Celluláris és molekuláris neurobiológia SzJDI 2016. őszi félév Neuron-specifikus génműködés
Szabó Gábor MTA KOKI
[email protected]
Génexpressziós szintek Génhez való hozzáférés kromatin
DNS metiláció kromatin modifikáció
epigentika
Átírás cisz és transzelemek akivitás függő elemek
RNS érés (processing) alternatív splicing
mRNS szabályozás mikroRNS-ek editálás
Transzláció lokális aktivitás függő
epigentika
Génexpresszió kapcsolt lépései
Transzkripciós egység-génszerkezet
5 ’
szabályozó régió
3’
kódoló régió
mRNS képződés Transzkripció+„processing”+ transzport
Transzkripció szabályozásának elemei cisz elemek
- DNS szabályozó elemek gének részei- promoterek, transzkripciós faktor kötőhelyek, enhancerek (silencerek) (elhelyezkedésük 5’-vég, 3’-vég, intronok, kódoló régió) - mRNS leader szekvenciák transz elemek - az adott géntől független faktorok - fehérjék (más gének termékei) (lehetnek RNS-ek is microRNS) - transzkripciós faktorok (aktivátorok, represszorok) cisz elemekhez kötődnek - kofatorok (ko-aktivátorok, ko-represszorok) transzkripciós faktorokhoz kötődnek
enhancers
upstream promoter elements
core promoter
Promoter felépítése – core promoter (≈ -40 to +40 a TSS-hez viszonyítva) – promoter proximális régió - upstream regulációs elemeket
promoter
tartalmaz
Promoter típusok “house keeping” - minden/legtöbb sejtben működnek (TATA nélküli CpG sziget) szövetspecifikus- TATA/CAAT szövetspecifikus elemek indukálható/fejlődés szabályozott
Gének átírása polimeráz II- RNS szintetizáló enzim • mRNS-kódoló gének • mikroRNS-kódoló gének
Promoter elemek (RNS polimeráz II)
BRE - TFIIB kötő elem DPE - downstream promoter elem Inr - iniciátor régió
Általános upstream promoter elemek Az iniciáció frekvenciáját növelik: elősegítik azt, hogy a bazális transzkripciós faktorok iniciációs komplex-szé szerveződjenek.
upstream promoter elemek
Transzkripciós faktorok -transz ható elemek - regulációs fehérjék aktivátorok, vagy inhibitorok Funkcionális doménjeik - DNS kötő domén - promoter, vagy enhancer DNS elemekhez kötődik - Aktivációs domén - transzkripciós faktorokkal, ko-aktivátorokkal, ko-represszorokkal, vagy közvetlenül az RNS polimeráz II komplex-szel lép kapcsolatban - Dimerizációs domén: dimér formájában működnek
Egyéb faktorokkal transzkripciós komplexet képeznek és serkentik, vagy gátolják az RNS polimeráz II kötődését a promoterhez.
Transzkripciós faktorok osztályozása 1. Általános transzkripciós faktorok TFIID, TFIIB, TFIIA, TFIIH, TFIIE, TFIIF Közvetlenül az RNS polimeráz II működéséhez kell. Minden sejtben megtalálható. 2. Minden sejtben jelenlévő konstitutív transzkripciós faktorok sok gén transzkripcióját aktiválja
(SP1, CCAAT-box kötő fehérje…) 3. Szövetspecifikus transzkripciós faktorok • Specifikus trasz-elemhez kötődik • Adott sejttípusban fejeződik ki • Szövetspecifikus géneket aktivál 4. Szignál függő/aktiválható transzkripciós faktorok
Transzkripciós faktorok kötődése a cisz DNS elemekhez
A humán genomban található transzkripciós faktor gének
Venter et al al al (2001) Science 291, 1304-
Cisz regulációs elemek:„enhancerek/silencerek“ enhancers
upstream promoter elements
core promoter
Cis regulációs elemek: aktivátorok (enhancerek), gátlók („silencerek”) Promoterektől a következőkben térnek el: 1. Enhancerek működéséhez szükségesek a promoterek (promoterek enhancerek nélkül is működnek, bár gyengén) 2. Az enhancerek a transzkripciós starthelytől távol is működnek, a promoterek nem 3. fordított orientációban is működnek 4. a transzkripciós kezdőhely mögött is működnek 5. enhancerek nagyon távoli helyekről is működnek A transzkripciót térben és időben szabályozottan fokozzák, vagy gátolják. Működésükhöz szükséges a transzkripciós alap-apparátus. A transzkripció iniciációját serkentik, vagy gátolják.
Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék a transzkripciós komplexhez kötődnek és növelik a transzkripció hatásfokát Lehetnek: • szövet/sejttípus specifikusak • fejlődés specifikusak • aktiválhatók
Komplex enhancerek
general transcription factors
Represszorok Represszorok a „silencerekhez” kötődnek
• gátolják az aktivátorok kötődését • közvetlenül gátolják az aktivátort • közvetlenül kötődnek az általános transzkripciós faktorokhoz
A transzkripció szabályozásában résztvevő transz-elemek
Tipikus emlős génregulációs régió
Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer ≈ 500 bp hosszú ≈10 kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.
Szövetspecfikus transzkripciós szabályozás: szövetspecifikus enhancerek-transzkipicós faktorok
Ligand-függő transzkripciós szabályozás
Nukleáris hormon receptorok: ligand függő transzkripciós faktorok
• • • •
szteroid hormonok tiroid hormonok retinidok D vitamin
Nukleáris hormon receptorok szerkezete
Nukleáris hormonreceptorok működési mechanizmusa 1: NR ligand nélkül inaktív komplexet képez a citoplzmában (hsp90)
2: Ligand kötés-nukleáris transzlokáció
2
1
3
4
3: DNS elemhez kapcsolódik koaktivátorokkal és más fehérjékkel 4: Gén transzkripció beindul 5: Más transzkripciós faktorokhoz is kapcsolódhat (NFkB, AP-1) Indirekt transzkripciós szabályozás
Aktivitás függő transzkripciós szabályozás az idegrendszerben
Szignál specifikus transzkripciós komplexek az idegsejtekben
kinases
Különböző stimulusok hatására CaMP és Ca++ reszponzív elemekhez kapcsolódnak a foszforiláció után a faktorok. Beindítják a c-fos és Bdnf transzkripciót.
CREB függő gén expressziós kaszkád aktivitása szükséges a neuronális plaszticitáshoz és a memóriához szignálok neurotranszmittertek növekedési faktorok depolarizáció
stress kinázok CREB foszforiláció C/EBP TF gén aktiváció késői gének aktivációja plaszticitás
C/EBP=CAAT enhancer binding protein
memória
Az aktivitás függő Bdnf transzkripció szerepe a GABAerg szinapszisok szabályozásában
Bdhf gén IV. exon
RNS összeszerelődés (processing)
2 processing 1 transcription
cap
splicing
poliA
Alternatív splicing típusok
Mire jó az „alternatív „splicing”? A gének exonjaiból a kódoló régiók több féle módon szerelődhetnek össze
• •
A genom kódoló kapacitását növeli Fehérjék funkcionális komplexitását növeli eltérő N-, vagy C-eltérő domén szerkezet funkcionális eltérés változik a szubcelluláris lokalizáció poszt-transzlációs modifikáció fehérje-fehérje kölcsönhatás ligand kötés
•
mRNS-ek nem-kódoló régióinak diverzitása RNS szintű szabályozás RNS szint, targetálás, stabilitás transzláció szabályozása (microRNS kötődés)
Lehet fejlődés és szövetspecifikus és “aktivitás függő” is
Splicing mechanizmus
Alternatív „splicing” mechanizmussal egy génről többféle mRNS és fehérje képződik -tropomyosin gén
Splicing világbajnok a Drosophila Dscam1 (Down Syndrom cell adhesion molecule) gén 2 Alt.
(38, 016)
A DScam1 izoformák a dendrit arborizációt a dendrit típusok között átfedést szabályozzák.
Alternatív splicing az idegrendszerben Alternatív splicing eredményeképpen képződő receptor, ioncsatorna, enzim, jelátviteli fehérje strukturális fehérje (sejtváz, sejtadhézió) formáknak eltérőek lehetnek: funkcionális tulajdonságai lokalizációja, membrán kötődése interakciói
Vannak idegsejt specifikus splicing faktorok. Az alternatív splicing-et a neuronális aktivitás is szabályozhatja.
A glutamáterg és GABAerg szinapszis képződést (gátló vagy serkentő szinaptikus specializáció) a preszinaptikus neurexin és a posztszinaptikus Neuroligin alternatív “spilce”-formái határozzák meg 3 neurxin génről összesen több mint 1000 izoforma képződhet (5 altenetív exon és 2 promoter) 4/5 neuroligin gén 2-2 splice formája 8-10 izoformát kódol. A kettő nagyszámú kombinációja sokféle gátló és serkentő szinaptikus kapcsolat kialakítását szabályozhatja.
AChE alternatív splicing: különböző szerkezetű és lokalizációjú enzimet eredményez
intron retenció alternatív 3’ exon alternatív 3’ exon hidrifil monomér
membrán-kötött dimér VVS membrán kapcsolt
tetramer szinaptikus membrán kötött
AMPA receptor alternatív splicing: flip/flop variáns
Q/R editing a Ca++ permeábilitást szabályozza Flip/Flop AS és az R/G editing a deszenzitzácót szabályozza
Idegrendszerben működő splicing faktorok
A hippocampus CA1 régiójában az NMD receptor aktiváció által kiváltott LTP-hez szükséges a NOVA2 splicing faktor NOVA2 KO egér: sIPSC, LTP NOVA2 alternatív splicing
NMDAR GABABR2 GIRK2
siPSC (lassú gátló posztszinaptikus áram)
LTP
Szinaptikus mRNS-ek, amelyek alternatív splicing-jét a NOVA szabályozza
Génműködés epigenetikus szabályozása „Olyan változások, amelyek a genom változtatása nélkül hatással vannak a fenotípusra.” Egy sejt tulajdonságainak örökletes megváltozása, amely nem jár együtt a genetikai információ megváltozásával. Génműködés epigenetikus szabályozása: nem függ közvetlenül az adott gén regulációs DNS elemeitől: kromatin (hiszton) módosítás DNS metiláció RNS interferencia RNS editálás
Epigenetikus hatások: kapcsolat a környezet és a genom között Környezeti hatások eltérő egyedi következményei: egyedi epigenetikus variabilitás környezet (toxinok, gyógyszerek, táplálkozás, sport, szociális hatások)
epigenetikus változás
személyek közötti epigenetikus variabilitás génexpressziós programozás FENOTIPIKUS VARIABILITÁS
DNS-től a kromoszómákig: A DNS kromatin formájában található a sejtmagban
Kromatinszerkezet és szerveződés
nucleosome
Nukleoszóma szerkezet
Hisztonok (H1, H2A, H2B, H3, H4) • kis fehérjék • arginin- vagy lizingazdag: pozitívan töltött • kötődik a negatívan töltött DNS-hez • poszt-transzlációs módosítás - csökkenti a pozitív töltést foszforiláció poli(ADP) riboziálció metiláció acetiláció hiperacetiláció hiszton acetiláz “laza” nukleoszómák transzkripciós aktiváció hipoacetiláció hiszton deacetiláz “szoros” nukleoszóma transzkripciós gátlás
Hiszton kód: hiszton fehérjék poszt-transzlációs módosítása
Hiszton acetiláció a kromatin kondenzációt szabályozza
Hiszton acetiláció aktiválja a transzkripciót
A transzkripciós aktivátorok és represszorok a kromatin szerkezetének módosításán keresztül is hatnak
DNS metiláció: citozin metiláció
A CpG dinukleotidok alulreprezentáltak a genomban Lehetséges dinukleotid párok
A CpG előfordulása alacsonyabb a vártnál
GG AG TG CG
– várt gyakoriság 1/16= 6.25%
oka Met-citozin spontán deaminációja timidint eredményez- csökken a CpG aránya
NH2
NH2
N O
CH3
N
N C
O
N mC
deamination O O CH3 HN HN
O N T
O
GA AA TA CA
GT AT TT CT
GC AC TC CC
megfigyelt gyakoriság ≈1%
A genomban vannak olyan régiók ahol a CpG arány megtartott, illetve magas. Itt a CpG nem metilált.
N
CpG szigetek. U
Ezek regulációs régiók.
A CpG szigetek kijelölik a promotereket
• CpG szigetek = DNS régió a várt CpG frekvenciával hossza = 200 bp -tól néhány kb-ig. • CpG a szigeten belül döntően nem-metilált, míg a CpG szigeten kívül metilált. • A humán genomban 29 000 CpG sziget van (a genom 1-2%-a) • CpG szigetek majdnem mindig promotereket és/vagy exonokat tartalmaznak. ( a gének 50-60% tartalmaz CpG szigetet. • CpG szigetben található promoterek nem tartalmaznak TATA • vagy DPE elemeket, de többszörös GC motívumokat tartalmaznak. - gyakran többszörös és gyenge transzkripciós starthellyel rendelkeznek (többszörös Sp1+Inr miatt ) • Ez a metilációs mintázat a genomot transzkripciósan aktív és inaktív zónákra osztja.
A CpG szigetek kijelölik a promotereket • A metilált és nem metilált CpG nem random található a genomban Metilált
Nem-metilált TSS
AGCGAGCGAGCGTGTATGTTCTCATTAGGGGACGATC TCGCTCGCTCGCACATACAAGAGTAATCCCCTGCTAG
Hemimetilát
• CpG promóterekhez kapcsoltak
legtöbb CpG metilált az emlős sejtekben
• A konstitutívan működő háztartási gének promoterei CpG szigetben találhatók. • Van olyan szövetspecifikus gén is, amelyiknek a promotere szintén CpG szigetben helyezkedik el.
• A CpG szigetben a CpG nem metilált- a promoter aktív. • Metilációval a promoter inaktiválható.
Gének ki-be kapcsolása DNS metilációval
BE: CpG sziget demetiláció
KI: CPG sziget metiláció
DNA metiláció funkcionális következménye Metilált promoter inaktív – A a CpG sziget mentes szövetspecifikus gének automatikusan metiláltak, ennek a következménye a globális inaktiváció, aminek a fenntartásához nem kellenek további elemek.
Metilkötő fehérje – A metilált CpG-ket a metilkötő fehérjék ismerik fel (MBP), amelyek különböző hisztonmódosító enzimeket vonzanak (HDAC-hiszton deacetiláz, HMT hiszton metil transzferáz)- következmény kromatin kondenzáció-inaktiváció. – A DNS metilációnak direkt szerepe lehet a nukleoszómák pozicionálásában is.
DNS és hiszton modifikáció együttes szerepe a kromatin-szerkezet szabályozásában
CpG-ben gazdag promoterrel rendelkező idegrendszeri gének: epigenetikus szabályozás alatt állhatnak
Epigenetikus szabályozás az idegrendszerben • egyedi gének • sejtek: idegi őssejt differenciáció (fejlődés alatt felnőttben) • jelátviteli folyamatok • szinaptikus folyamatok • plaszticitás • memória • hálózati aktivitás • oszcilláció • magatartás •kóros idegi tevékenység
Szinaptikus plaszticitás epigenetikus szabályozása
Epigenetikus szabályozás zavara: idegrendszeri betegségek
Reelin és a GAD76 promoter hipermetilációja skizofréniás betegek preforntális cortexében DNMT promoter metiláció Reelin/GAD67
csökkent gátlás dendrit tüske változások oscillációs zavarok kognitív zavarok
Génműködés poszt-transcripciós szabályozása RNS interferenciával (géncsendesítés)
• RNS-RNS interakción alapszik • poszt-transzkripciós szinten hat • mRNS-t inaktivál (transzlációt gátol) • mRNS-t szinetet csökkent (degradál) Szabályozó nem fehérjekódoló RNS-ek (npc) Eukarióta gén
mRNS + npc RNS
Fehérje
A genomban fehérjét nem-kódoló RNS gének is találhatók, amelyek szabályozó RNS-eket kódolnak
Génműködés szabályozása genom kódolt mikro-RNS-ekkel MicroRNS-ek Kisméretű nem-kódoló RNS család, amely szekvencia specifikusan szabályozza a génexpresszió különböző szintjeit.
Micro-RNS-ek képződés és hatásának mechanizmusa
A micro RNS-ek az idegrendszer fejlődésének minden lépést szabályozzák
Micro RNS-ek szerepe a szinaptikus tüske plaszticitás szabályozásában
micRNS-ek transzkripciós faktorokon, deacetilázokon, kinázokon és növekedési faktorokon keresztül szabályozzák az aktin citoszkeleton komponenseit serkentő gátló
Micro-RNS-ek és az Alzheimer kór
miRNS-ek szabályozzák az APP mRNS és a BACE1 processzáló enzimet kódoló mRNS szintjét.
An overview of selected miRNAs associated with neurological disorders miRNA
Disease
miR-9/9*
Huntington disease
Dysregulation
Target
Consequence of miRNA dysregulation
REST (miR-9)
Excessive amount of REST and CoREST in the nucleus
Downregulated CoREST (miR-9*)
miR-29a
AD
Downregulated
NAV3
miR-29a,-29b-1 miR-106b miR-107
Sporadic AD AD AD
Downregulated Downregulated Downregulated
BACE1 APP BACE1
miR-124
FXS
Downregulated
miR-133b
PD
Upregulated
miR-146a/b
Rett syndrome Downregulated
miR-181b
Schizophrenia
miR-298 and -328 miR-342-3p
AD Prion disease
miR-485-5p
AD
Upregulated in prefrontal cortex
Inactivation of neuron-specific genes NAV3 coexpressed tau neurofibrillary tangles in pyramidal neurons Increase of amyloid-β Increase of amyloid-β Increase of amyloid-β Decreased neuronal maturation
Pitx3
Repression of neuronal maturation
Irak1
An increase in the amount of Irak1 puts the brain into an inflammatory state
GRIA2 VSNL1 BACE1
Unknown Upregulated Downregulated in entorhinal cortex and BACE1 hippocampus
Decrease in neuronal outgrowth Increase of amyloid-β
Increase of amyloid-β
Poszttranszkripciós szabályozás: RNS editálás (editing) RNS-ben a DNS által kódolt nukleotid (bázis) enzimatikus reakcióval történő megváltoztatása
C-U editing A-I
guanozin a kodon szempontjából adenozin
dezaminálás
inozin
adenozin dezamináz (ADAR)
kodon változás
aminósav csere
A/I editálás az RNS különböző helyein történhet
mRNS kódoló régió- kodon változás- aminósav csere - fehérje funkció változás
5’ 3’- UTR – megváltozik az mRNS transzlációja, lokalizációja vagy stabilitás intron/splice “brach site”- megválozik az “altertnative splicing”- „új” fehérje izoforma STOP kodon eliminálódik- kódoló régió hosszabb
Nem-kódoló RNS- miRNS
biogenezis (szint) szbályozása funkció szabályozása?
A/I RNS editálás hatása neuronális receptor és csatorna funkcióra KV1.1 I/V csere kapcsolat a KVb1.1-el
GluA2- Q/R csere Ca++ permeábilitás ER exit
GABAA3 I/M csere membrán trafficing
Cav 1.3 IQ-MR csere calmodulin kötés 0
5-HT2C I-N-I/ V-S(N)-V csere G-protein kötés
editált
genom kódolt
mRNS anatómiája Az mRNS a fehérje kódoláson kívül olyan szekvenciákat és struktúrákat tartalmaz, amelyekhez fehérjék kötődve szabályozzák a transzlációt, transzportot, lokalizációt és stabilitást. 5’-UTR+ faktorok transzláció hatásfoka
3’-UTR+ faktorok mRNS transzport stabilitás transzláció
Lokális fehérjeszintézis az idegrendszer sejtjeinek nyúlványaiban Előfordul: • dedritek • axonok- növekedés, cél-megtatlás, • sérülés • glia-nyúlványok oligodendroglia- mielinizáció Asztrocita-GFAP
Aktivitás függő transzláció a dendritekben lehetővé tesz szinapszisok morfológiájának és aktivitásának egyedi szabályozását
RNS transzport és lokális fehérjeszintézis
szignál
mRNS
inaktív
aktív
Lokalizációs szignálok idegsejt-specifikus mRNS-ek 3’- nem-transzlálódó (3’-UTR) régiójában
Transzláció szabályozása a dendritekben Neurotranszmitter receptor kapcsolt útvonalak serkentő szinapszisok esetében BDNF R
szignál függő kinázok
foszforiláció
RNS kötő fehérjék
általános
miRNS
RNS specifikus
Hosszú 3’-UTR-t tartalmazó BDNF mRNS a dendritekbe transzportálódik és itt transzlálódik. Dendritikus BDNF szabályozza a dendrit tüske morfológiáját és a szinaptikus plaszticitást.
A CamK2 mRNA hosszú 3’-UTR-t eltávolítva megszűnik a dendritikus lokalizáció és zavart szenved a szinaptikus plaszticitás.
Szinaptikus aktivitás stimulálja az Arc transzkripcióját és a lokális transzlációját. Arc modulálja szinaptikus plaszticitást az AMPA receptorok endocitózisán keresztül.
CREB lokális transzlációja az axonban NGF hatására. Majd retrográd transzportálódik a sejtmagba és NGF reszponzív géneket aktivál.
A RanBP1 és importinb lokális szintézise az axonba hozzájárul a retrográd transzport jelátviteli komplex létrehozásában a sérülést követően.
A denritekben lokálisan szintetizálódott fehérjék szerepe a hippocampalis LTP-ben
A c-fos gén transzkripciójának Ca++-függő szabályozása
Neuronális aktivitás RNS kötő fehérjék Ca++ függő foszforilációján és hiszton modifikáción keresztül szabályozza az alternatív splicing-ot
Szövetspecifkus alternatív exon a fehérje-fehérje kölcsönhatást is szabályozza
Az RNS editálás megváltoztatja humán felszültségfüggő kálium csatorna tulajdonságait
