Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra organické a jaderné chemie
Charles University in Prague, Faculty of Science Department of Organic and Nuclear Chemistry Doktorský studijní program: Organická chemie Ph.D. study program: Organic Chemistry
Autoreferát dizertační práce Summary of the Ph.D. Thesis
Příprava nových typů acyklických nukleosidfosfonátů pro studium jejich interakce s enzymy metabolismu nukleových kyselin Preparation of novel types of acyclic nucleoside phosphonates for study of their interaction with enzymes of metabolism of nucleic acids Ing. Martin Maxmilian Kaiser Školitel/Supervisor: Ing. Zlatko Janeba, CSc. Praha 2014
Abstrakt Tato dizertační práce vznikla jako součást podrobného výzkumu v oblasti acyklických nukleosidfosfonátů ve skupině Chemie nukleových kyselin (prof. A. Holý) a později ve skupině Cílených analogů komponent nukleových kyselin (Dr. Z. Janeba) na Ústavu organické chemie a biochemie, Akademie věd České republiky. Byla vyvinuta metodika přípravy
tří
nových
typů
karboxyfosfonoethoxymethyl
acyklických (CPME),
nukleosidfosfonátů
dále
pak
(ANF),
v prvé
karboxyfosfonoethoxyethyl
řadě
(CPEE)
a hydroxyfosfonoethoxypropyl (HPEP) derivátů s cílem studovat jejich biologické vlastnosti. CPME deriváty byly navrženy na základě strukturní podobnosti s PMEA (9-[2(fosfonomethoxy)ethyl]adenin,
Adefovir)
a
(S)-HPMPA
[(S)-9-(3-hydroxy-2-(fosfono-
methoxy)propyl)adenine], tedy látkami s mimořádně vysokým protivirovým účinkem. Klíčovým krokem v jejich syntéze byla oxidace primární hydroxylové skupiny prekurzorů v řadě HPMP pomocí systému TEMPO/chloritan sodný/chlornan sodný. Jako velmi slibný analog s potenciální protivirovou (HIV) aktivitou se na základě počítačového modelování jevila sloučenina (S)-CPMEA [(S)-3-(adenin-9-yl)-2-(fosfonomethoxy)propanová kyselina)], 2‘-karboxy analog PMEA. I když se nakonec tato polární látka ukázala jako biologicky neaktivní, její dvě proléčiva vykazovala aktivitu proti viru hepatitidy C v submikromolárním měřítku.
Připravená
proléčiva
(S)-CPMEA
vykazovala
rovněž
slabou
inhibici
adenylátcyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis. Další strategie syntézy CPME, CPEE a HPEP derivátů byla založena na tzv. synthonovém přístupu. V tomto případě bylo nutné připravit z výchozího tritylglycidolu meziprodukt obsahující fosfonátovou a hydroxymethyl/karboxylovou funkci a připojit jej následně pomocí Mitsunobuovy reakce k příslušné nukleobázi. Tento přístup byl využit zejména při syntéze ANF
obsahujících
6-oxopurinové
báze,
cílených
jako
inhibitory
plasmodiových
fosforibosyltransferáz. Byla připravena a otestována série hypoxanthinových a guaninových derivátů, z nichž CPME byly zcela neaktivní, nicméně CPEE a HPEP deriváty vykazovaly účinnou inhibici lidského a plasmodiových enzymů. Výsledky tohoto studia ovšem naznačují, že pro vylepšení aktivity a/nebo selektivity mezi lidským a parazitickým enzymem bude zapotřebí dále modifikovat fosfonátový řetězec. Dále byly připraveny HPEP monomery nesoucí adenin, thymin, cytosin a guanin pro syntézu modelových oligonukleotidů (nonamerů) sloužících ke studiu teplotní stability duplexů. Tato problematika je v současnosti předmětem dalšího studia.
Abstract This Ph.D. thesis is a part of detailed SAR studies among acyclic nucleoside phosphonates carried out in the group of the Nucleic acid chemistry (Prof. A. Holý) and later in the group of the Targeted analogues of nucleic acid components (Dr. Z. Janeba) at the IOCB AS CR, v.v.i. Three novel series of acyclic nucleoside phosphonates, namely carboxyphosphonomethoxyethyl (CPME), carboxyphosphonoethoxyethyl (CPEE) and hydroxyphosphonoethoxy propyl (HPEP) derivatives were prepared in order to reveal their biological properties. The CPME compounds were designed as structural analogues of PMEA (9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenine, Adefovir) and (S)-HPMPA [(S)-(3-hydroxy-2-(phosphonomethoxypropyl)adenine], well-known compounds with prominent antiviral effect. The key step in their synthesis was oxidation of primary hydroxyl group in HPMP precursors using TEMPO/sodium chlorite/sodium hypochlorite system. The initial docking studies indicated that (S)-CPMEA [(S)-3-(adenin-9-yl)-2-(phosphonomethoxy)propanoic acid)], 2‘-carboxy analogue of PMEA, could be a candidate with promising anti-HIV activity. Although this compound did not show desired biological activity, its two prodrugs exhibited submicromolar anti-HCV activity. Prepared prodrugs of (S)-CPMEA were also shown to be weak inhibitors of adenylate cyclase toxin of bacteria Bordetella pertussis. Another strategy of synthesis of CPME, CPEE and HPEP derivatives was based on the synthon approach. Starting from tritylglycidol, it was necessary to prepare convenient intermediates containing phosphonate and hydroxymethyl/carboxylic moieties and attach them subsequently to the corresponding nucleobase via Mitsunobu reaction. This approach was used particularly for the synthesis of 6-oxopurine ANPs designed as inhibitors of plasmodial phosphoribosyltransferases. Series of hypoxanthine and guanine based compounds were prepared and tested. While CPME derivatives revealed no activity, CPEE and HPEP derivatives exhibited potent inhibitory effects on both human and plasmodial enzymes. However, the final results suggested that further modifications of the phosphonate linker may be necessary to achieve higher activity and/or better selectivity between the human and parasitic enzymes. Furthermore, a novel series of HPEP monomers bearing adenine, cytosine, guanine and thymine was prepared for the subsequent synthesis of model oligonucleotides (nonamers). The nonamers were used for the study of thermal stability of their duplexes. This topic is currently subject of further study.
1 1. Úvod ............................................................................................................................... 2 2. Cíle práce ....................................................................................................................... 3 3. Materiál a metodika........................................................................................................ 4 4. Výsledky a diskuse ......................................................................................................... 4 4.1. Nové typy ANF odvozené od 2-(fosfonomethoxy)propanové kyseliny ................. 4 4.2. Proléčiva (S)-CPMEA ............................................................................................. 6 4.3. ANF s prodlouženým acyklickým řetězcem (CPEE a HPEP) jako inhibitory plasmodiových fosforibosyltransferáz ........................................................................... 8 4.3.1. Syntéza (S)-HPEP derivátů obsahující 6-oxopurinové báze ............................ 8 4.3.2. Syntéza (S)-CPEE derivátů obsahující 6-oxopurinové báze .......................... 10 4.3.3. Biologické aktivity ......................................................................................... 11 4.4. Potenciální inhibitory adenylátcyklázy ................................................................. 13 4.5. Příprava modifikovaných oligonukleotidů obsahujících HPEP jednotky............. 14 5. Závěr ............................................................................................................................ 15 6. Použitá literatura .......................................................................................................... 16 1. Introduction .................................................................................................................. 18 2. Aims of the study ......................................................................................................... 19 3. Material and methods ................................................................................................... 20 4. Results and discussion ................................................................................................. 20 4.1. Novel types of ANPs derived from 2-(phosphonomethoxy)propanoic acid......... 20 4.2. Prodrugs of (S)-CPMEA ....................................................................................... 22 4.3. ANPs with elongated CPEE and HPEP acyclic chain as inhibitors of the plasmodial HG(X)PRTs ............................................................................................... 24 4.3.1. Synthesis of (S)-HPEP derivatives bearing 6-oxopurine bases...................... 24 4.3.2. Synthesis of (S)-CPEE derivatives bearing 6-oxopurine bases...................... 26 4.3.3. Biological results ............................................................................................ 27 4.4. Potential inhibitors of Adenylate cyclase .............................................................. 29 4.5. Prepararation of oligonucleotides modified with HPEP units .............................. 30 5. Conclusion ................................................................................................................... 31 6. References .................................................................................................................... 32 Curriculum Vitae.............................................................................................................. 34 Seznam publikací/List of publications: ............................................................................ 35 Conferences: ..................................................................................................................... 35
2
1. Úvod Nukleotidy obsahující purinové a pyrimidinové báze jsou základními stavebními kameny nukleových kyselin. Tyto složky nukleových kyselin hrají významnou roli nejen při replikaci dědičné informace, ale podílejí se i na řadě regulačních a řídících procesů v živých systémech. Jejich chemickou modifikací se pak získávají tzv. analoga složek nukleových kyselin, která mohou ovlivňovat základní životní procesy v buňce či životní cyklus buněčných parazitů. Tohoto faktu je hojně využíváno při návrzích nových antibiotik, antivirotik, cytostatik a antiprotozoálních preparátů. Acyklické nukleosidfosfonáty (ANF) tvoří významnou skupinu protivirových látek.1 Vykazují rovněž výraznou cytostatickou,2 antiparazitickou3 a immunomodulační aktivitu.4 Mezi hlavní výhody ANF patří jejich stálost vůči působení enzymů in vivo, a schopnost obejít první fosforylační krok nezbytný pro aktivaci bioaktivních nukleosidů.5 Pro užití v klinické praxi byly dosud schváleny tři ANF: HPMPC (cidofovir, Vistide®) pro léčbu CMV retinitidy u pacientů s AIDS,5,6 PMEA (ve formě svého proléčiva - adefovir dipivoxil, Hepsera®) pro léčbu HBV,5 a PMPA (ve formě svého proléčiva - tenofovir disoproxil fumarate, Viread®) pro léčbu HIV a HBV.5 Předložená dizertační práce popisuje přípravu nových typů acyklických nukleosidfosfonátů, které se strukturně podobají výše zmíněným biologicky aktivním látkám. První část dizertační práce se zabývá syntézou látek odvozených od 2-(fosfonomethoxy)propanové kyseliny [(S)-CPME deriváty], zejména pak adeninového derivátu (S)-2‘-karboxyPMEA [(S)-CPMEA], který se jevil jako slibný kandidát s možnou biologickou aktivitou. Druhá část dizertační práce popisuje syntézu strukturně rozmanitých proléčiv odvozených od (S)-CPMEA. Tyto látky byly navrženy za účelem modifikace polární fosfonátové a/nebo karboxylové skupiny různými lipofilními skupinami. Třetí část dizertační práce je zaměřena na přípravu ANF obsahujících 6-oxopurinové báze a prodloužený fosfonátový řetězec [karboxyfosfonoethoxyethyl (CPEE) a hydroxyfosfonoethoxypropyl (HPEP) deriváty] jako cílených inhibitorů plasmodiových fosforibosyltranferáz. Čtvrtá část dizertační práce se zabývá syntézou monomerů obsahujících (S)-HPEP jednotky sloužících pro přípravu modifikovaných oligonukleotidů.
3
2. Cíle práce
Vypracování efektivní syntézy nových typů ANF odvozených od 2-(fosfonomethoxy)propanové kyseliny a testování jejich biologických vlastností.
Vyvinutí nové syntetické cesty pro přípravu proléčiv odvozených od (S)-3(adenin-9-yl)-2-(fosfonomethoxy)propanové kyseliny [(S)-CPMEA] a testování protivirové aktivity těchto sloučenin.
Syntéza nových typů ANF obsahujících 6-oxopurinové báze a prodloužený fosfonátový řetězec [karboxyfosfonoethoxyethyl (CPEE) a hydroxyfosfonoethoxypropyl (HPEP) deriváty] jako cílených inhibitorů plasmodiových fosforibosyltranferáz.
Optimalizace syntézy monomerů obsahujících jednotky HPEP pro přípravu modelových oligonukleotidů – nonamerů sloužících pro měření teplotních charakteristik komplexů (duplexů) – a pro jejich možné využití v oblasti antisense oligonukleotidů a/nebo siRNA.
Poznámka: Číslování sloučenin bylo zachováno v souladu s dizertační prací.
4
3. Materiál a metodika Všechny sloučeniny byly připraveny standardními metodami organické syntézy. Řada reakcí musela být optimalizována, aby bylo možné dosáhnout uspokojivých výtěžků daných produktů. Tyto sloučeniny byly plně charakterizovány pomocí
1
H a
13
C NMR, MS
spektroskopie, IR spektroskopie a optické rotace (v případě chirálních molekul). Všechna činidla a rozpouštědla byla získána od komerčních dodavatelů a byla použita bez dalšího čištění.
4. Výsledky a diskuse 4.1. Nové typy ANF odvozené od 2-(fosfonomethoxy)propanové kyseliny Prvním cílem této dizertační práce byla příprava nového analogu acycklických nukleosidů, (S)-CPMEA 83a [(S)-3-(adenin-9-yl)-2-(fosfonomethoxy)propanová kyselina, obr. 1]. Tato sloučenina může být považována za přímou strukturní obměnu (R)-PMPA nebo (S)-HPMPA s oxidovanou 2‘-methylovou nebo 2‘-hydroxymethylovou skupinou. Na molekulu (S)CPMEA může být nahlíženo také jako na O-fosfonomethyl derivát (S)-AHPA. (S)-CPMEA byla navržena jako sloučenina s potenciální anti-HIV aktivitou.
Obrázek 1. Struktura (S)-CPMEA. Pro syntézu cílové molekuly 83a byla využita přímá oxidace vhodně ochráněného (S)HPMPA s následným odstraněním chránících skupin. Po provedení řady optimalizačních reakcí se pro tento typ oxidace ukázal být jako nejlepším systémem TEMPO/NaClO2/NaClO. Dané podmínky umožňovaly čisté provedení reakce a snadnou izolaci produktu pomocí flash chromatografie na silikagelu a následnou krystalizací. Tento efektivní postup poskytl sloučeninu 85a ve vysokém výtěžku. Pro odchránění esterů příslušných fosfonátů 85 bylo
5 využito dvou metod: a) reakce s TMSBr v acetonitrilu a následnou hydrolýzou; b) hydrolýza ve zředěném vodném roztoku HCl provedenou v mikrovlnném reaktoru. Následně byla připravena z odpovídajících HPMP derivátů 84 série CPME derivátů 85 nesoucí další nukleobáze (C, T, U) ve velmi dobrých výtěžcích. Pro tuto syntézu bylo využito optimalizované metodiky užívající TEMPO jako katalyzátoru (schéma 1).
Schéma 1. Syntéza CPME derivátů 83. Reakční podmínky: i) TEMPO, NaClO2, NaClO, MeCN, fosfátový pufr, r.t., 24 h; ii) TMSBr, MeCN, r.t., přes noc; iii) 0.5 M HCl (aq), mikrovlnné záření, 140 °C, 30 min. Proces oxidace toleruje funkční skupiny přítomné na běžných nukleobázích (A, C, T, U) s výjimkou látek obsahujících aminoskupinu v poloze C-2 na purinovém skeletu (DAP, G). Sloučeniny 84i a 84j musely být oxidovány ve formě svých N-benzoyl derivátů (schémata 2 a 3).
Schéma 2. Reakční podmínky: 1. TMSCl, pyridin, r.t., 2. BzCl, 3. H2O, 4. NH3 (aq); ii) TEMPO, NaClO2, NaClO, MeCN, fosfátový pufr, r.t. 24 h; iii) MeONa, MeOH, r.t., 24 h; iv) TMSBr, MeCN, r.t., přes noc; v) 0.5 M HCl (aq), mikrovlnné záření, 140 °C, 30 min.
6
Schéma 3. Reakční podmínky: i) 1. TMSCl, pyridin, 2. BzCl, 3. H2O, 4. NH3 (aq); ii) TEMPO, NaClO2, NaClO, MeCN, fosfátový pufr, r.t., 24 h; iii) MeONa, MeOH, r.t., 24 h; iv) 0.5 M HCl (aq), mikrovlnné záření, 140 °C, 30 min. U všech CPME sloučenin 83 byla testována jejich protivirová aktivita. Navzdory našemu očekávání, žádná z připravených látek, včetně (S)-CPMEA 83a, nevykazovala aktivitu jak proti viru HIV tak ostatním testovaným virům (HSV-1 (KOS), HSV-1 (KOS TK-), HSV-2 (G), RSV, Vaccinia virus, Vesicular stomatitis virus, Parainfluenza-3 virus, Reovirus-1, Sindbis virus, Coxsackie B4 virus, Punta Toro virus, Feline Corona virus, and Feline Herpes virus).
4.2. Proléčiva (S)-CPMEA Ve srovnání s jinými druhy ANF, (S)-CPMEA vykazuje mnohem polárnější charakter díky přítomnosti volné fosfonové kyseliny a karboxylové skupiny v molekule. Z tohoto důvodu mohou být očekávány nežádoucí farmakologické vlastnosti. Za účelem lepší biodostupnosti bylo rozhodnuto převést (S)-CPMEA na několik strukturně rozdílných proléčiv, která byla navržena za účelem modifikace fosfonátové a/nebo karboxylové skupiny v molekule.7 První skupina látek obsahovala proléčiva obsahující modifikovanou pouze kaboxylovou funkci (sloučeniny 95-97, schéma 4). Druhá skupina zahrnovala různé druhy lipofilních proléčiv obsahující modifikovanou jak fosfonátovou tak karboxylovou skupinu (sloučeniny 98-102, schéma 4).
7
Schéma 4. Reakční podmínky: i) 1. LiOH.H2O/MeOH, 2. MeI/DMF, r.t., 1 h; ii) TMSBr, MeCN, r.t., přes noc; iii) 3.5 M NH3 v EtOH, 120 °C, 1 h, mikrovlnné záření; iv) EDAC, N-hydroxysukcinimid, cyklopropylamin, DMF, r.t., 2 dny; v) 1. TMSBr, MeCN, r.t., přes noc, 2. L-alanin ethylester hydrochlorid, Et3N, pyridin, 50 °C, 15 min, 3. Aldrithiol-2, PPh3, pyridin, 50 °C, 5 h; vi) 1. TMSBr, MeCN, r.t., přes noc, 2. 3-(hexadecyloxy)propan-1-ol, DCC, pyridin, 60 °C, 30 h; vii) 1. TMSBr, MeCN, r.t., přes noc, 2. L-phenylalanin ethylester
8 hydrochlorid, Et3N, pyridine, 60 °C, 7 min, 3. Aldrithiol-2, PPh3, pyridin, 70 °C, 3 dny; viii) 1. TMSBr, MeCN, r.t., přes noc, 2. L-phenylalanin ethylester hydrochlorid, fenol, Et3N, pyridin, 60 °C, 7 min, 3. Aldrithiol-2, PPh3, pyridin, 65 °C, 5 h. U nově připravených proléčiv byla rovněž testována jejich protivirová aktivita. Ve srovnání se svou mateřskou molekulou, (S)-CPMEA 83a, proléčiva 101a 102 (schéma 4) vykazovala submikromolární aktivitu proti viru Hepatitidy C (Tabulka 1). Jedná se o první známé příklady ANF, které vykazují aktivitu proti HCV. Žádné z proléčiv nevykazovalo aktivitu proti viru HIV-1. Všechna proléčiva byla také testována na schopnost inhibice adenylácyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis (CyaA), ale dané látky se ukázaly být pouze slabými inhibitory tohoto enzymu. Nejlepším inhibitorem CyaA byl bis-amidát 101, který byl schopen snížit tvorbu cAMP na 68% v porovnání s plnou (100%) aktivitou CyaA. Tabulka 1. Anti-HCV a cytotoxické vlastnosti (S)-CPMEA a jejích proléčiv. Sloučenina
HCV Replicon EC50 1A RLUC-384 (μM)
HCV Rep CC50 1ACalcein-384 (μM)
HCV Replicon EC50 1B RLUC-384 (μM)
HCV Rep CC50 1B-Calcein-384 (μM)
HCV Replicon EC50 2A RLUC-384 (μM)
HCV Rep CC50 2ACalcein-384 (μM)
83a 98 99 100 101 102
>44.4 >44.4 20.6 >44.4 0.6 0.8
>44.4 >44.4 >44.4 >44.4 18.3 42.6
>44.4 >44.4 30.9 >44.4 1.1 1.5
>44.4 >44.4 >44.4 >44.4 30.4 >44.4
>44.4 >44.4 9.6 39.2 0.6 0.6
>44.4 >44.4 >44.4 >44.4 12.6 25.3
4.3. ANF s prodlouženým acyklickým řetězcem (CPEE a HPEP) jako inhibitory plasmodiových fosforibosyltransferáz Dalším projektem, na kterém jsem se podílel v rámci své dizertační práce, byla syntéza nových ANF s potenciální antimalarickou aktivitou. 4.3.1. Syntéza (S)-HPEP derivátů obsahující 6-oxopurinové báze Pro syntézu (S)-HPEP derivátů byl využit tzv. synthonový přístup vycházející z (R)tritylglycidolu. Dále byla použita v literatuře popsaná metodika pro provedení oxaMichaelovy adice diethyl vinylfosfonátu (DEVP) na sekundární alkoholy. Produkt 116 byl získán reakcí sloučeniny 115 (schéma 5) s DEVP za přítomnosti katalytického množství KOH.8 Tato látka byla použita pro další reakční krok ve formě surového meziproduktu.
9 Zahříváním sloučeniny 116 v 80% kyselině octové k refluxu byla odstraněna chránící tritylová skupina za vzniku alkoholu 117 ve vysokém výtěžku (schéma 5).
Schéma 5. Reakční podmínky: i) BnOH, NaH, DMF, 100 °C, 2 h; ii) KOH, CH2=CHP(O)(OEt)2, dioxan, r.t., 70 h; iii) 80% AcOH, reflux, 2 h. Mitsunobuovou reakcí alkoholu 117 s 6-chloropurinem nebo 2-amino-6-chloropurinem byly získány příslušné diestery fosfonátů 118 a 119 v dobrých výtěžcích (80% a 55%). Sloučeniny 118 a 119 reagovaly s DABCO v přítomnosti uhličitanu draselného za vzniku produktů 120 a 121. Po odstranění benzylových chránících skupin byly získány sloučeniny 122 a 123, které byly převedeny na odpovídající volné fosfonové kyseliny 124 a 125. Dále byla provedena reakce guaninového derivátu 125 s iso-pentylnitritem v 80% kyselině octové za vzniku odpovídajícího xanthinového analogu 126.
Schéma 6. Reakční podmínky: i) Mitsunobuova reakce: 1. 6-chloropurin nebo 2-amino-6chloropurin, sloučenina 117, PPh3, dioxan, 2. DIAD, r.t., 24 h; ii) DABCO, K2CO3, dioxan/H2O (4:1), 90 °C, 3 h; iii) H2/Pd/C, AcOH, r.t., 72 h; iv) TMSBr, MeCN, r.t., přes noc; v) iso-pentylnitrit, 80% AcOH, r.t., přes noc.
10 4.3.2. Syntéza (S)-CPEE derivátů obsahující 6-oxopurinové báze Syntéza (S)-CPEE derivátů zahrnuje výše zmíněný syntetický přístup. V prvním kroku došlo k otevření (S)-tritylglycidolu benzylalkoholem v bazickém prostředí za vzniku sloučeniny 104 (schéma 7). O-Alkylace derivátu 104 pomocí DEVP poskytla (po refluxu v 80% kyselině octové) alkohol 147, který byl následně oxidován za mírných podmínek9 (TEMPO/NaClO2/NaClO) na příslušnou karboxylovou kyselinu 148. Sloučenina 148 reagovala v dalším kroku s diazomethanem na příslušný methylester 149, který po odstranění benzylové chránící skupiny poskytl žádaný synthon 150 (schéma 7).
Schéma 7. Reakční podmínky: i) KOH, CH2=CHP(O)(OEt)2, dioxan, r.t., 70 h; ii) 80% AcOH, reflux, 2 h; iii) TEMPO, NaClO2, NaClO, fosfátový pufr, MeCN, 40 °C, 48 h; iv) CH2N2, EtOAc, r.t., 0.5 h; v) H2/Pd/C, MeOH, r.t., 72 h. Alkohol 150 následně reagoval za podmínek Mitsunobuovy reakce s 6-chloropurinem nebo 2-amino-6-chloropurinem za vzniku sloučenin 151 a 152 (schéma 8). Jejich reakcí za bazických (DABCO, K2CO3) nebo kyselých podmínek (75% vodný roztok kyseliny trifluoroctové) byly získány deriváty 153 a 154 nebo 157 a 158. Sloučeniny 151 a 152 podstupovaly za bazických podmínek přeměnu z 6-chloro na 6-oxo a zároveň docházelo k hydrolýze methylesteru na volnou karboxylovou skupinu. Kdežto v případě kyselých podmínek docházelo pouze k přeměně 6-chloro na 6-oxo a methylester zůstal zachován. Konečné produkty 155, 156 a 159, 160 byly připraveny štěpením odpovídajících esterů za standardních podmínek (TMSBr v acetonitrilu, schéma 8).
11
Schéma 8. Reakční podmínky: i) Mitsunobuova reakce: 1. 6-chloropurin nebo 2-amino-6chloropurin, sloučenina 150, PPh3, dioxan, 2. DIAD, r.t., 24 h; ii) DABCO, K2CO3, dioxan/H2O (4:1), 90 °C, 3-5 h; iii) TMSBr, MeCN, r.t., přes noc; iv) 75% vodný roztok CF3COOH, r.t., přes noc.
4.3.3. Biologické aktivity Některé z HPEP a CPEE derivátů vykazovaly inhibiční aktivitu na lidském HGPRT, PfHGXPRT a PvHGPRT s hodnotami Ki v rozsahu od 0.02 do 3.4 μM. HPEP a CPEE deriváty obsahující jako bázi hypoxanthin (sloučeniny 124 a 159) nevykazovaly aktivitu vůči PfHGXPRT, kdežto guaninové deriváty (sloučeniny 125, 156 a 160) vykazovaly aktivitu vůči všem třem testovaným enzymům. Navzdory našemu očekávání byly inhibitory selektivní pouze na lidskou HGPRT ve srovnání s plasmodiálními enzymy. Jeden z nejlepších dosud objevených inhibitorů lidské 6-oxopurin fosforibosyltransferázy je sloučenina 125 [(S)HPEPG], s hodnotou Ki 0.02 μM. Byly určeny krystalové struktury sloučenin 124 a 125 v komplexu s lidskou HGPRT, které ukazují na vazebná místa v enzymech (obr. 2).
12 Tabulka 2. Hodnoty Ki ANF obsahujících 6-oxopurinové báze pro lidskou HGPRT, PfHGPRT a PvHGPRT při pH 7.4.
a
COOH COOMe
CPEE
HPEP
Y
Sloučenina
Ki (µM) human
H
124
5.6 HGPRT
NH2
125
H NH2
PfHGXPRT a
PvHGPRT
NI
31
0.02
7.7
3.4
155
200
6
12
156
0.2
1.5
2.5
a
NI
32
2
0.7
H
159
0.9
NH2
160
0.1
NI = neinhibuje při dané koncentraci sloučeniny užité v tomto experimentu
Obrázek 2. Interakce sloučenin 124 a 125 s lidskou HGPRT (a, b). Lokalizace sloučenin 124 a 125 v aktivním místě lidské HGPRT (c, d).
13
4.4. Potenciální inhibitory adenylátcyklázy Adenylátcykláza (AC) je enzym katalyzující přeměnu ATP na cyklický adenosin-3‘,5‘monofosfát (cAMP) a pyrofosfát. Na základě předchozích studií bylo důležité objasnit, zdali substituce v poloze C-2‘ a/nebo prodloužení fosfonátového řetězce u acyklické části PMEA může zlepšit aktivitu vůči adenylátcyklázovému toxinu (ACT). Pro tuto strukturně-aktivitní studii byly použity všechny sloučeniny obsahující adenin, které byly připraveny v rámci této dizertační práce. Ve schématu 9 je zobrazena syntéza prodloužených PMEA derivátů s karboxylovou skupinou v poloze 2‘: (S)-CPEEA 174 a odpovídajícího amidu 176.
Schéma 9. Reakční podmínky: i) TEMPO, NaClO2, NaClO, fosfátový pufr/MeCN (1:1), r.t., 24 h; ii) TMSBr, MeCN, r.t., přes noc; iii) 3.5 M NH3 v EtOH, mikrovlnné záření, 120 °C, 1 h. Sloučeniny 174 a 176 byly testovány na inhibiční aktivitu vůči adenylátcyklázovému toxinu. Jak již bylo zmíněno výše, všechny připravené deriváty PMEA substituované v poloze 2‘ (včetně (S)-CPMEA a jejích proléčiv) se ukázaly být pouze slabými inhibitory tohoto enzymu.
14
4.5. Příprava modifikovaných oligonukleotidů obsahujících HPEP jednotky Monomery obsahující HPEP (hydroxyfosfonoethoxypropyl) jednotky byly připraveny vícekrokovou syntézou z odpovídajících HPEP derivátů. Mezi klíčové syntetické kroky patřila dimethoxytritylace hydroxylové skupiny v poloze 3‘, odchránění esterových skupin pomocí TMSBr a následná esterifikace volné fosfonové kyseliny 4-methoxy-1-oxido-2-pyridylmethanolem (MOP-OH) za přítomnosti 2-chloro-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxafosfinan-2-oxidu jako kondenzačního činidla. Pro inkorporaci fosfonátů nukleosidů a jednotek přirozených nukleotidů na pevné fázi byla použita fosfotriesterová a fosforamiditová metoda. Výstavba oligonukleotidů byla provedena od 5‘ ke 3‘ konci za použití komerčních reverzních nukleosid-fosforamiditů. Odstranění chránících skupin bylo provedeno pomocí thiofenolu a plynného amoniaku. Všechny připravené oligonukleotidy byly čištěny aniontově výměnnou chromatografií. Byly úspěšně připraveny série DNA a RNA nonamerů obsahující jednotky založené na ANF (obr. 3). Dále byly měřeny teplotní stability DNA-DNA, RNA-DNA a RNA-RNA duplexů. Zavedení acyklických jednotek v oligonukleotidech mělo za následek destabilizaci duplexů (došlo ke snížení bodů tání).
5'-r(GCA UAU CAC)-3' 5'–r(GTG ATA TGC)-3' 5'-d(GCA TAT CAC)-3' 5'–d(GTG ATA TGC)-3' Obrázek 3. Nonamery modifikované jednotkou HPEP.
15
5. Závěr Jedním z hlavních cílů této práce byla příprava (S)-CPMEA 83a [(S)-3-(adenin)-9-yl)-2(fosfonomethoxy)propanová kyselina, obr. 1]. Tato sloučenina byla navržena jako látka s potenciální anti-HIV aktivitou. Klíčovým krokem v syntéze (S)-CPMEA byla oxidace derivátu 84a pomocí systému TEMPO/NaClO2/NaClO za vzniku sloučeniny 85a. Následně byla připravena celá série CPME derivátů 85 ve velmi dobrých výtěžcích. Jako výchozích látek pro tuto syntézu bylo použito odpovídajících HPMP derivátů 84. Žádná z připravených (S)-CPME sloučenin, včetně (S)-CPMEA, nevykazovala protivirovou aktivitu. Nový syntetický přístup byl vyvinut rovněž pro přípravu proléčiv (S)-CPMEA. Záměrem bylo připravit několik strukturně rozdílných druhů proléčiv, která by obsahovala modifikovanou fosfonátovou a/nebo karboxylovou skupinu. U nově připravených proléčiv byla testována jejich protivirová aktivita. Sloučeniny 101 a 102 vykazovaly submikromolární anti-HCV aktivitu. Žádné z připravených proléčiv nevykazovalo aktivitu proti viru HIV-1. Některé z HPEP a CPEE derivátů vykazovaly inhibiční aktivitu na lidském HGPRT, PfHGXPRT a PvHGPRT s hodnotami Ki v rozsahu od 0.02 do 3.4 μM. HPEP a CPEE deriváty obsahující jako bázi hypoxanthin (sloučeniny 124 a 159) nevykazovaly aktivitu vůči PfHGXPRT, kdežto guaninové deriváty (sloučeniny 125, 156 a 160) ji vykazovaly vůči všem třem testovaným enzymům. Navzdory našemu očekávání byly inhibitory selektivní pouze na lidskou HGPRT ve srovnání s plasmodiálními enzymy. Jeden z nejlepších dosud objevených inhibitorů lidské 6-oxopurin fosforibosyltransferázy je sloučenina 125 [(S)HPEPG], s hodnotou Ki 0.02 μM. U všech připravených sloučenin obsahujících adenin [(S)-CPMEA 83a a její proléčiva, (S)HPEPA 129, (S)-CPEEA 174 a příslušný amid 176] byla testována inhibiční aktivita vůči adenylátcyklázovému toxinu bakterie Bordetella pertusis (CyaA). Nicméně všechny testované sloučeniny se ukázaly pouze jako slabé inhibitory tohoto enzymu. Nejlepším inhibitorem byl bis-amidát 101, který byl schopen snížit tvorbu cAMP na 68% v porovnání s plnou (100%) aktivitou CyaA. Dva acyklické nukleosidfosfonáty obsahující HPEP řetězec a nesoucí buď adenin nebo thymin jako nukleobázi byly synteticky převedeny na vhodně ochráněné stavební bloky. Tyto byly následně použity pro syntézu modifikovaných oligonukleotidů na pevné fázi. Zavedení acyklických jednotek v oligonukleotidech mělo za následek destabilizaci duplexů, která se projevovala poklesem bodů tání.
16
6. Použitá literatura
1.
a) De Clercq, E.; Holý, A.; Rosenberg, I.; Sakuma, T.; Balzarini, J.; Maudgal, P.C. A novel selective broad spectrum anti-DNA virus agent. Nature 1986, 323, 464467; b) De Clercq, E. The acyclic nucleoside phosphonates from inception to clinical use: Historical perspective. Antiviral Res. 2007, 75, 1-13.
2.
a) Holý, A.; Votruba, I.; Tloušťová, E.; Masojídková M. Synthesis and cytostatic activity of
N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl]
derivatives
of
N-6-substituted
adenines, 2,6-diaminopurines and related compounds. Collect. Czech. Chem. Commun. 2001, 66, 1545-1592; b) Zídek, Z.; Potměšil, P.; Holý, A. Cytostatic activity of antiviral acyclic nucleoside phosphonates in rodent lymphocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2003, 192, 246-253. 3.
a) Keough, D. T.; Hocková, D.; Holý, A.; Naesens, L. M. J.; Skinner-Adams, T. S.; de Jersey, J.; Guddat, L. W. Inhibition of Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase by Acyclic Nucleoside Phosphonates: A New Class of Antimalarial Therapeutics. J. Med. Chem. 2009, 52, 4391-4399. b) Hocková, D.; Holý, A.; Masojidkova, M.; Keough, D. T.; de Jersey, J.; Guddat, L. W. Synthesis of branched 9-[2-(2-phosphonoethoxy)ethyl]purines as a new class of acyclic nucleoside phosphonates which inhibit Plasmodium falciparum hypoxanthineguanine-xanthine phosphoribosyltransferase. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 6218.
4.
a) Zídek, Z.; Franková, D.; Holý, A. Macrophage activation by antiviral acyclic nucleoside phosphonates in dependence on priming immune stimuli. Int. J. Immunopharmacol. 2000, 22, 1121-1129; b) Zídek, Z.; Potměšil, P.; Kmoníčková, E.; Holý, A. Immunobiological activity of N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl] derivatives of N-6-substituted adenines, and 2,6-diaminopurines. Eur. J. Pharmacol. 2003, 475, 149-159.
5.
a) De Clercq, E. Acyclic nucleoside phosphonates in the chemotherapy of DNA virus and retrovirus infections. Intervirology 1997, 40, 295-303; b) De Clercq, E. Clinical potential of the acyclic nucleoside phosphonates cidofovir, adefovir, and tenofovir in treatment of DNA virus and retrovirus infections. Clin. Microbiol. Rev. 2003, 16, 569-596.
17 6.
De Clercq, E.; Holý, A. Efficacy of (S)-1-(3-hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl)cytosine in various models of Herpes-simplex virus-infection in mice. Antimicrob. Agents Chemother. 1991, 35, 701-706.
7.
Jansa, P.; Baszczyňski, O.; Dračínský, M.; Votruba, I.; Zídek, Z.; Bahador, G.; Stepan, G.; Cihlar, T.; Mackman, R.; Holý, A.; Janeba, Z. A novel and efficient one-pot synthesis of symmetrical diamide (bis-amidates) prodrugs of acyclic nucleoside phosphonates and evaluation of their biological activites. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 3748-3754.
8.
Cristau, H. J.; Virieux, D. Anomalous reactivity of diphenylhydroxymethylphosphine oxide in the synthesis of a phosphorylated ether by oxa-Michael reaction. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 703-706.
9.
Zhao, M. M.; Li, J.; Mano, E.; Song, Z. J.; Tschaen, D. M. Oxidation of primary alcohols to carboxylic acids with sodium chlorite catalyzed by TEMPO and bleach: 4-methoxyphenylacetic acid. Org. Synth. 2005, 81, 195-203.
18
1. Introduction Purine and pyrimidine nucleotides are basic keystones of nucleic acids. These essential nucleic acids components play an important role not only in replication of hereditary information but they participate in many important regulatory and leading processes in living systems. Their chemical modification leads to analogues of nucleic acid components that are able to influence basic life processes in cell or life cycle of cell parazites. This fact is often used for design of potential antibiotics, antivirotics, cytostatics and antiprotozoan agents. Acyclic nucleoside phosphonates (ANPs) constitute a distinguished class of antiviral agents.1 They also exhibit important cytostatic,2 antiparasitic3 and immunomodulatory activities.4 The main advantages of ANPs are their resistance towards degradation by enzymes in vivo, and the ability to by-pass the first phosphorylation step necessary for the activation of the bioactive nucleosides.5 Three ANPs have been approved worldwide for clinical use:5 HPMPC (cidofovir, Vistide®) for the treatment of CMV retinitis in AIDS patients,5,6 PMEA (as its oral prodrug adefovir dipivoxyl, Hepsera®) for the treatment of chronic HBV infections,5 and PMPA (as its oral prodrug tenofovir disoproxyl fumarate, Viread®) for treatment of HIV and chronic HBV infections.5 This thesis deals with the preparation of novel type of acyclic nucleoside phosphonates structurally related to above-mentioned biologically important compounds. The first part of the thesis depicts the synthesis of compounds derived from 2(phosphonomethoxy)propanoic acid [(S)-CPME derivatives], especially with the adenine derivative (S)-2’-carboxy-PMEA [(S)-CPMEA], being a promising candidate with potential biological properties. The second part of the thesis describes the transformation of (S)-CPMEA into several structurally different types of prodrugs, which had been designed to mask the phosphonate and/or carboxylic groups in the molecule. The third part of the thesis is focused on the preparation of ANPs containing 6-oxopurine bases and an elongated phosphonate linker [carboxyphosphonoethoxyethyl (CPEE) and hydroxyphosphonoethoxypropyl (HPEP) derivatives] as potential inhibitors of plasmodial phosphoribosyltransferases. And finally the fourth part of this thesis describes the synthesis of monomers containing (S)-HPEP units for the preparation of modified oligonucleotides.
19
2. Aims of the study
Development of an efficient synthesis of novel ANPs derived from 2-(phosphonomethoxy)propanoic acid and evaluation of their biological properties.
Development of a novel strategy for the synthesis of prodrugs of (S)-3-(adenin-9yl)-2-(phosphonomethoxy)propanoic acid [(S)-CPMEA] and evaluation of antiviral activity of these compounds.
Synthesis of novel ANPs containing 6-oxopurine bases and an elongated phosphonate linker [carboxyphosphonoethoxyethyl (CPEE) and hydroxyphosphonoethoxypropyl
(HPEP)
derivatives]
as
potential
inhibitors
of
plasmodial phosphoribosyltransferases.
Development of novel synthesis of HPEP monomers for preparation of model oligonucleotides – nonamers serving for the measurement of thermal characteristics of the complexes (duplexes) – and for their potential use in antisense oligonucleotides and/or in siRNA field.
Note: Numbering of compounds was preserved in accordance with Ph.D. thesis.
20
3. Material and methods All compounds were prepared by standard methods of organic synthesis, where many reactions had to be optimized to obtain reasonable yields of products. The compounds were fully characterized by 1H and
13
C NMR, MS spectroscopy, IR spectroscopy and optical
rotation assignment (in case of chiral molecules). Chemical reagents and solvents, purchased from commercial sources, were of analytical grade and were used without further purification.
4. Results and discussion 4.1. Novel types of ANPs derived from 2-(phosphonomethoxy)propanoic acid One of the first aims of the present work was to develop a synthesis of a novel acyclic nucleoside analogue, (S)-CPMEA 83a [(S)-3-(adenin-9-yl)-2-(phosphonomethoxy)propanoic acid, Fig. 1]. This compound can be considered to be a direct structural modification of (R)PMPA or (S)-HPMPA with oxidized 2’-methyl or 2’-hydroxymethyl functions, respectively. (S)-CPMEA can also be looked upon as an O-phosphonomethyl derivative of (S)-AHPA. (S)CPMEA has been designed as a compound with potential anti-HIV activity.
Figure 1. Structure of (S)-CPMEA. The direct oxidation of the properly protected (S)-HPMPA followed by the removal of the protecting groups was used for the synthesis of target analogue 83a. After an optimization study, the system TEMPO/NaClO2/NaClO turned out to be the best one for such oxidation. It offered a clean reaction and easy isolation of the product by flash chromatography on silica gel followed by crystallization. This efficient procedure gave compound 85a in very high purity. Finally, two methods were employed for the deprotection of phosphonate diesters 85:
21 a) treatment with TMSBr in acetonitrile followed by hydrolysis; b) microwave-assisted hydrolysis with HCl. Subsequently, a whole series of CPME derivatives 85 with other nucleobases (C, T, U) was prepared in high yields from the corresponding HPMP analogues 84 by the optimized oxidative methodology using TEMPO (Scheme 1).
Scheme 1. General synthesis of CPME analogues 83. Reaction conditions: i) TEMPO, NaClO2, NaClO, MeCN, phosphate buffer, r.t., ~24 h; ii) TMSBr, MeCN, r.t., overnight; iii) 0.5 M HCl (aq), microwave irradiation, 140 °C, 30 min.
The oxidation process tolerates the functional groups present on the common nucleobases (A, C, T, U), with exception of compounds containing the amino group in position C-2 of the purine ring (DAP, G). Compounds 84g and 84h had to be oxidized as their benzoyl derivatives 84i and 84j, respectively (Schemes 2 and 3).
Scheme 2. Reaction conditions: i) 1. TMSCl, pyridine, r.t., 2. BzCl, 3. H2O, 4. NH3 (aq); ii) TEMPO, NaClO2, NaClO, MeCN, phosphate buffer, r.t. 24 h; iii) MeONa, MeOH, r.t., 24 h; iv) TMSBr, MeCN, r.t., overnight; v) 0.5 M HCl (aq), microwave irradiation, 140 °C, 30 min.
22
Scheme 3. Reaction conditions: i) 1. TMSCl, pyridine, 2. BzCl, 3. H2O, 4. NH3 (aq); ii) TEMPO, NaClO2, NaClO, MeCN, phosphate buffer, r.t., 24 h; iii) MeONa, MeOH, r.t., 24 h; iv) 0.5 M HCl (aq), microwave irradiation, 140 °C, 30 min.
All CPME analogues 83 were tested for their antiviral properties. Although completely nontoxic in all assays, none of the compounds, including promising (S)-CPMEA 83a, exhibited any activity against the HIV virus or any other viruses tested (HSV-1 (KOS), HSV-1 (KOS TK-), HSV-2 (G), RSV, Vaccinia virus, Vesicular stomatitis virus, Parainfluenza-3 virus, Reovirus-1, Sindbis virus, Coxsackie B4 virus, Punta Toro virus, Feline Corona virus, and Feline Herpes virus).
4.2. Prodrugs of (S)-CPMEA Compared to other types of ANPs, (S)-CPMEA has even more polar character due to the presence of both free phosphonic acid function and free carboxylic group. Thus, unfavorable pharmacological properties can be expected. In order to improve bioavailability, it was decided to convert (S)-CPMEA into several structurally different types of prodrugs, which had been designed to mask the phosphonate and/or carboxylic groups in the molecule.7 The first class included prodrugs containing groups masking only the carboxylic moiety (compounds 95-97, scheme 4). The second class consisted of various lipophilic prodrugs masking both the phosphonate and carboxylic groups (compounds 98-102, scheme 4).
23
Scheme 4. Reaction conditions: i) 1. LiOH.H2O/MeOH, 2. MeI/DMF, r.t., 1 h; ii) TMSBr, MeCN, r.t., overnight; iii) 3.5 M NH3 in EtOH, 120 °C, 1 h, microwave irradiation; iv) EDAC, N-hydroxysuccinimide, cyclopropylamine, DMF, r.t., 2 days; v) 1. TMSBr, MeCN, r.t., overnight, 2. L-alanine ethylester hydrochloride, Et3N, pyridine, 50 °C, 15 min, 3. Aldrithiol-2, PPh3, pyridine, 50 °C, 5 h; vi) 1. TMSBr, MeCN, r.t., overnight, 2. 3(hexadecyloxy)propan-1-ol, DCC, pyridine, 60 °C, 30 h; vii) 1. TMSBr, MeCN, r.t.,
24 overnight, 2. L-phenylalanine ethylester hydrochloride, Et3N, pyridine, 60 °C, 7 min, 3. Aldrithiol-2, PPh3, pyridine, 70 °C, 3 days; viii) 1. TMSBr, MeCN, r.t., overnight, 2. Lphenylalanine ethylester hydrochloride, phenol, Et3N, pyridine, 60 °C, 7 min, 3. Aldrithiol-2, PPh3, pyridine, 65 °C, 5 h. The newly prepared prodrugs were evaluated for their antiviral properties. Compared to the parent molecule, (S)-CPMEA 83a, prodrugs 101 and 102 (Scheme 4) displayed submicromolar anti-HCV activity (Table 1). To the best of our knowledge, these are the first examples of ANP derivatives to exhibit potent activity against HCV. None of the prodrugs exhibited any interesting activity against the HIV-1 virus. All of the prodrugs were also tested for inhibitory activity of adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis (CyaA), but they were shown to be only weak inhibitors of this enzyme. The best CyaA inhibitor was compound 101, which decreased the formation of cAMP to 68% compared to the full (100%) activity of CyaA. Table 1. Anti-HCV and cytotoxic properties of (S)-CPMEA and its prodrugs. Compound
HCV Replicon EC50 1A RLUC-384 (μM)
HCV Rep CC50 1ACalcein-384 (μM)
HCV Replicon EC50 1B RLUC-384 (μM)
HCV Rep CC50 1B-Calcein-384 (μM)
HCV Replicon EC50 2A RLUC-384 (μM)
HCV Rep CC50 2ACalcein-384 (μM)
83a 98 99 100 101 102
>44.4 >44.4 20.6 >44.4 0.6 0.8
>44.4 >44.4 >44.4 >44.4 18.3 42.6
>44.4 >44.4 30.9 >44.4 1.1 1.5
>44.4 >44.4 >44.4 >44.4 30.4 >44.4
>44.4 >44.4 9.6 39.2 0.6 0.6
>44.4 >44.4 >44.4 >44.4 12.6 25.3
4.3. ANPs with elongated CPEE and HPEP acyclic chain as inhibitors of the plasmodial HG(X)PRTs The synthesis of novel ANPs with a potential antimalarial activity was another project on which I participated during my Ph.D. studies. 4.3.1. Synthesis of (S)-HPEP derivatives bearing 6-oxopurine bases The HPEP derivatives were obtained via the synthon approach starting from the (R)tritylglycidol. Previously developed methodology for oxa-Michael additions of secondary alcohols to diethyl vinylphosphonate (DEVP) was employed. Treatment of compound 115
25 (Scheme 5) with DEVP and catalytic amount of KOH8 afforded product 116 which was used for the next step as a crude intermediate. Trityl group was then removed by treatment of compound 116 with 80% acetic acid under reflux to obtain desired alcohol 117 in a high yield (Scheme 5).
Scheme 5. Reaction conditions: i) BnOH, NaH, DMF, 100 °C, 2h; ii) KOH, CH2=CHP(O)(OEt)2, dioxane, r.t., 70 h; iii) 80% AcOH, reflux, 2 h. The treatment of alcohol 117 with 6-chloropurine and 2-amino-6-chloropurine under the Mitsunobu reaction conditions (Scheme 6) gave phosphonate diesters 118 and 119, respectively, in acceptable yields (80% and 55%). Compounds 118 and 119 were treated with DABCO in the presence of potassium carbonate to give products 120 and 121. Compounds 122 and 123 were obtained after removal of the benzyl groups and were subsequently converted to the corresponding free phosphonic acids 124 and 125, respectively. Guanine derivative 125 was also converted to the corresponding xanthine analogue 126 by treatment with iso-pentyl nitrite in 80% acetic acid.
Scheme 6. Reaction conditions: i) Mitsunobu reaction 1. 6-chloropurine or 2-amino-6chloropurine, compound 117, PPh3, dioxane, 2. DIAD, r.t., 24 h; ii) DABCO, K2CO3, dioxane/H2O (4:1), 90 °C, 3 h; iii) H2/Pd/C, AcOH, r.t., 72 h; iv) TMSBr, MeCN, r.t., overnight; v) iso-pentyl nitrite, 80% AcOH, r.t., overnight.
26 4.3.2. Synthesis of (S)-CPEE derivatives bearing 6-oxopurine bases The synthesis of CPEE derivatives and their methyl esters combines previously mentioned synthetic steps. At first, (S)-tritylglycidol was opened with benzylalcohol to give compound 104 (Scheme 7). O-Alkylation of 104 with DEVP gave (after refluxing with 80% acetic acid) alcohol 147, which was subsequently oxidized under the mild conditions9 (TEMPO/NaClO2/ NaClO) to the corresponding carboxylic acid 148. Compound 148 was converted to methyl ester 149 with diazomethane, and after removal of the benzyl group the desired synthon 150 was obtained (Scheme 7).
Scheme 7. Reaction conditions: i) KOH, CH2=CHP(O)(OEt)2, dioxane, r.t., 70 h; ii) 80% AcOH,
reflux,
2
h;
iii)
TEMPO,
NaClO2,
NaClO,
phosphate
buffer,
MeCN,
40 °C, 48 h; iv) CH2N2, EtOAc, r.t., 0.5 h; v) H2/Pd/C, MeOH, r.t., 72 h. Alcohol 150 was treated with 6-chloropurine and 2-amino-6-chloropurine under the Mitsunobu reaction conditions to give compounds 151 and 152 (Scheme 8). Their treatment in basic (DABCO/K2CO3) or acidic (75% aqueous trifluoroacetic acid) conditions afforded derivatives 153 and 154 or 157 and 158, respectively. Compounds 151 and 152 underwent under basic conditions simultaneous transformation of 6-chloro to 6-oxo and cleavage of methyl ester. Under acidic conditions, only the 6-chloro to 6-oxo transformation occurred and the methyl ester was preserved. Final free phosphonic acids 155, 156 and 159, 160 were prepared by ester cleavage of the corresponding diesters under the standard conditions (TMSBr in MeCN, Scheme 8).
27
Scheme 8. Reaction conditions: i) Mitsunobu conditions: 1. 6-chloropurine or 2-amino-6chloropurine, compound 150, PPh3, dioxane, 2. DIAD, r.t., 24 h; ii) DABCO, K2CO3, dioxane/H2O (4:1), 90 °C, 3-5 h; iii) TMSBr, MeCN, r.t., overnight; iv) 75% aqueous CF3COOH, r.t., overnight.
4.3.3. Biological results Some of the target HPEP and CPEE analogues were found to be potent inhibitors of human HGPRT, PfHGXPRT, and PvHGPRT with Ki ranging from 0.02 to 3.4 μM (Table 2). The HPEP and CPEE derivatives possessing the hypoxanthine base (compounds 124 and 159) exhibited no activity against PfHGXPRT, while the guanine derivatives (compounds 125, 156 and 160) revealed activity against all three enzymes tested. Contrary to our expectations, the inhibitors were selective toward the human HGPRT compared to Plasmodium enzymes. Compound 125 [(S)-HPEPG], with a Ki of 0.02 μM for human HGPRT, is one of the most potent inhibitors of human 6-oxopurine PRTase discovered to date. Crystal structures of compounds 124 and 125 in complex with human HGPRT have been determined which nicely show the binding mode of the inhibitors (Fig. 2).
28 Table 2. Ki values of 6-oxopurine ANPs for human HGPRT, PfHGXPRT and PvHGPRT at pH 7.4.
a
COOH COOMe
CPEE
HPEP
Y
Compound
Ki (µM) human
H
124
5.6 HGPRT
NH2
125
H NH2
PfHGXPRT a
PvHGPRT
NI
31
0.02
7.7
3.4
155
200
6
12
156
0.2
1.5
2.5
a
NI
32
2
0.7
H
159
0.9
NH2
160
0.1
NI = no inhibition at that particular concentration of the compound used in the assay
Figure 2. The interactions of compounds 124 and 125 with human HGPRT (a, b). Connolly surface of human HGPRT showing the location of compounds 124 and 125 (drawn as solid spheres) (c, d).
29
4.4. Potential inhibitors of Adenylate cyclase Adenylate cyclase (AC) is an enzyme catalyzing the conversion of ATP to 3‘,5‘-cyclic AMP (cAMP) and pyrophosphate. Based on previous studies we attempted to elucidate, whether the substitution at the position C-2’ of the acyclic chain of PMEA and/or elongation of the phosphonate linker can improve the biological activity against adenylate cyclase toxin (ACT). All derivatives bearing adenine prepared within this thesis were used for the structureactivity relationship study. Synthesis of elongated PMEA analogues with carboxyl moiety in the 2‘-position (S)CPEEA 174 and the corresponding amide 176 is depicted in Scheme 9.
Scheme 9. Reaction conditions: i) TEMPO, NaClO2, NaClO, phosphate buffer/MeCN (1:1), r.t., 24 h; ii) TMSBr, MeCN, r.t., overnight; iii) 3.5 M NH3 in EtOH, microwave, 120 °C, 1 h. Compounds 174 and 176 were tested on the adenylate cyclase toxin inhibition. As mentioned above, all of the tested 2’-substituted PMEA compounds (including (S)-CPMEA and its prodrugs) and 2’-substituted PEEA derivatives were shown to be only weak inhibitors of this enzyme.
30
4.5. Prepararation of oligonucleotides modified with HPEP units The desired suitably protected HPEP (hydroxyphosphonoethoxypropyl) monomers with adenine, cytosine, guanine and thymine bases were prepared by multistep synthesis from the corresponding HPEP derivatives. The crucial synthetic steps included dimethoxytritylation of the 3’-hydroxyl group, removal of the ethyl ester groups with TMSBr and subsequent esterification of free phosphonic acid with 4-methoxy-1-oxido-2-pyridylmethanol (MOP-OH) in the presence of 2-chloro-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxaphosphinane-2-oxide as the condensing agent. The phosphotriester and phosphoramidite methods were used for the solid phase incorporation of nucleoside phosphonates and natural nucleotide units, respectively. The oligonucleotide assembly was performed from the 5' to the 3'-end using commercial reverse nucleoside phosphoramidites. The deprotection protocol included thiophenol and gaseous ammonia treatments to remove the MOP ester groups and all base-labeled protecting groups, respectively. All prepared oligonucleotides were purified by anion exchange chromatography. Thus, a series of DNA and RNA nonamers containing the units based on ANPs were successfully prepared (Fig. 3) and thermal stabilities of DNA-DNA, RNA-DNA, and RNARNA duplexes have been evaluated. The introduction of flexible acyclic units into the oligonucleotides resulted in destabilization of the duplexes (decreased Tm values).
5'-r(GCA UAU CAC)-3' 5'–r(GTG ATA TGC)-3' 5'-d(GCA TAT CAC)-3' 5'–d(GTG ATA TGC)-3' Figure 3. Nonamers modified with HPEP unit.
31
5. Conclusion One of the main goals of this work was to synthesize (S)-CPMEA 83a [(S)-3-(adenin-9-yl)2-(phosphonomethoxy)propanoic acid, Fig. 1]. This compound has been designed as a compound with potential anti-HIV activity. The key step of the (S)-CPMEA synthesis was oxidation of (S)-HPMPA derivative 84a using TEMPO/NaClO2/NaClO to give compound 85a in a high yield. Subsequently, the whole series of CPME derivatives 85 was prepared in good to high yields from the corresponding HPMP analogues 84 by the optimized oxidative methodology with TEMPO. Unfortunately, none of the newly synthesized CPME compounds, including the most promising (S)-CPMEA, did show any interesting activity against the viruses tested. Synthetic strategies leading to prodrugs of (S)-CPMEA have been developed and optimized. The intention was to prepare several structurally different types of prodrugs, which had been designed to mask the phosphonate and/or carboxylic groups in the molecule. The prepared prodrugs were evaluated for their antiviral properties. Prodrugs 101 and 102 displayed submicromolar anti-HCV activity. None of the prodrugs exhibited any interesting activity against the HIV-1 virus. Some of HPEPG and CPEE analogues were found to be potent inhibitors of human HGPRT, PfHGXPRT, and PvHGPRT with Ki ranging from 0.02 to 3.4 μM. The HPEP and CPEE derivatives bearing the hypoxanthine base (compounds 124 and 159) exhibited no activity against PfHGXPRT, while guanine derivatives (compounds 125, 156 and 160) revealed activity against the all three enzymes tested. Compound 125 [(S)-HPEPG], with a Ki of 0.02 μM for human HGPRT, is one of the most potent inhibitors of human 6-oxopurine phosphoribosyltransferase discovered to date. All prepared compounds bearing the adenine base [(S)-CPMEA 83a and its prodrugs, (S)HPEPA 129, (S)-CPEEA 174 and its amide 176] were tested for inhibitory activity of adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis (CyaA), but were shown to be only weak inhibitors of this enzyme. The best inhibitor was bis-amidate 101, which decreased the formation of cAMP to 68% compared to the full (100%) activity of CyaA. Two acyclic nucleoside phosphonates bearing HPEP moiety with either adenine or thymine as nucleobase were synthetically converted into a suitably protected building blocks for the subsequent automated solid phase synthesis of modified oligonucleotides. The introduction of flexible acyclic units into the oligonucleotides resulted in destabilization of the duplexes (decreased Tm values).
32
6. References 1.
a) De Clercq, E.; Holý, A.; Rosenberg, I.; Sakuma, T.; Balzarini, J.; Maudgal, P.C. A novel selective broad spectrum anti-DNA virus agent. Nature 1986, 323, 464467; b) De Clercq, E. The acyclic nucleoside phosphonates from inception to clinical use: Historical perspective. Antiviral Res. 2007, 75, 1-13.
2.
a) Holý, A.; Votruba, I.; Tloušťová, E.; Masojídková M. Synthesis and cytostatic activity of
N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl]
derivatives
of
N-6-substituted
adenines, 2,6-diaminopurines and related compounds. Collect. Czech. Chem. Commun. 2001, 66, 1545-1592; b) Zídek, Z.; Potměšil, P.; Holý, A. Cytostatic activity of antiviral acyclic nucleoside phosphonates in rodent lymphocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2003, 192, 246-253. 3.
a) Keough, D. T.; Hockova, D.; Holy, A.; Naesens, L. M. J.; Skinner-Adams, T. S.; de Jersey, J.; Guddat, L. W. Inhibition of Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase by Acyclic Nucleoside Phosphonates: A New Class of Antimalarial Therapeutics. J. Med. Chem. 2009, 52, 4391-4399. b) Hockova, D.; Holy, A.; Masojidkova, M.; Keough, D. T.; de Jersey, J.; Guddat, L. W. Synthesis of branched 9-[2-(2-phosphonoethoxy)ethyl]purines as a new class of acyclic nucleoside phosphonates which inhibit Plasmodium falciparum hypoxanthineguanine-xanthine phosphoribosyltransferase. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 6218.
4.
a) Zídek, Z.; Franková, D.; Holý, A. Macrophage activation by antiviral acyclic nucleoside phosphonates in dependence on priming immune stimuli. Int. J. Immunopharmacol. 2000, 22, 1121-1129; b) Zídek, Z.; Potměšil, P.; Kmoníčková, E.; Holý, A. Immunobiological activity of N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl] derivatives of N-6-substituted adenines, and 2,6-diaminopurines. Eur. J. Pharmacol. 2003, 475, 149-159.
5.
a) De Clercq, E. Acyclic nucleoside phosphonates in the chemotherapy of DNA virus and retrovirus infections. Intervirology 1997, 40, 295-303; b) De Clercq, E. Clinical potential of the acyclic nucleoside phosphonates cidofovir, adefovir, and tenofovir in treatment of DNA virus and retrovirus infections. Clin. Microbiol. Rev. 2003, 16, 569-596.
33 6.
De Clercq, E.; Holý, A. Efficacy of (S)-1-(3-hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl)cytosine in various models of Herpes-simplex virus-infection in mice. Antimicrob. Agents Chemother. 1991, 35, 701-706.
7.
Jansa, P.; Baszczyňski, O.; Dračínský, M.; Votruba, I.; Zídek, Z.; Bahador, G.; Stepan, G.; Cihlar, T.; Mackman, R.; Holý, A.; Janeba, Z. A novel and efficient one-pot synthesis of symmetrical diamide (bis-amidates) prodrugs of acyclic nucleoside phosphonates and evaluation of their biological activites. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 3748-3754.
8.
Cristau, H. J.; Virieux, D. Anomalous reactivity of diphenylhydroxymethylphosphine oxide in the synthesis of a phosphorylated ether by oxa-Michael reaction. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 703-706.
9.
Zhao, M. M.; Li, J.; Mano, E.; Song, Z. J.; Tschaen, D. M. Oxidation of primary alcohols to carboxylic acids with sodium chlorite catalyzed by TEMPO and bleach: 4-methoxyphenylacetic acid. Org. Synth. 2005, 81, 195-203.
34
Curriculum Vitae Name:
Martin Maxmilian Kaiser
Born:
September 16, 1983 in Děčín, Czechoslovakia
Nationality:
Czech
Address:
Srbská Kamenice 137, Srbská Kamenice, 407 15, Czech Republic
Email:
[email protected]
2003 – 2008
MSc. Degree on a Faculty of Chemical Technology, Institute of Chemical Technology, Prague, Department of Organic Chemistry. Topic of the Master’s thesis: Preparation and characterization of hydroxybenzeno-derivatives of 2’-deoxyguanosine, 2’-deoxyadenosine, and 2’-deoxycytidine.
2008 – now
Ph.D. studies on a Faculty of Natural Sciences, Charles University in Prague, Department of Organic and Nuclear Chemistry. Work on the Ph.D. thesis was performed at the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic under supervision of Dr. Zlatko Janeba. Originally part of Prof. Holý’s team and currently in Dr. Zlatko Janeba’s team. Topic of the Ph.D. thesis: Preparation of novel types of acyclic nucleoside phosphonates for study of their interaction with enzymes of metabolism of nucleic acids.
35
Seznam publikací/List of publications: 1.
Kaiser, M. M.; Jansa, P.; Dračínský, M.; Janeba, Z.: Anovel type of acyclic nucleoside phosphonates derived from 2-(phosphonomethoxy)propanoic acid. Tetrahedron 2012, 68, 4003-4012.
2.
Baszczyňski, O.; Jansa, P.; Dračínský, M.; Kaiser, M. M.; Špaček, P.; Janeba, Z.: An efficient oxa-Michael addition to diethyl vinylphosphonate under mild reaction conditions. RSC Advances 2012, 2, 1282-1284.
3.
Blažek, J.; Jansa, P.; Baszczyňski, O.; Kaiser, M. M.; Otmar, M.; Krečmerová, M.; Dračínský, M.; Holý, A.; Králová, B.: An enzymatic glycosylation of nucleoside analogues using β-galactosidase from Escherichia coli. Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 3111-3118.
4.
Šolínová, V.; Kaiser, M. M.; Lukáč, M.; Janeba, Z.; Kašička, V.: Enantiopurity analysis of new types of acyclic nucleoside phosphonates by capillary electrophoresis with cyclodextrins as chiral selectors. J. Sep. Sci. 2014, 37, 295-303.
Conferences: 2011
15th Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components, Český Krumlov, Czech Republic. Poster “Jansa, P.; Kaiser, M. M.; Holý, A.; Votruba, I.; Janeba, Z.: A novel, highly stereoselective synthetic approach for the preparation of substituted 2,5-dihydro-2,5-dihydroxyfurans.”
2012
13th Tetrahedron Symposium - Challenges in Bioorganic & Organic Medicinal Chemistry, Amsterdam, Netherlands. Poster “Kaiser, M. M.; Jansa, P.; Hocková, D.; Dračínský, M.; Janeba, Z.: Novel type of acyclic nucleoside phosphonates derived from 2-(phosphonomethoxy)- and 2(phosphonoethoxy)propanoic acid.”
36 2013
15th International Conference "Heterocycles in Bio-organic Chemistry" (BioHeterocycles-2013), Riga, Latvia. Poster “Kaiser, M. M.; Poštová Slavětínská, L.; Dračínský, M.; Keough, D. T.;
Hocková, D.;
Guddat,
L.
W.;
Janeba, Z.: Novel class of acyclic nucleoside phosphonates: (S)-3hydroxyl-2-(phosphonoethoxy)propyl analogues.” 2014
16th Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components, Český Krumlov,
Czech
Republic.
Poster
“Kaiser;
M.
M.;
Novák,
P.;
Rosenbergová, Š.; Poštová Slavětínská, L.; Rosenberg, I.; Janeba, Z.: Oligonucleotides modified with acyclic nucleoside phosphonate (HPEP) units.” 2014
23th International Symposium on Medicinal Chemistry (EFMC-ISMC 2014), Lisbon, Portugal. Poster “Kaiser, M. M.; Poštová Slavětínská, L.; Dračínský, M.; Janeba, Z.: Synthesis and biological evaluation of prodrugs of (S)-(3-adenin-9-yl)-2-(phosphonomethoxy)propanoic acid.”
