TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSA HUMÁN BETEGSÉGMODELL CÉLJÁBÓL
BŐSZE ZSUZSANNA 2013
Transzgenikus nyúl előállítása mikroinjektálással • • • • • •
Donorok 6x FSH vagy 1xPMSG HCG+ 2x termékenyít Recipiensek HCG vagy GnRh embrió transzfer sebészeti vagy laparoszkópos eljárással • Hatékonysága • 1-2% transzgénikus alapító/ injektált és beültetett embrió
Donor nőstény
Petevezető
DNS Embriótartó pipetta
Előmag mikroinjektálás Embrióbeültetés
PCR analízis Álvemhes nőstény
Southern analízis
Nyúl zygóták mikroinjektálása és embrióbeültetés
MIKROINJEKTÁLÁS
EMBRIOTRANSZFER
MIÉRT JELENT A NYÚL MINT MODELLÁLLAT VALÓS ALTENATÍVÁT AZ EGÉRHEZ KÉPEST ?
• A NYÚL-FŐEMLŐS FILOGENETIKAI TÁVOLSÁG AZONOS A RÁGCSÁLÓFŐEMLŐSSEL • A RÁGCSÁLÓ SZEKVENCIÁK EVOLÚCIÓJA GYORSABB EZÉRT A NYÚL GÉNEK KÖZELEBB ÁLLNAK A HUMÁNHOZ • A NYÚL LÉNYEGESEN KÖZELEBB ÁLL AZ EMBERHEZ MINT BÁRMELY MÁS HÁZIÁLLAT
GÉN SZABÁLYOZÁS ÉS GÉNKIÜTÉS
Transzlációs kutatások, gyógyszerkutatás
TR NYÚL MINT HUMÁN BETEGSÉGEK MODELLÁLLATA I. LIPID ANYAGCSERE, ÉRELMESZESEDÉS • RÉGÓTA ISMERT HOGY A KOLESZTERIN GAZDAG DIÉTA SULYOS HIPERKOLESZTERIMÉNIÁT ÉS GYORSAN KIFEJLŐDŐ ÉRELMESZESEDÉST OKOZ ÚJZÉLANDI FEHÉR NYULAKBANLABORATÓRIUMI EGÉRTÖRZSEKBEN NEM • TÖBB OLYAN SPONTÁN MUTÁCIÓT HORDOZÓ NYÚLTÖRZSET IRTAK LE ÉS TARTANAK FENN, AMELYEK KÜLÖNBÖZŐ HUMÁN LIPID ANYAGCSERE BETEGSÉGEK MODELLJEI • WATANABE ÖRÖKLŐDŐEN HIPERLIPIDÉMIÁS NYULAK: CSALÁDI HIPERKOLESZTEROLÉMIA MODELLJEI- AZ ILYEN NYULAK SZÍVINFARKTUST KAPNAK 2 ÉVES KORIG EMBEREKNÉL A BETEGSÉG KIALAKULÁSÁÉRT FELELŐS HOMOZIGÓTA MUTÁNS GÉNT HORDOZÓ GYEREKEK A NORMÁLISNÁL 3-7X MAGASABB KOLESZTEROL SZINTŰEK ÉS GYAKRAN INFARKUST KAPNAK MÉG TINÉDZSER KORUKBAN
Normal
Normal
WHHL
Normál
Mérsékelt
Súlyos
HUMÁN BETEGSÉG MODELLÁLLATA II. LIPID ANYAGCSERE, ÉRELMESZESEDÉS • A NYÚL LIPID ANYAGCSERÉJE, ENZIMJEI, A LIPOPROTEINEK KÉMIAI ÖSSZETÉTELE NAGYMÉRTÉKBEN HASONLÓ AZ EMBERÉHEZ, MÍG AZ EGÉRÉ KÜLÖNBÖZIK ATTÓL • NAGY SZÁMÚ TRANSZGENIKUS NYÚLTÖRZSET ÁLLITOTTAK ELŐ, MELYEKET EGYMÁSSAL ILLETVE A MUTÁNS NYÚLTÖRZSEKKEL KERESZTEZVE VIZSGÁLHATÓAK A LIPIDANYAGCSERE FEHÉRJEFEHÉRJE KÖLCSÖNHATÁSAI
MAGAS KOLESZTERIN TARTALMÚ DIÉTÁVAL KIVÁLTOTT ATHEROSZKELRÓZIS HUMAN apo(a) TRANSZGENIKUS NYULAKBAN / Fan and Watanabe 2003/
Lipid festés az aortában
Koronáriák csökkent átmérője transzgenikus nyulakban
HUMÁN BETEGSÉG MODELLÁLLATA SZIVIZOM SZERKEZET- MŰKÖDÉS, SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK
• A NYÚL SZÍV- SZEMBEN AZ EGÉRÉVEL - MÉRETÉNÉL ÉS FEHÉRJE ÖSSZETÉTELÉNÉL FOGVA IS JOBBAN HASONLÓ AZ EMBERÉHEZ, EZÉRT • KÖNNYEN ADAPTÁLHATÓAK A HUMÁN CÉLRA KIFEJLESZTETT MŰSZEREK • A SZÍVIZOM ÖSSZEHÚZÓDÁSOK IDŐTARTAMA KÖZELEBB ÁLL AZ EMBERÉHEZ
SZIVIZOM SZERKEZET- MŰKÖDÉS, SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK • A SZÍVKAMRA FAL FELÉPÍTÉSÉBEN EMBERBEN ÉS NYÚLBAN -MIOZIN NEHÉZ LÁNC VAN TÖBBSÉGBEN, MÍG AZ EGÉRBEN -MIOZIN • A -MIOZIN MUTÁCIÓJA EMBERBEN ÖRÖKLŐDŐ SZÍVNAGYOBBODÁST OKOZ- MELYNEK MODELLEZÉSÉRE TRANSZGENIKUS NYULAKAT ÁLLÍTOTTAK ELŐ
• A MUTÁNS -MIOZINT HORDOZÓ TRANSZGENIKUS NYULAK FENOTÍPUSA NAGYMÉRTÉKBEN AZONOS AZ EMBERÉVEL, EZÉRT ALKALMAS KLINIKAI VIZSGÁLATOKRA, PL. DOPPLER ANALIZIS A SZIVIZOMÖSSZEHÚZÓDÁSOK VIZSGÁLATÁRA, GYÓGYSZERKIPRÓBÁLÁSRA
EGY PÉLDA SZÍVIZOMSZERKEZET MEGVÁLTOZATÁSÁRA: MUTÁNS HUMÁN TROPONIN1- T TERMELŐ TRANSZGENIKUS NYULAK ELŐÁLLÍTÁSA
Mutáns troponin 1 (arg/gly csere) Nyúl béta miozin promóter: szívkamra specifikus, kópiaszám függő expresszió Egy tr vonala normál troponin1-el Három tr vonal a mutánssal Sanbe et al. Circulation 111. 2330. 2005
MUTÁNS HUMÁN TROPONIN1- T TERMELŐ TRANSZGENIKUS NYULAK SZÍVIZOMSZERKEZETE Sanbe et al. Circulation 111. 2330. 2005
Magas tr kópiaszám = 40-50%-nál nagyobb mutáns fehérje arány = egy hetes kor körüli elhalálozás szívműködési zavar következtében ! Alacsony kópiaszám /2/ = 28% mutáns fehérje, fiatalon tünetmentes Másfél kétéves korban fokális fibrózis, izomsejtek random elrendeződése, kamra fal megvastagodás A normál troponin 1 túltermeltetése tünetmentes!
TRANSZGENIKUS NYÚLMODELLEK SZÍVRITMUS ZAVAROKRA ÉS HIRTELEN HALÁLRA
•
•
AZ EGÉR SZÍV 10x GYORSABBAN VER MINT AZ EMBER
A NYÚL SZÍVBEN Ca 2+ ÁRAMOK KONTRAKCIÓKOR HASONLATOSABBAK AZ EMBERÉHEZ •
HUMÁN ÉS FELNŐTT NYÚL PITVAR ALFA MIOZIN NEHÉZ LÁNCOT, MÍG A KAMRA BÉTA MIOZIN NEHÉZ LÁNCOT TERMEL, AZ EGÉRBAN CSAK ALFA MIOZIN VAN •
A SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS TACHYKARDIÁK MELYEK GYAKRAN HIRTELEN SZÍVHALÁLHOZ VEZETNEK TR EGÉRMODELLEKEN NEM TAPASZTALHATÓAK
VERSUS
SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation 118. 2246. 2008. LONG QT SZINDRÓMA: ÖRÖKLŐDŐ BEETEGSÉG, MELYET AZ ECG QT INTERVALLUM MEGHOSSZABBODÁSA, KAMRAI TACHYKARDIA ÉS FIATAL KORI HIRTELEN SZÍVHALÁL JELLEMEZ A REPOLARIZÁCIÓBAN RÉSZT VEVŐ K+ CSATORNA ALKOTÓ FEHÉRJÉK MUTÁCIÓI OKOZZÁK LQT 1 ÉS LQT 2 TIPUSÚ BETEGSÉGEKET MODELLEZTEK TR NYULAKBAN
SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation 118. 2246. 2008.
TRANSZGÉN: NYÚL BÉTA MIOZIN PROMÓTER ÉS MUTÁNS HUMÁN CSATORNAFEHÉRJE cDNS-e
SZÍVRITMUS ZAVAROK ÉS HIRTELEN SZÍVHALÁL A HOSSZÚ QT SZINDRÓMÁVAL RENDELKEZŐ TRANSZGENIKUS NYULAKBAN Brunner et al. J. Clinical. Investigation 118. 2246. 2008. Extrasystole in LQT2 rabbit
Kamrai tachykardia LQT2
Normál nyúl kamrai tachykardia
Transzgenikus nyúl mint a retina degeneráció modellje Kondo és mtsai. 2009
• A retina pálcikák és csapok progressziv degenerációja 1:4000 gyakoriság • Számos gén mutációja okozhatja, leggyakoribb a rodopszin domináns negatív mutációja (25-40%) • A nyúl nagy szeme fontos a kezelések kifejlesztésében
150 kb hosszú BAC klón 5 exonban mutáció Red/ET BAC rekombinációval
BAC klón tisztítása PFGE-vel és Southern analízis az alapítók detektálására
Immunhisztológia a pálcikák és csapok kimutatására
A transzgenikus nyulak retinájából hiányoznak a pálcikák 48 hetes korukra
GFP NYÚL • A ZÖLD FLUORESZCENS FEHÉRJÉT MINDEN SEJTJÜKBEN TERMELŐ NYULAK UV FÉNNYEL MEGVILÁGÍTVA ZÖLDEK (Boulanger et al. 2002) •
A GFP NYULAKAT EGYEBEK KÖZÖTT RECEHÁRTYA ÁTÜLTETÉS KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLJÁK
• A GFP NYÚL /ALBA/ MŰVÉSZI TELJESÍTMÉNYEKRE ÖSZTÖNZÖTT SZÁMOS MŰVÉSZT http://www.ekac.org/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor
• HATÁSÁRA SZÉLESKÖRŰ VITA BONTAKOZOTT KI FRANCIAORSZÁGBAN A GMO ÁLLATOK SZEREPÉRŐL ÉS ELFOGADOTTSÁGÁRÓL
2009-ben öt lagoglyphic csillagközi üzentet továbbítottak a Lepus csillagképbe mely 29 év múlva fog megérkezni
FONTOS WEB HELYEK BioProtein Technologies – tr nyúlon alapuló ellenanyag, peptid, fehérje vakcina termelés http://www.bioprotein.com/gb/open.htm#Séquence_1 PHARMING
http://www.pharming.com/ human C1 inhibitor (rhC1INH)-Hereditary Angioedema-Clinical Phase III trials
GFP Bunny –transzgenikus állatok ihlette művészeti alkotások http://www.ekac.org/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor
Fényképalbum szerző: Bősze Zsuzsa
