Gymnázium Jana Nerudy
Závěrečná práce studentského projektu Fotosyntéza - Rostlinná barviva Evropský sociální fond Praha a EU – Investujeme do vaší budoucnosti
Pod vedením vedoucích práce Mgr. Jiřího Vozky, RNDr. Lenky Simonianové a odborného konzultanta RNDr. Květy Kalíkové, Ph.D. S poděkováním Katedře fyzikální a makromolekulární chemie Univerzity Karlovy v Praze, kde proběhlo měření.
Stránka 1 z 16
Sára Juranková Eliška Krýslová Aneta Peychlová Barbora Ševčenková 2014 Prohlášení
Prohlašujeme,
že
jsme
závěrečnou
práci
studentského
projektu
zpracovaly samostatně a že jsme uvedly všechny použité informační zdroje a literaturu.
Stránka 2 z 16
1. Abstrakt Studentský projekt se zabývá fotosyntetickými pigmenty. V rámci experimentální části jsme separovali různá rostlinná barviva pomocí papírové chromatografie. Izolovaná barviva byla posléze proměřena na spektrofotometru, abychom mohli určit jejich spektrální aktivitu. Pro ověření funkce pigmentů jako přenašečů elektronu bych navržen pokus, který tuto funkci jasně demonstruje. Na základě jednotlivých spekter a srovnání s literaturou se nám podařilo určit čtyři barviva, pátý izolovaný pigment se určit nepodařilo. Oxidoredukční aktivita pigmentů byla ověřena.
This student project focuses on photosynthetic pigments. In the experimental part we separated pigments using paper chromatography. The absorbance spectra of isolated pigments were determined using spectrophotometry. One experiment was developed to verify the ability of pigments to carry electrons and work as a redox agent. Four of five separated pigments were determined according to literature research. Redox activity was also confirmed.
Stránka 3 z 16
Obsah 1.
Abstrakt ........................................................................................................................................... 3
2.
Úvod ................................................................................................................................................ 5
3.
Teoretická část ................................................................................................................................. 6 3.1. Fotosyntéza................................................................................................................................... 6 3.1.1. Fáze fotosyntézy .................................................................................................................... 7 3.1.2. OEC komplex ........................................................................................................................ 7 3.1.3. Rychlost fotosyntézy ............................................................................................................. 7 3.2. Spektrofotometrie ......................................................................................................................... 8 3.3. Rostlinná barviva .......................................................................................................................... 8 3.3.1 Chloroplasty, chromoplasty.................................................................................................... 8 3.3.2. Lipochromy ........................................................................................................................... 9 3.3.3. Hydrochromy....................................................................................................................... 10
4.
Experimentální část ....................................................................................................................... 11 4.1. Ověření schopnosti pigmentů pohlcovat světlo a přijímat a předávat elektron .......................... 11 4.2. Absorpční spektra pigmentů ....................................................................................................... 13
5.
Závěr.............................................................................................................................................. 15
6.
Použité zdroje ................................................................................................................................ 16
Stránka 4 z 16
2. Úvod Rostliny obsahující chlorofyl jsou jedny z mála organismů schopné využití slunečního záření jako zdroje energie k přeměně anorganických látek na látky organické. V tomto ohledu jsou proto nenahraditelným začátkem potravního řetězce, na jehož konci jsou masožravci a člověk. Bez přehánění lze konstatovat, že rostliny jsou jedny z nejdůležitějších organismů – život na Zemi by bez nich nemohl existovat. Ačkoliv jsou rostliny pro člověka, kromě estetického potěšení, především potravou, rostlinstvo v přírodě plní ještě mnoho dalších důležitých funkcí. Například lesy, velmi příznivě ovlivňují klima a kořenové systémy rostlin zmenšují půdní erozi – významně tak ovlivňují koloběh vody a její uplatnění v krajině. Aktuálním příkladem je může být nynější situace na ostrově Madagaskar - kvůli přílišnému spásání, vypalování porostů a kácení lesů zde dochází k nadměrné erozi, která ohrožuje budoucnost celého ostrova.1 Nejzákladnějším přínosem rostlin pro život na Zemi je však jejich schopnost tvořit kyslík a regulovat množství oxidu uhličitého v ovzduší díky procesu zvaném fotosyntéza. Základní rovnice fotosyntézy:
.
Stránka 5 z 16
3. Teoretická část 3.1. Fotosyntéza K proběhnutí je nutné, aby rostlina byla schopna získávat energii v podobě světelné energie (sluneční). Dle definice je fotosyntéza „biologický děj, při němž dochází k přeměně absorbovaného slunečního záření v energii chemických vazeb organických látek“.2 Pojmem fotosyntéza většinou myslíme fotosyntetickou asimilaci oxidu uhličitého, jelikož většina energie je použita k redukci CO2 a k syntéze asimilátů sacharidového typu. Nedochází však jen k ukládání energie do stabilnějších chemických vazeb, ale zvyšuje se také množství organicky vázaného uhlíku. Mohou proto vznikat uhlíkaté řetězce potřebné pro syntézu dalších organických látek. Energie uložená v chemických vazbách monosacharidů je rychle dostupná pro další životní procesy. Je transportována ve formě sacharidů z chloroplastů do cytoplazmy a dále do buněk/pletiv/orgánů, které buď nejsou schopné fotosyntézy (např. kořeny rostliny) nebo je jejich fotosyntetizující schopnost nedostačující (např. u mladých vyvíjejících se listů). Transport energie na delší vzdálenosti (např. z listu do kořene) probíhá ve formě sacharosy a oligosacharidů, ze kterých se energie opět zpětně získává ve formě adenosintrifosfátu (ATP) během respirace. ATP je jakési univerzální energetické platidlo, malá molekula obsahující makroergické (vysokoenergické) vazby, při jejichž rozštěpení může být jejich energie použita pro jiné reakce. Fotosyntéza probíhá v chloroplastech. Jedná se o membránové organely, které se hojně vyskytují např. v asimilačním pletivu zvaném mezofyl, nacházející se především v listech zelených rostlin (viz Obr.1).
(Obr.1) Průřez listem - mezofylové pletivo se skládá z mezofylových buněk, ve kterých se nacházejí zelené chloroplasty - na spodní části listu se nacházejí tzv. stomata neboli průduchy, sloužící ke kontrolované výměně plynů mezi rostlinou a okolím (průduchů existuje více typů, např. Amaryllis či Helleborus) - žilnatina neboli nervatura listu slouží k transportu živin a k mechanickému zpevnění listu
Stránka 6 z 16
3.1.1. Fáze fotosyntézy Fotosyntéza probíhá ve dvou fázích: 1. Primární (světelná) Absorbovaná světelná energie je použita k tvoření ATP, jedná se o nukleotid nepostradatelný pro funkci veškerých dosud známých buněk. Při jeho rozkladu je uvolňováno velké množství energie nutné pro většinu buněčných pochodů. Zároveň se zde tvoří redukované formy redukujících agens (redukovaný ferredoxin a nikotinamidadenindinukleotid fosfát, tzv. NADPH) a dochází k uvolňování kyslíku. 2. Sekundární = syntetická (nazývaná temnostní, ačkoliv může probíhat na světle) Produkty primární fáze se používají k tvorbě organických látek v druhé fázi fotosyntézy. V chloroplastech jsou také nezbytné pro další životní procesy rostliny - k asimilaci anorganicky vázaného dusíku a síry a k syntéze mastných kyselin. Produkty těchto procesů (aminokyseliny a mastné kyseliny) však nejsou vhodné jako rychle použitelný a snadno transportovatelný zdroj energie. 3.1.2. OEC komplex Jiný způsob, jak se vyvarovat nebezpečných peroxidových částic představuje OEC - komplex, který najdeme u vyšších rostlin. Tento proteinový komplex je spojen s fotosystémem II. Zkratka OEC pochází z anglického Oxygen Evolving Complex, tedy kyslík uvolňující komplex. Jak již název napovídá, tak právě zde dochází k fotolýze vody (tzv. Hillově reakci), která je významným prvkem fotosyntézy. V průběhu této reakce se voda rozkládá na elektrony, které procházejí fotosystémy, na protony, které se uvolňují do lumenu thylakoidu a budou využity později a na kyslík, který dýcháme. Jak ale získat elektrony z vody, tak aby nevznikl nebezpečný kyslíkový radikál? Příroda to vyřešila geniálně. Komplex OEC díky své struktuře složené ze čtyř iontů odvozených od Mn a stabilizaci ionty Ca2+ a Cl- dokáže přijmout až čtyři elektrony, tedy se vyskytuje v pěti oxidovaných stavech označovaných S0 až S4. Index u písmene S označuje počet elektronů, které komplex již předal to fotosyntetického řetězce. OEC komplex prostřednictvím atomů manganu reaguje rovnou se dvěma molekulami vody, kterým odebere 4 e- a přejde ve stav plně redukovaný S0. Současně vznikne molekula kyslíku a 4 H+. 2 H2O -> 4 H+ + 4 e- + O2 Reakcí se dvěma molekulami vody najednou se rostlina vyhnula vzniku reaktivních forem kyslíku s lichým počtem elektronů a zároveň získala možnost částečně regulovat fotosyntézu. 3.1.3. Rychlost fotosyntézy Rychlost fotosyntézy závisí na řadě vnitřních i vnějších faktorů. Z vnitřních faktorů jde zejména o množství chlorofylu, stáří listů a minerální výživu. Mezi vnější činitele patří světlo, koncentrace CO2, teplota a voda. Světlo ovlivňuje fotosyntézu spektrálním složením, které se mění s výškou Slunce a intenzitou záření. Rostoucí intenzita může rychlost zvyšovat je do určité úrovně. Spektrum vhodné pro fotosyntézu je v rozmezí 380-760 nm. Koncentrace CO2 v ovzduší je asi 0,03%. 3 Závislost rychlosti na množství CO2 je stejného charakteru jako u světla. Lze zvýšit např. ve skleníku. Teplota výrazně ovlivňuje fotosyntézu. U rostlin mírného pásu je optimum asi 15-25°C, při teplotách nad 30°C nastává pokles rychlosti. Voda je zcela nezbytná, nedostatek se projevuje uzavíráním průduchů, které způsobí zastavení přístupu CO2.
Stránka 7 z 16
3.2. Spektrofotometrie Spektrofotometrie je metoda měřící absorpci ultrafialového (10-380 nm) a viditelného záření (380-780 nm) . Měří se absorbance monochromatického záření roztokem určované látky v hranolových nebo mřížkových spektrofotometrech s fotoelektrickými čidly (fotoelektrické články a násobiče). Spektrofotometrie také umožňuje zjištění neznámé koncentrace c hledané látky pomocí Lambertova-Beerova zákonu, který linearizuje vztah mezi absorbancí a koncentrací: c=A/ ε l, clátková koncentrace (mol L-1), A- absorbance, ε-molární absorpční koeficient (L mol-1 cm-1), ltloušťka vrstvy (cm). Pro spektrofotometrické stanovená se používá wolframová lampa, halogenová žírovka nebo deuteriová lampa: Wolframová lampa je využívána pro rozsah vlnových délek 350-3000 nm. Halogenová žárovka je wolframová žárovka s obsahem malého množství jodu v křemenné bance. Halogenová žárovka má asi dvojnásobnou životnost než běžná wolframová žárovka. Její spektrum zasahuje až do ultrafialové oblasti. Používá se v mnoha moderních spektrofotometrech. Deuteriová lampa je ideálním zdrojem pro ultrafialovou oblast záření. Emituje žáření v rozsahu 160275 nm.
3.3. Rostlinná barviva Fotosyntetický pigment či fotosyntetické barvivo je organické barvivo, které využívají fotosyntetizující organismy k zachycení sluneční energie (fotonů) při fotosyntéze. Z chemického hlediska se jedná o cyklické nebo lineární tetrapyroly, karotenoidy a flavonoidy, které se často vážou s proteiny, s cukry nebo s ionty kovů. Mezi základní barviva fotosyntézy patří chlorofyly a bakteriochlorofyly. Doprovodnými barvivy jsou pak karotenoidy, fykobiliny, fykoerytrin a fykocyanin. Tyto doprovodné pigmenty tvoří tzv. „světlosběrný anténní systém“- periferní části fotosystémů. Molekuly fotosyntetických pigmentů jsou v nich nekovalentně vázány na strukturní proteiny, s nimiž tvoří tzv. pigmentoproteinové komplexy. Světlosběrné komplexy u vyšších rostlin mohou obsahovat 200-300 molekul chlorofylu a i b a četné xantofyly. K jednému proteinu se váže 1012 molekul chlorofylu (a i b v různých poměrech) a 2-3 molekuly xantofylů. Rostlinná barviva se rozdělují na barviva rozpustná v tucích a nepolárních rozpouštědlech (lipochromy) a barviva rozpustná ve vodě (hydrochromy). 3.3.1 Chloroplasty, chromoplasty Chloroplasty jsou zelené fotosynteticky aktivní plastidy, vyskytující se v zelených částech rostlin. U vyšších rostlin bývají čočkovitého, mírně protáhlého tvaru o průměru 2-10 mikrometrů. Mají specificky silně vyvinutý vnitřní membránový systém plochých váčků, thylakoidů, a veliké množství pigmentu, chlorofylu. V chloroplastech je membrána thylakoidů velmi členitá- tvoří výběžky, které k sobě přiléhají a tvoří tak sloupcovité útvary tzv. grana. Takto členité thylakoidy se nazývají granální thylakoidy/thylakoidy stěsnané. Základní funkcí thylakoidní membrány je její nepropustnost pro protony. Při stárnutí listů, stonků nebo plodů ztrácejí chloroplasty vlivem rozkladu chlorofylu zelenou barvu a mění se na chromoplasty. Chromoplast je žlutý nebo červený fotosynteticky neaktivní plastid obsahující pouze pomocné fotosyntetické pigmenty (karotenoidy), které slouží jako doprovodné sběrače fotonů pro chloroplasty. Stránka 8 z 16
Chromoplasty se vyskytují ve zralých plodech, květech, v podzimním lístí a někdy i v kořenech, např. u mrkve. 3.3.2. Lipochromy Lipochromy jsou obsažené v plastidech. Patří k nim zelené chlorofyly a žluté až červené karotenoidy. Chlorofyly jsou přítomny především v listech. Absorbují fotony v modré a červené oblasti spektra, v oblasti zelené je jejich absorpce minimální a proto se člověku jeví jako zelené. Chlorofyl je tvořen cyklickým tetrapyrolem-porfyrinem. V centru porfyrinového kruhu je vázán atom Mg. Biosyntéza chlorofylu probíhá v chloroplastu. Existuje pět typů chlorofylu (a,b,c,d,e). Všechny rostliny včetně měchů a řas obsahují chlorofyl a. U vyšších rostlin najdeme chlorofyly typu a a b, které zachycují fotony červené a modrofialové části slunečního spektra. Karotenoidy jsou barviva rostlin, hub, řas, mikroorganizmů a živočichů. Jde o lipofilní (rozpustné v tucích) organické látky ze skupiny tetraterpenů (C40), kterých základem je 8 izoprenových jednotek (C5). Absorbují fotony ve fialové a modré oblasti světla. Způsobují žluté, oranžové a červené zbarvení listů, květů a plodů. Barevnost spůsobuje řetězec konjugovaných dvojných vazeb. Karotenoidy se rozdělují na primární a sekundární karotenoidy: Primární karotenoidy jsou obsaženy v chloroplastech, absorbují světelnou energii a přenášejí ji na chlorofyl. Sekundární karotenoidy jsou obsažené v chromoplastech. Funkce karotenoidů je ochrana fotosyntetického aparátu před fotooxidací. V situaci, kdy dopadající světelné energie je více, než je fotosyntetický aparát schopen využít a kdy by její nadbytek vedl k poškození aparátu, začíná fungovat tzv. xantofylový cyklus, nadbytek absorbovaného světla se přemění na teplo v procesu zvaném tepelná disipace. Dělí se na dvě skupiny: karoteny (červené barvivo) a kyslíkaté deriváty karotenů, xantofyly (žluté barvivo). Karoteny také zvyšují spektrum vlnových délek, na kterých je fotosystém schopen absorbovat. V chloroplastech vyšších rostlin se vyskytuje hlavně β-karoten, z xantofylů lutein, violaxantin, zeaxantin a neoxantin
(Obr.2) Stavba molekul chlorofylů, β-karotenu a luteinu
Stránka 9 z 16
3.3.3. Hydrochromy Antokyany patří mezi hydrochromy. V rostlinách se vyskytují ve formě glykosidů, jejich aglykonová část (necukerná) se označuje jako antokyanidin. Jsou obsaženy v buněčné šťávě vakuol, které patří mezi nejrozměrnější membránové organely. Způsobují modré, červené, fialové až černé zbarvení květů a plodů. Mění barvu se změnou pH buněčné šťávy obsažené ve vakuolách, v kyselém prostředí se barví červeně, v neutrálním prostředí fialově a v zásaditém modře. Jejich funkce je chránit před UV zářením.
Stránka 10 z 16
4. Experimentální část 4.1. Ověření schopnosti pigmentů pohlcovat světlo a přijímat a předávat elektron Extrahování barviv z listů břečťanu popínavého (Hedera helix) pro ověření jejich schopnosti absorbovat světlo, fungovat jako akceptor (přijímat elektrony od donoru) a fungovat jako donor při předávání elektronu. Princip: Použijeme-li kyselinu askorbovou jako donor a methylčerveň (indikátor) jako akceptor, lze tyto vlastnosti barviv ověřit. Pigment bude přijímat elektrony a předávat je methylčerveni, která se zredukuje, čímž změní svou barvu z červené na žlutou. Pomůcky: listy břečťanu, pipeta, nůžky, zkumavky Chemikálie: aceton, methylčerveň, kyselina askorbová Postup:
(Obr.4) Nastříhaný břečťan s pískem v třecí misce
(Obr.3) Stříhání břečťanu
Nastříhali jsme listy břečťanu (obrázek 3) a třeli je v třecí misce s trochou písku (obrázek 4). Poté jsme přidali 15mL acetonu a filtrát jsme odsáli do suché kádinky. Připravili jsme si 5 zkumavek dle následující tabulky: Číslo zkumavky 1 2 3 4 5
Acetonový extrakt 5,0 2,5 1,0 0 5,0
Aceton (mL) 0 2,5 4,0 5,0 0
Stránka 11 z 16
Methylčerveň (mL) 1 1 1 1 1
Do všech zkumavek jsme přidali kyselinu askorbovou, až vznikly nasycené roztoky (obrázek 5). Zkumavku č.5 jsme obalili alobalem, abychom zabránili přístupu světla. Ostatní jsme osvítili lampou (obrázek 6) a zaznamenali jsme čas, kdy došlo ke změně zabarvení z červenohnědé na zelenou, díky redukci methylčerveně.
(Obr. 5) Zkumavky a kyselina askorbová
(Obr.6) Zkumavky osvícené lampou
Závěr: Zkumavka č.1 změnila barvu po 18 minutách, č.2 po 25 minutách, č.3 po 31 min. Zjistili jsme, že koncentrace pigmentu přímo ovlivňuje rychlost přenosu elektronu. Ve zkumavce bez pigmentu nedošlo k žádné změně. Zkumavka č.5, která nebyla vystavena světlu také nezměnila barvu, což je důkazem nutné přítomnosti světla při tomto procesu.
(Obr.7) Zkumavky v pořadí 1-5 po proběhnutí barevných změn
Stránka 12 z 16
4.2. Absorpční spektra pigmentů Extrahování barviv z listů břečťanu popínavého a jejich oddělení pomocí chromatografie. Změření absorpčního spektra jednotlivých látek. Princip: Každé barvivo, které rostlina obsahuje se při chromatografii pohybuje po chromatografickém papíru jinou rychlostí, která je dána jejich absorbancí. Na chromatografickém listu tedy dochází k jejich separaci, kdy se vzdálenost každého barviva od počátečního bodu do zóny liší. Jednotlivá barviva se liší tím, které barvy spektra pohlcují a je tedy možno je tím odlišit. Pomůcky: listy břečťanu, chromatografický list, kádinka, tužka, pipeta, pravítko, nůžky, dvoupaprskový skenovací spektrofotometr SHIMADZU (měřící rozsah :190-1100 nm; zdroj záření: deuteriová lampa pro UV oblast, wolframová lampa pro viditelnou oblast; pozice kyvet: měrná kyveta vpravo; temperování držáku kyvet: Peltierův článek s řídící jednotkou TCC Controller Program pro řízení přístroje a sběr dat UV-Probe 2.21) Chemikálie: aceton, izopropanol, benzin, destilovaná voda
Postup: Nastříhali jsme listy břečťanu a třeli je v třecí misce. Poté jsme přidali vyvíjecí směs složenou z 50 mL benzinu, 5 izopropanolu a 1,125 destilované vody a filtrát jsme přelili do kádinky. Vystřihli jsme obdélníkový kus chromatografického papíru a ve vzdálenosti 1cm od jeho kraje jsme narýsovali čáru, sloužící jako počáteční bod. Extrakt jsme pomocí injekční stříkačky přefiltrovali přes filtr Whatman 0,5μm a pomocí automatické pipety jsme jej nanesli na startovací linii. Nanesení jsme opakovali šestkrát. Poté jsme chromatografický papír vložili do kádinky s vyvíjecí směsí a přikryli hodinovým sklem. Poté, co došlo k oddělení jednotlivých barviv (obrázek 10), jsme chromatografický list vyjmuli a jednotlivé zóny barviv vystříhali pro následné zkoumání ve spektrofotometru. Každá zóna byla vložena do acetonu, aby došlo k oddělení pigmentu od chromatografického papíru (obrázek 11). Poté došlo po přefiltrování k měření absorpčních spekter jednotlivých barviv ve spektrofotometru.
(Obr.8) Potřeby pro nanesení vrstvy extraktu (odspodu: extrakt břečťanu, chromatografický papír, automatická pipeta)
(Obr.9) Chromatografický list s barvivem vložený do kádinky - barviva se začínají oddělovat
Stránka 13 z 16
(Obr.10) Oddělená barviva (Obr.11) Jednotlivé zóny barviv ponořené do acetonu
Závěr: Identifikace pigmentů břečťanu popínavého: Název pigmentu Extrakt 1- chlorofyl b
Vlnová délka 430-470 nm, 640-650 nm
Extrakt 2 - chlorofyl a Extrakt 3- lutein Extrakt 4 - β-karoten Extrakt 5
420 nm, 660 nm 410-490nm 430-490 nm 420-470 nm, 700nm
oblast Fialová až modrá, oranžová až červená oblast Fialová, červená oblast Fialová až modrá oblast Fialová až modrá oblast Fialová až modrá, červená oblast
Vzhledem k nedostatečnému oddělení jednotlivých fotosyntetických pigmentů chromatografii, nebyla výsledná spektra čistá.
Stránka 14 z 16
5. Závěr V prvním experimentu jsme ověřili, že barviva extrahovaná z břečťanu popínavého mají schopnost absorbovat světlo a fungovat jako jeho akceptor i donor. Po absorbování světla pigment přijme elektrony od kyseliny askorbové, která zde funguje jako donor, a předá je methylčerveni, čili akceptoru. Důkazem této skutečnosti je změna barvy z původní červenohnědé na zelenou, díky redukci methylčerveně. Ve druhém experimentu jsme po extrahování a rozdělení rostlinných barviv břečťanu a následném změření jejich absorpčního spektra zjistili, že břečťan obsahuje základní barviva chlorofyl a a chlorofyl b a doprovodní barviva ze skupiny karotenoidu lutein a β-karoten.
Stránka 15 z 16
6. Použité zdroje Citace 1. článek Krvácející hory z časopisu Vesmír – Pavel Hošek (Vesmír 84, duben 2005) 2. Fyziologie rostlin – Libuše Pavlová (Praha 2005) 3. článek Oxid uhličitý na http://www.globalni-ochlazovani.cz/ (6.1.2014) Botanika – Karel Kubát, Tomáš Kalina, Jaroslav Kováč, Dagmar Kubátová, Karel Prach, Zdeněk Urban (Scientia, Praha 2003) Magické rostliny- Susan Lavenderová, Anna Franklinová (Volvox Globator, Praha 1999) Biozahrada- Geoff Hamilton (Dorling Kindersley, Londýn 1987, české vydání- Príroda 1994) Seminární práce- Přírodní barviva, Ludmila Marečková (školní rok 2007/2008) Rostlinná barviva- Ing. Věra Přikrylová, Ph.D. (Gymnázium Frýdlant) Organická činidla v anorganické analýze- Prof. Ing. Dr. Z. Holzbecher, Doc. Ing. Dr. L. Diviš, Ing. M. Král, Doc. Ing. Dr. L. Šůcha, Doc. Ing. Dr. František Vláčil (STNL- Nakladatelství technické literatury, Praha 1975)
Stránka 16 z 16
