorům.
65
7 Seznam literatury Abad, L. R., D´Urzo, M. P., Liu, D., Narasimhan, M. L., Reuveni, M., Zhu, J. K., Niu, X., Singh, N. K., Hasegawa, P. M. a Bressan, R. A. (1996): Antifugal activity of tobacco osmotin has specifity and involves plasma membrane permeabilization. Plant Science, vol. 118, no. 1, pp. 11-23. Ackermann, P. et al. (2004): Metodiky ochrany zahradních plodin, 4. přeprac. a rozšíř. vyd., Květ, Praha, 181-197. Amano, T., Hirasawa, K., O´Donohue, M. J., Pernolle, J.-C. a Shioi, Y. (2003): A versatile assay for the accurate, time-resolved determination of cellular viability. Analytical Biochemistry, vol. 314, no. 1, pp. 1-7. Benjak, A., Boué, S., Forneck, A., Casacuberta, J. M. (2009): Recent amplification and impal of MITEs on the genome of grapevine (Vitis vinifera L.). Genome Biology and Evolution, vol. 1, no. 1, pp. 75-84. Bézier, A., Lambert, B.a Baillieul, F. (2002): Study of defense-related gene expression in grapevine leaves and berries Infected with Botrytis cinerea. European Journal of Plant Pathology, vol. 108, no. 2, pp. 111-120. Bishop, P. D., Makus, D. J., Pearce, G. a Ryan, C. A. (1981): Proteinase inhibitorinducing factor activity in tomato leaves resides in oligosaccharides enzymically released from cell walls. Proceedings of the National Academy of Science sof the United States of America, vol. 78, no. 6, pp. 3536-3540. Bolte, S., Schiene, K. a Dietz, K.-J. (2000): Characterization of a small GTP-binding protein of the rab 5 family in Mesembryanthemum crystallinum with increased level of expression during early salt stress. Plant Molecular Biology, vol. 42, no. 6, pp. 923-935. Boudet, A-M. (2000): Lignins and lignification: Selected issues. Plant Physiology and Biochemistry, vol. 38, no. 1-2, pp. 81-96. Buchanan, B. B., Gruissem, W. a Jones R. L. (2000): Biochemistry & Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, 1102-1156, 1158-1203. Casasoli, M., Spadoni, S., Lilley, K. S., Cervone, F., De Lorenzo, G. a Mattei, B. (2008): Identification by 2-D DIGE of apoplastic proteins regulated by oligogalacturonides in Arabidopsis thaliana. Proteomics, vol. 8, no. 5, pp. 1042-1054. Casati, P., Drincovich, M. F., Edwards, G. E. a Andreo C. S. (1999): Malate metabolism by NADP-malic enzyme in plant defense. Photosynthesis Research, vol. 61, no. 2, pp. 99-105. Castro, A. J., Carapito, Ch., Zorn, N., Magné, Ch., Leize, E. a Van Dorsselaer, A., Clément, Ch. (2005): Proteomic analysis of grapevine (Vitis vinifera L.), tissues 66
subjected to herbicide stress. Journal of Experimental Botany, vol. 56, no. 421, pp. 2783-2795. Di Carli, M., Zamboni, A., Pè, M. E., Pezzotti, M., Lilley, K. S., Benvenuto, E. a Desiderio, A. (2011): Two-Dimensional Differential in Gel Electrophoresis (2D-DIGE) analysis of grape berry proteome during postharvest withering. Journal of Proteome Research, vol. 10, no. 2, pp. 429-446. Edreva, A. (2005): Pathogenesis-related proteins: Research progress in the last 15 years. General and Applied Plant Physiology, vol. 31, no. 1-2, pp. 105-124. Fahnenstich, H., Scarpeci, T. E., Valle, E. M., Flügge, U. a Maurino, V. G. (2008): Generation of hydrogen peroxide in chloroplasts of Arabidopsis overexpressing glycolate oxidase as an inducible system to study oxidative stress. Plant Physiology, vol. 148, no. 2, pp. 719-729. Ferri, M., Tassoni, A., Franceschetti, M., Righetti, L., Naldrett, M. J. a Bagni, N. (2009): Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics, vol. 9, no. 3, pp. 610-624. Figueiredo, A., Fortes A. M., Ferreira S., Sebastiana, M., Choi Y. H., Sousa L., AcioliSantos, B., Pessoa, F., Verpoorte, R. a Pais, M. S. (2008): Transcriptional and metabolic profilling of grape (Vitis vinifera L.) leaves unravel possible innate resistance against pathogenic fungi. Journal of experimental Botany, vol. 59, no. 12, pp. 3371-3381. Flowers, T. J., Garcia, A., Koyama, M.. a Yeo, A. R. (1997): Breeding for salt tolerance in crop plants – the role of molecular biology. Acta Physiologiae Plantarum, vol. 19, no. 4, pp. 427-433. Gloser, J. (1998): Fyziologie rostlin, 2. rozš. vyd., Masarykova univerzita, Brno, 130131, 151-152. Govrin, E. M. a Levine, A. (2000): The hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. Current Biology, vol. 10, no. 13, pp. 751-757. Grand, C., Sarni, F. a Lamb Ch. J. (1987): Rapid induction by fungal elicitor of the synthesis of cinnamyl-alcohol dehydrogenase, a specific enzyme of lignin synthesis. European Journal of Biochemistry, vol. 169, no. 1, pp. 73-77. Grimplet, J., Wheatley, M. D., Jouira, H. B., Deluc, L. G., Cramer, G. R. a Cushman J. C. (2009): Proteomic and selected metabolite analysis of grape berry tissues under wellwatered and water-deficit stress conditions. Proteomics, vol. 9, no. 9, pp. 2503-2528. Hall, J. L. (2002): Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Experimental Botany, vol. 53, no. 366, pp. 1-11.
67
Hamiduzzaman, M. M., Jakab, G., Barnavon, L., Neuhaus, J-M. a Mauch-Mani, B. (2005): β-aminobutyric acid-induced resistance against downy mildew in grapevine acts through the potentiation of callose formation and jasmonic acid signalling. Molecular Plant-Microbe Interactions, vol. 18, no. 8, pp. 819-829. Heldt, H-W. a Piechulla, B. (2011): Plant biochemistry, 4. vyd., Academic Press, USA, 361-363, 461. Heřmanová, V., Bárta, J. a Čurn, V. (2006): Antifugální proteiny rostlin-klasifikace, charakteristika, moţnosti vyuţití. Chemické Listy, vol. 100, no. 7, pp. 495-500. Hluchý, M., Ackermann, P., Zacharda, M., Bagar, M., Jetmarová, E. a Vanek, G. (1997): Obrazový atlas chorob a škůdců ovocných dřevin a révy vinné, Biocont Laboratory s.r.o., 207-264. Hluchý, M., Ackermann, P., Zacharda, M., Laštůvka, Z., Bagar, M., Jetmarová, E., Vanek, G., Szöke, L. a Plíšek, B. (2008): Ochrana ovocných dřevin a révy v ekologické a integrované produkci, Biocont Laboratory spol. s r.o., Brno, 221-290. Hoffman, U.(2006): Sborník z mezinárodní vinařské konference VINO ENVI 2007 Jayani, R. S., Saxena, S. a Gupta R. (2005): Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process Biochemistry, vol. 40, no. 9, pp. 2931-2944. Jellouli, N., Jouira, H. B., Skouri, H., Ghorbel, A., Gourgouri, A. a Mliki, A. (2008): Proteomic analysis of Tunisian grapevine cultivar Razegui under salt stress. Journal of Plant Physiology, vol. 165, no. 5, pp. 471-481. Kafka, Z. a Punčochářová, J. (2002): Těţké kovy v přírodě a jejich toxicita. Chemické Listy, vol. 96, no. 7, pp. 611-617. Kaur, H., Shaker, K., Heinzel, N., Ralph, J., Gális, I. a Baldwin, I. T. (2012): Environmental stresses of field growth allow cinnamyl alcohol dehydrogenase-deficient Nicotiana attenuata plants to compensate for their structural deficiencies. Plant Physiology, vol. 159, no. 4, pp. 1545-1570. Kraus, V., Hubáček, V. a Ackermann, P. (2000): Rukověť vinaře, Květ, Praha, 3, 138160. Kromina, K. A., Ignatov, A. N. a Abdeeva I. A. (2008): Role of peptidyl-prolylcis/trans-isomerases in pathologic processes. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, vol. 2, no. 3, pp. 195-202. Kurek, I., Aviezer, K., Erel, N., Herman, E. a Breiman, A. (1999): The wheat peptidyl prolyl cis-trans-isomerase FKBP77 is heat induced and developmentally regulated. American Society of Plant Physiologists, vol. 119, no. 2, pp. 693-704. León, J., Rojo, E. a Sánchez-Serrano, J. J. (2001): Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botany, vol. 52, no. 354, pp. 1-9. 68
Liu, S., Cheng, Y., Zhang, X., Guan, Q., Nishiuchi, S., Hase K. a Takano, T. (2007): Expression of an NADP-malic enzyme in rice (Oryza sativa L.) is induced by environmental stresses; over-expression of the gene in Arabidopsis confers salt and osmotic stress tolerance. Plant Molecular Biology, vol. 64, no. 1-2, pp. 49-58. Ma, Q-H. a Xu, Y. (2008): Characterization of a caffeic acid 3-O-methyltransferase from wheat and its function in lignin biosynthesis. Biochimie, vol. 90, no. 3, pp. 515524. Mahalingam, R., Jambunathan, N., Gunjan, S. K., Faustin, E., Weng, H. a Ayoubi, P. (2006): Analysis of oxidative signalling induced by ozone in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment, vol. 29, no. 7, pp. 1357-1371. Marsh, E., Alvarez, S., Hicks, L. M., Barbazuk, W. B., Qiu, W., Kovacs, L. a Schachtman, D. (2010): Changes in protein abundance during powdery mildew infection of leaf tissues of Cabernet Sauvignon grapevine (Vitis vinifera L.). Proteomics, vol. 10, no. 10, pp. 2057-2064. Martinez-Esteso, M. J., Sellés-Marchart, S., Vera-Urbina, J. C., Pedreño, M. A. a BruMartinez, R. (2009): Changes of defense proteins in the extracellular proteome of grapevine (Vitis vinifera cv. Gamay) cell cultures in response to elicitors. Journal of Proteomics, vol. 73, no. 2, pp. 331-341. Martinez-Esteso, M. J., Sellés-Marchart, S., Vera-Urbina, J. C., Pedreño, M. A. a BruMartinez, R. (2011): DIGE analysis of proteome changes accompanying large resveratrol production by grapevine (Vitis vinifera cv. Gamay) cell cultures in response to methyl-β-cyclodextrin and methyl jasmonate elicitors. Journal of Proteomics, vol. 74, no. 8, pp. 1421-1436. Milli, A., Cecconi, D., Bortesi, L., Persi, A., Rinalducci, S., Zamboni, A., Zoccatelli, G., Lovato, A., Zolla, L. a Polveran, A. (2012): Proteomic analysis of the compatible interaction between Vitis vinifera and Plasmopara viticola. Journal of Proteomics, vol. 75, no. 4, pp. 1284-1302. Ndimba, B. K., Chivasa, S., Hamilton, J. M., Simon, W. J. a Slabas, A. R. (2003): Proteomic analysis of changes in the extracellular matrix of Arabidopsis cell suspension cultures induced by fungal elicitors. Proteomics, vol. 3, no. 6, pp. 1047-1059. Niu, N. Cao, Y., Duan, W., Wu, B. a Li, S. (2013): Proteomic analysis of grape berry skin responding to sunlight exclusion. Journal of Plant Physiology, vol. 170, no. 8, pp. 748-757. Nürnberger, T. a Scheel, D. (2001): Signal transmission in the plant immune response. Trends in Plant Science, vol. 6, no. 8, pp. 372-379.
69
O´Donnell, P. J., Calvert, C., Atzorn, R., Waternack, C., Leyser, H. M. O. a Bowles, D. J. (1996): Ethylene as a signal mediating the wound response of tomato plants. Science, vol. 274, no. 5294, pp. 1914-1917. Paquis, S., Mazeyrat-Gourbeyre, F., Fernandez, O., Crouzet, J., Clément, Ch., Baillieul, F. a Dorey, S. (2011): Characterization of a F-box gene up-regulated by phytohormones and upon biotic and abiotic stresses in grapevine. Molecular Biology Reports, vol. 38, no. 5, pp. 3327-3337. Pavloušek, P. (2005): Pěstování révy vinné v zahradách, CP Books, Brno, 134-139. Pavloušek P. (2011): Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví, Grada Publishing, Praha, 16. Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S. a Ryan, C. A. (1991): A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science, vol. 253, no. 5022, pp. 895-897. Perret, C. (2001): Analyse de tanins inhibiteurs de la stilbène oxydase produite par Botrytis cinerea, Université de Neuchâtel. Pessarakli, M. (1999): Handbook of Plant and Crop Stress [online]. 2. New York, USA: Marcel Dekker, Inc., pp. 125-152, 231-238. Piterková, J., Luhová L., Mieslerová, B., Lebeda A. a Petřivalský, M. (2013): Nitric oxide and reactive oxygen species regulate the accumulation of heat shock proteins in tomato leaves in response to heat shock and pathogen infection. Plant Science, vol. 207, pp. 57-65. Piterková, J., Tománková, K., Luhová, L., Petřivalský, M. a Peč, P. (2005): Oxidativní stres: Lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu. Chemické Listy, vol. 99, no. 7, pp. 455-466. Poinssot, B., Vandelle, E., Bentéjac, M., Adrian, M., Levis, C., Brygoo, Y., Garin, J., Sicilia, F., Coutos-Thévenot, P. a Pugin, A. (2003): The endopolygalacturonase 1 from Botrytis cinerea activates grapevine defense reactions unrelated to its enzymatic activity. Molecular Plant-Microbe Interactions, vol. 16, no. 6, pp. 553-564. Pontin, M., Piccoli, P., Francisco, R., Bottini, R., Martinez-Zapater, J. a Lijavetzky, D. (2010): Transcriptome changes in grapevine (Vitis vinifera L.) cv. Malbec leaves induced by ultraviolet-B radiation. BioMed Central Biology, vol. 10, no. 1, pp. 224-236. Procházka, S., Macháčková, I., Krekule, J., Šebánek, J. a kol. (1998): Fyziologie rostlin, Academia, Praha, 412-430. Repka, V., Fischerová, I. a Šilhárová, K. (2004): Methyl jasmonate is a potent elicitor of multiple defense responses in grapevine leaves and cell-suspension cultures. Biologia Plantarum, vol. 48, no. 2, pp. 273-283. 70
Reymond, P., Weber, H., Damond, M. a Farmer, E. E. (2000): Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. The Plant Cell, vol. 12, no. 5, pp. 707-719. Řepková, J. a Relichová, J. (2001): Genetika rostlin, Masarykova univerzita, Brno, 183185. Semchuk, N. M., Lushchak, O. V., Falk, J., Krupinska, K. a Lushchak, V. I. (2009): Inactivation of genes, encoding tocopherol biosynthetic pathway enzymes, results in oxidative stress in outdoor grown Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry, vol. 47, no. 5, pp. 384-390. Shanker, A. K. a Venkateswarlu, B. (2011): Abiotic response in plants-physiological, biochemical and genetic perspectives [online]. Croatia: InTech, pp. 5-16. Spagnolo, A., Magnin-Robert, M., Alayi, T. D., Cilindre, C., Mercier, L., SchaefferReiss, C., Van Dorsselaer, A., Clément, C. a Fontaine, F. (2012): Article physiological changes in green stems of Vitis vinifera L. cv. Chardonnay in response to esca proper and apoplexy revealed by proteomic and transcriptomic analyses. Journal of Proteome Research, vol. 11, no. 1, pp. 461-475. Speth, E. B., Imboden, L., Hauck, P. a He, S. Y. (2009): Subcellular localization and functional analysis of the Arabidopsis GTPase RabE. Plant Physiology, vol. 149, no. 4, pp. 1824-1837. Spoel, S. H. a Dong, X. (2012): How do plants achieve immunity? Defence without specialized immune cells. Nature Reviews Immunology, vol. 12, no. 2, pp. 89-100. Srivastava, S., Fristensky, B. a Kav, N. N. V. (2004): Constitutive expression of a PR10 protein enhances the germination of Brassica napus under saline conditions. Plant and Cell Physiology., vol. 45, no. 9, pp. 1320-1324. Suo, Y. a Leung, D. W. M. (2002): Accumulation of extracellular pathogenesis-related proteins in roses following inoculation. Scientia Horticulturae, vol. 93, no. 2, pp. 167178. Süle, A., Vanrobaeys, F., Hajós, G., Van Beeumen, J. a Devreese, B. (2004): Proteomic analysis of small heat shock protein isoforms in barley shoots. Phytochemistry, vol. 65, no. 12, pp. 1853-1863. Tattersall, E. A. R., Grimplet, J., DeLuc, L., Wheatley, M. D., Vincent, D., Osborne, C., Ergül, A., Lomen, E., Blank, R. R., Schlauch, K. A., Cushman, J. C. a Cramer, G. R. (2007): Transcript abundance profiles reveal larger and more complex responses of grapevine to chilling compared to osmotic and salinity stress. Functional and Integrative Genomics, vol. 7, no. 4, pp. 317-333.
71
Tronchet, M., Balagué, C., Kroj, T., Jouanin, L. a Roby, D. (2010): Cinnamyl alkohol dehydrogeases-C and D, key enzymes in lignin biosynthesis, play an essential role in disease resistance in Arabidopsis. Molecular Plant Pathology, vol. 11, no. 1, pp. 83-92. Tuteja, N., Gill, S. a Tuteja, R. (2011): Omics and Plant Abiotic Stress Tolerance [online]. Sharjah, UAE: Bentham Science Publishers, pp. 39-64. Van Loon, L. C. a Van Strien, E. A. (1999): The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology, vol. 55, no. 2, pp. 85-97. Váňa, J. (1998): Systém a vývoj hub a houbových organismů, Karlova univerzita, Karolinum, Praha, 30-36, 68-93. Velasco-García, R., Mújica-Jiménez, C., Mendoza-Hernández, G. a Muñoz-Clares, R. A. (1999): Rapid purification and properties of betaine aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology, vol. 181, no. 4, pp. 1292-1300. Vieira Dos Santos, Ch. a Rey, P. (2006): Plant thioredoxins are key actors in the oxidative stress response. Trends in Plant Science, vol. 11, no. 7, pp. 329-334. Wood A. J., Saneoka, H., Rhodes, D., Joly, R. J. a Goldsbrough, P. B. (1996): Betaine aldehyde dehydrogenase in sorghum: Molecular cloning and expression of two related genes. Plant Physiology, vol. 110, no. 4, pp. 1301-1308. Yang, L., Takahashi, Y., Chen, F., Walker, M. A. a Civerolo, E. L. (2011): Proteomic analysis of grapevine stem in response to Xylella fastidiosa inoculation. Physiological and Molecular Plant Pathology, vol. 75, no. 3, pp. 90-99. Walters, D. R. (2010): Plant defence [online]. Hoboken, NJ, USA: Wiley-Blackwell, pp. 15-25. Wang, W., Vinocur, B., Shoseyov, O. a Altman, A. (2004): Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response. Trends in Plant Science, vol. 9, no. 5, pp. 244-252. Zhang, J., Ma, H., Chen, S., Ji, M., Perl, A., Kovacs, L. a Chen, S. (2009): Stress response proteins´ differential expression in embryonic and non-embryonic calus of Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon−A proteomic approach. Plant Science, vol. 177, no. 2, pp. 103-113. Ţiva: archiv. [online]. Praha: Academia, 2009. Dostupné z: http://ziva.avcr.cz/20094/jak-se-rostliny-brani-napadeni-houbovymi-patogeny.html (březen 2013)
72
