Transzgenikus egerek előállítása és felhasználásuk Erdélyi Ferenc MTA KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg
Transzgenikus állatok Mesterségesen megváltozatott genetikai állománnyal rendelkeznek. Genom módosítás Génaddíció Géntranszfer eredményeként a genomba (random) beépülve egy idegen DNS darabot tartalmaznak.
Célzott génmódosítás Endogén gén célzott mesterséges megváltoztatása. Öröklődő: a gén/genom módosítás érinti az ivarsejtet is. (ivarsejt- embrionális őssejt módosítás)
Szomatikus: gén/genom módosítás csak a testi sejteket érinti. (módosítás testi sejtekbe történik, a DNS integrálódhat a genomba, vagy lehet episzómális is )
A genom módosítás lehet térben és időben szabályozott és reverzibilis is.
Genetikai állatmodellek random • spontán mutánsok • kémiai mutagenezis
tervezett (transzgenikus) csíravonal
szomatikus
funkióvesztéses mutáns (loss-of-function)
funkciónyeréses mutáns (gain-of-function)
túltermelés
domináns negatív
kondicionális/indukálható
öröklődő
null-mutáns knockout
részleges (hipomorf) mutáns knockdown
mutáció knockin
sejt-abláció
térben és/vagy időben szabályozott
Transzgenikus állatok felhasználása kutatás
gyakorlat
• szövet- és fejlődés- specifikus génszabályozás (promoter vizsgálat) • génfunkciós és fejlődéstani vizsgálatok • sejtazonosítás • sejtfunkciós vizsgálatok • emberi betegségek állatmodelljeinek létrehozása • gyógyszercélpontok validálása-fejlesztés • gyógyászatban fontos fehérjék előállítása (bioreaktorok) • haszonállatok előnyös tulajdonságainak javítása
Miért pont egér? • • • • •
Régóta tenyésztik Sok jól definiált törzse ismert Kis helyigény Felhasználó barát Könnyen manipulálható
Egerek embrionális fejlődése
Donor nőstények előkészítése 5-8 hetes nőstény:
5U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (FSH) 5U Human Chorionic Gonadotropin Időzítés: PMSG 47 órával később HCG
14 h
13 h
Pároztatás donor hímmel Másnap reggel plugolás
Donor nőstény X Donor hím
Embrió Álvemhes anya Recipiens nőstény X Vazektomizált hím
Embrió preparálás
ampulla
Hyaluronidáz
Mikroinjektált embrió beültetése
Az eukarióta génexpresszió szabályozásának lépései inaktív mRNS transzkripció
DNS
sejtmag
citoplazma
primér transzkriptum
mRNS
RNS processzing
RNS transzport
mRNS degradáció mRNS
transzlációs szabályozás fehérje poszttranszlációs modifikáció aktív
inaktív
Gének általános szerkezete 5’-upstream régió exon
inron
ATG Kozák konszenzus GCCACCATGGCTG
3’-downstream régió
PoliA addiciós szignál
Határoló szekvenciák MAR, SAR, LCR
Genetikai módosítás fajtái 1. „transzgenikus” A transzgén
A’
transzgén
transzgén
A’’
A mikroinjektált transzgén sorsa •Fej-farok irányú konkatamér képződés •Beépülés a genomba általában egy helyre •Koinjektált DNS együttes beépülésének esélye magas •Integráció helye random (preferenciális helyek?) •Bépülés helye hatással van az expresszióra (heterokromatikus régió- néma)
Hagyományos pronukleáris mikroinjektálás Előnyök • Felszerelés igénye kicsi • Olcsó • Gyors • Hatékony (1-25%) • Nagy kópiaszám • Expresszió szintje magas
Hátrányok • Véletlenszerű beépülés • Transzgén beépülése konkatamer formában • Inaktiváció esélye magas • Csak génaddíció lehetséges.
Riportergéneket expresszáló transzgenikus egerek A riportergén egy olyan fehérjét kódol, amelynek az expressziója egy meghatározott génhez kötött és nem befolyásolja a sejtfunkciót.
Alkalmazása ✦ gének szabályozó elemeinek azonosítása, jellemzése ✦ sejtek jelölése ✦ fehérjék jelölése fehérje expresszió, aktivitás lokalizáció sejtben, szövetben, szervezetben fehérje-fehérje kapcsolat fehérje mozgás jelátviteli funkciók
Riporterfehérjék bakteriális -galaktozidáz enzim: LacZ gén kódolja kimutatása enzimhisztokémiával/enzimaktivitás alapján Luciferáz enzim (szentjánosbogár) kimutatása: biolumineszcenciával/enzimaktivitás alapján fluoreszkáló fehérjék (GFP, DsRED) kimutatása autofluoreszcencia alapján
Biolumineszcencia és fluoreszcencia alapján élőben, egész állatban is kimutathatók, nyomon követhetők (hűtött CCD kamera).
A génexpresszió helye in vivo detektálható a biolumineszcens markergént hordozó transzgenikus modellben
• könnyű valós in vivo detektálás • ugyanazon kísérleti állaton több időpontban is elvégezhető a vizsgálat
Az iNOS gén transzkripciós aktivitásának in vivo egész állatban történő valós detektálása luciferáz
iNOS
IFN+sLPS
transzkripció a májban 30000 kontrol
25000 20000
IFNg+sLPS
15000 10000
IFNg+sLPS + Dex
5000
gyulladásos állapotokban aktiválódik: • zimozán-indukálta arthritis • bőrsérülés gyógyulása Gyulladáscsökkentő szerek tesztelésére
Genetikailag kódolt fluorogének fluoreszcens riporter fehérjék fluoreszcens szenzorok (PF-k)
Genetikailag kódolt fluoreszkáló fehérjék használatának előnyei, hátrányai ! ! ! ! ! ! !
detektálásához nem kell szubsztrát expresszáló sejtek élőben és fixálatlan szeletben is azonosíthatók fixálás után is működik ellenanyaggal is kimutatható mivel nincs amplifikálás a kimutatásnál nem túl érzékeny nagyon stabil, ezért az expresszió gyors változásainak kimutatására kevésbé alkalmas sokféleképpen módosítható aminósavcsere fúzió inszerció cirkuláris permutáció
Prototípus: zöld fluoreszkáló fehérje (GFP)
GFP fehérje
GFP mesterséges színvariánsok
mRFP variánsok
Spectra are normalized to the excitation and emission peak for each protein. (a,b) Excitation (a) and emission (b) curves are shown as solid or dashed lines for monomeric variants and as a dotted line for dTomato and tdTomato, with colors corresponding to the color of each variant. (c,d) Purified proteins (from left to right, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, and mCherry) are shown in visible light (c) and fluorescence (d). The fluorescence image is a composite of several images with excitation ranging from 480 nm to 560 nm.
Transzgenikus egérben: DsRedT3
Transzgén kódoló régiója stop
start
kódoló régió
ATG
TGA
poli(A) • mRNS másolat (cDNS) •minigén hibrid gén „valódi” gén intakt/mutáns
riportergén:
sejtek jelölése/fehérjék -galaktozidáz zöld fluoreszkáló fehérje (GFP) luciferáz
„valódi” gén mutáns, hibrid,csonkolt
jelző funkció promoter sejt fehérje
megváltozott sejtfunkció
Transzgén kifejeződés specificitását a DNS szabályozó elem határozza meg promoter GFP
mindes sejtjében „transzgenikus” egér
Általános (CAG)
-gal
transzgenikus agy
Agyspecifikus (NSE)
-gal
Purkinje sejt specifikus (L7)
transzgenikus idegsejt
Transzgenikus kisagyi Purkinje sejtek L7 Purkinje sejt specifikus gén E1
E2
E3
Purkinje sejt
kisagy
zöld fluoreszkáló fehérje
-galaktozidáz
Gátló (GABAerg) idegsejtek genetikai módosítása GABAerg idegsejt-specifikus gén (GABA-szintetizáló enzim- GAD65) eGFP
transzgén
medúza zöld fluoreszkáló fehérje gén
hippocampus
agy
embrió
cortex fluoreszáló GABAerg idegsejtek az agyban
szaglógumó
kisagyi Purkinje sejt
GFP+ Purkinje sejtek izolálása FAX-szal L7/gfp transzgenikus egér
FAX
tiszta Purkinje sejt tenyészet Purkinje sejt
Transzgén expresszió térbeni szabályozása transzgén regulációs régiója
enhancer-promoter
kódoló régió
poli(A)
intron
Meghatározza a transzgén expressziójának: helyét idejét szabályozását promoter típusok természetes hibrid/mesterséges szövetspecfikus enhancerhsp68 (tk) minimál promoter szövetspecifikus enhancerek azonosítására
általános, minden sejtben működő promoter CAG (csirke aktin promoter CMV enhancer) ROSA26 ubiqutin, RNS pol. II
szövetspecifikus sejttípus-specifikus indukálható
Tipikus emlős génregulációs régió
Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer ≈ 500 bp hosszú ≈10 Kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.
A transzkripció szabályozásában résztvevő transz elemek
Nagyméretű inszertet tartalmazó klónozó vektorok Plazmid: ~10 kb l-fág: ~20 kb cosmid: 34-40 kb • P1 fág: 100 kb • PAC/BAC: 350 kb • YAC: 2 Mb
P1 fág – BAC vector
YAC vector
PV-GFP transzgenikus egerek plazmid: csak izom expresszió BAC: izom és agy expresszió izom
agy cerebellum
cortex
Purkinje sejtek
hippocampus
Hagyományos pronukleáris mikroinjektálás Előnyök • Felszerelés igénye kicsi • Olcsó • Gyors • Hatékony (5-30%) • Nagy kópiaszám • Expresszió szintje magas
Hátrányok • Véletlenszerű beépülés • Transzgén beépülése konkatamer formában • Inaktiváció esélye magas • Csak génaddíció lehetséges.
Genetikai módosítás fajtái 2. „knock-out” A
P
exon1
exon2 X
X NeoR gén
Homológ rekombináció NeoR gén P Transzláció nem megy végbe
Genetikai módosítás fajtái 3. „knock-in” A P X
exon1 Transzlációs start
exon2 X
kifejezendő gén Homológ rekombináció Transzlációs start
P
Genetikai módosítás fajtái 4. Speciális fajtája a „speedy mouse”, ahol egy olyan konstitutív génbe inzertálják homológ rekombinációval a kifejezendő gént, aminek hiánya nem okoz fiziológiai változást, viszont a gén környezete lehetővé teszi, hogy minden sejtben egyenletes expresszió alakuljon ki. (hprt lókusz X kromoszóma, ROSA26)
Transzlációs start P
P
Kiméra előállítás
Szőrszín kimérák
C57BL/6NTac-Atm1.1ArteTyrtm1Arte • Blasztociszta donor cc,AA • ES sejt CC,aa • C57Bl6 CC,aa • Hibridek Cc, Aa aguti
ES-sejt gén manipuláció Előnyök • A génbevitel nagy hatásfokú • Szelekciós lehetőségek állnak rendelkezésre • Könnyen archiválható • Szinte bármilyen gén és genom manipulációra lehetőség van. • Knockout Mouse Project
Hátrányok • Korlátozott a sejtvonalak száma • Folyamatos kromoszóma és fertilitás ellenőrzés • Drága • Csak olyan laborokban működik, ahol folyamatosan nagyszámú mutánst állítanak elő • Neo kazetta problémás
Taconic rendszer exon
flp loxP
loxP exon
flp
Neo
Hagyományos pronukleáris mikroinjektálás Előnyök • Felszerelés igénye kicsi • Olcsó • Gyors • Hatékony (1-25%) • Nagy kópiaszám • Expresszió szintje magas
Hátrányok • Véletlenszerű beépülés • Transzgén beépülése konkatamer formában • Inaktiváció esélye magas • Nagy kópiaszám • Csak génaddíció lehetséges.
Transzpozícióra képes segédfehérjék használata • Lentivírus – Vírus mediált beépülés – Módosított, defektív HIV vírus – Helper vírussal burok generálás – Korlátozott cargo kapacitás – BLS2 szintű labor és állatház
• Transzpozonok
Genetikai módosítás fajtái 1b. „transzgenikus” A transzgén LTR
LTR
Transzpozáz
A’
A’’
transzgén LTR
LTR
Transzpozon mediált genom módosítás A 2. típusú transzpozonok olyan mobil genetikai elemek, amelyek önkivágó/beépítő aktivitással rendelkező transzpozázt kódolnak és annak felismerő helyét is tartalmazzák. transzpozon alapú géntranszfer rendszer 1
„cut and paste” transzpozició
2
önkivágás
beépülés új helyre
1. a transzpozáz felismerő helyekkel (IR) körülvett beültetendő gént tartalmazó vektor 2. A transzpozázt hordozó vektor RNS-sel helyettesíthető Amennyiben mindkettő jelen van a sejtben a kivágás és a genomiális DNS-be való Integráció megtörténik.
Transzpozon mediált genom módosítás Gerincesekben aktív 2-es típusú transzpozon rendszerek Név/forrás
Cargo méret
Integrációs preferencia
Sleeping beauty (SB)* Tc1/mariner
5-7 kb? Méret növelésével csökken a hatásfok
nincs gén preferencia inkább intron
piggyBac
piggyBac
Hatásfok csökken 9 kb felett -pronukl. injektálás
gén kódoló régió preferencia
Frog prince
Tc1/mariner
ua. min egyéb Tc1/mainer
intron preferencia
Tol1/2
hAT
nagyobb mint a többi gének 5’-régiója? 10-20 kb (BAC transzgén 70 kb)
Transzpozon család
Izsvák Zs, Ivics Z, Matés L SB100 X- 100X aktívabb: 35-50% hatékonyság stem sejtekben, 45% stabil transzgenikus egér
Transzpozon mediálta genom módosítás •
Alapja random inszerciós mutagenezis (funkció vesztés funkció nyerés)
• két-komponensű rendszer: (1) transzpozon vektor tartalmazza a bevinni kívánt cDNS-t, vagy a gén inaktiváláshoz (aktiváláshoz) szükséges elemeket (2) transzpozáz RNS/vektor formában. Mindkét komponenst be kell juttatni a sejtbe • Néhány kópiába épül be (függ a transzpozon/transzpozáz mennyiségétől) • Szomatikus és ivarsejt módosításra is alkalmas • Nem vírus-eredetű géntranszfert tesz lehetővé • Nagy hatásfokú, gyors módszer
Használható
• Transzgenikus modellállatok előállítása (egér, patkány, nyúl stb)
génaddíció RNAi knock down- kiválthatja a lentivírust • Inszerciós mutagenezis- nem homológ rekombináción alapuló KO technológia- ES sejt független - nagyléptékű patkány KO projekt • génterápia • Humán (és egyéb) KO sejtvonalak előállítása • iPSC vonalak előállítása vírus nélkül
sb-cag/eyfp transzgén kópiaszáma az alapító egyedekben
line # 22 23 24 25 26 27 28 43 44
founder ID copy number 105798 mosaic
105799
mosaic
105800 105801 105802
2 2 3-4
105803
6
6/6
1-6
105804
4-5
1-4
105815
1
105816
~1
105817
~2
105818
1
105819
5
6/6 8/8 7/5 7/6 7/2 6/2 6/1 11/0 4/1 9/5 7/3 9/9
45 46 47
offspring F1 pups/Tg copy number 8/3 1 5/2 1 4/4 1 7/3 11/0 0 4/4 2
ID/copy number
108977 male/2 110175 female/6 110176 female/4
1
offspring F2 pups/Tg copy number
5/4 10/8 6/5 8/8
1-2 1-2 3-4 1-4
7/6 6/5
1 ~2
1-2 3-5
108961 male/4 108964 female/5 108967 female/5
4/4 7/7
2-4
A
B
C
D
SB-CAG/eYFP mouse brain sagittal sections. A: Cerebral Cortex, B: Cerebellum, C: Hippocampus D: Detailed part of prefrontal cortex. As figures show, however the brain itself seems to be green, CAG promoter is not active in neurons oposite of endothel layer of vessels.
Transzpozáz mediált genom módosítás Előnyök • Nagy hatásfokú (15-85%) • Az integrálódás egyedi, így a transzgén inaktiválódás esélye alacsonyabb • A transzgén továbbörökítés aránya magas
Hátrányok • RNS munkát igényel, ami drágább és nagyobb odafigyelést igényel. • Az alacsony kópiaszámból adódóan a transzgén expressziója alacsony lehet • A „cargo” méretre korlátoz • A random integrálódásból adódó gén inaktiválódás előfordulhat
PhiC31 integráz mediált géntranszfer Streptomyces ΦC31fág integráz
attB helyek elhelyezése a ROSA26 locusba
Genetikai módosítás fajtái 4. Speciális fajtája a „speedy mouse”, ahol egy olyan konstitutív génbe inzertálják homológ rekombinációval a kifejezendő gént, aminek hiánya nem okoz fiziológiai változást, viszont a gén környezete lehetővé teszi, hogy minden sejtben egyenletes expresszió alakuljon ki. (hprt lókusz X kromoszóma, ROSA26)
Transzlációs start P
P
Meganukleázok • Endonukleáz aktivitással bíró enzimek • DNS duplaszál törést követően megnő a repair aktivitás, ami rekombinációs hot spotot alakít ki • Target specifitással bíró hibrid meganukleázok kialakítása
Genetikai módosítás fajtái 2b. „knock-out” A
P X
XX MN
MN
X
TALEN, ZFN, CRISPR P
P Transzláció nem megy végbe
„ZN-finger” nukleáz mediált genom módosítások
„ZN-finger” nukleáz mediálta genom módosítások ZNF kettőszálú törést okoz a genom meghatározott helyén. Specificitást a ZF biztosítja. 1. A törést a sejt NHEJ mechanizmussal javítja mikrodeléció/inszerció
potenciális KO 2. A törést a sejt HR mechanizmussal javítja
+ módosított homológ régió
knock in deléció mutáció
ZN-finger” nukleáz mediálta genom módosítással KO sejtek és modellállatok is létrehozhatók Előnye
Transzgenikus patkány előállítása ZNF technológiával
• Homológ rekombináció nélkül létrehozható KO sejtvonal, vagy modellállat • Azokba az állatfajokban is alkalmazható, amelyeknél nem áll rendelkezésre pluripotens ES sejt • Nagy a hatásfoka és gyors
Hátránya A kívánt specificitású ZNF-et elő kell állítani Ez nem egyszerű és drága
mutáció a kódoló exonban
KO
SIGMA-SAGE labs • ZNF • KO sejtvonalak előállítása • GMO állatmodellek előállítása: egér, patkány és nyúl constitutive KO humanization reporter tagging point mutations
bármely törzs
Kész patkány KO modellek
TALEN
Xanthomonas sp. Transcriptional activator like effectors TALE 34 aminosav modulok (repeat variable diresidues RVD) 12., 13. aminosav a nukleotid kötésért felelős aminosavak NI = A, HD = C, NG = T, NN = G or A)
TRESK mutáns egerek szekvenciája Wt Tm48 Tm57 Tm7 Tm57 Tm60 Tm51 Tm49 Tm44 Tm38 Tm43 Tm61
CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCTGTCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT-TCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT--CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT--CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATG--GTCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAAGC----TCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCA---------------------CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCA---------------------CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCA---------------------CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCA---------------------CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGG---------------------------------GGATGCTGCCCCG CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGA---------------------------------TGAGGCCCCG
TALEN felismerő hely Nucleotid mutáció --- deléció 9bp hosszú repeat
CRISPR/Cas
Lehetséges történések
Target specifikus nukleázok Cink finger
TALEN
CRISPR/Cas
Tervezés
közepes
könnyű
könnyű
Konstruálás
közepes
könnyű
nagyon könnyű
Hatékonyság
alacsony
80-90%
magas
Aktivitás
alacsony/ változó
magas
magas
Off-targeting vágás
változó
alacsony
magas
Toxikusság
változó
alacsony
alacsony
Költség
magas
közepes
alacsony
ES sejt vs target specifikus nukleázok ES
TSN
• • •
Csak dedikált laborokban Folyamatos ES sejt ellenőrzés Egy konstrukció 1 vonal
• • •
•
Egy sejtvonal még nem garantálja az egész egeret és a továbbörökítés sem 100% ~40.000 € 40 hét
•
Nem igényel nagy befektetést RNS munka Egy konstrukció több féle vonal (knock-out, potenciális knockdown és knockin) Vonal kialakítás közel 100%
• •
~4-6.000 € 16-20 hét
• •
Konstitutív - indukálható • Korai megnyilvánulás, vagy korai génhiány sok esetben káros • A szervezet gyakorta kompenzál, így egy gén hiányát más, hasonló funkcióval bíró gének veszik át • Egy gén sok szövet - és sejtféleségben nyilvánulhat meg, az általános génkiütés elfedheti a specifikus működést.
Indukálható promóterek I. indukálható endogén promoterek használata:
transzgén expresszió szabályozása endogén kontrol szekvenciákkal heat shock promoter; metallothionein MAF kötődik a MRE-hez Cd/Zn jelenlétében; interferon aktiválható promoter; steroid regulált promoterek; GRE (glukokortikoid- MMTV) indukálhatóság nem túl magas, “mellékhatások”
Indukálható promóterek II. Mesterségesen indukálható génexpresszió: indukálható transzgenezis
Szövetspecifikus promóter TRANSZKRIPCIÓS faktor
Reszponzív promóter
RNS pol
Target transzgén
Szövetspecifikus promóter
tetO – CMV IE
RNS pol
rtTA-VP16
Target transzgén
Térbeli szabályozás Cre rekombinázzal
Cre mediált génkifejezés
Brainbow egér
1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. „founder” kiválasztása – genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása
5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások
Transzgenikus egyedek azonosítása és jellemzése Genomiális DNS izolálás farok mintákból 2-3 mm darab - Proteináz K feltárás • fenol-kloroform extrakció - etanol/izopropanol kicsapás Előny: nagy mennyiségő tiszta DNS, olcsó Hátrány: munkaigényes, veszélyes szerves oldószer
• magas ionerő mellett szilikátos megkötés - mosás guanidin izo tiocianát hidroklorid oldattal - elúció alacsony ionerő mellett Előny: automatizálható Hátrány: rossz kitermelés, drága
Transzgenikus egyedek azonosítása és jellemzése II. Génexpresszió alapján RNS
- Northern hibridizáció - RT-PCR
Fehérje
- Western blot - enzim aktivitás
- fenotípus Homozigóta egyedekben a transzgén expresszió szintje magasabb lehet.
1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. „founder” kiválasztása – genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása
5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások
Transzgenikus egyedeket nem transzgenikus egyedekkel keresztezik, felszaporított heterozigóta egyedek keresztezésével homozigóta vonalakat alakítanak ki.
1. Konstrukció elkészítése
2. Génbevitel 3. „founder” kiválasztása – genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások
Kísérletezés
Mit használjunk, és hogyan?
Egér fajok elterjedése
Laboratóriumi egerek eredete
Kedvtelésből tartott egerek Ázsia, Európa (XVIII-XX. Sz.)
Abbie Lathrop összegyűjtötte és tenyésztette őket Granby, MA – 1900
Castle, Little és Mások folytatták Lathrop munkáját és alakították ki Az első inbred törzseket (1908-tól) W.E. Castle
C.C. Little
Egér Családfa
Castle’s egerek
Kína Japán
Swiss
Egyéb törzsek
C57leszármazott
vad eredetű
Felhasznált egértörzsek C57/BL6
129
FVB/N NMRI
Inbred
Outbred/F1
A genetikai háttér hatása a genetikai módosítás fenotípusos megjelenésére Magatartás Szív és érrendszer élettana Fejlődési defektek Diabetes Immunitás and gyulladás Metabolizmus Tumor képzés és gyakoriság
15 129 B6
10 n 5
500
400
300
200
100
0
Blood glucose (mg/dL) Adapted from Almind et al., Diabetes 52:1535, 2003
2 típusú diabetes Diabetes db/db (Leprdb)
C57BL/6 (B6.Cg-m +/+ Leprdb/J) elhízás tranziens diabetes-szel
Obese ob/ob (Lepob)
C57BL/6 (B6.V-Lepob/J) elhízás tranziens diabetes-szel
ob C57BLKS (BKS.Cg- m +/+ Leprdb /J) C57BLKS (BKS.V-Lep /J) elhízás megnyilvánuló diabeteselhízás megnyilvánuló diabetes-szel szel
Episztatikus faktorok hatása a transzgén megnyilvánulásra 50
Body weight (g)
WT HDC -/-
45 40 35 30 25 5
10
15
20
25
30
35
weeks
Fülöp et al. Endocrinology 2003
FVB/N-FVB/Ant
Congenic 1
2
3
4
Co-isogenic 5
1
2
3
4
5
A. Hagyományos
B. “SPEED CONGENIC”
Háttér specifikus genotipizálás nélkül
Strain B
Szelektált tenyészpárokkal
Strain A
Strain A a/amt
a/amt
b/b
% loci A/B
Strain B
Strain B
Generation
b/b Strain B
F1
b/amt
b/b
F1N1
<30%
b/amt
b/b
Strain B
b/b Strain B
F1N2
25%
b/amt
b/b
N5-N11
F1N3
12.5%
b/amt
b/amt
b/amt
b/amt
amt/amt a/amt
a/amt
a/a
<0.2%
F1N4
6.25%
F1N12
<0.2%
N12F1 N12F1 N12F1 N12F1
Strain B-amt
b/amt
<5%
b/b Strain B
b/b Strain B
amt/amt
b/amt
b/amt
b/b Strain B
N12F1
100%
Strain B 50%
Beltenyésztett kongenikus törzs
b/b
% loci A/B
100%
Minimum idő: 13 generáció X 3hónap/generáció => 3.25 év
Strain B
N12F1 a/a
Strain B
b/amt
b/b
Beltenyésztett Kongenikus törzs Átlagos elvégzési idő: 5 generáció X 3 hónap/generáció => 1.25 év
Alom kontrol cb1Z
cb1
cypD
D2R
net
+/+
29%
27%
31%
30%
31%
+/-
50%
50%
47%
48%
56%
-/-
21%
23%
22%
22%
13%
288
2145
221
330
327
16
78
7
12
13
utódszám tenyészpár
1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. „founder” kiválasztása – genotipizálás
4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások • Rederiválás • Embrió mélyhűtés
Rederiválás
SPF space
Befogadó állatház
Kórokozó mentes kolónia Szuperovuláció kiváltása hormoninjekcióval Fertőzött kolónia
♀
X
♂
zigóta/hólyagcsíra állapotú embrió preparálás
barrier
♀ SPF „béranya”
Tripszin kezelés
Elválasztás után higiéniai státusz ellenőrzése
1. Konstrukció elkészítése 2. Mikroinjektálás 3. „founder” kiválasztása – genotipizálás
4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások • Rederiválás • Embrió mélyhűtés
Technológiai sor 1. Konstrukció elkészítése 2. Génbeviteli eljárás 3. „founder” kiválasztása – genotipizálás
4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások • Rederiválás • Embrió mélyhűtés
