PROGRAM NEUROVĚDY A MOL. DRÁŽDIVOST 07 8. 40- 9.25 Teorie vzniku membránového potenciálu a Na-K-pumpy - F.Vyskočil 9. 30-10.15 Napěťově závislé iontové kanály - J. Krůšek Přestávka 10. 30 – 11.25 Iontové kanály aktivované neuropřenašeči – L. Vyklický ml. 11. 30 -12. 15 Iontové kanály aktivované sensorickými podněty – V. Vlachová
PODSTATA BIOPOTENCIÁLŮ Několik axiomů o klidovém a akčním potenciálu, vnitřek buňky minus, vnějšek plus. Hlavní kationty uvnitř K+, vně Na+. V klidu je membrána propustná pro draslík, je otevřeno mnoho draslíkových kanálů různého typu, především . Při akčním potenciálu se otevírají dosud zavřené sodíkové kanály, sodík vstupuje dovnitř buňky, což buňce nesvědčí.
+ -
Vnitřek je sice elektricky neutrální – stejný počet kladných i záporných nábojů, ALE VZHEDEM K VNĚJŠKU JE elektricky záporný. Na této polaritě se podílejí hlavně záporně nabité molekuly, které nemohou volně procházet membránou a jsou drženy uvnitř buňky (ATP,CP, isothionát, záporně nabité zbytky postranních aminokyselin proteinů aj.).
Na+ Cl-
A
K+
ROZDĚLENÍ iontů uvnitř a vně: • JAK SE UDRŽUJE? • K ČEMU SLOUŽÍ?
[Ca2+] ~ 10-7 M
-
+
Nejprve popišme MODELOVOU situaci, kdy je
jen pro K+ .
membrána propustná
Protože je nitrobuněčná koncentrace K+ vysoká (100 - 150 mM, zde 120 mM) oproti 2,5 mM vně, mají K+ ionty tendenci k difúznímu pohybu do místa své nízké koncentrace, tj. ven z buňky. Jakmile se kladné K+ ionty počnou pohybovat draslíkovými kanály ven, vzniká rozdíl nábojů mezi oběma stranami membrány, neboť komplementární A- nemohou provázet z buňky unikající K+. Vnitřek buňky začíná být tedy záporný vzhledem k vnějšku. Tento vznikající potenciálový rozdíl začne brzdit pohyb K+ iontů ven na základě Coulombova zákona o přitažlivosti záporně nabitých částic či polí, až se K+ přesun zastaví. Dochází k dynamickému rovnovážnému stavu, elektrochemické rovnováze pro draslík, kdy je vyrovnána difúzní síla ženoucí K+ z buňky po koncentračním spádu opačnou silou, rozdílem potenciálů, bránícím tomuto pohybu.
Oddělení nábojů na membráně znamená, že na vnitřní straně je přebytek záporných nábojů a na straně vnější je přebytek kladných nábojů. Zdá se, že je tím porušen výše uvedený princip elektrické neutrality, a je to pravda. Kvantitativně však způsobuje oddělení nábojů tak nepatrné změny v koncentraci aniontů a kationtů, že je ani nelze změřit. Např. modelová buňka nechť má poloměr 25 μm. Pak při koncentraci 120 mM obsahuje uvnitř 4×1012 kationtů a stejné množství aniontů. Při MP = -85 mV lze vypočítat, že na vnitřní straně je přebytek asi 4×107 negativních nábojů, což je jedna stotisícina jejich celkového počtu. Neboli na každých 100 000 kationtů připadá uvnitř buňky 100 001 aniontů, což je rozdíl skutečně zanedbatelný.
Na rozhraní ( membráně) probíhá tento nepatrný přesun elektricky nabitých chemických částic - iontů . Na membráně se ustavuje dynamický elektrochemický potenciál Δμi, jehož velikost je určena dvěma členy. První, logaritmický člen, je odvozen z difusní (osmotické) práce, druhý představuje práci elektrickou, přesun určitého množství nábojů z jednoho do druhého roztoku. [xi]II ~ Δμi = RT ln + nFΔψ [xi]I [xi] je koncentrace (obecného) iontu xi v roztocích I a II, F je Faradayova konstanta (náboj jednoho molu elektronů, asi 96 000 coulombů/mol), a n (nebo někdy z) je valence iontu (např. n=+1 pro K+ a –1 pro Cl-).
ΔΨ je rozdíl elektrických potenciálů ve voltech, což nás bude zajímat jako MEMBRÁNOVÝ POTENCIÁL.
Nernstova rovnice Jak bude popsán rovnovážný stav, za kterého je ustaven ~ rovno klidový membránový potenciál? Za rovnováhy je Δμ i nule (k žádné změně nedochází). Pak převedením členu elektrické práce nalevo a zpět napravo nF (do jmenovatele) získáme Nernstovu rovnici:
0=
[xi]II Δμi = RT ln + nFΔψ [xi]I ~
RT [xi]II Δψi = ln nF [xi]I
(9)
Za prostředí I a II můžeme dát o (vně, outside the cell) a i (inside the cell).
ΔΨ je tedy potenciál(ový rozdíl) mezi vnitřkem a vnějškem buňky,za stavu, kdy přes membránu neteče žádný difusní proud. Říká se mu též ROVNOVÁŽNÝ POTENCIÁL (s patřičným indexem pro ten který iont: K+ ionty ⇒ EK).
[K+]out ln EK = +] [K in nF RT
EK =
RT nF
ln
[K+]out [K+]in
Byl-li by v buňce jen K+ , je EK roven Klidovému Membránovému Potenciálu (KMP, nebo Vm). Jakou by měl tento KMP hodnotu? Pro zjednodušení řekněme, že uvnitř je [K+]i = 100 mM a venku [K+]o = 10 mM. R = univerzální plynová konstanta (8,314 J.mol-1. K1), F= Faradayova konstanta (náboj jednoho molu elektronů , asi 96 500 coulombů),
T = teplota v kelvinech, z = valence iontu, o nějž jde, s patřičným znaménkem (pro K+ = +1).
Výraz RT má rozměr voltů a při tzv. pokojové teplotě 20 oC (293 K) zF
se rovná 25 mV. Převedením logaritmu na dekadický (×2,3) nabývá rovnice formu K + ]o Vm = (58 mV) log [K+]i = (58 mV)(log 10 – log 100) Vm
= 58 (-1)= -58 mV
Pro savce a jejich fyziologickou teplotu 37 oC je EK při poměru koncentrací vně :uvnitř buňky draslíku 1 : 10 vyšší ⇒ ne -58 mV, ale -61 mV. V našem modelu je poměr koncentrací draselných Iontů uvnitř a vně svalového vlákna 1 : 56, což vede k hodnotě 58 log (1/56) ≈- 100 mV.
E
Rovnovážný potenciál nějakého iontu lze také jinak charakterizovat jako potenciál, při němž neteče pasivně iontovými kanály žádný elektrický, zde tedy i difusní proud - ani z buňky, ani do buňky. Někdy se také označuje jako
potenciál reversní (Vr),
protože na jeho úrovni se mění směr toku proudu přes membránu; v případě draslíku teče K+ proud ven při kladnějších hodnotách KMP než je EK a dovnitř, jestliže buňku uměle „hyperpolarizujeme“ na zápornější potenciál než je Vr, tekou ionty draslíku naopak do buňky.
Pro každý elektrogenní ion lze teoreticky vypočítat jeho rovnovážný potenciál, nutný pro kompensaci koncen tračního rozdílu, za situace, kdyby byla membrána pro tento ion propustná ideálně (t.j. pohyblivost iontu by byla stejná jako ve vodě) a propustnost pro ostatní ionty by byla nulová.
Řada buněk, např. svalových, má dobře propustné kanály i pro druhý hlavní elektrogenní ion, chloridový- Cl- . Ten prochází naproti tomu z extracelulárního prostoru do buňky, ale protože je nabit opačně, přispívá k téže standardní polarizaci membrány, kdy je minus uvnitř.
Také pro chloridové anionty je možno napsat Nernstovu rovnici: ECl =
RT F
ln
[Cl]in [Cl]out
a protože valence chloridových aniontů je záporné číslo (z = -1), ECl = -58 log [Cl-]o/[C-]i neboli díky pravidlům logaritmování ECl = +58 log [Cl-]i/[Cl-]o. Při srovnatelně stejně vysokých propustnostech klidové membrány pro Cl- a K+ platí v ekvilibriu rovnost příspěvku obou iontů: RT F
ln
[K+]out = [K+]in
-
RT F
ln
[Cl-]out [Cl-]in
Tato rovnice vyjadřuje rozdíl (membránových) potenciálů obou iontů, který je důsledkem vzniku elektrické dvojvrstvy na rozhraní obou roztoků s rozdílnými koncentracemi iontů. Z této rovnice vyplývá základní podmínka membránové rovnováhy:
po zjednodušení dostáváme vztah známý jako Donnanova rovnováha [K+]o × [Cl-]o = [K+]i × [Cl-]i
Konečné koncentrační složení na obou stranách membrány je je řízeno, doladěno Donannovou rovnováhou.
Membránový potenciál (mV)
ODCHYLKA OD TEORIE – NEDOKONALÁ SPECIFICKÁ SELEKTIVITA MEMBRÁNY
Membránový potenciál versus koncentrace extracelulárního draslíku (osa x - semilogaritmická škála). Přímka má směrnici - sklon 58 mV na každou 10násobnou změnu extracelulární draslíku, podle Nernstovy rovnice (obr.a). Protože je ale
propustná v klidu i pro Na+ (sice 50x méně než pro K+, leč přece), experimentální body se odchylují,
membrána
především v nízkých koncentracích K+ (obr. b).
Memránový potenciál podle Goldmanovy rovnice
Naměřené hodnoty
Naměřené hodnoty
Nernstovský potenciál pro K+
0,5 – 140 mM K+out
140 mM K+ vně ⇒ úplná depolarizace, membránový potenciál = 0 mV
Účast jednotlivých iontů na výsledném klidovém membránovém potenciálu (Em) je dána nejen poměrem koncentrací, ale poměrem jejich propustností, což vyjadřuje komplexní GOLDMAN-HODGKIN-KATZOVA ROVNICE, v níž jsou zavzaty poměrné propustnosti P jednotlivých iontů, vztažené k PK = 1: Em = nebo též
RT PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i ln nF PNa [Na+]i + PK [K+]i + PCl [Cl-]o PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i Em = 58 log PNa [Na+]i + PK [K+]i + PCl [Cl-]o
Např. pro obří vlákna sépie jsou propustnosti pro Na+ (PNa=PNa/PK), K+ (PK=PK/PK) a Cl- (PCl=PCl/PK) následující: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,5 Je zřejmé, že klidová propustnost pro Na+ je zpravidla 25× (1:0,04) až 100× (1:0,01) nižší než pro K+ (jen nepatrný počet Na+ kanálů se v klidu náhodně otevírá). Pro Cl- je propustnost membrány obřího vlákna sépie asi poloviční.
POČÍTÁME AKČNÍ POTENCIÁL – VTOK SODÍKU
ENa = 58 mV . log
[Na +]o [Na+]i
= 58 mV . (log 120 – log 10) =
Akční potenciál je dán HLAVNĚ ENa
membránový potenciál
= 58 (2,08 - 1)= 58 (1,08) = + 63 mV
přestřelení
Prahová depolarizace
lokální odpověď
Klidový potenciál (KMP) je dán EK,ECl…. proud
KMP
(nad)prahový puls
následná hyperpolarizace
JAK SE KONCENTRAČNÍ ROZDÍL UDRŽUJE? • AKTIVNÍM TRANSPORTEM Na+ z buňky (intracelulární koncentrace sodných kationtů je asi 10 mM/l) • SOUČASNÝM TRANSPORTEM K+ DOVNITŘ BUŇKY (uvnitř buňky je draslíku asi 20-70x více než extracelulárně ~ 140 mM/l)
V padesátých letech byl demonstrován transportní mechanismus, který tuto funkční „únavu“ odstraňuje a především prof. Skou (Nobelova cena 1997) vytvořil koncepci sodné pumpy, tj. systému schopného přenášet současně Na+ a K+ přes buněčnou membránu za využití energie intracelulárního ATP.
Jens Christ. Skou (* 1918)
John E. Walker (* 1941)
Paul D. Boyer (* 1918)
transportní FoF1 typy ATPáz jsou OLIGOMYCINCITLIVÉ (Fo..) čti Markoš Akumulátory života, Vesmír č. 1. 1998
John E. Walker (* 1941)
Paul D. Boyer (* 1918)
AKTIVNÍ TRANSPORT - především sodnodraselná pumpa-Na+-K+ATPáza
Na+-K+ ATPáza (sodnodraselná pumpa) přispívá ke klidovému rozložení K+ a Na+ iontů po obou stranách membrány. Již na počátku tohoto století bylo ukázáno, že srdeční a svalové buňky, na nichž vznikají akční potenciály v důsledku přesunu sodíku a draslíku, ztrácejí postupně část svého intracelulárního draslíku a ten je nahrazen sodíkem.
Historie zkoumání Na+/K+-ATPázy 1957- Skou J.C. (The influence of some cations on an adenosinetriphosphatase from peripheral nerves, Biochim.Biophys.Acta 23: 394-401)
izoloval z krabích nervů ATPázu, která „zdá se, splňuje několik podmínek, které musí mít enzym, jenž jak se předpokládá, exportuje sodík z nervu.“ 1960 - Skou J.C. (Biochim.Biophys.Acta 42: 6-23) ATPáza potřebuje jako kofaktor Mg2+ a je inhibována ouabainem, enzym je fosforylován. 1962 - Skou J.C. (Biochim.Biophys.Acta 58: 314-25) Podobná Na+/K+-ATPáza se nachází i v mozku a ledvinách savců.
Jens Christian Skou Nobelova cena 1997
Transportuje Na+ mimo buňku a K+ do buňky.
Energetická spotřeba vysoká, až 1/3 energie buňky. Tento „dobíječ buněčného akumulátoru“ je membránový protein s ATPázovou aktivitou, má
tři podjednotky, větší α (100 kD) a
menší β (reguluje zabudování do mbr,38
kD).γ-regulační. Vyskytuje se ve formě heterotetradimeru (2 α a 2β podjednotky) 1 molekula ATP hydrolyzována na 1 molekulu ADP + Pi.
INSIDE
Struktura P-ATPáz
ALBERS-POSTOVO SCHÉMA
Úloha lipidů – supervyčistěný enzym nehydrolysuje ATP, potřebuje lipidový anulus.
Použitá energie umožňuje transport 3 Na+ iontů ven a současně 2 K+ iontů dovnitř buňky. Má tedy elektrogenní efekt (činí klidový KMP asi o 10 mV negativnějším). Přesouvá poměrně pomalu 150-600 iontů Na+ a trochu méně K+ iontů (o kolik?) a za sekundu přes μm2 membrány Sodium-loaded muscle fibre(O K+ 2h)
Membrane potential (mV)
100 80
5mM K+
60 x x x x x
x
x
x
40
x x x
x
x
x
x
o-control 20 x-ouabain 0
0
2
After Vyskocil et al. 1989
4
6
Time (min)
8
10
. Z vnější strany je inhibovatelná ouabainem (gamma strofantidinem) a dalšími srdečními glykosidy (digitoxin z náprstníku). O vnitřní vazebné místo pro molekulu ATP kompetuje 5-vazný vanad (ve formě vadaničnanu). digitoxin
Na+-K+ ATPáza je životně důležitý enzym: při nedostatku kyslíku v tkáních ⇒ mizivá produkce ATP ⇒ anoxická depolarizace ⇒ klinická smrt (naše).
VYSKOČIL, KŘÍŽ, BUREŠ, Brain Research, 1971 ION-SENSITIVNÍ IONTOMĚNIČ“CORNING“ FLUKA
Čím je dále významná Na+/K+-ATPáza ? ¾ první izolovaná ATPáza P-typu ¾ nepřímá regulace objemu buňky,
cytoplasmického pH, koncentrace Ca2+ a glukózy ¾ její inhibice či dysfunkce je příčinou celé řady onemocnění (hypertenze, infarkt myokardu, šedý zákal, diabetes, hypokalemie, astma, …) ¾ je zodpovědná za spotřebu 20% - 70% energie v metabolismu buňky na povrchu buňky se nachází 800 000 – 30 000 000 pump
Steroidní glykosidy (kardioglykosidy, účinné na myokard). Při předávkování může dojít k zástavě srdce. Rozdělují se na kardenolidy a bufandienolidy. K nejdůležitějším kardenolidům patří glykosidy náprstníkové a strophantové. K náprstníkovým patří digitoxin, digoxin nebo acetyldigitoxin. Jsou obsaženy v listech náprstníku červeného Digitalis purpurea a nejčastěji se získávají z náprstníku vlnatého Digitalis lanata. Strofantové glykosidy se získávají ze semen jihoamerického krutikvětu cenného Strophanthus gratus. Nejcennější experimentálně je
ouabain
(γ - strofantidin). V koncentrované formě slouží (sloužily) srdeční glykosidy jihoamerickým domorodcům jako šípové jedy, podobně jako tubokurare. Adenotoxin z hlaváčku jarního, konvalotoxin konvalinky vonné a oleandrozit oleandru obecného. Činnost pumpy inhibují také některá antibiotika, např. oligomycin, Náprstník velkokvětý podobně jako transportní FoF1 typ ATPáz .(Digitalis grandiflora MILL.)
Hlaváček jarní (Adonis vernalis L.)
Použití kardioglykosidů v srdeční farmakologii = částečná blokáda (20-30%) Na+-K+ ATPázy. To vede jednak k slabé depolarizaci (snižuje se elektrogenní příspěvek pumpy k klidovému membránovému potenciálu) a spontánnímu vtoku sodíku. Protože v membráně kardiocytů je spřažený symport Na+ a Ca2+ iontů, tekou dovnitř i Ca2+, což potencuje plató fázi srdečního akčního potenciálu a v konečném efektu zvyšuje sílu stahu kardiocytu při pracovním cyklu.
síla stahu plató akčního potenciálu
VZNIK KLIDOVÉHO MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU 2 HLAVNÍ PŘÍČINY:
ROZDĚLENÍ iontů uvnitř a vně: K ČEMU SLOUŽÍ? KE VZNIKU KLIDOVÉHO MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
K+
Iont je po vstupu do póru kanálu dehydratován. Hydratační obal iontu závisí na jeho poloměru. Sodík má menší poloměr než draslík, ale hydratační obal větší – molekuly vody jsou k němu přitahovány větší silou.
Na+
Iontový filtr -aminokyseliny +,-. Vrátkaotevření natočením
Během minulých let byla objevena nová superrodina draslíkových kanálů (2P-K kanály), které mají • dva póry, což je (s výjimkou akvaporinů pro vodu) naprostá rarita. Tento typ se připojil jako třetí ke dvěma již dobře charakterizovaným skupinám draslíkových kanálů a to ke kanálům řízených napětím (Kv) a dovnitř usměrňujícím draslíkovým kanálům (inward rectifiers - KIR). Nová, třetí rodina kanálů pro draslík, je charakterizována tím, že každý kanál má dvě podjednotky (je tedy dimerem), na rozdíl od ostatních skupin, kde je membránový pór tvořen čtyřmi nezávisle geneticky produkovanými jednotkami (tetramery). Pro strukturální labužníky dodejme, že každá podjednotka tohoto dvoupórového draslíkového kanálu má čtyři „stehy“, jimiž prošívá buněčnou membránu (transmembránové domény) oproti šesti, které jsou předpokládány u Kv, nebo dvou u KIR kanálů.
• Jaké jsou základní funkční charakteristiky těchto kanálů, z nichž každý
vypadá trochu jako lovecký dalekohled? Na rozdíl od jiných draslíkových propustí jsou tyto kanály zřejmě otevřeny při všech úrovních membránového potenciálu a vykazují tedy velmi malý stupeň usměrnění elektrického proudu. Jiné draslíkové usměrňující kanály (KIR) propouštějí proud lépe jedním směrem (např. při depolarizaci membrány) než směrem druhým (při hyperpolarizaci) a chovají se tak podobně jako analogické elektronické komponenty (transistory). Dalším důležitým diagnostickým znakem proudů tekoucích 2P-K kanály je to, že úspěšně odolávají klasickým inhibičním látkám, které blokují jiné draslíkové kanály, jako je apamin (z jedu včely), tetraetylamonium aj.
Podobné jsou i chloridové kanály. Každá podjednotka má 18 helikálních průniků membránou (zde nevidno), které vyvářejí pór. Póry mohou být uzavřeny společně operujícími vrátky (gates).
PŘEHLED KANÁLŮ 1) iontové kanály stále otevřené- 2P-K draslíkové-mají překvapivě ne 4, ale 2 funkční podjednotky, jako „dalekohled“. Spolu s podobnými Cl- kanály jsou základní
pro klidový membránový potenciál (viz Nernstovu rovnici a G-H-K rovnici) 2) řízené napětím – Na+,Ca2+, K+, Cl-, H+ - mají napěťový sensor a otevírají se (někdy ale i zavírají, jako např. K+ kanály v dendritech neuronů) depolarizací, podrážděním.Některé ještě potřebují intracel.Ca při depolarizaci:Ca-dependentní Kkanál. Ca-kanály v srdci se naopak ZAVÍRAJÍ, když vzroste intracel.Ca při stahu 3) řízené chemicky – komplex receptor-kanál; mají vazebné místo pro ligand, většinou pro neuropřenašeče: KDYŽ JDE O KANÁL PRO IONTY, ŘÍKÁ SE JIM RECEPTORY IONOTROPNÍ, JE-LI TO RECEPTOR G-PROTEINOVÝ, MAJÍ ZAŘAZENÍ JAKO RECEPTORY METABOTROPNÍ. MŮŽE SE JEDNAT O TENTÝŽ LIGAND (ACH- NIKOTINOVÝ A MUSKARINOVÝ receptor).
a) Aktivační neuropřenašeče - ligandem je ACh, glutamát či serotonin (jediný ionotropní typ serotoninového reeptoru je 5HT3, ostatní serotoninové receotory jsou metabotropní), tekou jimi Na+ a K+, někdy i Ca2+, jako u NMDA receptorů pro glutamát a některých AChR v mozku.VÝSLEDEK JEJICH OTEVŘENÍ ⇒ DEPOLARIZACE, PODRÁŽDĚNÍ b) Inhibiční neuropřenašeče– ligandem je GABA, glycin (tekou Cl- nebo K+) VÝSLEDEK JEJICH PODRÁŽDĚNÍ
OTEVŘENÍ
⇒
HYPERPOLARIZACE
NEBO
STABILIZACE
MP.-INHIBICE
c) kanály řízené změnou pH, třebas vaniloidní kanály u bolesti aj. 4) řízené mechanicky (kanály vláskových buněk v uchu) nebo jinou energií (tepelnou, světelným zářením aj.) 5) řízené G-proteiny
IONTOVÉ KANÁLY
RECEPTOR
lze obecně rozdělit do pěti skupin:
DVA MODELY OTEVÍRÁNÍ POMOCÍ SENSORU-“VÝVRTKA“ A „PÁDLO“
DEPOL
DEPOL
Kluzně šroubový model, vysvětlující úlohu segmentu S4 napěťových kanálů při jejich otevření. Segment je znázorněn jako transmembránová α-šroubovice s řadou pozitivních nábojů, tvořených opakujícími se zbytky zásadité (kladné) aminokyseliny argininu (každá třetí v pořadí), což je typické pro všechny Na+, Ca2+ a K+ kanály. Při depolarizaci (DEPOL) se uvolní síla membránového elektrického pole, která stabilizovala šroubovici v poloze nalevo. Šroubovice se vysune ven jako uvolněná pružina přibližně o 0,5 nm, přičemž se otočí o 60 o tak, že se kladné náboje posunou vzhledem k sousedním záporným nábojům o 1 místo ven z buňky. Dojde tím jednak k poklesu kladného náboje uvnitř (in-SLABOUNKÝ PROUD LZE MĚŘIT-tzv.VRÁTKOVÝ PROUD) a hlavně se allostericky (na dálku) kanál-vystýlající průniky narovnají a zatočí tak, že se kanál otevře a příslušné kladné či záporné zbytky ve stěnách lákají ionty tlačící se u ústí kanálu k hopsavému průniku. K otevření kanálu je zapotřebí aktivace všech čtyř oblastí S4 v čtyřnásobné podjednotce Na+ či Ca2+ (nebo spojených podjednotkách - K+ kanálu), které tvoří pór.
RECENTNÍ MODEL-PÁDLOVÁNÍ V OLEJI MacKinnon et al, Nature, Dec.06, krystalografie K-kanálu-plus argininy na kraji kanálu, v kontaktu s minus fosfáry fosfolipidů.
Při změně napětí při el. stimulu „pádlo“ přeskočí do druhé vrstvy bilayeru a to otevře kanál Jde-li o stále otevřené K či Cl kanály, k přeskoku asi nedojde
MEMBRÁNOVÁ ASYMETRIE PC, SM OBJEMNĚJŠÍ, STÁČENÍ
PE, IP Např. jeden TLAK, typ ATP/dependentního, dovnitř usměrňujícího KLATERÁLNÍ POVRCHOVÝ NÁBOJ, USPOŘÁDÁNÍ (ORDER PARAMETER) ROTAČNĚ-RELAXAČNÍ ČAS, TEPLOTA, kanálu KATP má zvýšenou dobu otevření a sníženou inhibici ATP CHOLESTEROL).Poměrně obtížně lipidy přeskakují (flip-flop) mezi vrstvami-enzym flipáza. vMembránová přítomnosti fosfoinositoll 4, 5-bisfosfátu (IP2) a fosfatidylinosition asymetrie je jak příčná, tak podélná. Příčná asymetrie- vnitřní list obsahuje 4často monofosfátu (IP), který je regulován složitým setem fosfatidylethanolamin a inositolové lipidy. Vnější list je bohatý na fosfolipáz, fosfatidylcholin a sfingomyelinfosfatáz je celkověaméně elektronegativní list vnitřní a to zřejmě přispívá několika fosfolipid kináz, které jsounež zase samy regulovány milivolty k přirozené příčné polaritě, kdy je vnitřek záporný. Příčná asymetrie také podporu signálními kaskádmi, jako jsou G-proteiny spojené s receptory aj. tvarování a stáčení membrány, protože fosfolipiy vnějšího listu mají objemnější hydrofilní skupiny. Platí to i při spontánní tvorbě liposomů ze směsi fosfolipidů. Tako asymetrie také ovlivňuje některé vlastnosti kanálů.
Hodně vody prochází
transcelulárně. Kanálotvorná rodina proteinů akvaporinů, především v erytrocytech, epiteliálních buňkách, sekrečních buňkách produkujících sliny a slzy. Akvaporiny jsou tetramery, každá podjednotka má 6 transmembránových průniků a 263 aminokyselin. Voda neprochází pórem mezi podjednotkami, ale skrz (něm. durch) každou zvlášť. Permeabilita akvaporinů je velmi vysoká, asi 3 miliardy molekul vody/sec. Tvorba a membránové zabudování porinů z váčků do PM je indukováno ADH (arginin-vasopresinem z neurohypofýzy).
Trojrozměrné schéma tetrameru porinu. Upraveno podle Alberts, 1994.
G+H+K
PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i Em= 58 log P [Na+] + P [K+] + P [Cl-] Na i K i Cl o
PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,5 AŽ z této komplexní rovnice pro membránový potenciál vyplývají dva základní principy el. změn na membráně, navozených drážděním axonu (svalu) nebo chemickým přenosem na synapsi. 1.PROPUSTNOSTI PRO VŠECHNY IONTY SE MOHOU PŘI FYZIOLOGICKÉ ČINNOSTI MĚNIT a TÍM I „VÁHA“ PŘÍSLUŠNÉHO TRANSMEMBRÁNOVÉHO ROZDÍLU KONCENTRACÍ tohoto iontu. DOKONCE I PRO K+ se může zvýšit P otevřením více K-kanálů,jako je tomu při druhé fázi akč. potenciálu, což vede k HYPERPOLARIZACI (positivnímu následnému potenciálu při refrakterní fázi), PROTOŽE EK (ROVNOVÁŽNÝ POTENCIÁL PRO K+) JE VÍCE NEGATIVNĚJŠÍ 2. (cca -105 mV u žáby), než vlastní Em (JEN -90 mV). 2. V pokusu s intracelulárními elektrodami, ale i působením elektrogenních pump či přenašečů můžeme vnutit buňce jiný membr. potenciál, silně depolarizovat či hyperpolarizovat. Pak směr toku nějakého iontu (dovnitř či ven) a tedy i elektrického potenciálu z této nové hladiny bude záležet na tom, je-li jeho Erovnovážný „nad“ nebo „pod“ tímto potenciálem. Rovná-li se Er=Em, neteče proud žádný (bod zvratu synaptických potenciálů, kdy se mohou z excitačních změnit na inhibiční)
KABELOVÉ VLASTNOSTI BIOLOGICKÝCH VODIČŮ - nervových a svalových vláken podmořský kabel – komunikační kabel pokládaný pod hladinu moře s vnitřním vodičem z měděné trubky s polyetylenovou izolací a s vnějším vodičem z mědi nebo hliníku, s odpovídající izolací. Ve vnitřním vodiči je až 5000 sdělovacích vedení, která mají po každých 5 km umístěn zesilovač. Evropa s Amerikou byla trvale spojena 1866. Thomson sir William, lord Kelvin (1824-1907). Zrcátkový galvanometr. Takový borec a k stáru zblbl: „Létací stroje těžší než vzduch nemohou existovat,“ prohlásil s přesvědčením v roce 1895. Podmořské kabely, špatná zkreslení a vymizení zbohatnul.
isolace, signálů,
Stejné zkreslení a pokles amplitudy elektrických signálů ve vodičích v našem těle.
1. ISOLACE – membrána: má elektrickou kapacitu a zkresluje elektrické impulsy 2. Nedokonalou isolací uniká část proudu mimo kabel 3. V cestě proudu stojí vnitřní odpor (uvnitř) buňky
Vodiči jsou v našem případě intracelulární a extracelulární tekutina a dielektrikem (isolační vrstvou) je cca 7 nm tenká buněčná membrána, v „elektrických“ termínech kondensátor s určitou
kapacitou s paralelně zapojeným odporem
S určitou rychlostí, jejímž vyjádřením je tzv. časová konstanta τ, se při aplikaci pravoúhlého pulsu tento kondensátor v určitém místě nabíjí. Proto se napěťová forma pulsu mění z pravoúhlé na postupně rostoucí po zapnutí pulsu a klesající po jeho vypnutí.Toto nabíjení buněčného kondensátoru určuje, jak rychle se např. při depolarizaci dosáhne prahu pro akční potenciál. Časová konstanta také τ zkresluje (zpomaluje a zmenšuje) velmi rychlé pulsy, jakými jsou akční a často i synaptické potenciály. Proto je τ dobré znát pro konkrétní studovaný neuron či jinou dráždivou buňku. Toť první parametr pasivních vlastností biologických vodičů.
Časová konstanta τ exponenciálního nabíjení daného vodiče:
τ=R.C R=vstupní odpor, C=kapacita
Je to doba, za kterou po aplikaci pravoúhlého proudu přes membránu dosáhne napětí velikosti (1-1/e) výsledného potenciálového pulsu, prakticky asi 63%. Při vypnutí platí totéž, V (napětí) klesá exponenciálně se stejnou rychlostí a tedy i se stejnou časovou konstantou.
Proud
Kabelové vlastnosti neuronu: délková nebo také prostorová konstanta λ
Vnější roztok
Vzdálenost od elektrody (mm)
Axoplasma
λ 0.37 Vzdálenost
• prostorová konstanta λ je vzdálenost od místa aplikace proudu, kde poklesne napěťová elektrotonická odpověď na 1/e, tj. na 0,37 –tinu odpovědi v místě aplikace (Vo). TOTO je ŠÍŘENÍ S DEKREMENTEM-úbytkem záleží na 3 parametrech: • odporu vnějšího roztoku ro, • odporu membrány rm a • odporu uvnitř axonu či svalového vlákna ri. Platí, že λ bude delší, když bude menší únik proudu přes membránu ven, t.j. čím větší bude rm (ať už zmenšením plochy membrány, nebo vyšším specif. odporem-méně kanálů) a čím menší odpor proudu bude klást vnitřek axonu ri a okolí ro. • λ2 = rm/ro+ri, ro zanedbáváme (= 0), takže
λ2 = rm/ri, (λ= √rm/ri, )
Z potřeby co nejvyšší hodnoty délkové konstanty λ vyplývají DVĚ STRATEGIE pasivního šíření impulsu podél axonu: 1. snížení vnitř. odporu ri zvýšením průměru vlákna (ri=Ri/π průměr2). Viz obří vlákno sépie, λ až 13 mm!!! ⇒ tj. pokles amplitudy na třetinu až ve vzdálenosti 13 mm od místa jeho vzniku
2. nebo zvýšením membránového odporu rm
– např. myelinem jako mnohem lepším isolantem. V internodální oblasti jsou jen nečetné draslíkové kanály, v Ranvierových zářezech pochopitelně převládají kanály pro sodné ionty.
λ2
rm = ri
Obří vlákno lze vymačkat válečkem, naplnit libovolným roztokem a studovat akční potenciály, membránové proudy aj.
Izolovaný obří axon sépie s podélně (osově, axiálně) zavedenou elektrodou. Převzato z Hogdkina a Keynese, 1969.
Vytlačování axoplasmy z obřího axonu.
Axon je nakanylován a proplachován roztokem. Po vytlačení axoplasmy může být axon naplněn roztokem o definovaném složení a požit k experimentům. Podle Bakera, pryží pokrytý kotouček
vytlačovaná axoplasma
Hogdkina a Shawa, 1962.
pryžová podložka
S jistým zjednodušením lze říci, že nervový systém je schopen pouze
dvou typů elektrických signálů: • LOKÁLNÍ POTENCIÁLY NEBO PROUDY, které mohou být gradované, stupňované, ale šířící se s úbytkem. Fyziologicky k nim patří generátorové nebo receptorové potenciály na sensorických zakončeních. Těmi reagují příslušná zakončení na sílu podnětu a všechny možné druhy energie (mechanická při ohnutí lokte či vlásků v Cortiho orgánu nebo energie tepelná se mění na elektrickou, kterou kabely uvnitř nás mohou přenášet). Na synapsích je lokálním potenciálem či proudem (post)synaptický potenciál (proud), stupňovaný podle počtu vyloučených kvant neuropřenašečů. Je inhibiční (hyperpolarizuje po dobu několika ms postsynaptickou membránu hlavně otevíráním Cl- kanálů) nebo excitační (depolarizuje membránu otevíráním Na+ kanálů, nebo společných Na+/K+ kanálů). • AKČNÍ POTENCIÁLY (impulsy, vzruchy) - aktivně se udržující otevíráním napěťově ovládaných Na+ kanálů (u nižších živočichů a v dendritech c.n.s. často i Ca2+ kanálů).
NERVOSVALOVÁ PLOTÉNKA, PŘÍKLAD SYNAPTICKÉ TRANSFORMACE A.P. NA „CHEMICKÝ“ SIGNÁL A ZPĚT NA A.P. NAPRAHOVÝ PLOTÉNKOVÝ POTENCIÁL PŘI OTEVŘENÍ NIKOT. Ach RECEPTORŮ VEDE KE SVALOVÉMU AKČ.POT.
mV 30
AP 0
EPP -40
-70
AKČNÍ POTENCIÁL, intracelulárně snímaný skleněnou el-dou membránový potenciál
PODSTATA: 1) Otevření Na+ kanálů, pří depolarizaci na prahovou hodnotu (elektricky, chemicky, mechanicky). Pna převýší ostatní, Na+ teče dovnitř, Em na pár ms určen ENa (plus uvnitř-přestřelení) 2) Následné zvýšení PK (další K+ kanály se pod vlivem depolarizace otevřou a přetrvají po uzavření Na+ kanálů→vzniká následnáhyperpolarizace→násl.p otenciál→ nedráždivá refrakterní doba
ENa přestřele ní
práh lokální odpověď
KM P
Ek proud
Akční potenciál (AP, vzruch, impuls) je velký, krátký a neměnný signál ("vše nebo nic"), který se šíří podél nervu a dlouhých svalových vláken bez snížení amplitudy.
následná hyperpolarizac (nad)prahový e puls
K+
(A) Vně buňky membrána
ENa+= +66 mV
uvnitř buňky
absolutní
Membránový potenciál
relativní
draslíkový kanál
sodíkový K+ kanál
refrakterní fáze
přestřelení 0
Jednotlivé fáze AP práh
Δ 15 mV
klidový MP = - 70 mV následná hyperpolarizace
EK+= -90 mV
1-2 ms
Schéma registračního okruhu. Na osciloskopu rostoucí napětí na svislých destičkách pohybuje paprskem elektronů zleva doprava. Signál se zesílí a přivádí na horizontální destičky a ty vychylují. paprsek nahoru a dolů.
Paprsek nemá žádnou setrvačnost a věrně zobrazuje pikosekundové děje.
Novější setupy používají pouze počítače.
FLUIDITA MEMBRÁNY Fluidita neboli tekutost membrány je vágní pojem. Přesnější je její charakterizace alespoň dvěma biofyzikálními parametry - stupněm uspořádanosti (order parametr) a rotačně-relaxačním časem nějaké fluorescenční sondy, snadnost jejíhož pohybu v membráně se měří spektrofluorimetricky. Je jasné, že se bílkoviny v membráně mohou pohybovat: v její rovině pomocí difuse [mikrometry (μm) za minutu; rhodopsin ve membránách vnějších segmentů tyčinek difunduje rychlostí asi 0,1 μm2/s, jiné proteiny až o tři rády pomaleji], rotují kolem některé ze svých os (milisekundy), rázně mění koformaci (na dobu řádově v ms, příkladem je otevření iontových kanálů), části polypetidových molekul (segmenty) v membráně se „chvějí“ v řádu ns až ps (nano- až pikosekund).
(CH=CH)3
difenylhexatrien – zanořuje se do membrány a jeho rotace a relaxace po vybuzení udává uspořádanost (membrane order) a další parametry fluidity
Prof. Agre - Nobelova cena 2003 za akvaporiny. Objeveny náhodou u erytrocytů. Neznámá bílkovina byla klonována na nezralých žabích vajíčkách (oocyty) žáby drápatky (rod Xenopus). Vajíčka praskala v hypotonickém roztoku (voda tekla akvaporiny dovnitř, ředila hypertonické prostředí s velkým obsahem solí a oocyty bobtnaly).
injikovaná mRNA akvaporinů
exprimované voda akvaporiny
KŘACH
Akvaporin 1 je také kanál pro CO2. Když jsou geneticky přinuceny oocyty produkovat akvaporin 1, kyselost po přidání CO2 uvnitř oocytů vzrostla. Akvaporin 1 se tedy ukázal být propustný nejenom pro vodu, ale i pro CO2! To ve svém důsledku sice vedlo nakonec k prasknutí a zničení vaječných buněk během pokusu v „sodovce“, ale současně to demonstrovalo, jak fyziologicky důležité tyto kanály mohou být. Proniká CO2 do oocytů jako uhličitanový anion, nebo jde o samostatnou cestu pro tu část CO2, která je pouze rozpuštěna? A tady pomohla fyziologům molekulární genetika. Umožnila doktoru Cooperovi a jeho spolupracovníkům pozměnit aminokyselinové složení akvaporinu 1 tak, aby byla odstraněna buď propustnost pro vodu nebo oxid uhličitý. Jedna z tzv. bodových mutací v primárním řetězci akvaporinové bílkoviny, konkrétně záměna 189té serin učinila tento kanál nepropustným pro vodu. aminokyseliny cysteinu za Překvapivě byl ale stále schopný propouštět plyn - oxid uhličitý.
TRANSPORT LÁTEK PŘES MEMBRÁNU Někdy se velikost transportu přes membránu reguluje syntézou a zvýšením počtu transportních bílkovin. Na modelové rostlině huseníčku obecném (Arabidopsis thaliana) bylo nalezeno asi 35 typů akvaporinů. Otevírají např. průduchy, díky jim rostlina ve vodě nevadne, semena příliš nevysychají atd.
V ledvinách akvaporiny AQP1 a AQP2 jsou těmi otvůrky ve filtračním
systému ledvin, kterými se vrací po očištění do těla denně až 200 litrů vody, resorbované z tzv. primární moči. Tuhle vodu moc potřebujeme pro život na suchu. V další části nefronu se moč zahušťuje a počet akvaporinů nutných pro správnou hustotu moči řídí antidiuretický hormon arginin-vasopresin. Patologické snížení kanálků - akvaporinů při nedostatku tohoto hormonu z podvěsku mozkového (hypofýzy) se projeví jako těžká nefrogenní žíznivka, diabetes insipidus. Snižuje se vstřebávání vody, odchází litry moči a žízniví pacienti jsou dosud odsouzeni k celoživotní náhradní hormonální léčbě. Proto je žádoucí například v budoucnu nahradit chybějící akavaporiny jinými typy na hormonech nezávislými, které budou pracovat. Ještě nevíme jakými, ale výzkum pokračuje. Mimochodem, akvaporiny blokují rtuťnaté ionty a proto dbejme opatrnosti s rozlitou rtutí z teploměru apod.
TRANSPORT LÁTEK PŘES MEMBRÁNU 1. DIFÚZE PROSTÁ Látky rozpustné v tucích (lipofilní,hydrofobní) pronikají volně lipidovou dvouvrstvou bez transportních makromolekul – jak látky exogenní (léky), tak i látky endogenní (lipofilní hormony steroidy). Dále se tvrdí, že prostou difúzí pronikají membránou některé malé neutrální molekuly O2, CO2, někdy H2O, i když v poslední době byly popsány specifické proteinové kanálky pro plyny (CO2 ) a samozřejmě pro vodu - akvaporiny. Též procházejí radikály typu oxidu dusnatého (NO), hrajícího významnou roli při relaxaci cév, při imunitních reakcích a v mozku jako retrográdní neuromodulátor a parakrinní plynný „hormon“. Prostup iontovými kanály: ionty a voda prostupují přes membránu bílkovinnými kanálky, otevíranými napětím, chemickým ligandem (extracelulárním nebo intracelulárním) nebo fyzikálními vlivy (fotony, změnou teploty, mechanicky aj.). 1. USNADNĚNÁ DIFUSE, carrier-mediated 2. PRIMÁRNÍ TRANSPORT - Na+/K+-ATPáza, protonová pumpa, Ca2+ pumpa 3. SPŘAŽENÝ TRANSPORT Je sám o sobě pasivní, ale je spřažen s jiným energii spotřebovávajícím systémem. Týmž směrem je označován jako symport, opačným směrem jako antiport SYMPORT Na+ , GLUKOSY A AMINOKYSELIN • • • •
Symport. Ca2+ a Na+ v srdci – vztah k Na+/K+ pumpě –ouabain. Transportní protein přenáší molekulu cukru do buňky. Energii poskytuje koncentrační a potenciálový gradient sodíku, . S jedním Na+ jde jedna molekula glukózy, v poměru 1:1. Známe pět různých symportních mechanismů pro jednotlivé aminokyseliny, z nichž některé jsou závislé a jiné nezávislé na gradientu Na+. Antiport. Příkladem je Ca2+ a Na+ antiport (1:3). Energie pro přenos jednoho Ca2+ ven je dodána transportem tří Na+ dovnitř. Energii dodává na jiném místě membrány vznikající koncentrační a elektrický gradient Na+.
TRANSPORT LÁTEK PŘES MEMBRÁNU ENDOCYTÓZA A EXOCYTÓZA. Řada látek nemůže pronikat ani lipidovou dvouvrstvou, ani s pomocí transportními proteiny (proteiny, cholesterol a neuropřenašeče). Prostupují uzavřeny do transportních vezikulů (měchýřků, váčků). EXOCYTÓZA. Transportní vezikuly přicházejí do kontaktu s plasmatickou povrchovou membránou - vzájemně splynou lipidové složky obou membrán,"otevře" se měchýřek do extracelulárního prostoru a vyteče obsah, např. hormon nebo neuropřenašeč (acetylcholin, glutamát, GABA aj.) ENDOCYTÓZA. Při obráceném procesu - endocytóze, se plazmatická membrána vchlipuje do buňky a vtahuje extracelulární tekutinu a některé makromolekuly. Vchlipování se účastní pomocná, chaperonová molekula klatrinu, která pokrývá svými trojcípými molekulami vchlipovaný měchýřek a provází ho dále. Není-li klatrin, účastní se v některých membránových doménách (kaveolách) vchlipování membrány protein kaveolin. Exocytóza a endocytóza potvrzují, že membrána je dynamická organela, jsou známé i její „vlnité“ pohyby a samozřejmě i stupeň její tekutosti, fluidity.
To může být snad zajímavé teoreticky, ale pro nás jako běžné konsumenty kyslíku a producenty oxidu uhličitého to není důležité. Omyl. Naše červené krvinky, které přenášejí jednak kyslík ke tkáním a opačným směrem vynášejí oxid uhličitý do plic, se na to dívají evidentně jinak. U nich je možné zcela inhibovat uhličitanové transportéry (účastnící se tzv. Hamburgerova přesunu chloridů, kdy se přemísťují HCO3- do červených krvinek a Cl- z krvinek do krevní plasmy, aby se zachoval konstantní počet aniontů v erytrocytu) pomocí derivátu stilbenu, označovaného jako DIDS. Ukázalo se, že přidání tohoto inhibitoru až o 90% snižuje průchodnost membrány červených krvinek pro HCO3- a tím nepřímo pro oxid uhličitý. Zasažen byl zřejmě opět kanál pro vodu, akvaporin AQP 1. Zdá se tedy, že značná část oxidu uhličitého prochází membránou našich červených krvinek právě tímto kanálem. Plicní kapilára Cl-
CO2
Tkáňová kapilára
HCO3AQP 1
Cl-
CO2
HCO3AQP 1
Je ale pozoruhodné, že podobné iontové kanály pro plyny byly nalezeny i v membránách bakterií, které pohlcují vzdušný dusík v kořenových hlízách luštěnin a dávají ho k dispozici pro další metabolické využití. Do těchto bakterií se naopak nesmí dostat vzdušný kyslík. Ten by blokoval enzym nitrogenázu, která je pro fixaci dusíku nezbytná. Jinými slovy, membrána těchto bakterií nemůže být volně propustná pro všechny plyny, ba naopak není volně propustná pro žádný plyn! Dusík a amoniak, které mají být lapeny, zřejmě procházejí přes bakteriální membránu opět specifickými kanály. Ty mají v tomto případě všechny rysy jiného „vodného“ kanálu nazývaného nodulin 26. Takže - minimálně dva z rozhodujících procesů, na nichž závisí náš život, konkrétně přenos plynů v červených krvinkách a fixace vzdušného dusíku pro stavbu všeho živého, nejsou jen jednoduché difúzní procesy. Spíše jde o další z mnoha pečlivě vyladěných membránových systémů, které rozmetávají mýtus o samovolném vzniku buněčné membrány kolem koacervátů jako pouhé jednoduché fyzikálně-chemické fázové bariéry.
Co mají VŠECHNY I.K.SPOLEČNÉHO? Jsou to integrální membránové proteiny, mají nálevkové ústí pro „dehydrataci“ iontů. Selektivitu mezi anionty a kationty určuje selektivní filtr (aminkys. zbytky čnějící do póru a nabité plus, minus) a tzv. vrátka vágní pojem, spíše jde o stav natočení a uspořádání výstelky kanálu, ne jako zavírání Iontový filtr a vrátka (hradlo) a otevírání dveří!
RTG snímek ACh receptor-kanálu ze strany
Mají 2 hlavní stavy: ZAVŘENÝ A OTEVŘENÝ. ! I V KLIDU SE NÁHODNĚ A SPONTÁNNĚ OTVÍRAJÍ,
PRAVDĚPODOBNOST OTEVŘENÍ SE ZVÝŠÍ LIGANDEM, ČI ZMĚNOU NAPĚTÍ (PRÁH), TAHEM AJ. Otevřený stav charakterizuje DOBA OTEVŘENÍ (ms) a VODIVOST (převrácená hodnota odporu: 1/R, jednotky 1/Ω = siemensy, S, typicky od 1-150 pS).
(j)
ZAVŘENÝ stav = kanálem neteče proud OTEVŘENÝ. Teče jím proud (tj. tok iontů při určitém klid. (holding) potenciálu, např. 10 nA. Kanály mají vodivost, např. 20 pS. Někdy pozorujeme podstavy, neúplná otevření, nebo kratičká zavření - jiskření (j).
Stimulační elektroda
Záznamová elektroda
Akční potenciál je zesilovací princip, po svém vzniku se šíří podél vodiče, který má Na+ Vnější roztok kanály. Ty reagují na sousední depolarizaci otevřením, Na+ teče dovnitř a vlna AP se nezmenšeně šíří. AP samovolně regeneruje. Dva depolarizační pulsy aplikované elektrodou I
Záznam z elektrody V1 Práh
NE!!
Přestřelení
Následná hyperpolarizace
Skutečně se nezmenšuje?
Záznam z elektrody V2
EK
mS/cm2
membránový potenciál (mV)
Akční potenciál vzniká postupným otevřením nejprve Na+ (někdy Ca2+) a pak K+ iontových kanálů, jestliže je klidový membránový potenciál náhle snížen zhruba po 15 mV (řekněme z -70 mV na -55 mV) na tzv. hodnotu prahové depolarizace. ři této prahové depolarizaci se otevírají napěťově citlivé Na+ kanály. Sodík vtéká po koncentračním spádu do buňky a snižuje negativní náboj vnitřku. Na vrcholu vlny se polarita uvnitř buňky otáčí na +20 či +30 mV (hodnota se blíží rovnovážnému potenciálu ENa = +50 mV). Tomuto obrácení polarity se také ms) a říká přestřelení - overshoot. Akční potenciál je krátkodobý (1-3 regenerativní- depolarizace otevírá další Na+ kanály v sousední oblasti, čímž se E vlna šíří. Na
Akční potenciály zaznamenané z obřího vlákna sépie ponořeného v mořské vodě a v roztocích s různou koncentraci Na+.
F.V. na weekendu u Huxleyů 1993
Jak se na to přišlo? Změnou složení extracelulárního roztoku, zde se ubíral sodík a akční potenciál se zmenšoval. (Nobelova cena roku 1963 za rekonstrukci AP ze změn propustností pro Na+ a K+.) Sir Andrew Huxley v Praze r. 2000
Trvání akčního potenciálu je určeno a) spontánní inaktivací, tj. uzavřením Na+ kanálů – jejich inaktivací a b) opožděným otevřením napětím řízených K+ kanálů, které tendenci membránu repolarizovat.
mají
Po ukončení vlny akčního potenciálu se klidový membránový potenciál dočasně hyperpolarizuje v důsledku přetrvávající zvýšené propustnosti pro K+ což znamená, že po několik dalších milisekund je toto místo membrány nedráždivé (refrakterní fáze). Jakmile vznikne akční potenciál - jakožto vlna opačné polarity, než je v klidu -, vznikají mezi tímto místem a sousedními úseky membrány lokální proudy. EN
EK
mS/cm2
membránový potenciál (mV)
a
K+
Iont je po vstupu do póru kanálu dehydratován. Hydratační obal iontu závisí na jeho poloměru. Sodík má menší poloměr než draslík, ale hydratační obal větší – molekuly vody jsou k němu přitahovány větší silou.
Na+
Iontový filtr -aminokyseliny +,-. Vrátkaotevření natočením
Tyto lokální proudy vybíjejí a depolarizují sousední úsek, což opět vede k otevření Na+ kanálů, vtoku Na+ a zvratu polarity tohoto úseku. Tak se akční potenciál šíří podél vlákna.
Typický akční potenciál lidského kardiocytu s pořadím otevírání a zavírání Na, Ca a K kanálů: AP začíná otevřením napěťím řízeným Na-kanálem,ten vyvolá rychlou depolarizaci a sám se zavře. Při depolarizaci se otvírá napěťím řízený Ca-kanál (stah).Ca ionty 1) aktivují pomalý K-kanál(hyperpolarizace)-návrat ke klid.potenciálu,2)dva Ca++ blokují Zevnitř Ca kanál a ten se zavře. Dlouhý srdeční AP brání nechtěnému kroužení vzruchu (reentry)
Ca-dependentn
í K+
a+ C 2
+
Rychlost vedení akčního potenciálu se zvýší z 0,5 (u vláken nemyelinizovaných) až na 100 m/s, buď když má vnitřek axonu větší průměr a lokální proudy zasahují do větší vzdálenosti (což je případ "obřích", v průměru milimetrových vláken bezobratlých, např. sépie a raka), nebo když lokální proudy u myelinizovaných nervových vláken vybíjejí a depolarizují membránu v sousedním Ranvierově zářezu, vzdáleném až l mm. Akční potenciál se zde šíří přeskokem, saltatorně.
A
B
Distribuce sodíkových a draslíkových kanálů v myelinizovanýxh axonech. (A) Sodíkové kanály jsou natěsnány v Ranvierových zářezech (zeleně) a draslíkové kanály (červeně) jsou roztroušeny v paranodální oblasti. Všimněte si, jak se axon v R.z. zužuje. (B) Změna v distribuci sodíkových kanálů po demyelinizaci. V myelinizovaném axonu jsou sodíkové kanály koncentrovány v R.z. (a, ŠIPKA K PROUŽKU). 14 dní po demyelinizaci se objevují i mimonodálně v ohraničených ostrůvcích (b), 21 dní po demyelinizaci počet těchto ostrůvků stoupá a rozšiřují se podél axonu.
Autoimunitní (?) demyelizační onemocnění (roztroušená
mozkomíšní skleróza) myelin se rozpadá.
Rychlosti vedení a typy nervových vláken v savčích nervech
Rychlosti vedení a typy nervových vláken v savčích nervech Vlákna kategorie A jsou myelinizovaná a dělí se čtyři podskupiny: α, β, γ, a δ. Vlákna kategorie B jsou myelinizovaná pregangliová vegetativní vlákna. Vlákna kategorie C jsou nemyelinizovaná buďto postgangliová vlákna sympatiku (CS), nebo dostředivá vlákna pro bolest (Cd.r., index d.r. značí zadní kořeny míšní-dorsal roots).
Toto dělení podle Erlangera a Gassera je obecně přijímané. Pro rozlišení senzorických nervů se někdy používá číselné označení podle Lloyda.
Elektroneurogram
Jednotlivé vlny elektroneurogramu odpovídají jednotlivým typům nervových vláken.
Rychlosti vedení a typy nervových vláken v savčích nervech Vlákna kategorie A jsou myelinizovaná a dělí se čtyři podskupiny: α, β, γ, a δ. Vlákna kategorie B jsou myelinizovaná pregangliová vegetativní vlákna. JEDINÁ INERVACE PULPY-BOLEST buďto postgangliová vlákna Vlákna kategorie C jsou nemyelinizovaná ZUBN sympatiku (CS), nebo dostředivá vlákna pro bolest (Cd.r., index d.r. značí zadní kořeny míšní-dorsal roots).
Toto dělení podle Erlangera a Gassera je obecně přijímané. Pro rozlišení senzorických nervů se někdy používá číselné označení podle Lloyda.
Elektroneurogram
Jednotlivé vlny elektroneurogramu odpovídají jednotlivým typům nervových vláken.
Dvě charakteristiky dráždivosti: reobáze - nejmenší stimulační napětí při velmi dlouhém pulsu, chronaxie – doba trvání dráždícího pulsu, po kterou je intenzita stimulačního napětí dvojnásobná než hodnota reobáze
Mechanicky řízené kanály
Schéma funkce mechanicky řízeného kanálu Po ohnutí stereocilií receptorové buňky vestibulárního aparátu směrem ke kinocilii se otevírají K+ kanály v membráně stereocilie. Kalium vniká do cytoplazmy, což vede ke změně membránového potenciálu receptorové buňky. Otevření iontového kanálu je podmíněno natažením membrány stereocilie na straně odvrácené od kinocilie. Mechanické spojení mezi kanálem a membránou je zprostředkováno „strunou“ (mikrofilamentem), tedy součástí cytoskeletu
Struktrura napětím řízených iontových kanálů Sodíkový kanál tvoří 1 proteinová molekula se čtyřmi (I-IV) doménami spojenými itracelulárními smyčkami. Každá doména je složena ze 6 transmembránových segmentů (S1S6). Vlastní pór kanálu ohraničují segmenty S5 a S6. Kluzně-šroubovicový model otevření kanálu
Sodíkový kanál
Vápníkový kanál
S4 segment je „napěťový sensor“, reaguje na změnu napětí díky kladně nabitým argininovým zbytkům.
Draslíkový kanál
DEPOL
DEPOL
Kluzně šroubový model (NEBO SPÍŠ PLATÍ PÁDLOVÁNÍ V OLEJI?), vysvětlující úlohu segmentu S4 napěťových kanálů při jejich otevření. Segment je znázorněn jako transmembránová α-šroubovice s řadou pozitivních nábojů, tvořených opakujícími se zbytky zásadité (kladné) aminokyseliny argininu (každá třetí v pořadí), což je typické pro všechny Na+, Ca2+ a K+ kanály. Při depolarizaci (DEPOL) se uvolní síla membránového elektrického pole, která stabilizovala šroubovici v poloze nalevo. Šroubovice se vysune ven jako uvolněná pružina přibližně o 0,5 nm, přičemž se otočí o 60 o tak, že se kladné náboje posunou vzhledem k sousedním záporným nábojům o 1 místo ven z buňky. Dojde tím jednak k poklesu kladného náboje uvnitř (in-SLABOUNKÝ PROUD LZE MĚŘITtzv.VRÁTKOVÝ PROUD) a hlavně se allostericky (na dálku) kanál-vystýlající průniky narovnají a zatočí tak, že se kanál otevře a příslušné kladné či záporné zbytky ve stěnách lákají ionty tlačící se u ústí kanálu k hopsavému průniku. K otevření kanálu je zapotřebí aktivace všech čtyř oblastí S4 v čtyřnásobné podjednotce Na+ či Ca2+ (nebo spojených podjednotkách - K+ kanálu), které tvoří pór.
Tetrodotoxin inhibuje Na kanály
Sodíkový kanál
LIGANDEM ŘÍZENÝ KANÁL
Liposom z elektr. orgánu parejnoka
receptory
Vazebná místa pro ACh (
) jsou na receptoru z boku
Model ligandem řízeného iontového kanálu – acetylcholinový receptor nikotinového typu (nikotinový typ je i v mozku, řídí vylučování jiných přenašečů a proto při Alzheimerově demenci, kdy se ničí cholinergní neurony v nc.basalis Meynerti, dojde k rozpadu osobnosti). K úplnému otevření kanálu dojde až po navázání 2 molekul ACh na dvě α podjednotky (kvarterní dusíkovou hlavičkou) a na sousední podjednotku ocáskem (skobička). Proto celková odpověď (O) na cholinergní synapsi je funkcí koncentrace ACh: O = [ACh]2. Na vazebná místa pro ACh se nezvratně váží hadí jedy najatoxin (Naja sp.) a bungarotoxin (Bungarus multicinctus). Tyto jedy se na rozdíl od kurare „nerozdýchají“ .
synaptická štěrbina
místo z boku, kde se váže ACh
plasmatická membrána cytoplasma
Acetylcholinový receptor nikotinového typu, který je na nervosvalové ploténce a v elektrických orgánech parejnoka Torpedo sp. či elektrického úhoře. Má 5 podjednotek, z toho dvě stejné (α, α, β, γ/ε , δ). V CNS jsou složeny jen ze dvou typů podjednotek (α a β).
Mimo geny pro svalové podjednotky (označované někdy jako α1 a β1) je známo nejméně 11 genů pro nervové podjednotky v mozku, z toho 9 pro α a 3 pro β. Nejčastější typ, který váže dobře nikotin, je α4β2. V autonomních gangliích a v srdci je častý typ α3α5β4. vodní pór
podjednotky (všech 5)
RTG analýza krystalických bílkovin
povrch postsynaptické membrány u parejnoka – husté nahloučením receptorů s ústím kanálků uprostřed
Velmi dobře propustný pro vápník (víc než NMDA kanál a 10x víc než pro Na+) je typ složený jen z 5 stejných podjednotek - α7. Vápník teče do buňky na rozdíl od NMDA glutamátových receptorů- i při normálním a případně hyperpolarizovaném klidovém membr. potenciálu. Toto je hlavní cesta pro vstup vápníku do buňky při normálně polarizovaném neuronu.
Iontové kanály a membránové transportéry
