ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU Projekt Název projektu: Stanovení biomarkerů oxidativního stresu u kapra obecného (Cyprinus carpio L.) po dlouhodobém působení simazinu v environmentální koncentraci 1. Průběh řešení projektu: Během období řešení projektu byl proveden chronický test toxicity, kde byl sledován dlouhodobý vliv simazinu na kapra obecného (Cyprinus carpio L.). K testu byl použitý kapr obecný (délky těla 21,31 ± 2.05 cm a hmotnosti 282.05 ± 38.08 g) z odchovného zařízení Fakulty rybářství a ochrany vod ve Vodňanech. Sto dvacet osm kaprů bylo umístěno do osmi 200 l akvárií po 16 kusech. Test probíhal v opakování. Kapři byli vystaveni experimentálním koncentracím simazinu (Sigma Aldrich, Česká republika, chemické čistoty 99,5%) po dobu 60 dnů v následujících koncentracích ve vodě: 0,06 µg/l (environmentální koncentrace nalézaná v českých řekách - skupina 1), 2 mg/l (skupinu 2), a 4 mg/l (skupina 3), zároveň byla sladována i kontrolní skupina ryb bez simazinu. Koncentrace simazinu 2 mg/l a 4 mg/l odpovídají 5% 48hLC50 a 10% 48hLC50 pro kapra obecného. Ryby byly během experimentu krmeny jednou denně komerčním krmivem pro ryby v dávce 1% hmotnosti obsádky. Po celou dobu experimentu bylo sledováno chování ryb. Během pokusu byly sledovány fyzikálněchemické parametry vody a koncentrace simazinu ve všech akváriích. Po 14, 28 a 60 dnech byly z každé skupiny a opakování odebrány a usmrceny 4 ryby, z kterých byly odebrány vzorky tkání (mozek, žábra, sval, játra, střevo) pro stanovení analýz oxidativního stresu a antioxidačních biomarkerů. Vzorky tkání byly zmraženy na -80 °C a byly připraveny pro stanovení analýz biomarkerů oxidativního stresu a antioxidačních biomarkerů. Připravené vzorky tkání byly zváženy a homogenizovány (1:10 w/v) pomocí Ultra Turrax homogenizátoru (Ika, Německo) za použití 50 mM fosfátového pufru (pH 7,
obsahující 0,5 mM EDTA). Homogenát byl rozdělen na dvě části, první pro stanovení biomarkerů oxidačního stresu a druhá pro stanovení antioxidačních biomarkerů. Pro stanovení oxidativního stresu byly měřeny reaktivní kyslíkové radikály (ROS) a látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou (TBARS). ROS byly měřeny pomocí 2,7dichlorofluorescin diacetátu (DCFH-DA) podle metodiky Driver et al. (2000) s drobnými modifikacemi podle Zhang et al. (2008). TBARS byly stanoveny metodou podle Lushchak et al. (2005), která byla použita i k vyhodnocení lipidní peroxidace (LPO). Z antioxidačních biomarkerů byla spektrofotometricky stanovená celková aktivita superoxid dismutázy (SOD), katalázy (CAT), glutathion peroxidázy (GPx), glutathion reduktázy (GR) a množství redukovaného glutathionu (GSH). K vyhodnocení naměřených dat byla stanovena koncentrace proteinů. Následně byla všechna získaná data zpracována a statisticky vyhodnocena pomocí statistického softwaru STATISTICA program (verze 8.0 pro Windows, StatSoft). Pro hodnocení rozdílu mezi sledovanými skupinami a kontrolní skupinou byla použita analýza variace (ANOVA) – Tukeyův test. Driver, A.S., Kodavanti, P.R.S., Mundy, W.R., 2000. Age-related changes in reactive oxygen species production in rat brain homogenates. Neurotoxicol. Teratol. 22, 175–181. Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Husak, V.V., Luzhna, L.I., Lushchak, O.V., Storey, K.B., 2005. Hyperoxia results in transient oxidative stress and an adaptive response by antioxidant enzymes in goldfish tissues. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37, 1670–1680. Zhang,
X., Yang, F., Zhang, X., Xu, Y., Liao, T., Song, S., Wang, H., 2008. Induction of hepatic enzymes and oxidative stress in Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) exposed to waterborne hexabromocyclododecane (HBCDD). Aquat. Toxicol. 86, 4–11.
2. Dosažené výsledky: V průběhu testu bylo sledováno chování ryb ve všech skupinách. Ryby vystavené simazinu nejevily žádné změny chování (příjem krmiva, dýchání, pohybovou aktivitu) ve srovnání s kontrolními rybami. Během experimentu nebyla zjištěna žádná úmrtnost. Biomarkery oxidačního stresu Bylo prokázáno statisticky významné (p < 0,01) zvýšení hladiny ROS v tkáních mozku, svalu a jater kaprů, kteří byli vystaveni nejvyšší koncentraci simazinu (4 mg/l) po dlouhodobém působení ve srovnání s kontrolní skupinou. U ryb vystavených koncentraci 2 mg/l byla zjištěná zvýšená hladina ROS v jaterní tkáni po 60 dnech expozice. Statisticky významná data jsou uvedená v Tab. 1.
Tab. 1. Reaktivní kyslíkové radikály (ROS, %) v tkáních kapra obecného po expozici simazinem Tkáň
Mozek
Sval
Játra
100.11 ± 18.54
Testovaná skupina Simazin Simazin 0,06 µg/l 2 mg/l 100.08 ± 19.51 106.75 ± 8.54
Simazin 4 mg/l 111.26 ± 8.63
28
100.91 ± 12.29
105.22 ± 6.98
111.31 ± 10.02
113.17 ± 8.04
60
100.91 ± 12.29
107.87 ± 9.43
112.17 ± 7.92
144.76 ± 17.19*
14
100.77 ± 10.19
103.73 ± 9.74
110.90 ± 7.65
112.05 ± 9.19
28
100.98 ± 13.01
116.32 ± 32.03
128.03 ± 31.69
136.48 ± 32.5
60
100.63 ± 9.73
112.46 ± 17.50
118.54 ±17.54
141.80 ± 20.73*
14
100.63 ± 9.38
105.99 ± 5.59
110.53 ± 8.58
116.68 ± 9.05
28
100.35 ± 12.35
110.56 ± 23.99
115.05 ± 23.67
149.15 ± 21.67*
60
100.83 ± 7.16
108.82 ± 8.07
133.83 ±11.64*
145.07 ± 17.47*
Expoziční doba (dny)
Kontrola
14
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0,01.
Dlouhodobá expozice simazinu neměla vliv na lipidní peroxidaci stanovenou pomocí TBARS testu v tkáních kapra obecného. Antioxidační biomarkery Z antioxidačních biomarkerů byly zjištěny statisticky významné změny (p < 0,01) v aktivitě SOD ve svalové tkáni v koncentracích 2 a 4 mg/l po celou dobu experimentu. Po 14 a 28 dnech expozice byla v těchto koncentracích zvýšená aktivita SOD, 60 den byla snížena oproti kontrolní skupině, viz. Tab. 2. Tab. 2. Aktivita superoxid dismutázy (SOD,U/mg protein) ve svalové tkáni kapra obecného po expozici simazinem Tkáň
Sval
Testovaná skupina
Expoziční doba (dny)
Kontrola
14
33.25 ± 12.27
Simazin 0,06 µg/l 35.02 ± 5.89
Simazin 2 mg/l 43.70 ± 7.98*
Simazin 4 mg/l 49.30 ± 9.08*
28
36.99 ± 10.69
40.76 ± 8.07
60.91 ± 8.30*
71.85 ± 8.81*
60
32.54 ± 6.10
33.92 ± 5.71
20.99 ± 6.17*
16.94 ± 4.77*
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0,01.
V tkáních mozku, svalu a jater byly zjištěné statistický významné změny v aktivitě CAT ve všech testovaných koncentracích. U ryb vystavených koncentraci 0,06 µg/l došlo ke zvýšení aktivity CAT po 60 dnech expozice simazinu v tkáni svalu. V koncentraci 2 mg/l byla zjištěná zvýšená aktivita CAT v tkáni mozku po 60 dnech experimentu, v tkáni svalu po 28 dnech a v jaterní tkáni po 14 a 28 dnech. U ryb vystavených této koncentraci bylo zjištěno snížení aktivity CAT po 60 dnech ve svalové a jaterní tkáni. Zvýšená aktivita CAT byla
zjištěná u ryb vystavených nejvyšší koncentraci (4 mg/l) v tkáni mozku, svalu a jater po 14 a 28 dnech expozice této koncentraci. Po 60 dnech bylo v této koncentraci zjištěné staticky významné (p < 0,01) snížení aktivity CAT v těchto tkáních v porovnání s kontrolní skupinou. Statisticky průkazná data jsou uvedená v Tab. 3. Tab. 3. Aktivita katalázy (CAT, U/mg protein) v tkáních kapra obecného po expozici simazinem Tkáň
Mozek
Sval
Játra
Testovaná skupina
Expoziční doba (dny)
Kontrola
14
2.48 ± 0.99
Simazin 0,06 µg/l 2.90 ± 1.20
Simazin 2 mg/l 2.27 ± 0.59
Simazin 4 mg/l 7.04 ± 1.55*
28
2.75 ± 0.93
2.88 ± 0.85
3.91 ± 1.08
12.60 ± 3.77*
60
4.67 ± 1.87
5.19 ± 1.452
14.24 ± 3.01*
0.85 ± 0.62*
14
6.37 ± 2.96
6.51 ± 2.07
10.29 ± 2.41
13.05 ± 2.67*
28
10.35 ± 2.48
14.61 ± 3.58
17.91 ± 4.39*
22.77 ± 4.22*
60
12.87 ± 2.71
30.48 ± 5.67*
7.61 ± 3.94*
4.69 ± 2.14*
14
37.87 ± 6.60
39.30 ± 5.61
49.77 ± 8.96*
54.18 ± 9.65*
28
37.44 ± 8.55
40.60 ± 5.65
56.77 ± 8.13*
60.72 ± 7.71*
60
39.69 ± 6.33
38.10 ± 6.49
22.88 ± 4.16*
19.06 ±5.29*
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0,01.
Enzymatická aktivita GPx po dlouhodobém působení simazinu v játrech kapra obecného byla snížená v jaterní tkáni po 28 a 60 dnech expozice u ryb vstavených 2 a 4 mg/l simazinu ve srovnání s kontrolní skupinou. U nejvyšší koncentrace simazinu byla zjištěná snížená aktivita GPx i po 14 dnech expozice, viz. Tab. 4. Tab. 4. Aktivita glutathion peroxidázy(GPx, mU/mg protein) v játrech kapra obecného po expozici simazinem Tkáň
Játra
Testovaná skupina
Expoziční doba (dny)
Kontrola
14
44.36 ± 8.27
Simazin 0,06 µg/l 41.39 ± 9.81
Simazin 2 mg/l 38.82 ± 10.76
Simazin 4 mg/l 25.788 ± 8.578*
28
47.64 ± 8.08
42.98 ± 4.07
34.45 ± 6.43*
22.92 ± 4.97*
60
47.86 ± 8.18
44.49 ± 4.71
33.29 ± 6.69*
28.83 ± 6.38*
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0,01.
Statisticky významné (p < 0,01) změny koncentrace GSH byly nalezeny v tkáni mozku a jater ve všech testovaných koncentracích v porovnání s kontrolní skupinou. V koncentraci 0.06 µg/l byla zjištěná signifikantně zvýšená hladina GSH v jaterní tkáni odebrané 28. a 60. den expozice. V koncentraci 2 mg/l bylo GSH zvýšeno v jaterní tkáni po celou dobu experimentu, v tkáni mozku po 60 dnech experimentu. U ryb vystavených koncentraci 4 mg/l byla zjištěná zvýšená hladina GSH v tkáni mozku po celou dobu experimentu a jaterní tkáni
po 14 a 28 dnech, 60 den expozice bylo zjištěno snížení koncentrace GSH ve srovnání s kontrolní skupinou. Statisticky významná data jsou uvedená v Tab.5. Tab. 5. Hladina redukovaného glutathionu (GSH, µg/mg protein) v tkáních kapra obecného po expozici simazinem Expoziční doba (dny)
Tkáň
Mozek
Játra
Testovaná skupina
14
23.06 ± 6.53
Simazin 0,06 µg/l 22.31 ± 10.96
28
24.21 ± 8.13
22.53 ± 7.86
25.25 ± 10.15
42.16 ± 12.92*
60
23.60 ± 7.15
25.73 ± 4.89
34.67 ± 4.88*
50.23 ± 12.76*
14
38.46 ± 11.51
40.30 ± 7.43
51.19 ± 6.11*
54.94 ± 9.27*
28
34.67 ± 7.77
45.26 ± 9.11*
49.11 ± 10.50*
64.97 ± 7.20*
60
34.58 ± 3.73
49.71 ± 8.04*
45.65 ± 10.62*
19.71 ± 9.16*
Kontrola
Simazin 2 mg/l 21.69 ± 5.04
Simazin 4 mg/l 32.05 ± 6.14*
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0,01.
Dlouhodobá expozice ryb simazinu neprokázala statisticky významné změny v aktivitě GR v tkáních kaprů.
3. Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce: Tato práce byla zaměřena na hodnocení biomarkerů oxidativního stresu a antioxidačních biomarkerů v tkáních kapra obecného po chronické expozici simazinu. Bylo zjištěno, že výší koncentrace simazinu (2 a 4 mg/l) po dlouhodobém působení vedou k oxidativnímu poškození (ROS) buněk v tkáních (mozku, svalu a jater) a následně narušují rovnováhu a stabilitu antioxidačních systémů (SOD, CAT, GPx a GSH) v těchto tkáních. Lze tedy říci, že dlouhodobé působení simazinu ovlivňuje rovnováhu mezi oxidačním stresem a antioxidanty. Tyto výsledky byly přijaty ve vědeckém časopise Environmental Toxicology and Pharmacology - "Effect of chronic exposure to simazine on oxidative stress and antioxidant response in common carp (Cyprinus carpio L.)" a časopise Bulletin VÚRH Vodňany – „Vliv chronické expozice simazinu na biomarkery oxidačního stresu a antioxidační biomarkery jaterní tkáně kapra obecného (Cyprinus carpio L.)“. Výsledky byly prezentovány na konferencích – EAFP 2011 Split, Chorvatsko – „Effect of chronic exposure to simazine on oxidative stress and antioxidant response in common carp (Cyprinus carpio L.)“ a na XV. národní toxikologické konferenci Toxicita a biodegradabilita odpadů a látek významných ve vodním prostředí, SRŠ a VOŠ Vodňany – „Vliv simazinu na jaterní tkáň kapra obecného (Cyprinus carpio L.)“.
Měření těchto biomarkerů poskytuje užitečné informace pro hodnocení toxických účinků herbicidu simazinu na ryby. Mechanismy působení herbicidů na bázi triazinů na tyto fyziologické reakce ryb nejsou stále doposud jasné a je potřeba dále je studovat. Výsledky jsou zároveň součástí disertační práce zabývající se vlivem pesticidů na bázi triazinů na ryby.
4. Stav čerpání finančních prostředků: Z požadovaných finančních prostředků bylo vyčerpáno 49 294,98 Kč (včetně DPH). Za tyto finanční prostředky byl pořízen především spotřební materiál (chemikálie, drobný laboratorní materiál) a drobný hmotný a nehmotný majetek. Byla obdržena odborná literatura v hodnotě 1 261,32 Kč včetně DPH.
Rozpis
Poskytnuté prostředky v Kč
Náklady na pořízení drobného hmotného a nehmotného majetku
50 000 Kč
49 294,98 Kč
Náklady na publikace
2 000 Kč
1 261,32 Kč
52 000 KČ
50 556,30 KČ
Celkem
Skutečně čerpáno v Kč
Drobný hmotný = 5 041,85 Kč (pipeta EPPENDORF Research plus 2). Spotřební materiál celkem = 44 253,13 Kč (- Nákup chemikálií (stanovení biomarkerů oxidačního stresu, antioxidačních parametrů = 15 633,71 Kč; standard pesticidního preparátu = 18 604,80 Kč) = 34 238,51 Kč. - Drobný laboratorní materiál (ependorfky, špičky, mikrodestičky, kyvety) = 10 014,62 Kč. )
Celkem = 49 294,98 Kč
