TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSA ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
BŐSZE ZSUZSANNA MTA Doktora MEZŐGAZDASÁGI BIOTECHNOLÓGIAI KUTATÓKÖZPONT 2013
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Eredet • az egyik legkésőbben háziasított állatfaj, őse az üregi nyúl (Oryctogalus cuniculus) • az üregi nyúl az utolsó jégkorszak után terjedt el Spanyolországból, részben oly módon hogy királyi vadas parkokba telepítették Klasszikus alkalmazási területei fiziológia vizsgálatok pl. vérkeringés, vérnyomás, • toxicítás vizsgálatok pl. gyógyszerek tesztjei • ellenanyag termelés • értékes szarvasmarha embriók szállítása Gyakorlati alkalmazás • hús, szőrme és angóra fonal • hobby állat
Transzgenikus nyúl előállítása mikroinjektálássalsematikus ábra Donor nőstény
Petevezető
DNS Embriótartó pipetta
Előmag mikroinjektálás Embrióbeültetés
PCR analízis Álvemhes nőstény
Southern analízis
TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLÍTÁSA MIKROINJEKTÁLÁSSAL
Hormon kezelések: Donorok • 6x FSH vagy 1xPMSG • HCG+ 2x termékenyít Recipiensek • HCG vagy GnRh Embrió transzfer sebészeti vagy laparoszkópos eljárással Módszer hatékonysága • 1-2% transzgénikus alapító/ injektált és beültetett embrió
PLAZMID ALAPÚ TRANSZGÉN ELVI SZERKEZETE
IRES (internal ribosomal entry site) = vírus eredetű DNS szekvencia, amely lehetővé teszi a transzláció iniciációját a mRNS 5’ CAP-tól függetlenül
Fényképalbum szerző: Bősze Zsuzsanna
Transzgenikus nyúl előállítása mikroinjektálással saját felvételek
A véletlenszerű transzgén beépülés és a célzott génbeépítés összehasonlítása
„Hagyományos” előmag mikroinjektálással random, véletlenszerű transzgén beépülést tudunk elérni, sem a beépülés helyét sem a beépült transzgén kópiaszámot nem tudjuk meghatározni
Problémák a hagyományos mikroinjektálással:a véletlenszerűen beintegrálódó transzgén kromoszómális környezete által okozott változások a transzgén kifejeződésében-pozíció effektust eredményeznek
A sejtmagban a gének expressziós doménekbe szerveződnek
3D functional architecture of the nucleus in animal and plant kingdoms
Visualization of genomic regions of different sizes by FISH. J. Localization of genes encoding casein (green) andwhey acidic protein (white) in the nucleus of HC11 cells after hybridization with gene specific BAC probes and DNA staining with propidium iodide(red). K. Localization of 3 genomic regions (about 100 kbp) with 3 BAC probes (2 in green and one in red) in an A. thaliana leaf nucleus L. Territory of chromosome 15 (green) in the nucleus of a cultured rabbit embryonic fibroblast; DNA counterstained with propidium iodide (red)
Megoldás:a pozíció hatás kivédése nagy méretű kromoszóma darabok bejuttatásával
Véletlenszerűen integrálódott transzgénre ható távoli szabályozó elemek
http://futuresoft.org/MAR-Wiz
centromer FLT3LG
FCGRT
FcRn génje
64496
69296
74096
78896
83696
88496
93296
98096
102896
107365
telomer MAR helyek keresése az IgG kötő FcRn régióban http://www.futuresoft.org/MAR-Wiz/
BAC TRANSZGENIKUS EGÉRMODELL LÉTREHOZÁSA Az IgG kötő FcRn szerepe a transzcitosisban és az IgG katabolizmusában vizsgálatára Bender és mtsai. Transgen Res. 16:613-27. 2007.
Ghetie and Ward. 2002. Immunol Res. Rojas and Apodaca 2002. Nat Rev Mol Cell Biol
BAC transzgenezis előnyei Integrációs helytől független, kópiaszámfüggő génkifejeződés. Az endogén génnel megegyező szövet- és fejlődésspecifikus kifejeződés függetlenül attól, hogy milyen más emlősből származik a transzgén. Alkalmas a géntől nagy távolságban elhelyezkedő szabályozó elemek vizsgálatára.
MM
1
2
3
4
5
6
7
8
9#
1. BAC 128E04 5’ vég 2. FLT3LG 3. LOC53916
14#
4. FCGRT -lánc kódoló gén 5. LOC522073 6. LOC511234
19#
7. LOC511253 8. BAC 128E04 3’ vég BAC
BAC128E04: 107 kb 6000
12000
18000
24000
30000
36000
42000
48000
54000
59696
64496
69296
74096
78896
83696
88496
93296
98296 102896 107365
RELATIVE POSITION (Base Pairs)
centromer
FLT3LG
LOC539196
FCGRT
LOC522073
LOC 511234
LOC511235
telomer
Kópiaszám meghatározása Real-Time PCR-rel QPCR_b_actin
QPCR_bFcRn
36 35
32 Slope: -3.75 ± 0.27 R2: 0.989
31 30
33
Ct value
Ct value
34
32 31
29 28 27
30
26
29 28 2.50
Slope: -3.16 ± 0.19 R2: 0.992
2.75
3.00
3.25
3.50
3.75
4.00
25 2.75
3.00
3.25
14
19
gene Mouse -actin bFcrn Mouse -actin bFcRn
3.75
4.00
4.25
logQ
logQ
#line
3.50
Ct
Absolute quantity Absolute quantity of gene in sample of cell number (AGN) in sample (ACN)
31,01 28,86
3760,49 3852,48
1880,248
30,89 27,05
4075,44 10468,18
2037,722
bFcRn copy number (ACNbFcRn/ACN)
Estimated copy number of bFcRn transgene in a diploid hemizygous animal
2,04
2
5,13
5
14# vonal heterozigóta: 2 kópia homozigóta: 4 kópia 19# vonal heterozigóta: 5 kópia homozigóta: 10 kópia
B.
Kópiaszám függőlu nexpresszió liv ekimutatása r g n e w b o rn in te s tin e
Western blot 500 bp (tüdő szövetből)
A.
1
2
3
1
25000
WT
C. denzitás
2
5
6
7
3
bov
6
**# 1 9
#14 he
9
he
ho
1
h o totalRNA
bFcRn
*
15000
* 10000 5000
4
0
1
2 ine WT bov
23
4
4 5
5 10
6
integrált bFcRn gének száma
1. FVB/N egér 0 kópia
1. +K (B4 sejtvonal) 2. FVB/N egér 0 kópia C.
denzitás
3. 14# 2 kópia
4. 19# 5 kópia
8
2 Northern 3 4 blot 5 (máj szövetből)
20000
B.
1
4
25000
2. Szarvasmarha 2 kópia
20000
* 3. 14# 2 kópia heterozigóta
15000
* 4. 14# 4 kópia homozigóta
10000
**
5. 19# 5 kópia heterozigóta
5000 0
6. 19# 10 kópia homozigóta
tot bF
A laboratóriumi nyulat poliklonális ellenanyag termelésre használják világszerte
IgG védelem az FcRn transzgenkus nyúlban
TG (+/+) WT
6 4 2
) (+ /+
14
TG
7
Time (days)
W T
0
10
Total IgG 15
* 10
5
0
)
days; AVGSEM
50
*
8
Total IgG (mg/ml) SEM
10
100
Percent remaining (%)
C
(+ /+
Half-life of rabbit IgG
TG
B Elimination of OVA-spec IgG in vivo
W T
A
ALTERNATÍV MÓDSZER A MIKRONJEKTÁLÁSHOZ: LENTIVIRUS VEKTOROKKAL TÖRTÉNŐ TRANSZGÉN BEVITEL
HARMADIK GENERÁCIÓS LENTIVÍRUS VEKTOROK ELŐÁLLÍTÁSA
A PRONUKLEUSZ MIKROINJEKTÁLÁS ÉS SZUBZONÁLIS LENTIVÍRUS TRANSZDUKCIÓ MÓDSZER ÖSSZEHASONLÍTÁSA (Fassler R. EMBO Reports 5. 28. 2004.)
LENTIVÍRUS TRANSZGENEZIS ÖSSZEHASONLÍTÁSA A MIKROINJEKTÁLÁSSAL
ÖSSZEHASONLÍTOTT TULAJDONSÁGOK
MIKROINJEKTÁLÁS
LENTIVÍRUS TRANSZDUKCIÓ
TRANSZGÉN MÉRETHATÁR
≤ 50 KB (PLAZMID)
≤ 8 KB
EMBRIÓ TÚLÉLÉS
ALACSONY
MAGAS ≥ 70%
TRANSZGENIKUS UTÓDOK ARÁNYA
1-2-5 -10 % /FAJTÓL FÜGGŐEN/
20-100%
INTEGRÁLÓDOTT TRANSZGÉN KÓPIASZÁM
ÁTLAGOSAN 1-5 (50) KONKATAMER EGY HELYRE
EGY HELYRE MINDIG CSAK 1 DE TÖBB HELYRE IS BEÉPÜLHET
Zöld jelzőgént kifejező egér előállítása lentivírus transzgenezissel Bősze Zs. és munkatársai-Kvell K. (Pécsi Egyetem) Transgen Res. 19:105-12. 2010.
Lenti vírus transzgenezis gazdasági állatokon
Fiziológiai és anatómiai modell Betegség modell Xenotranszplantáció
Hoffmann et al. (2003)
Zöld jelzőgént kifejező transzgenikus nyúl lentivírus transzgenezissel
Hiripi és mtsai. Transgenic Res. 2010. Jan 13. [Epub ahead of print]
EGFP EXPRESSZÁLLÓ LENTVÍRUS TRANSZGENIKUS EMBRIÓK ÉS NYÚLSAJÁT EREDMÉNYEK
LENTIVÍRUS TRANSZGENIKUS UTÓD 14 napos p.c. embrió A,B: nem transzgenikus C,D: transzgenikus embrió
A
C
B
D
7 l / slot Control cerebellum
Control heart
Control liver
SIV9 BT liver
35 kDa
35 kDa
Control skin
Control spleen
Control pancreas
Control kidney
Control lung
SIV6 JT liver
SIV6 JT heart
SIV6 JT skin
SIV9 BT liver
SIV6 JT lung
SIV6 JT kidney
SIV6 JT pancreas
SIV6 JT spleen
SIV6 JT cerebellum
SIV9 BT lung
SIV9 BT spleen
SIV9 BT kidney
SIV9 BT liver
35 kDa
5 l / slot
7 l / slot
LENTIVÍRUS TRANSZEGIKUS ALAPÍTÓ NYULAK WESTERN ANALÍZISE
SIV9 BT liver
SIV9 BT pancreas
SIV9 BT cerebellum
SIV9 BT skin
SIV9 BT heart
SIV9 JBK ear
SIV7 BKK ear
SIV10 JBK+JT ear
SIV3 F1 placenta
SIV7 JT ear
SIV7 JKK ear
SIV9 JKK ear
SIV9 BT ear
SIV9 JTBT ear
SIV6 JT ear
Dead #2 (SIV9 JTBT F1)
Dead #1 (SIV9 JTBT F1)
SIV3 F1 placenta
Működési mechanizmus YFP YFP
YFP
- transzpozáz - genom
Transzgénikus blasztociszta
3,5 napos YFP-t expresszáló blasztociszta
Kimosott embriók
Beültetett embriók
Recipiens/ ellések
Transzgén utódok/ összes
Transzgénikus vonalak
644
472
25/10 40 %
7/46 15 %
4
Alapítók
F1 generációs TG utódok
AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ELŐNYEI ÉS HÁTRÁNYAI BAC Lentivírusos SB transzpozon transzgenezis transzgenezis rendszer
Hatékonyság
1-6 %
20-60 %
15 %
Kapacitás
>2 Mb
<10 kb
<6 kb
Integráció
random
random
random (TA)
konkatamer
egyedi
egyedi
≈ 80-100 %
60-90 %
100 %
+++++
+
++++
Integráció formája Expresszió Örökítés
ÚJGENERÁCIÓS MÓDSZEREK TRANSZGÉNIKUS NYÚL ELŐÁLLÍTÁSRA • Mesterséges kromoszóma /BAC/ mikroinjektálása • Lentivírus transzdukcióval először hoztunk létre GFP-TR-nyulat • Transzpozon/ sleeping beuty/ mediált transzgén beépülés először hoztunk létre Venus-TR-nyulat • Tervezett:célzott génkiütés ZFN nukleázzal Bender és mtsai. Transgenic Res. 2007;16(5):613-27. Hiripi és mtsai. Transgenic Res. 2010, 19(5):799-808 Catunda és mtsai. PlosOne 2012. 7(1):e28869.
Zinc Finger Proteins = DNA transcription factors Sequence specific DNA-binding proteins
The "classic zinc finger protein” -2 Cys, 2 His and 3 hydrophobic AA: framework of tertiary folding -first described in the mid 80s -ZFP ~2-3 % of genes in many species !
Cys2His2 sequence specific DNA-binding proteins • The individual zinc finger domains typically occur as tandem repeats with two, three or more fingers comprising the DNA-binding domain of the protein. These tandem arrays can bind in the major groove of DNA and are typically spaced at 3-bp intervals. The α-helix of each domain (often called the "recognition helix") can make sequence specific contacts to DNA bases
Zinc Finger Nucleases or chimeric nucleases Kim et al. PNAS 93:1156.1996 The two monomer subunit dimerization activates the FokI endonuclease to create double strand break
If the zinc finger domains are perfectly specific for their intended target site then even a pair of 3-finger ZFNs that recognize a total of 18 basepairs can theoretically target a single locus in a mammalian genome.
Quantifying ZFN efficiency The mismatch assay consists of amplifying the target region from ZFNtreated genomic DNA via standard PCR. Resultant PCR products are denatured and allowed to re-anneal. A fraction of re-annealed products will contain bulges of DNA where heterogeneous mismatches occur. A mismatch sensitive enzyme Cel I is added to the reaction, cleavage of the DNA duplexes occur at the site of the nucleotide mismatch. PCR pools are analyzed via PAGE and sequencing. Surveyor mutation detection kit Transgenomic Inc.
ZFN-driven Targeted Gene Knockout or Homologous Recombination Eukaryotic cells • bone marrow (IL2Rγ) • CD4+ T cells (CCR5) • CHO • human ES and iPS cells • Rat one-cell embryos
• Porteus & Baltimore, Science 2003 • Perez et al., Nat. Biotech, 2008 • Santiago et al., PNAS 2008 • Liu et al. 2009. • Hockemeyer et al. Nat. Biotech. 2009 • Geurts et al., Science 2009 • Mashimo et al. PlosOne 2010
X-SCID KNOCKOUT RAT /Mashimo et al. Plos One 5. 8870.2010/
EGYÉB ALTERNATÍV MÓDSZEREK TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSÁRA •
SZOMATIKUS SEJTBE TÖRTÉNŐ GÉNBEVITEL MAJD KLÓNOZÁS
•
Transzgenikus felnőtt fibroblaszt sejtek Tg(Wap-GH1) gén marker mikrosebészeti eljárással enukleált blasztomerbe juttatva egy két sejtes nem transzgenikus embrió egyik sejtjébe, 1.2% transzgenikus utód /Skrzyszowska és mtsai Biol Reprod. 76:1114. 2006.
•
SPERMÁVAL TÖRTÉNŐ GÉNBEVITEL
•
Exogén DNS/DMSO inkubálása spermával,majd herébe történő injektálása, 36 élő tr nyúl /56,3%/ PCR és Southern is. /Shen és mtsai. Mol Reprod Dev. 73:589. 2006/
•
85-ből 29 (34.1%) IVF embrió transzgenikus lett DMSO mediált spermába történő transzgén bevitelnél. 21-ből 17 tr nőstény nyúl termelt humán lactoferrint a tejében 153 ug/ ml mennyiségben /Li és mtsai. Reprod Fertil Dev. 18:689. 2006/
•
NINCS ÚJABB KÖZLEMÉNY EGYIK MÓDSZERREL SEM!!
TRANSZGENIKUS NYULAK FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI BIOFARMING • GYÓGYHATÁSÚ FEHÉRJÉK VAGY PEPTIDEK TERMELTETÉSE GÉNMÓDOSÍTOTT ÁLLATOK TEJÉBEN
HUMÁN BETEGSÉGEK MODELLÁLLATAI • LIPID ANYAGCSERE ÉS ÉRELMESZESEDÉS • SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK • SZÍVRITMUS ZAVAROK
SAJÁT BIOFARMING EREDMÉNYEINK MEZŐGAZDASÁGI BIOTECHNOLÓGIAI KUTATÓKÖZPONT GÖDÖLLŐ TRANSZGENIKUS NYÚLTEJBEN TERMELT FEHÉRJÉK • HUMAN VIII VÉRALVADÁSI FACTOR /Hiripi et al. DNA and Cell Biology 22. 41-45. 2003/ • HUMAN SZÖVETI NEM SPECIFIKUS ALKALIKUS FOSZFATÁZ (TNAP) /Bodrogi et al. Transgenic Research 15. 627-636. 2006/ • FENILALANIN MENTES KAPPA KAZEIN /Baranyi et al. J. Biotechnology 128. 383-392. 2007/
FONTOS WEB HELYEK BioProtein Technologies – tr nyúlon alapuló ellenanyag, peptid, fehérje vakcina termelés http://www.bioprotein.com/gb/open.htm#Séquence_1 PHARMING http://www.pharming.com/ humán C1 inhibitor Örökletes Angioödéma- III fázisú klinikai kísérletek GFP Bunny –transzgenikus állatok ihlette művészeti alkotások http://www.ekac.org/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor
