Celluláris és molekuláris neurobiológia SzJDI 2014. őszi félév
Neuron-specifikus génműködés Szabó Gábor MTA KOKI
[email protected]
Génexpressziós szintek Génhez való hozzáférés kromatin DNS metiláció kromatin mdifikáció
epigentika
Átírás cisz és transzelemek akivitás függő
RNS érés (processing) alternatív splicing
mRNS szabályozás mikroRNS-ek editálás
Transzláció lokális aktivitás függő
epigentika
Génexpresszió kapcsolt lépései
Transzkripciós egység-génszerkezet
5 ’
szabályozó régió
3’
kódoló régió
mRNS képződés transzkripció+ „processing”+ transzport
Transzkripció szabályozásának elemei cisz elemek - DNS szabályozó elemek gének részei- promoterek, transzkripciós faktor kötőhelyek, enhancerek (silencerek) (elhelyezkedésük 5’-vég, 3’-vég, intronok, kódoló régió) - mRNS leader szekvenciák transz elemek - az adott géntől független faktorok - fehérjék (más gének termékei) - transzkripciós faktorok (aktivátorok, represszorok) cisz elemekhez kötődnek - kofatorok (ko-aktivátorok, ko-represszorok) transzkripciós faktorokhoz kötődnek
polimeráz II- RNS szintetizáló enzim – mRNS-kódoló gének – mikroRNS-kódoló gének
promoter Promoter felépítése – core promoter (≈ -40 to +40 a TSS-hez viszonyítva) – promoter proximális régió - upstream regulációs elemeket tartalmaz
Promoter típusok “house keeping” - TATA nélküli CpG sziget szövetspecifikus- TATA/CAAT szövetspecifikus elemek indukálható/fejlődés szabályozott
promoter
Promoter elemek (RNS polimeráz II)
BRE - TFIIB kötő elem DPE - downstream promoter elem Inr - iniciátor régió
Az általános upstream elemek az iniciáció frekvenciáját növelik: elősegítik azt, hogy a bazális transzkripciós faktorok iniciációs komplex-szé szerveződjenek
upstream promoter elemek
Transzkripciós faktorok -transz ható elemek - regulációs fehérjék aktivátorok, vagy inhibítorok Funkcionális doménjeik - DNS kötő domén - promoter, vagy enhancer DNS elemekhez kötődik - Aktivációs domén - transzkripciós faktorokkal, ko-aktivátorokkal, ko-represszorokkal, vagy közvetlenül az RNS polimeráz komplex-szel lép kapcsolatban - Dimerizációs domén: dimér formájában működnek
Egyéb faktorokkal transzkripciós komplexet képeznek és serkentik, vagy gátolják az RNS polimeráz kötődését a promoterhez.
Transzkripciós faktorok osztályozása 1. Általános transzkripciós faktorok TFIID, TFIIB, TFIIA, TFIIH, TFIIE, TFIIF Közvetlenül az RNS polimeráz működéséhez kell. Minden sejtben megtalálható. 2. Minden sejtben jelenlévő transzkripciós faktorok
sok gén transzkripcióját aktiválja (SP1, CCAAT-box kötő fehérje…) 3. Szövetspecifikus transzkripciós faktorok • Specifikus trasz-elemhez kötődik • Adott sejttípusban fejeződik ki • Szövetspecifikus géneket aktivál
Transzkripciós faktorok kötődése a cisz DNS elemekhez
A humán genomban található transzkripciós faktor gének
Venter et al al al (2001) Science 291, 1304-
„Enhancerek”(silencerek)
Cis regulációs elemek: aktivátorok, gátlók („silencerek”) Promoterektől a következőkben térnek el: 1. Enhancerek működéséhez szükségesek a promoterek (promoterek enhancerek nélkül is működnek, bár gyengén) 2. Az enhancerek a transzkripciós starthelytől távol is működnek, a promoterek nem 3. fordított orientációban is működnek 4. a transzkripciós kezdőhely mögött is működnek 5. enhancerek nagyon távoli helyekről is működnek
A transzkripciót térben és időben szabályozottan fokozzák, vagy gátolják működésükhöz szükséges a transzkripciós alap-apparátus. A transzkripció iniciációját serkentik, vagy gátolják.
Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék a transzkripciós komplexhez kötődnek és növelik a transzkripció hatásfokát
Komplex enhancerek
Represszorok Represzorok silencerekhez kötődnek
• gátolják az aktivátorok kötődését • közvetlenül gátolják az aktivátort • közvetlenül kötődnek az általános transzkripciós faktorokhoz
A transzkripció szabályozásában résztvevő transz elemek
Szövetspecfikus transzkripciós szabályozás: szövetspecifikus enhancerektranszkipicós faktorok
Tipikus emlős génregulációs régió
Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer ≈ 500 bp hosszú ≈10 Kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.
Nukleáris hormon receptorok: ligand függő transzkripciós faktorok
• • • •
szteroid hormonok tiroid hormonok retinidok D vitamin
Nukleáris hormon receptorok szerkezete
Nukleáris hormonreceptorok működési mechanizmusa
NR ligand nélkül inaktív komplexet képez a citplzmában (hsp90) Ligand kötés-nukleáris transzlokáció DNS elemhez kapcsolódik koaktivátorokkal és más fehérjékkel Gén transzkripció beindul Más transzkripciós faktorokhoz is kapcsolódhat (NFkB, AP-1) Indirekt transzkripciós szabályozás
Aktivitás függő transzkripciós szabályozás az idegrendszerben
Szignál specifikus transzkripciós komplexek az idegsejtekben
Különböző stimulusok hatására CaMP és Ca++ reszponzív elemekhez kapcsolódnak a foszforiláció után a faktorok. Beindítják a c-fos és Bdnf transzkripciót.
CREB függő gén expressziós kaszkád aktivitása szükséges a neuronális plaszticitáshoz és a memóriához szignálok neurotranszmittertek növekedési faktorok depolarizáció stress kinázok CREB foszforiláció C/EBP TF gén aktiváció
késői gének aktivációja plaszticitás memória
A c-fos gén transzkripciójának Ca++-függő szabályozása
RNS összeszerelődés (processing)
cap
splicing
poliA
„Alternatív „splicing” A gének exonjaiból a kódoló régiók több féle módon szerelődhetnek össze
• •
A genom kódoló kapacitását növeli Fehérjék funkcionális komplexitását növeli eltérő N-, vagy C-terminális régió eltérő domén szerkezet
funkcionális eltérés változik a szubcelluláris lokalizáció poszt-transzlációs modifikáció fehérje-fehérje kölcsönhatás
•
mRNS-ek nem-kódoló régióinak diverzitása RNS szintű szabályozás RNS szint,targetálás, stabilitás transzláció szabályozása (microRNS kötődés)
Lehet fejlődés és szövetspecifikus és “aktivitás függő” is
Alternatív splicing típusok
Splicing mechanizmus
Alternatív „splicing” mechanizmussal egy génről többféle mRNS és fehérje képződik
-tropomyosin gén
Splicing világbajnok a Drosophila Dscam1 (Down Syndrom cell adhesion molecule) gén
A DScam1 izoformák a dendrit arborizációt a dendrit típusok között átfedést szabályozzák.
Alternatív splicing az idegrendszerben
Alternatív splicing eredményeképpen képződő receptor, ioncsatorna, enzim, jelátviteli fehérje és strukturális fehérje (sejtváz, sejtadhézió) formák funkcionális tulajdonságai lokalizációja, membrán kötődése interakciói különbözőek lehetnek. Vannak idegsejt specifikus splicig faktorok. Az alternatív splicing-et a neuronális aktivitás is szabályozhatja.
A glutamáterg és GABAerg szinapszis képződést (gátló vagy serkentő szinaptikus specializáció) a preszinaptikus neurexin és a posztszinaptikus neuroligin alternatív “spilce” formái határozzák meg 3 neurxin génről összesen több mint 1000 izoforma képződhet (5 altenetív exon és 2 promoter) 4/5 neuroliging gén 2-2 splice formája 8-10 izoformát kódol. A kettő nagyszámú kombinációja sokféle gátló és serkentő szinaptikus kapcsolat kialakítását szabályozhatja
AChE alternatív splicing: különböző szerkezetű és lokalizációjú enzimet eredményez
intron retenció alternatív 3’ exon
alternatív 3’ exon hidrifil monomér
membrán-kötött dimér VVS membrán kapcsolt
tetramer szinaptikus membrán kötött
AMPA receptor alternatív splicing: flip/flop variánas
Q/R editing a Ca++ permeábilitást szabályozza Flip/Flop AS és az R/G editing a deszenzitzácót szabályozza
Kaninát receptor splice variánsok különböző C-terminális doménnel rendelkeznek
Eltérő C-erminális határozza meg a membránba való beépülést
Szövetspcifkus alternatív exon a fehérje-fehérje kölcsönhatást is szabályozza
Neuronális aktivitás RNS kötő fehérjék Ca++ függő foszforilációján keresztül szabályozza az alternatív splicing-ot
Idegrendszerben működő splicing faktorok
A hippocampus CA1 régiójában az NMD receptor aktiváció által kiváltott LTP-hez szükséges a NOVA2 splicing faktor NOVA2 KO egér: sIPSC, LTP
NOVA2 alternatív splicing
NMDAR GABABR2 GIRK2
siPSC (lassú gátló posztszinaptikus áram)
LTP
Szinaptikus mRNS-ek, amelyek alternatív splicing-jét a NOVA szabályozza
Génműködés epigenetikus szabályozása „Olyan változások, amelyek a genom változtatása nélkül hatással vannak a fenotípusra.” Egy sejt tulajdonságainak örökletes megváltozása, amely nem jár együtt a genetikai információ megváltozásával. Génműködés epigenetikus szabályozása: Nem függ közvetlenül az adott gén regulációs DNS elemeitől kromatin (hiszton) módosítás DNS metiláció RNS interferencia RNS editálás
Epigenetikus hatások: kapcsolat a környezet és a genom között Környezeti hatások eltérő egyedi következményei: egyedi epigenetikus variabilitás
DNS-től a kromoszómákig: A DNS kromatin formájában található a sejtmagban
Kromatinszerkezet és szerveződés
nucleosome
Nukleoszóma szerkezet
Hisztonok (H1, H2A, H2B, H3, H4) • kis fehérjék • arginin- vagy lizingazdag: poztitíven töltött • kötődik a negatívan töltött DNS-hez • poszt-transzlációsan módosított - csökkenti a pozitív töltést foszforiláció poli(ADP) riboziálció metiláció acetiláció hiperacetiláció hiszton acetiláz “laza” nukleoszómák transzkripciós aktiváció hipoacetiláció hiszton deacetiláz “szoros” nukleoszóma transzkripciós gátlás
Hiszton kód: hiszton fehérjék poszt-transzlációs módosítása
Hiszton acetiláció a kromatin kondenzációt szabályozza Hiszton acetiláció aktiválja a transzkripciót
A transzkripciós aktivátorok és represszorok a kromatin szerkezetének módosításán keresztül is hatnak
DNS metiláció: citozin metiláció
A CpG dinukleotidok alulreprezentáltak a genomban A CpG előfordulása alacsonyabb a vártnál
Lehetséges dinukleotid párok
GG AG TG CG
– várt gyakoriság 1/16= 6.25%
oka
GA AA TA CA
megfigyelt gyakoriság ≈1%
Met-citozin spontán deaminációja timidint eredményez- csökken a CpG aránya deamination
NH2
NH2
N O
N C
O
O CH3 HN
N
GT GC AT AC TT TC CT CC
N
O N
mC
T
O CH3 HN O N U
A CpG szigetek kijelölik a promotereket
• CpG szigetek = DNS régió a várt CpG frekvenciával hossza = 200 bp -tól néhány kb-ig. • CpG a szigeten belül döntően nem-metilált, míg a CpG szigeten kívül metilált. • A humán genomban 29 000 CpG sziget van (a genom 1-2%-a) • CpG szigetek majdnem mindíg promotereket és/vagy exonokat tartalmaznak. ( a gének 50-60% tartalmaz CpG szigetet. • CpG szigetben található promoterek nem tartalmaznak TATA • vagy DPE elemeket, de többszörös GC motívumokat tartalmaznak. - gyakran többszörös és gyenge transzkripciós starthellyel rendelkeznek (többszörös Sp1+Inr miatt ) • Ez a metilációs mintázat a genomot transzkripciósan aktív és inaktív zónákra osztja.
A CpG szigetek kijelölik a promotereket
• A metilált és nem metilált CpG nem random található a genomban Metilált
Nem-metilált TSS
AGCGAGCGAGCGTGTATGTTCTCATTAGGGGACGATC TCGCTCGCTCGCACATACAAGAGTAATCCCCTGCTAG
Hemimetilát
legtöbb CpG are metilált az emlős sejtekben
• CpG promóterekhez kapcsoltak
• A konstitutívan működő háztartási gének promoterei CpG szigetben találhatók. • Van olyan szövetspecifikus gén is, amelyiknek a promotere szintén CpG szigetben helyezkedik el. • A CpG szigetben a CpG nem metilált- a promoter aktív. • Metilációval a promoter inaktiválható.
Gének ki-be kapcsolása DNS metilációval
BE: CpG sziget metiláció
KI: CPG sziget metiláció
DNA metiláció funkcionális következménye Metilált promoter inaktív – A a CpG sziget mentes szövetspecifikus gének automatikusan metiláltak, aminek a következménye a globális inaktiváció, aminek a fenntartásához nem kellenek további elemek. – Metilkötő fehérje – A metilált CpG-ket a metilkötő fehérjék ismerik fel (MBP), amelyek különböző hisztonmódosító enzimeket vonzanak (HDAC-hiszton deacetiláz, HMT hiszton metil transzferáz)- következmény kromatin kondenzáció-inaktiváció. – A DNS metilációnak direkt szerepe lehet a nukleoszómák pozicionálásában is.
DNS és hiszton modifikáció együttes szerepe a kromatinszerkezet szabályozásában
CpG-ben gazdag promoterrel rendelkező idegrendszeri gének: epigenetikus szabályozás alatt állhatnak
Epigenetikus szabályozás az idegrendszerben
• egyedi gének • sejtek: idegi őssejt differenciáció (fejlődés alatt felnőttben) • jelátviteli folyamatok • szinaptikus folyamatok • plaszticitás • memória • hálózati aktivitás • oszcilláció • magatartás •kóros idegi tevékenység
Szinaptikus plaszticitás epigenetikus szabályozása
Reelin és a GAD76 promoter hipermetilációja skizofréniás beteg preforntális cortexében
DNMT promoter metiláció Reelin/GAD67
csökkent gátlás dendrit tüske zavarok
Génműködés poszt-transcripciós szabályozása RNS interferenciával (géncsendesítés)
• RNS-RNS interakción alapszik • poszt-transzkripciós szinten hat • mRNS-t inaktivál (transzlációt gátol) • mRNS-t szinetet csökkent Szabályozó nem fehérjekódoló RNS-ek (npc) Eukarióta gén
mRNS + npc RNS
Fehérje
A genomban nem-kódoló RNS gének is találhatók, amelyek szabályozó RNS-eket kódolnak
Génműködés szabályozása genom kódolt mikro RNS-ekkel MicroRNS-ek Kisméretű nem-kódoló RNS család, amely szekvencia specifikusan szabályozza a génexpresszió különböző szintjeit.
Micro-RNS-ek képződés és hatásának mechanizmusa
A micro RNS-ek az idegrendszer fejlődésének minden lépést szabályozzák
Micro RNS-ek szerepe a szinaptikus tüske plaszticitás szabályozásában
micRNS-ek transzkripciós faktorokon, deacetilázokon, kinázokon és növekedési faktorokon keresztül szabályozzák az aktin citoszkeleton komponenseit serkentő gátló
Micro-RNS-ek és az Alzheimer kór
miRNS-ek szabályozzák az APP mRNS és a BACE1 processzáló enzimet kódoló mRNS szintjét
An overview of selected miRNAs associated with neurological disorders miRNA
Disease
miR-9/9*
Huntington disease
Dysregulation
Target
Consequence of miRNA dysregulation
REST (miR-9)
Excessive amount of REST and CoREST in the nucleus
Downregulated CoREST (miR-9*)
miR-29a
AD
Downregulated
NAV3
miR-29a,-29b-1 miR-106b miR-107
Sporadic AD AD AD
Downregulated Downregulated Downregulated
BACE1 APP BACE1
miR-124
FXS
Downregulated
miR-133b
PD
Upregulated
miR-146a/b
Rett syndrome Downregulated
miR-181b
Schizophrenia
miR-298 and -328 miR-342-3p
AD Prion disease
miR-485-5p
AD
Upregulated in prefrontal cortex
Inactivation of neuron-specific genes NAV3 coexpressed tau neurofibrillary tangles in pyramidal neurons Increase of amyloid-β Increase of amyloid-β Increase of amyloid-β
Decreased neuronal maturation Pitx3
Repression of neuronal maturation
Irak1
An increase in the amount of Irak1 puts the brain into an inflammatory state
GRIA2 VSNL1 BACE1
Unknown Upregulated Downregulated in entorhinal cortex and BACE1 hippocampus
Decrease in neuronal outgrowth Increase of amyloid-β
Increase of amyloid-β
RNS editálás (editing) RNS-ben a DNS által kódolt nukleotid (bázis) enzimatikus reakcióval történő megváltoztatása
C-U editing A-I
guanozin a kodon szempontjából adenozin
dezaminálás adenozin dezamináz (ADAR)
inozin
kodon változás aminósav csere
A/I editálás az RNS különböző helyein történhet
mRNS kódoló régió- kodon változás- aminósav csere - fehérje funkció változás 5’ 3’- UTR – megváltozik az mRNS transzlációja, lokalizációja vagy stabilitás intron/splice “brach site”- megválozik az “altertnative splicing”- „új” fehérje izoforma STOP kodon elominálódik- kódoló régió hosszabb
Nem-kódoló RNS- miRNS biogenezis (szint) szbályozása funkció szabályozása?
I/A RNS editálás hatása neuronális receptor és csatorna funkcióra
KV1.1 I-V csere kapcsolat a KVb1.1-el
GluA2- Q/R csere Ca++ permeábilitás ER exit
GABAA3 I/M csere membrán trafficing
Cav 1.3 IQ-MR csere calmodulin kötés 0
5-HT2C I-N-I/ V-S(N)-V csere G-protein kötés
Lokális fehérjeszintézis az idegrendszer sejtjeinek nyúlványaiban Előfordul: • dedritek • axonok- növekedés, cél-megtatlás, • sérülés • glia-nyúlványok oligodendroglia- mielinizáció Asztrocita-GFAP
Aktivitás függő transzláció a dendritekben lehetővé tesz szinapszisok morfológiájának és aktivitásának egyedi szabályozását
mRNS anatómiája Az mRNS a fehérje kódoláson kívül olyan szekvenciákat és struktúrákat tartalmaz, amelyekhez fehérjék kötődve szabályozzák a transzlációt, transzportot, lokalizációt és stabilitást.
5’-UTR+ faktorok transzláció hatásfoka
3’-UTR+ faktorok
mRNS transzport stabilitás transzláció
RNS transzport és lokális fehérjeszintézis
szignál
mRNS
inaktív
aktív
Lokalizációs szignálok idegsejt-specifikus mRNS-ek 3’- nem-transzlálódó (3’-UTR) régiójában
Transzláció szabályozása a dendritekben Neurotranszmitter receptor kapcsolt útvonalak serkentő szinapszisok esetében BDNF R
szignál függő kinázok
foszforiláció
RNS kötő fehérjék
általános
miRNS
RNS specifikus
Hosszú 3’-UTR-t tartalmazó BDNF mRNS a dendritekbe transzportálódik és itt transzlálódik. Dendritikus BDNF szabályozza van a dendrit tüske morfológiáját és a szinaptikus plasztictást.
A CamK2 mRNA hosszú 3’-UTR-t eltávolítva megszűnik a dendritikus lokalizáció és zavart szenved a szinaptikus plaszticitás.
Szinaptikus aktivitás stimulálja az Arc transzkripcióját és a lokális transzlációját. Arc modulálja szinaptikus plaszticitást az AMPA receptorok endocitózisán keresztül.
CREB lokális transzlációja az axonban NGF hatására. Majd retrográd transzportálódik a sejtmagba és NGF reszponzív géneket aktivál.
A RanBP1 és importinb lokális szintézise az axonba hozzájárul a retrográd transzport jelátviteli komplex létrehozásában a sérülést követően.
A denritekben lokálisan szintetizálódott fehérjék szerepe a hippocampalis LTP-ben
