Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4,No. 1, Februari 2011
Respon hMG Terhadap Perkembangan Ovarium Kambing Peranakan Etawah (PE) Respon hMG Toward Ovarium Development In Goat Hermadi H A, Indah Norma T, Abdul Samik, Trilas Sarjito , Suzanita U 1
Fakultas Kedokteran Hewan Unair PPDH Fakultas Kedokteran Hewan Unair
2
Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115 Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015 Email :
[email protected]
Abstract hMG can be used as another alternative for superovulation apart from the other FSH-LH Like, hMG usually for superovulation is always profitable when the dosage is too high. The research is to be able to give any constribution of the transfer embryo of goat by selecting the qualified ova cells of egg cells resulting from superovulation.It used 4 female goats that devided into hMG defferent dosage are injected 75 IU hMG, 150 IU hMG ,225 IU hMG and 300 IU hMG. The result show that injected of hMG showed the sign of oestrus ( 66 ± 2,5819) hours, produce ovulation (corpus luteum) (5,25 ± 0,5), an ovulated dominan follicles (2,25 ± 0,5.00) and flushed embryos in day 2nd averages in 4 cells stages embryos. The conclution by using variation dosage hMG can be influenced the ovarium development in goat Keywords : hMG superovulation Pendahuluan Penyediaan protein hewani di Indonesia, hingga sekarang ini dinilai kurang mencukupi dibandingkan dengan laju pertumbuhan penduduk yang demikian pesatnya. Tingkat konsumsi protein hewani asal ternak yangdigariskan oleh pemerintah adalah lima gram perkapita per hari (Anonimus, 1989). Target ini belum dapat dipenuhi, karena banyaknya kendala yang harus dihadapi, dinataranya adalah tingkat produktifitas ternak yang belum optimal baik kuantitas maupun kualitasnya. Sebagai salah satu sumber protein hewani yang cukup digemari masyarakat, ternak kambing kacang di Indonesia saat ini mengalami perkembangan yang kurang menggembirakan. Dari laporan Direktorat Jenderal Peternakan pada Pelita IV terjadi penurunan populasi ternak kambing 4.63% per tahunnya (Anonimus, 1989). Hal ini disebabkan masih rendah nya tingkat efisiensi reproduksi ternak kambing di Indonesia, disamping tingginya tingkat konsumsi daging kambing di masyarakat. Kenyataan seperti ini perlu mendapat penanganan yang serius dari pihak-pihak yang berkepentingan, termasuk para dokter hewan. Berbagai teknologi mutakhir telah diciptakan dan digunakan untuk mengatasi permasalahan tersebut, diantaranya adalah teknologi Inseminasi Buatan. Pada awal mulanya, penerapan teknologi Inseminasi Buatan diperhitungkan sebagai
suatu cara yang paling praktis dan cepat untuk mencapai maksud tersebut. Akan tetapi sejak sepuluh tahun terakhir ini, yakni pada tahun 1984, di Indonesia telah diperkenalkan teknologi tinggi yang baru yakni Transfer Embrio (Martojo, 1987: Toelihere, 1987; Ismudiono, 1991). Transfer embrio adalah serangkaian teknik pengambilan embrio dari alat reproduksi seekor induk donor dan menempatkan kembali alat reproduksi seekor induk donor dan menempatkan kembali pada alat reproduksi induk lain sebagai resipien, di mana status reproduksi induk resipien pada waktu transfer sama dengan induk donor (Hardjopranjoto, 1987). Salah satu keunggulan dari transfer embrio adalah dapat melipatgandakan bangsa ternak unggul, lebih cepat dibandingkan dengan inseminasi buatan (Hardjopranjoto, 1987). hMG yang dihasilkan dari urin perempuan menopause memberikan efek terapi yang baik dan relevan pada perempuan resipien atau penderita infertil, bahkan setelah terapi hMG dapat langsung terjadi proses in vivo maturasi dan dilanjutkan in vitro fertilisasi (IVF) pada manusia (Daya et al., 1995; Daya and Gunby., 1999; Kubo, 2005). Terapi dengan hMG menghasilkan oosit dan perkembangan embrio yang sangat memuaskan, yang hampir sama bila dibandingkan dengan menggunakan recombinant human FSH (rhFSH). Pemberian hMG yang dilanjutkan dengan perlakuan IVF dapat memicu
43
Respon HMG Terhadap ......
mitosis oosit hingga fase metafase (Agarwal et al., 2000; Imthurn, et al. 1996; Mercan et al., 1997). hMG efektif untuk terapi infertilitas maupun untuk perlakuan sebelum IVF guna merangsang proses maturasi folikel, ovulasi dan respon ovarium, serta pertumbuhan embrio yang dihasilkan, disamping itu harganya yang jauh lebih murah (Huang et al., 2004; Westergaard et al., 1996). hMG mempunyai peluang untuk dikembangkan karena sumbernya yang mudah diperoleh (Alcivar et al., 1992). Sumber hMG diperoleh saat perempuan memasuki usia 50 tahun. Diperkirakan menopause pada perempuan terjadi saat usia 50 tahun yang ditandai dengan penurunan aktivitas ovarium karena folikel primordial tidak ada lagi, sedangkan kelenjar hypofisa anterior tetap memproduksi FSH-LH. Saat itu pada perempuan memasuki gejala perimenopause dan berakhir pada kondisi postmenopause. Kondisi menopause menyebabkan kadar hormon estrogen dan progesteron menurun karena tidak ada proses steroidogenesis dan disertai dengan peningkatan kadar hormon FSH-LH yang tinggi dalam serum darah terekspresi di dalam urin, disebut sebagai hormon kombinasi FSH-LH like atau dikenal sebagai hMG. Human FSH-LH adalah glikoprotein mempunyai struktur dan berat molekul hampir sama dengan Bovine FSH-LH pada sapi. Berat molekul Bovine FSH dan LH masing-masing adalah 30 kDa. hMG adalah hormon glikoprotein yang terdiri dari gabungan dua hormon FSH dan LH, sehingga disebut sebagai FSH–LH like. Human FSH mempunyai berat molekul sekitar 30 kDa dan LH 28,5-30 kDa. Struktur hFSH terdiri dari subunit dan Sub unit mempunyai 92 asam amino dan 111 asam amino. Sub unit dan, masing-masing mempunyai dua ikatan karbohidrat. Dua ikatan karbohidrat ini berperan untuk mempertahankan waktu paruh (halflife) aktivitas biologisnya di dalam darah (Motta et al., 1996). Penggunaan hMG untuk infertlitas belum banyak dilakukan penelitian oleh para peneliti terdahulu. Hormon hMG ternyata mempunyai fungsi fisiologis yang hampir sama dengan campuran fungsi fisiologis yang hampir sama dengan campuran antara Follicle Stimulating Hormone (FSH) dan Luteinizing Hormone (LH) dari hipofisa anterior. Tetapi pengaruh utamanya menurut Turner dan Bagnara (1988) lebih menyerupai FSH, yaitu mampu memacu pertumbuhan dan terbentuknya folikelfolikel pada ovarium. Sedangkan pengaruh LH pada
44
hMG uang berfungsi untuk menggertak terjadinya ovulasi terutama pada kambing, menurut Ratnani Hermadi (1997) kurang begitu efektif, sehingga untuk menggertak terjadinya ovulasi, pemberian hMG perlu diiukuti dengan pemberian hormon HCG atau LH Berdasarkan permasalahan tersebut di atas maka dapat dirumuskan sebagai berikut: Seberapa jauh pengaruh pemberian hormon hMG pada perkembangan ovarium kambing PE terhadap jumlah korpus luteum dan folikel yang tidak diovulasikan pada ovarium kambing PE, setelah penyuntikan hormon hMG. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian hormon hMG dalam menginduksi perkembangan ovarium kambing PE. Di samping itu juga untuk mengetahui perbedaan pengaruh pemberian hormon-hormon tersebut terhadap respon ovarium kanan dan ovarium kiri pada kambing PE. Adapun hasil yang diperoleh dari penelitian ini, diharapkan dapat dijadikan dasar untuk penggunaan hormon hMG dalam pengembangan infertilitas pada ternak kambing di Indonesua dan kemungkinan penerapannya pada hewan besar di masa-masa yang akan datang, sehingga dapat memberikan informasi data tentang prosedur pemberian hormon hMG pada kambing PE untuk menginduksi birahi dan ovulasi. Materi dan Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Mei 2009 dan berakhir bulan Juli 2009 di Laboratorium Ilmu Kemajiran Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Adapun kambing-kambing untuk penelitian dipelihara di kandang milik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang kambing sistem panggung, tempat pakan dan air minum serta alat-alat operasi yang terdiri dari : alat suntik disposable berukuran 3cc, 5 cc dan 10 cc, meja operasi, arteri klem, pisau cukur, pinset, skalpel, nedle holder, kain steril, introducer, jarum infus, jarum operasi, drapping, sarung tangan dan lampu. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah hMG hasil extraksi (Hermadi, 2009), PGF 2 @ Glandin, infus, alkohol 70%, Aquades, NaCl fisilogis, Ketamin Hidrochlorid (Ketalar, Parke Davis), Rivanol, larutan jodium, Clorpromazin HCl (Ethibernal, Ethica), Procain HCl (Ethica), Penicillin procain (Meiji), Streptomicin
Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4,No. 1, Februari 2011
(Meiji), Oxytetraciclin (Terramycin, Pfizer), kain steril, kapas, plester, sulfanilamide (Nufarindo), cat gut (Braun Melsungen AG) dan benang nilon. Pakan untuk kambing selama penelitian berupa rumput, kangkung, dedak serta konsentrat yang diberikan secara bergantian, dalam jumlah ad libitum. Air minum selama penelitian berasal dari PDAM Surabaya yang diberikan secara ad libitum. Hewan percobaan yang dipakaidalam penelitian ini adalah kambing PE betina yang berumur 1,5 sampai 2 tahun, yang diperoleh dari pasar hewan sebanyak 4 ekor dan dinyatakan mempunyai kondisi tubuh yang sehat secara klinis. Semua kambing dalam penelitian ini diberi perlakuan sama baik makanan maupun cara pemeliharaan dan lingkungannya. Tahapan Penelitian Persiapan Sebelum dilakukan perlakuan, ke 4 ekor kambing PE betina diadaptasikan dengan lingkungan setempat selama 4 minggu. Selama beradaptasi, ke – 5 ekor kambing dipantau dan dicatat mengenai siklus birahinya. Kemudian dilakukan pembagian dosis hMG dengan tiap ekor dipilih secara acak. Masing-masing diberi suntikan hMG 75, 150, 225 dan 300 IU secara intra muskular pada hari ke 17 dari siklus birahinya. 1 ekor kambing diberikan PGF2 7,5 mg. Deteksi Birahi Deteksi birahi dilakukan dua kali sehari, yaitu pagi pukul 07.00 – 08.00 WIB dan sore hari pukul 16.30 – 17.30 WIB, dengan menggunakan seekor pejantan pemancing. Tanda – tanda birahi pada kambing antara lain; alat kelamin luar tampak membengkak, basah, merah dan hangat; menggerakgerakkan ekornya; diam bila dikawini atau dinaiki oleh pejantan atau ternak lain; gelisah dan nafsu makan menurun (Ludgate, 1989). Pengamatan Struktur Ovarium dan Flushing Embrio Pada hari kedua setelah kambing menunjukkan tanda – tanda birahi, dilakukan pengamatan struktur pada kedua ovariumnya untuk menghitung jumlah korpus luteum dan folikel masak yang tidak diovulasikan. Pengamatan ini dilakukan dengan teknik pembedahan (laparotomy). Sebelum dilakukan pembedahan, kambing dipuaskan terlebih dahulu selama kurang lebih 12
jam. Pembedahan dilakukan dengan metoda rebah dorsal (dorsal recumbency), di mana punggung kambing terletak di atas meja operasi dengan keempat kakinya diikat pada meja operasi guna mempertahankan posisi tubuh. Setelah itu, kambing dipremedikasi dengan ethibernal 1 miligram per kilogram berat badan secara intra muskular. Persiapan daerah yang akan dilakukan operasi meliputi pencukuran bulu yang dilakukan seluas tiga kali panjang sayatan, membersihkan daerah operasi dengan air hangat dan sabun lalu mengeringkan daerah operasi dengan air hangat dan sabun lalu menberingkannya dengan handuk. Kemudian daerah operasi dibersihkan dengan tampon yang telah dibasahi dengan alkohol 70% dan setelah itu diolesi dengan larutan jodium. Anestesi umum yang digunakan dalam penelitian ini adalah ketamin hidrochlorid (Ketalar, Parke Davis) dengan dosis 5,0 miligram per kilogram berat badan secara intravena pada vena jugularis. Kemudian diikuti anestesi lokal dengan procsin HCl 2 % secara sub kutan pada daerah sekitar operasi. Prosedur pembedahan adalah sayatan yang dilakukan pada linea alba di daerah posterior dari umbilikalis ke belakang sepanjang kurang lebih 5 cm. Setelah sayatan menembus peritonium, sayatan diperlebar dengan bantuan introducer secukupnya. Kemudian alat kelamin dikeluarkan dari rongga abdomen melalui lubang sayatan dan dicari ovarium kenan maupun ovarium kiri untuk dihitung dan dicatat jumlah korpus luteum dan folikel masak yang tidak diovulasikan. Setelah penghitungan selesai, alat kelamin dimasukkan kembali ke dalam rongga abdomen dan kemudian dimasukkan kembali ke rongga abdomen dan kemudian dilakukan penutupan lubang sayatan. Penutupan lubang sayatan dilakukan dengan menjahit secara terputus dan menerus dengan cat gut pada lapisan peritonium, kemudian dilanjutkan dengan menjahit secara menerus pada lapisan otot-otot dinding perut. Kulit dijahit secara terputus dengan menggunakan benang nilon. Pemberian antibiotik pada bagian yang disayat diberikan dalam bentuk bubukan, yaitu campuran antara Streptomicin dan Penicilin Prokain. Setelah selesai dioperasi, kambing diberi kain gurita steril untuk melindungi jahitan dan pada akhir operasi, kambing disuntik dengan oxytetraciclin secara intramuskular dengan dosis 10 miligram per kilogram berat badan. Pemberian suntikan antibiotik ini diulang seharu sekali selama empat hari. Jahitan
45
Respon HMG Terhadap ......
pada kulit dilepas pada hari ke 10 sampai 14 setelah operasi. Flushing Embrio Flushing embrio yang dimaksud adalah memeberikan cairan media embrio TCM 199 sebanyak yang dibutuhkan dimasukka kedalam uterus dari arah cornua ke ovarium dan hasil flushing ditampung dalam petri dish dan di amati stage pertumbuhan embrio metode selanjutnya dapat dilihat pada lampiran 2. Analis Data Data yang diperoleh disusun dalam bentuk tabel dan dianalisis secara deskriptip. Hasil dan Pembahasan Hasil penelitian yang telah dilaksanakan Respon hMG Terhadap Perkembangan ovarium Kambing PE dapat dilihat pada data sebagai berikut: Tabel 1. Waktu timbulnya Birahi Setelah Pemberian Berbagai Dosis hMG WAKTU TIMBULNYA BIRAHI No.
Kambing
Waktu timbulnya birahi setelah PGF2 @ ke dua
1.
75 IU hMG
63 jam
2.
150 IU hMG
65 jam
3.
225 IU hMG
69 jam
4.
300 IU hMG
67 jam
X ± SD
(66 ± 2,5819)
Adapun jumlah korpus luteum setelah pemberian berbagai dosis hMG dapat dilihat pada tabel di bawah ini dengan pemberian dosis 75 IU hMG, 150 IU hMG 225 IU hMG dan 300 IU hMG.
Tabel 2. Jumlah Korpus Luteum Setelah Pemberian Berbagai Dosis hMG KELOMPOK
No.
Kambing
Ovarium Kanan
Ovarium Kiri
Jumlah Korpus Luteum
1.
75 IU hMG
1
4
5
2.
150 IU hMG
2
3
5
3.
225 IU hMG
1
4
5
4.
300 IU hMG
2
4
6 (5,25 ± 0,5)
X ± SD
Setelah mengetahui jumlah korpus luteum berikut menghitung jumlah folikel dominan yang masih tersisa karena tidak di ovulasikan. Tabel 3. Jumlah Folikel Dominan Sisa Setelah Pemberian Berbagai Dosis hMG KELOMPOK
No.
Kambing
Ovarium Kanan
Ovarium Kiri
Jumlah Folikel Sisa
1.
75 IU hMG
1
1
2
2.
150 IU hMG
1
1
2
3.
225 IU hMG
1
2
3
4.
300 IU hMG
1
1
2
X ± SD
(2,25 ± 0,5)
Setelah duhitung jumlah korpus luteum dan folikel sisa atau folikel dominan yang tidak diovulasikan dengan metoda flushing embrio diperoleh hasil flushing 4 sel embrio.
46
Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4,No. 1, Februari 2011
Gambar 1. Embrio Hasil Flushing Hari Ke – 2 Pasca inseminasi Waktu timbulnya Birahi Setelah Pemberian Berbagai Dosis hMG menunjukkan waktu hampir bersamaan sesuai dengan hasil penelitian Hermin dan Hermadi (1997) rata – rata timbulnya birahi 66 jam setelah PGF2@ ke dua. Adanya respon ovarium akibat pemberian hMG pada pengamatan menunjukkan korpus luteum sejumlah banyaknya korpus luteum pada permukaan ovarium menunjukkan adanya ovulasi yang terjadi. FSH - LH like yang terkandung di dalam hMG secara sinergis bekerja sama untuk saling menimbulkan aktivitas di ovarium yaitu menumbuhkan folikel dan ovulasi. Setelah pengamatan korpus luteum dilanjutkan dengan pemeriksaan jumlah folikel dominan sisa yang tidak terovulasikan, folikel dominan yang dimaksud adalah folikel yang berukuran diatas 8 mm yang belum sempat ovulasi terpantau saat pembedahan dilakukan pengukuran secara manual. Armstrong dkk (1982) menyatakan bahwa adanya folikel sisa menunjukkan fluktuasi perkembangan folikel yang tidak bersamaan atau mungkin ketidak mampuan LH untuk menimbulkan ovulasi. Pemberian hMG pada kambing PE pada penelitian ini menunjukkan respon yang sama pada perbedaan dosis yang diberikan, demikian pula jumlah folikel sisa diperoleh jumlah yang sama seperti yan tertulis pada data di Tabel 2. Berbagai alasan ilmiah justru folikel dominan sisa dapat berpengaruh pada proses kejadian kebuntingan jika terlalu banyak, sesuai dengan hasil penelitian Hermin dan Hermadi (1997) rata – rata timbulnya folikel dominant yang belum terovulasi hingga 6 jika diberikan dosis normal 1000 IU pada penelitian ini diperoleh rata – rata 2 folikel dominan saja. Beberapa jam setelah tanda-tanda estrus mulai terlihat, kambing diinseminasi buatan dengan semen beku. Selanjutnya dilakukan flushing embrio pada hari ke 2 - 3 pasca inseminasi. Teknik flushing embrio pada kambing dengan cara pembedahan ini mengikuti prosedur dari pengalaman yang telah dilakukan di Laboratorium kebidanan Veteriner.
Flushing embrio pada kambing dilakukan secara terbuka yaitu dengan cara melakukan pencucian uterus sampai ovarium. Selanjutnya flushing (pembilasan) uterus dilakukan dengan menggunakan cairan flushing (media PBS) untuk menemukan embrio. Embrio diperoleh dari sejumlah korpus luteum yang ada 21 korpus luteum diperoleh 18 embrio saja karena keterbatasan dalam pengamatan embrio dengan adanya faktor debris pada plate saat pengamatan dan flushing. Kesimpulan Dari hasil penelelitian dapat disimpulkan bahwa waktu timbulnya birahi (66 ± 2,5819), terdapat perkembangan ovarium dengan adanya sejumlah korpus luteum (5,25 ± 0,5), folikel masak yang tidak diovulasikan (2,25 ± 0,5.00) serta hasil flushing embrio hari ke 2 menunjukkan tingkat perkembangan 4 sel pada ovarium kambing PE, setelah penyuntikan berbagai dosis hormon hMG. Daftar Pustaka Agarwal, R., J Holmes and H.S. Jacobs. 2000. Follicle-stimulating hormone or human menopausal gonadotrophin for ovarian stimulation in in vitro fertilization cycles : a metaanalysis. Fertil. Steril., 73, 338-343. Alcivar. A.A, R.R Maurer and L.L Anderson 1992. Endocrine changes in beef Heifers Supewrovulated with Follicle stimulating Hormone (FSH.P) or Human Menopausal Gonadotropin. Department of Animal Science Iowa State University and Roman Lhruskaus. Dept. of agriculture clay center. J. Anim Sci 70: 224-231. Anonimus, 1989. Laporan Tahunan Dinas Peternakan Propinsi Daerah Tingkat I Jawa Timur 1989/ 1990 Armstrong, D.T., B.G. Miller, E.A. Walton, A.P. Pfitzner and G.M. Warnes. 1982. Endocrine Response And Factor Which Limit The Response of Follicles To PMSG And FSH. MRC Roup in Reproduction Biology University of Western Ontario, London, Canada and Departement of Obstetriccs & Gynaecology, University of Adelaide, Adelaide, Uastralia. 8-14. Daya, S., J.Gunby and E.G. Hughes. (1995). Folliclestimulating hormone versus human menopausal gonadotrophin for in vitro fertilization cycles: a meta-analysis. Fertil. Steril. 64 : 347-354.
47
Respon HMG Terhadap ......
Daya, S and Gunby, J. (1999). Recombinant versus urinary follicle stimulating hormone for ovarian stimulation in assisted reproduction. Hum.Reprod., 14:207-2215. Hardjopranjoto, S., 1987. Fisiologi Reproduksi. Ed. 11. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. 19 – 28 ; 130 – 160. Hung Yu Ng E. Estella Yee LL. William SBY and Pak Chung Ho 2000. hMG is as good as recombinant human FSH in term of oocyte and embryo quality: a prospective randomized trial Dept. of obstetrics and gynaecology, quen mary hospital, the University of Hongkong. Hunter, R. H. F., 1995. Fisiologi dan Teknologi Reproduksi Hewan Betina Domestik. Penerbit ITB Bandung.p: 42, 51 – 56, 73 – 97. Imthurn, B., Macas, E., Rosselli, M. et al. (1996). Nuclear maturity and oocyte morphology after stimulation with highly purified follicle stimulating hormone compared to human menopausal gonadotrophin. Hum. Reprod., 11, 2387-2391. [Abstract]. Ismudiono, 1991. Upaya Meningkatkan Angka Kebuntingan Melalui Inseminasi Dalam Upaya Penyerentakan Birahi Pada Sapi Perah. Lembaga Penelitian UNAIR. Ludgate, P. J. 1989. Penelitian Ternak Kambing dan Domba di Pedesaan. Cet. II. Balai Penelitian Ternak. Ciawi, Jawa Barat. 10.
48
Ludgate, P. J. 1989. Kumpulan Peragaan dalam Rangka Penelitian Ternak Kambing dan Domba di Pedesaan. Cet. II. Balitnak. Departemen Pertanian. Martojo, H. 1987. Pengaruh Faktor-faktor Pendukung Terhadap Keberhasilan Transfer Embrio dan Rekayasa Genetik dalam Peningkatan Mutu dan Produksi Ternak. Interuniversity Center for Live Sciences. Bogor Agricultural University.6 Mercan, R., J.F.Mayer and D. Walker. 1997. Improved oocyte is obtained with follicle stimulating hormone alone than with follicle stimulating hormone/human menapausal gonadotrophin combination. Hum. Reprod., 12, 1886-1889. [Abstract]. Ratnani H dan A.H. Hermadi. 1997. Pengaruh hMG Pergonal Serono terhadap Birahi dan Kebuntingan pada Kambing. Fakultas Kedokteran Hewan Unair. Toelihere, M.R. 1987. Ilmu Kebidanan pada Ternak Sapi dan Kerbau. Universitas Indonesia. P. 40 – 44. Westergaad L.G. 1996. Monotropin LH Content and Assisted Reproduction Out Come. The First world congrees on controversies in obstetrics. Gynecology and Infertility Prague, Czech Reprublik.
