VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
PRODUKCE A CHARAKTERIZACE EXTRACELULÁRNÍCH HYDROLÁZ Z VYBRANÝCH DRUHŮ PLÍSNÍ PRODUCTION AND CHARACTERITZATION OF EXTRACELLULAR HYDROLASES FROM SELECTED MOULDS
DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS
AUTOR PRÁCE
Bc. PETRA MATOUŠKOVÁ
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2011
doc. RNDr. IVANA MÁROVÁ, CSc.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:
FCH-DIP0575/2010 Akademický rok: 2010/2011 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Petra Matoušková Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) doc. RNDr. Ivana Márová, CSc.
Název diplomové práce: Produkce a charakterizace extracelulárních hydroláz z vybraných druhů plísní
Zadání diplomové práce: 1. Charakterizace hydrolytických enzymů, jejich katalytické vlastnosti a možnosti produkce extracelulárních hydroláz plísněmi - rešerše. 2. Optimalizace metod stanovení aktivity vybraných hydroláz - proteáz, glykozidáz, lipáz a peroxidáz. 3. Analýza produkčních vlastností vybraných kmenů plísní - optimalizace podmínek produkce extracelulárních hydroláz. 4. Využití směsných hydrolytických preparátů ke štěpení komplexních substrátů.
Termín odevzdání diplomové práce: 13.5.2011 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.
----------------------Bc. Petra Matoušková Student(ka)
V Brně, dne 15.1.2011
----------------------doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. Vedoucí práce
----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty
ABSTRAKT Tato diplomová práce byla zaměřena na studium možností produkce extracelulárních hydrolytických enzymů plísněmi. Teoretická část práce se zaměřuje na charakterizaci vybraných hydrolytických enzymů, jejich katalytické vlastnosti, možnosti produkce extracelulárních hydroláz plísněmi a jejich aplikace. V experimentální části byly enzymy produkovány pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium při submerzní kultivaci v minerálním médiu obsahujícím navíc složitý odpadní substrát. Jako odpadní substráty byly použity pšeničné, kukuřičné, ovesné a žitné otruby, dřevní piliny, rýže, jablečná vláknina, vaječné a bezvaječné těstoviny. V průběhu kultivace byla sledována produkce celuláz, amyláz, xylanáz, lipáz, proteáz a ligninolytických enzymů (lakáza, Mn-dependentní peroxidáza, lignin peroxidáza). Produkce enzymů se lišila v závislosti na použitém substrátu i čase kultivace U celuláz, xylanáz a amyláz byla nejvyšší produkce naměřena na začátku kultivace (3. až 7. den). Proteázy a ligninolytické enzymy byly produkovány hlavně v závěru kultivace (7. až 10. den). Lipolytická aktivita byla detekována pouze u A.pullulans, přičemž její hodnota rostla s délkou kultivace a nejvyšší hodnota byla stanovena při kultivaci na pšeničných otrubách (3,6 nmol/ml.min). Nejvyšší xylanázová a celulázová aktivita (170,3 nmol/ml.min, 248,0 nmol/ml.min) byla stanovena při kultivaci plísně F. solani na kukuřičných otrubách. Nejvyšší amylázou aktivitu (111,8 nmol/ml.min) vykazovala plíseň P. chrysosporium při kultivaci na rýži. Nejvyšší aktivita proteázy (68,0 nmol/ml.min) byla naměřena při kultivaci plísně F. solani na pšeničných otrubách. Nejlepším producentem lakázy byl kmen A.pullulans, nejvyšší produkce byla zaznamenána na bezvaječných těstovinách (27,0 nmol/ml.min). Nejvyšší aktivita ligninperoxidázy (12,5 nmol/ml.min) byla naměřena u F.solani na vaječných těstovinách, nejvyšší produkce Mn-dependentní peroxidázy (7,7 nmol/ml.min) bylo dosaženo při kultivaci A.pullulans na pšeničných otrubách. Ligninolytické enzymy se chovaly jako induktivní. U ostatních enzymů byla jejich produkce zaznamenána i na minerálním mediu, u A. pullulans byla aktivita celuláz na minerálním médiu dokonce vyšší než u ostatních použitých substrátů. U preparátu získaného z média A. pullulans byla také provedena purifikace produkovaných enzymů pomocí ultrafiltrace, ionexové chromatografie a gelové filtrace. KLÍČOVÁ SLOVA: plísně, Aureobasidium pullulans, Fusarium solani, Phanerochaete chrysosporium, extracelulární hydrolytické enzymy, ligninolytické enzymy
3
ABSTRACT This diploma thesis is focused on study of potential production of extracellular hydrolytic enzymes. The theoretical part deals with characterization of selected hydrolytic enzymes, their catalytic properties, the possibility of extracellular hydrolase production by fungi and their applications. In experimental part production strains Aureobasidium pullulans, Fusarium solani and Phanerochaete chrysosporium were used. Productions of cellulase, amylase, xylanase, lipase, protease and lignin-degraded enzymes (laccase, manganese- dependent peroxidase, lignin peroxidase) were observed. Cultivations were carried out in submersed mode in mineral medium supplemented by waste co-substrates such as wheat bran, corn bran, rice bran and oat bran, sawdust, rice, apple fiber, egg pasta and egg-free pasta. Production of enzymes depended on the substrate type and time of cultivation. The highest cellulase, xylanase and amylase activities were measured in the first period of cultivation (3 to 7 day). Lignin-degraded enzymes and proteases were produced at the end of cultivation (7 to 10 days). Lipolytic activity was detected only in A. pullulans, where the activity increased with time of cultivation. The highest value was determined during cultivation on wheat bran (3.6 nmol/ml.min). The highest xylanase and celulase activity (170.3 nmol/ml.min, 248.0 nmol/ml.min) were determined during cultivation of F. solani on corn bran. The highest amylase activity (111.8 nmol/ml.min) was reported in P. chrysosporium during the cultivation on rice. The highest protease activity (68.0 nmol/ml.min) was determined in F. solani grown on wheat bran. The best producer of laccase was A. pullulans, the highest production was recorded for egg-free pasta (27.0 nmol/ml.min). The maximum lignin peroxidase activity (12.5 nmol/ml.min) was measured during the cultivation of F. solani on egg pasta, while the highest yield of Mn-dependent peroxidase (7.7 nmol/ml.min) was achieved during the cultivation of A. pullulans on wheat bran. Lignin-degraded enzymes behaved as inductive, while the other enzymes were produced in mineral medium too. Activity of cellulase in the mineral medium was in A. pullulans strain higher than in media with waste substrates. Enzymes produced into A. pullulans medium were purified by ultrafiltration, ion exchange chromatography and gel filtration. KEYWORDS: moulds, Aureobasidium pullulans, Fusarium solani, Phanerochaete chrysosporium, extracellular hydrolytic enzymes, lignin-degraded enzymes
4
MATOUŠKOVÁ, P. Produkce a charakterizace extracelulárních hydroláz z vybraných druhů plísní. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 100 s. Vedoucí diplomové práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc.
PROHLÁŠENÍ: Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkanem FCH VUT. …………………………….. podpis studenta
PODĚKOVÁNÍ: Na tomto místě bych chtěla poděkovat své vedoucí diplomové práce, doc. RNDr. Ivaně Márové, CSc., za odborné vedení a cenné rady. Dále pak děkují svému konzultantovi Ing. Stanislavovi Obručovi, Ph.D., za pomoc, trpělivost, ochotu a cenné rady v průběhu práce na této diplomové práci. Předložená práce byla finančně podpořena z prosředků projektu CZ.1.05/2.1.00/01.0012/ERDF.
5
Obsah 1
ÚVOD ................................................................................................................ 10
2
TEORETICKÁ ČÁST ........................................................................................ 11
2.1 Plísně ............................................................................................................................ 11 2.1.1 Plíseň Phanerochaete chrysosporium ...................................................................... 11 2.1.2 Plíseň Fusarium solani ............................................................................................. 12 2.1.2.1 Makroskopické morfologie .............................................................................. 12 2.1.2.2 Mikroskopické morfologie ............................................................................... 12 2.1.2.3 Zvláštní poznámky ........................................................................................... 13 2.1.3 Mikroorganizmus Aureobasidium pullulans ............................................................ 13 2.2 Způsoby kultivace plísní při průmyslové produkci enzymu .................................. 14 2.2.1 Stacionární povrchová kultivace na polotuhých substrátech ................................... 14 2.2.2 Submerzní kultivace ................................................................................................. 15 2.2.3 Používané materiály pro kultivace ........................................................................... 15 2.3 Enzymy ........................................................................................................................ 15 2.3.1 Klasifikace enzymů .................................................................................................. 16 2.3.2 Použití enzymu v praxi ............................................................................................. 16 2.4 Vybrané hydrolytické enzymy .................................................................................. 17 2.4.1 Celulázy.................................................................................................................... 17 2.4.1.1 Plísně produkující celulázy .............................................................................. 18 2.4.1.2 Průmyslové aplikace celulázy .......................................................................... 18 2.4.2 Amylázy ................................................................................................................... 18 2.4.2.1 Plísně produkující amylázy .............................................................................. 19 2.4.2.2 Průmyslové aplikace amylázy .......................................................................... 19 2.4.3 Xylanázy................................................................................................................... 19 2.4.3.1 Plísně produkující xylanázy ............................................................................. 20 2.4.3.2 Průmyslové aplikace xylanázy ......................................................................... 20 2.4.4 Proteázy .................................................................................................................... 20 2.4.4.1 Plísně produkující proteázy .............................................................................. 21 2.4.4.2 Průmyslová aplikace proteáz ............................................................................ 21 2.4.5 Lipázy ....................................................................................................................... 21 2.4.5.1 Plísně produkující lipázy .................................................................................. 22 2.4.5.2 Průmyslové aplikace lipáz ................................................................................ 22 2.5 Lignolytické enzymy .................................................................................................. 23 2.5.1 Mangan-dependentní peroxidáza ............................................................................. 23 2.5.2 Ligninperoxidáza ...................................................................................................... 24 2.5.3 Lakáza ...................................................................................................................... 25 2.5.4 Plísně produkující lignolytické enzymy ................................................................... 25 2.5.4.1 Průmyslová aplikace lignolytických enzymů ................................................... 26 2.6 6
Izolace a purifikace enzymů ...................................................................................... 26
2.6.1 Srážení (precipitace) ................................................................................................. 26 2.6.2 Membránové separační procesy ............................................................................... 27 2.6.2.1 Membránová filtrace (ultrafiltrace) .................................................................. 27 2.6.2.2 Dialýza ............................................................................................................. 27 2.6.3 Chromatografie......................................................................................................... 27 2.6.3.1 Gelová filtrace .................................................................................................. 28 2.6.3.1 Ionexová chromatografie.................................................................................. 28 2.6.3.2 Afinitní chromatografie .................................................................................... 29 2.6.4 Elektroforéza ............................................................................................................ 29 2.6.4.1 PAGE-SDS ....................................................................................................... 30 2.7 Uchovávání a stabilizace enzymů.............................................................................. 30 2.7.1 Lyofilizace ................................................................................................................ 31 2.8 3
Cíl práce ...................................................................................................................... 32 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................ 33
3.1 Mikrobiální kmeny, chemikálie a přístrojové vybavení ......................................... 33 3.1.1 Použité mikroorganizmy .......................................................................................... 33 3.1.2 Použité chemikálie ................................................................................................... 33 3.1.3 Přístroje a pomůcky .................................................................................................. 34 3.2
Použité odpadní substráty ......................................................................................... 35
3.3 Kultivace ..................................................................................................................... 35 3.3.1 Kultivace plísně Fusarium solani ............................................................................ 35 3.3.1.1 Tuhé médium.................................................................................................... 35 3.3.1.2 Tekuté kultivační médium ................................................................................ 35 3.3.2 Kultivace mikroorganizmu Aureobasidium pullulans ............................................. 36 3.3.2.1 Tuhé médium.................................................................................................... 36 3.3.2.2 Tekuté kultivační médium ................................................................................ 36 3.3.3 Kultivace plísně Phanerochaete chrysosporium ...................................................... 37 3.3.3.1 Tuhé médium.................................................................................................... 37 3.3.3.2 Tekuté kultivační médium ................................................................................ 37 3.4 Postupy při stanovení enzymových aktivit............................................................... 38 3.4.1 Stanovení proteolytické aktivity............................................................................... 38 3.4.2 Stanovení lipolytické aktivity................................................................................... 38 3.4.2.1 Stanovení kalibrační křivky p-nitrofenolu ....................................................... 38 3.4.2.2 Příprava substrátu ............................................................................................. 39 3.4.2.3 Stanovení aktivity lipáz .................................................................................... 39 3.4.3 Stanovení aktivity mangan-dependetní peroxidáza.................................................. 39 3.4.4 Stanovení aktivity ligninperoxidázy......................................................................... 39 3.4.5 Stanovení aktivity lakázy ......................................................................................... 39 3.4.6 Stanovení celulázy pomocí karboxymethylcelulózy (CMC) ................................... 39 3.4.7 Stanovení celulázy s pomocí filtračního papíru ....................................................... 40 3.4.7.1 Příprava činidel ................................................................................................ 40 7
3.4.7.2 Stanovení kalibrační křivky glukózy................................................................ 40 3.4.8 Stanovení amylázy ................................................................................................... 40 3.4.9 Stanovení xylanázy .................................................................................................. 40 3.4.9.1 Stanovení kalibrační křivky xylózy.................................................................. 40 3.5 Stanovení extracelulárních bílkovin ......................................................................... 40 3.5.1 Složení činidel .......................................................................................................... 41 3.5.2 Stanovení kalibrační křivky ..................................................................................... 41 3.5.3 Stanovení koncentrace bílkovin ............................................................................... 41 3.6 Izolace a purifikace enzymů ...................................................................................... 41 3.6.1 Ultrafiltrace .............................................................................................................. 41 3.6.2 Dialýza ..................................................................................................................... 42 3.6.3 Gelová filtrace .......................................................................................................... 42 3.6.4 Vsádková ionexová chromatografie ......................................................................... 42 3.6.5 Vertikální PAGE SDS elektroforéza ........................................................................ 43 3.6.5.1 Roztoky ............................................................................................................ 43 3.6.5.2 Příprava polyakrylamidového gel .................................................................... 43 3.6.5.3 Příprava vzorků ................................................................................................ 43 3.6.5.4 Provedení elektroforézy ................................................................................... 43 3.6.5.5 Barvení stříbrem ............................................................................................... 43 4
VÝSLEDKY A DISKUSE................................................................................... 45
4.1 Stanovení enzymových aktivit ................................................................................... 45 4.1.1 Stanovení aktivity celulázy ...................................................................................... 45 4.1.1.1 Stanovení celulázové aktivity na filtračním papíře .......................................... 46 4.1.1.1 Stanovení celulázové aktivity na karboxymethylcelulóse ............................... 48 4.1.2 Stanovení aktivity amylázy ...................................................................................... 52 4.1.3 Stanovení aktivity xylanázy ..................................................................................... 55 4.1.4 Stanovení aktivity lakázy ......................................................................................... 59 4.1.5 Stanovení aktivity mangan-dependentní peroxidázy ............................................... 62 4.1.6 Stanovení aktivity ligninperoxidázy......................................................................... 65 4.1.7 Stanovení aktivity lipázy .......................................................................................... 68 4.1.8 Stanovení aktivity proteázy ...................................................................................... 70 4.2
Stanovení koncentrace extracelulárních bílkovin ................................................... 73
4.3 Uchovávání a stabilizace enzymů.............................................................................. 77 4.3.1 Změna aktivity enzymů při uchovávání vzorků zmrazováním ................................ 77 4.3.2 Změna aktivity enzymů při lyofilizaci ..................................................................... 78 4.4 Purifikace a identifikace enzymů .............................................................................. 79 4.4.1 Koncentrování vzorků pomocí ultrafiltrace ............................................................. 79 4.4.2 Dialýza ..................................................................................................................... 80 4.4.3 Gelová filtrace .......................................................................................................... 81 4.4.4 Vsádkova ionexová chromatografie ......................................................................... 85 4.4.5 Elektroforéza ............................................................................................................ 86 8
4.4.5.1
PAGE-SDS elektroforéza ................................................................................. 86
5
ZÁVĚRY ............................................................................................................ 88
6
LITERATURA ................................................................................................... 92
7
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ............................................. 96
8
OBRÁZKOVÁ PŘÍLOHA .................................................................................. 97
9
1
ÚVOD
Enzymy jsou biologické katalyzátory produkované všemi typy živých organismů. Lidská společnost využívá některé enzymy odnepaměti v rámci starověkých biotechnologií, jako je výroba kvašených nápojů, pečiva apod. Dlouhá léta se v potravinářství využívají proteolytické rostlinné enzymy k tenderizaci masa (papain z listů papájovníku) a živočišné enzymy v mlékárenském průmyslu (chymosin z telecích žaludů ke srážení kaseinů). Přestože rostlinné i živočišné tkáně jsou cenným zdrojem enzymů, zejména specializovaných, pro průmyslové aplikace je třeba mít k dispozici dostatečné množství enzymu, který je dostupný sice v nižší čistotě, ale za nízkou cenu a ve velkém množství. Nejvhodnějším zdrojem těchto typů enzymů jsou mikroorganismy. Výroba a spotřeba enzymů každým rokem roste o 10-15%. Mezi nejvýznamnější průmyslově významné enzymy patří proteázy, amylázy, celulázy, hemicelulosy, lipázy, pektolytické a lignolytické enzymy, které jsou produkovány zejména řadou plísní, ale i bakterií a kvasinek. Jako substráty pro biotechnologickou produkci se v současné době nejčastěji používají různé odpady zemědělského a potravinářského průmyslu, které jsou dostupné ve velkém množství všude na světě a jejichž produkce rovněž roste. Drtivá většina surovin pro potravinářský průmysl je získávána z obnovitelných zdrojů. Odpady ze zemědělské činnosti a potravinářské výroby jsou zdrojem řady organických látek (celulosa 30-40%, hemicelulosa 20-40%, lignin 20-30%, bílkoviny, aminokyseliny, sacharidy), minerálních látek a energie. Tyto odpady mají široké využití jako substráty pro mikrobiální výrobu enzymů. Průmyslově jsou enzymy získávány stacionární nebo submerzní kultivací. Jako substráty se používají odpadní materiály rostlinného původu jako například bagasa, řepné řízky, rýžové slupky, rýžová a pšeničná sláma, kukuřičné a pšeničné otruby, odpad z hroznové révy a ovoce, ze semen slunečnice a sóji, odpad ze zpracování dřeva a další. Mezi nejpoužívanější plísňové producenty patří některé druhy Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Trichoderma, Monilia, Penicillium a další. Komerční enzymové preparáty mají široké využití. Největší množství enzymů se spotřebuje při výrobě biodetergentů. Třetina všech enzymů se využije v potravinářském průmyslu. Další aplikace nalezneme například v textilním, kožedělném, papírenském, krmivářském a farmaceutickém průmyslu. Předložená práce je zaměřena na využití vybraných druhů plísní a kvasinek k řízené produkci extracelulárních enzymů a jejich směsí.
10
2
TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Plísně Jako plísně označujeme mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganizmy, náležící mezi houby (Fungi). Podle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování náležejí technicky důležité plísně do těchto taxonomických jednotek: 1. Do třídy Zygomycetes, jež patří mezi Zygomycotina a je charakterizována jednobuněčným, tj. nepřehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním s tvorbou tzv. zygospor; nepohlavní rozmnožování se děje endosporami. 2. Do podkmenu Ascomycotina, charakterizovaného přehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním za tvorby askospor tvořených v asku; nepohlavní rozmnožování nastává exosporami. 3. Do podkmenu Deuteromycotina (Fungi imperfecti, tj. houby nedokonalé, přesněji nedokonale známé) s přehrádkovaným myceliem, avšak pouze s nepohlavním rozmnožováním (pomocí exospor) [1]. Plísně se rozmnožují jednak rozrůstáním hyf, jednak sporami. Spory vznikají buď vegetativním způsobem (tzv. nepohlavní neboli vegetativní spory), nebo po spájení (pohlavní spory) [1]. 2.1.1 Plíseň Phanerochaete chrysosporium Bílá plíseň produkuje unikátní extracelulární oxidativní enzymy, které degradují lignin, stejně tak jako příbuzné směsi vyskytující se v explozivních kontaminovaných materiálech, pesticidech a toxickém odpadu. Lignin hraje klíčovou roli v přírodních uhlíkových cyklech jako nejhojnější aromatická směs, která poskytuje ochrannou matrix obklopující celulózová mikrovlákna buněčných stěn rostlin. Tento amorfní a nerozpustný polymer postrádá stereoregularitu a na rozdíl od celulózy a hemicelulózy není citlivý na hydrolytický atak. Přestože je lignin impozantní substrát, jeho degradace určitými plísněmi byla objevena a popsána již před 125 lety. Tyto mikroby, souhrnně označovány jako plísně bílé hniloby (protože degradují hnědý lignin a zanechávají bílou celulózu), jsou schopny účinné depolymerizace a mineralizace ligninu. Všechny patří mezi basidiomycety, což je skupina plísní obsahující jak jedlé houby, tak i rostlinné patogeny [2].
Obr. 1: Plíseň Phanerochaete chrysosporium na Petriho misce [3], obr. 2: Mikroskopický obraz plísně Phanerochaete chrysosporium [2] 11
Phanerochaete chrysosporium je nejintenzivněji studovanou bílou plísní. Bílé plísně vylučují řadu peroxidáz a oxidáz, které působí nespecificky prostřednictvím generace volných radikálů ligninu, které pak podstupují spontánní štěpné reakce. Nespecifický přirozený a výjimečný oxidační potenciál těchto enzymů přitahuje značný zájem o aplikace v bioprocesech jako je organopolutantní degradace a bělení vláken [2]. Phanerochaete chrysosporium má několik vlastností, které mohou být velmi užitečné. Za prvé, oproti jiným bílým plísním zanechává celulózu dřevní hmoty prakticky nedotčenou. Za druhé, má velmi vysokou optimální teplotu (kolem 40 °C), což znamená, že může růst na kouscích dřeva v kompostu, který dosahuje i velmi vysoké teploty. Tyto charakteristiky ukazují na některé možné role v biotechnologii [2]. 2.1.2 Plíseň Fusarium solani Fusarium roste velmi rychle. Struktura kolonie se různí od ploché až po vlněnou nebo bavlněnou. Barva kolonií může být bílá, žlutohnědá, lososová, skořicová, žlutá, červenofialová, růžová nebo purpurová [4]. 2.1.2.1 Makroskopické morfologie Makroskopická morfologie se může podstatně lišit na různých médiích. Popisy zde uvedené jsou založeny na růstu bramborového agaru při 25 °C při cyklech zapnutého a vypnutého zářivkového osvětlení, přičemž každý z těchto cyklů trvá přibližně 12 hodin. Kolonie jsou vlněné až bavlněné s krémově až bíle vzdušným myceliem a ze spodní strany krémové. Sporodochia (shluky konidiogenních buněk viditelné pouhým okem jako vyvýšené oblasti) se mohou utvářet a jsou obvykle mokvající a krémového vzhledu. Sporodochia mohou být také modrozelené nebo modré, ale nikdy ne oranžové [5]. 2.1.2.2 Mikroskopické morfologie Hyfy jsou přepažené a průhledné. Konidiofory jsou jednoduché (nerozvětvené) nebo rozvětvené monofialidy (fialidy s jediným otevřením). Makrokonidie jsou mírně zakřivené, tlusté, silnostěnné, obvykle s 3–5 přepážkami, jsou dlouhé 4–6 x 65 μm, vznikají na krátkých konidioforech, které brzy vytvoří sporodichie. Mikrokonidie vznikají z dlouhých monofialidů, jsou jednobuněčné až tříbuněčné, dlouhé 2–5 x 8–16 μm, vyskytují se pouze na falešných hlavách (v skupinách konidií na špičce fialidy). Chlamydokonidie jsou přítomny (někdy hojně) a vyskytují se buď jednotlivě, nebo v párech [5].
Obr. 3: Plíseň Fusarium solani na Petriho misce [6], obr. 4: Mikroskopický obraz plísně Fusarium solani [7] 12
2.1.2.3 Zvláštní poznámky Rod Fusarium občas způsobuje keratitidu, endoftalmitidu, mykózu nehtů, kožní infekce (otevřená poranění), plicní infekce a mycetom. Některé druhy rodu Fusarium produkují také řadu mykotoxinů. Fusarium solani je nejběžnějším druhem rodu Fusarium generujícím se v lidech a zvířatech [5]. 2.1.3 Mikroorganizmus Aureobasidium pullulans Aureobasidium pullulans není primární lidský patogen ani není veden jako producent významných mykotoxinů, ale jeho vysoké koncentrace v ovzduší byly spojeny s alergií v důsledku podráždění dýchacích cest [8]. Snáší dobře nízké teploty, na jaře je obvykle prvním mikroorganizmem s kvasinkovou fází, který je možno izolovat v severnějších částech Evropy. Je to převážně saprofytický organismus, ale vyskytuje se i jako parazit na rostlinách a může způsobit i choroby zvířat. Velmi často se vyskytuje na listech rostlin, na květech a plodech [9]. Po morfologické stránce tvoří tento rod přechod mezi kvasinkami a plísněmi, neboť některé kmeny produkují velké množství kvasinkovitých buněk a vzdušné mycelium není téměř přítomno [1]. A.pulluans slouží jako modelový mikroorganizmus pro testování toxických účinků různých kovů. Odolnost k toxickým účinkům kovů se vysvětluje jeho schopností detoxikace [9,10]. Aureobasidium pullulans se používá také pro výrobu polysacharidu pullulanu, který má široké technické použití. Slizovitý pullulan dává koloniím vlhký, lesklý slizovitý charakter, takže připomínají kolonie kvasinek nebo bakterií [1]. Aureobasidium je bohaté na různé hydrolytické enzymy, čehož se využívá v praxi. Zkvašuje maltosu, sacharosu, laktosu a glukosu, rozkládá celulosu, hemicelulosy, škrob, xylan a lignin [9,10]. Různé kmeny A. pullulans mohou produkovat řadu enzymů jako amylázy, proteinázy, lipázy, celulázy, xylanázy, mannanázy, a transferázy, které mají vysoké potenciálních uplatněni v biotechnologických aplikacích [11]. Při získávání biomasy často překáží černé barvivo, někdy je zase nežádoucí nadprodukce pullulanového slizu a nebo množství hyf. Kmen od kmenu se dosti liší, záleží též na kultivačních podmínkách [9]. Provedené výzkumy ukazují, že k produkci pigmentů dochází hlavně při nedostatku draslíku a fosfátu [12]. Černé barvivo melanin produkuje také při limitací dusíkem [9].
Obr.5: Aureobasidium pullulans [13] Obr.6: Aureobasidium pullulans hýfy a spóry[14]
13
Kolonie jsou nejprve bílé, později černají. Černání může postupovat od středu, ale také po jednotlivých kruhových výsecích, jindy nepravidelně v soustředných kruzích. Mycelium zpočátku matné, s postupným černáním se stává vlhce lesklé. Cyklické střídání fází se odráží v obrovských koloniích, které dobře znázorňují produkci barevných a bezbarvých elementů, produkci melaninu a pululanu [9,10]. Aureobasidium se dělí na dvě varianty - A.pullulans var pullulans, tvoří růžové, světle hnědé nebo žluté kolonie a až po delším čase kolonie tmavnou. A. pullulans var melanogenum tvoří brzy černé nebo zelenavě-černé kolonie [15]. Vegetativní rozmnožování probíhá pomocí blastokonidií, které pučí po stranách hyf. Tyto konidie pučí v další sekundární konidii, která je menší než je primární. Jednotlivé jednobuněčné články starších hyf se mohou rozpadat v arthrospóry. V "životním cyklu" se vyskytují též chlamydospóry, které v době zralosti uvolňují přežívající buňku, která potom vyklíčí. Střídání různých fází asexuálního vývoje A.pullulans bývá cyklické. Pohlavní způsob rozmnožování u tohoto organismu není znám [9,10]. Aureobasidium pullulans se často vyskytuje jako vzdušná kontaminace [1].
2.2 Způsoby kultivace plísní při průmyslové produkci enzymu Mikroorganizmy v daném prostředí mohou růst a množit se, dokud mají dostatečný zdroj živin, vhodný parciální tlak kyslíku, odpovídající hodnotu pH a teploty. Růst a množení jsou také limitovány koncentrací metabolitů, které buňka vylučuje do vnějšího prostředí [1,16]. Základní typy kultivace jsou: - Statická kultivace: Mikroorganizmus je naočkován na povrch tuhého média nebo do určitého objemu tekutého média. Během růstu jsou živiny postupně vyčerpávány a tak dochází k limitaci růstu, hromadí se produkty metabolismu, které mohou mít velmi často inhibiční vliv [16]. - Submerzní kultivace: Probíhá v tekutém médiu, které je neustále mícháno (na třepačkách, fermentor) a provzdušňováno. Růst při submerzní kultivaci probíhá rychleji než kultivace statická. Nevýhodou submerzní kultivace je, stejně jako u statické, nemožnost přesné specifikace aktuálních růstových podmínek a zajištění jejich konstantnosti [16]. - Kontinuální kultivace: K rostoucím buňkám mikroorganizmů přitékají živiny a zároveň je odváděn stejný objem půdy s mikroorganizmy a jejich produkty. Při vhodně zvolené rychlosti přítoku se dosáhne rovnovážného stavu a v celém objemu média se tak udržuje konstantní počet buněk [16]. Pro průmyslovou výrobu enzymů produkovaných plísněmi se nejčastěji používá stacionární povrchová kultivace na polotuhých substrátech a submerzní kultivace [17]. 2.2.1 Stacionární povrchová kultivace na polotuhých substrátech Tato kultivace je také označována jako solid state fermentation (SSF). Mezi výhody SSF jsou nejčastěji uváděny vyšší výtěžky enzymů než u submerzní kultivace při použití stejného mikroorganizmu a stejných kultivačních podmínek [17]. Pojem SSF označuje kultivaci mikroorganizmů na zvlhčeném pevném substrátu bez přítomnosti volné vody. Výhodou kultivace SSF proti kultivaci submerzní je vyšší výtěžnost, kratší doba fermentace, lepší cirkulace kyslíku, snadnější downstream proces atd. [18].
14
2.2.2 Submerzní kultivace Při submerzní kultivaci (někdy se označuje jako hloubková) se mícháním a provzdušňováním dosahuje homogenní růst populace mikroorganizmů v celém objemu kultivačního média. Tím nastává intenzivnější rozmnožování, maximálně se využívají živiny a zvyšuje se množství produktů, které se získají za kratší čas. Po čas submerzní kultivace se plynule mění složení kultivačního média, mění se počet, hmotnost a morfologie buněk [1]. Submerzní kultivace je nejčastěji používanou metodou produkce enzymů, postupně je ovšem v některých případech plísňové produkce enzymů nahrazována kultivaci SSF [17,18]. 2.2.3 Používané materiály pro kultivace Pro průmyslové produkce extracelulárních plísňových enzymů se jako substráty používají odpadní materiály rostlinné původu, jako například vylisovaná cukrová třtina neboli bagasa, řepné řízky, rýžové slupky, rýžová a pšeničná sláma, kukuřičné a pšeničné otruby, hlíznatý materiál obsahující škrob, odpad z hroznové révy, ze semen slunečnice a sóji, z banánů, z rozdrcených jablek, odpad po vylisování řepkového a palmového oleje, odpad ze zpracování dřeva a kokosových ořechům, arašídová mouka, lodyhy bavlny, bambus, čajový odpad [19].
2.3 Enzymy Enzymy jsou bílkovinné makromolekuly s katalytickou funkcí. Nacházíme je ve všech živých systémech a předpokládá se, že i nejjednodušší buňky obsahují přes 3000 enzymů, které řídí rychlosti prakticky všech reakcí v nich probíhajících. Katalytickou funkci může vykonávat buď jednoduchá, nebo častěji složená bílkovina. Nebílkovinná část enzymů povahy složených bílkovin se označuje jako kofaktor. Jejich funkce spočívá v přenosu atomů nebo jejich skupin nebo elektronů při biochemických reakcích, které enzymy katalyzují. Je-li kofaktor pevně vázán na bílkovinnou složku enzymu považuje se tedy za stabilní součást molekuly a nazývá se prostetická skupina. Jindy je kofaktor s bílkovinnou složkou vázán jen slabě a může se od ní lehce oddělovat, takový kofaktor nazýváme koenzym [20]. Enzymová reakce probíhá v relativně malé oblasti enzymové molekuly, která se označuje jako aktivní centrum. Aktivní centrum obsahuje určité, přesně rozmístěné funkční skupiny. Tyto skupiny jsou součástí postranních řetězců aminokyselinových zbytků, které bývají v polypetidovém řetězci vestavěny na různých, někdy dosti vzdálených místech. Jeho svinutím do osobité prostorové struktury se však dostávají do bezprostřední blízkosti [20]. Enzymy mají značnou reakční specifitu, tj. specifitu k typu katalysované reakce. Tentýž substrát tak může být přeměňován několika enzymy s různou specifitou na různé produkty. Vedle specifity k typu reakce jsou enzymy specifické i k přeměňovanému substrátu (substrátová specifita) [20]. Enzymově katalyzované reakce probíhají různou rychlostí. Rychlost enzymově katalyzované reakce je závislá na koncentraci substrátu, množství enzymu, fyzikálně chemických vlastnostech prostředí a přítomnosti efektorů. Z fyzikálně chemických vlastností prostředí ovlivňují rychlost reakce především teplota a pH. S růstem teploty roste i rychlost enzymově katalyzované reakce. Současně však také dochází k inaktivaci enzymu v důsledku denaturace jeho bílkovinné části a případně i odštěpení kofaktoru. Dochází tak ke vzniku teplotního optima, při kterém je enzymová reakce nejrychlejší. Katalytická aktivita enzymu je také závislá na pH prostředí. Většina enzymů pracuje nejúčinněji jen v určité oblasti pH. pH, při kterém je aktivita enzymu největší, se označuje jako pH optimum. Katalytickou účinnost enzymů také výrazně ovlivňuje řada látek – efektorů [20]. 15
Zvyšují-li tyto látky aktivitu enzymu, mluvíme o aktivátorech (ionty některých kovů, organické látky), snižují-li účinek enzymu, označují se jako inhibitory (ionty těžkých kovů, organické i anorganické látky nízkomolekulové povahy) [20]. 2.3.1 Klasifikace enzymů Podle místa působení můžeme enzymy rozdělit na intracelulární a extracelulární. Intracelulární enzymy, kterých je většina, zůstávají uvnitř buňky, ve které vznikly, a tam vykonávají své specifické funkce. Fungují buď v rozpuštěné formě, nebo vázané v různých biologických strukturách a tvoří většinou organisované funkční komplexy, multienzymové jednotky nebo multifunkční enzymy. Extracelulární enzymy jsou mikroorganizmy vylučovány do kultivačního prostředí. Mezi tyto enzymy patří zejména enzymy katalyzující hydrolysu živin [21]. Mikrobiální enzymy můžeme rozdělit do čtyř skupin: 1. Konstitutivní enzymy, které jsou přítomny v buňce za jakýchkoliv vnějších podmínek. 2. Idukovatelné enzymy, které jsou v buňce syntetizovány jen tehdy, je-li v živném prostředí sloučenina, tzv. induktor, jejíž přeměnu tyto enzymy uskutečňují. 3. Reprimovatelné enzymy, které jsou v buňce syntetizovány jen tehdy, není-li ve vnějším prostředí přítomna sloučenina produkovaná metabolickým řetězcem, jehož součástí jsou tyto enzymy. 4. Indukovatelné enzymy, které podléhají ještě represi [1]. Základem jednotné klasifikace enzymů je jejich rozdělení do šesti hlavních tříd, podle typu katalyzované reakce: 1. Oxidoreduktázy jsou velmi početná skupina enzymů, která katalyzuje oxidační a redukční reakce přenosem vodíku nebo elektronů mezi substrátem a akceptorem nebo včleňováním atomů kyslíku do molekuly substrátu. 2. Transferázy se podílí na přenosu různých skupin atomů v aktivní formě ze sloučeniny, která je jejich donorem na akceptor. 3. Hydrolázy štěpí hydrolytické vazby, které vznikly kondensací. 4. Lyázy jsou enzymy, které katalyzují nehydrolytický rozklad substrátu na dvě sloučeniny. 5. Isomerázy představují nepříliš početnou, ale významnou skupinu enzymů, které v organismech udržují rovnováhu mezi dvěma isomery. 6. Ligázy katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu látky uvolňující energii [21]. 2.3.2 Použití enzymu v praxi V průmyslové praxi se mohou enzymy uplatnit teprve tehdy, jeli je možno získávat ve velkých kvantech a za ekonomicky přijatelnou cenu. Až na některé výjimky lze za nejvhodnější zdroj enzymů považovat různé mikroorganizmy [21]. Z celosvětového hlediska je asi 25-30 % produkce enzymů spotřebováno v rámci potravinářského průmyslu. Pak následují enzymy pro analytické účely a farmaceutické preparáty. Zbytek připadá na celou řadu dalších průmyslových odvětví (kožedělný, textilní, papírenský průmysl atd.).
16
Vyráběné enzymové preparáty se liší podle předpokládaného použití, v deklarované aktivitě, čistotě, formě (tekuté, práškové, granulované), stabilitě, finální úpravě, adjustaci apod. Kromě isolovaných enzymů jsou jako enzymové preparáty prodávány také sušené buňky různých mikroorganizmů a různě upravené roztoky surových enzymů. Izolace enzymu je nákladná záležitost a cena enzymu musí být v relaci s charakterem jeho aplikace. Pro výrobce enzymů pak platí, že technologie výroby enzymů je ekonomická, pokud výrobní náklady jsou minimálně dvakrát nižší, než je cena enzymu. Drahé čisté enzymy jsou přijatelné jen pro vědecké účely a některé aplikace zpravidla využívající imobilizované enzymy. Ve všech ostatních případech se používají preparáty nižší čistoty, často kontaminované dalšími enzymovými aktivitami. Pro celou řadu aplikací jsou však tyto kontaminující enzymové aktivity ve vhodném poměru příznivé. Pro některé účely je i vhodné kombinovat různé preparáty, neboť výsledný efekt je závislí na jejich kombinovaném působení. Z obecného zdravotního hlediska je třeba při výrobě mikrobiálních enzymů věnovat pozornost možností produkce toxinů či jiných nežádoucích metabolitů a vzniku alergických reakcí. S rozvojem technik stabilizace enzymů je možno pozorovat snahu o upřednostnění tekutých enzymových preparátů, jejichž výroba je ekonomicky výhodnější [21].
2.4 Vybrané hydrolytické enzymy Hydrolytické enzymy štěpí hydrolytické vazby, které vznikly kondenzací. Na podtřídy se dělí podle typu štěpených vazeb. Patří mezi nejpočetnější skupinu enzymů. Mezi hlavní podtřídy patří proteázy, glykosidázy (amylázy, celulázy, hemicelulázy…) a esterázy (pektinázy, lipázy…) [21]. 2.4.1 Celulázy Mikrobiální degradace celulózy patří k významným přírodním procesům, které se podílejí na likvidaci rostlinných zbytků. Po chemické stránce je celulóza lineárním polymerem Dglukózy s β(1-4) glukosidickými vazbami [22,23].
Obr. 7 Mechanismus celulázové aktivity[24]
17
Enzym celuláza katalyzuje hydrolýzu celulózy na D-glukózu a je tvořena nejméně třemi enzymy: endo-β-1,4-glukanáza (EC 3.2.1.4); exo-β-1,4-glukanáza (EC 3.2.1.91) a βglukosidáza (EC 3.2.1.22). [17] Endocelulázy hydrolyzují celulosu náhodně za vzniku oligosacharidů, celobiosy a glukosy, exocelulázy hydrolyzují β-1,4-glykosidické vazby celulosy za uvolňování celobiosy z neredukujícího konce řetězce. β-glykosidázy hydrolyzují celobiosu na glukosu. Ačkoli β-glykosidázy nemají žádný přímý účinek na celulosu, jsou považovány za součást systému celuláz, protože stimulují hydrolýzu celulosy [22,25]. Rychlost degradace celulózy je ovlivněna zejména obsahem vody v prostředí, hodnotou pH a teplotou. Všeobecně se uvádí, že celulázy vykazují optimální aktivitu při pH 5-6 a teplotě v rozmezí 30 – 50°C [22]. 2.4.1.1 Plísně produkující celulázy Celá řada plísní produkuje celulolytické enzymy za rozličných podmínek, u mnohých mikroorganizmů je degradace celulosy také spojena se schopností odbourávat ještě složitější systémy lignocelulósových a hemicelulósových složek, např. u plísně Phanerochaete chrysosporium. Celulolytické enzymy produkuje velké množství mikroorganizmů. Mezi nejpoužívanější plísňové producenty patří rody Trichoderma, Humicola, Penicillium, Aspergillus a Fusarium [26,24]. Jeden z nejrozsáhleji prostudovaných celulolytických mikroorganizmů je houba Trichoderma reesei [26]. Rhizopus chinensis, Sclerotium rolfsii, Aspergillus niger, Achlya bisexualit a Orpinomyces sp. jsou houby s nejvyšší specifickou aktivitou celuláz [27]. 2.4.1.2 Průmyslové aplikace celulázy V současných průmyslových procesech mají celulolytické enzymy široké uplatnění. Jsou používány v potravinářském průmyslu při výrobě ovocných šťáv, požívají se jako přísada do detergentů, k zlepšení nutriční kvality krmiva a předzpracování průmyslových odpadů [25, 23]. Celulázy se používají také v textilním průmyslu, průmyslu papíru a při výrobě bioetanolu [26]. 2.4.2 Amylázy Amylázy hydrolyzují škrob, glykogen a další polysacharidy, v nichž se vyskytují α-1,4glukosidové vazby. Lze je rozdělit do 3 skupin: 1. α-Amylázy hydrolyzují 1,4-α-D-glukosidové vazby uvnitř polysacharidové molekuly. Toto štěpení vazeb není náhodné, ale do znační míry charakteristické pro α-amylázu určitého původu. 2. β-Amylázy odštěpující maltosové jednotky od neredukujícího konce polysacharidového řetězce. Na rozdíl od α-amyláz mají β-amylázy charakter exoenzymů. 3. Glukoamyláza, která je rovněž exoenzymem, hydrolyzujícím postupně glukózové jednotky od neredukujícího konce. S nižší účinností štěpí i vazby 1,6-α-D ve větvených polysacharidech amylopektinu a glykogenu [21]. Většina průmyslově používaných amyláz produkovaných plísněmi vykazuje optimální aktivitu při pH 5-7 a teplotě v rozmezí 30 – 70°C [28].
18
Obr. 8 Amylázová specificita [29] 2.4.2.1 Plísně produkující amylázy Nejčastějšími producenty jsou rody Aspergillus, Penicillium. V průmyslu se nejčastěji používají Aspergillus oryzae a Aspergillus niger, z termofilních mikroorganizmů je to potom Thermomyces lanuginosus [28]. 2.4.2.2 Průmyslové aplikace amylázy Amylázy představují třídu enzymů využívaných v řadě průmyslových procesů. Produkce amyláz tvoří přibližně 25% světového trhu s enzymy. V potravinářském průmyslu se používají při výroba ovocných šťáv, sojových omáček, při výrobě cukru Nejrozšířenější aplikací je hydrolýza škrobu (využívá se termostabilních amyláz) pro výrobu alkoholu a v pivovarnictví. Další uplatnění amyláz je v textilním průmyslu, papírenském průmyslu, při výrobě léčiv a jako přísady do pracích prostředků. Použití v pekařství a zlepšení stravitelnosti krmiv [28]. 2.4.3 Xylanázy Vedle celulózy je xylan nejhojnějším strukturním polysacharidem v přírodě. Kompletní degradace xylanu vyžaduje kooperaci několika hydrolytických enzymů: endoxylanáz (EC 3.2.1.8), které náhodně štěpí β-1,4 vázané xylosy (hlavní řetězec xylanu), β-xylosidáz (EC 3.2.1.37) hydrolyzujících xylooligomery a enzymů štěpících postranní řetězce (např. αglucuronidáza, α-arabinosidáza, acetylxylan esteráza a acetyl esteráza, která uvolňuje další sacharidy vázané jako větve na hlavním řetězci) [25]. Obvykle se jedná o induktivní enzym, Většina plísňových xylanáz je aktivní v širokém rozpětí pH a teploty. Většina však vykazuje optimální aktivitu při pH 4-6 a teplotě v rozmezí 30 – 60°C.
19
Obr. 9 Xylanázová specificita [30] 2.4.3.1 Plísně produkující xylanázy Mezi hlavní producenty xylanáz patří rody Aspergillus a Trichoderma [31]. Plísně s nejvyšší celulázovou aktivitou jsou Trichoderma longibrachiatum, Mortierella vinacea a Aspergillus niger [27]. V posledních letech je snaha o produkci xylanáz s využitím termofilních mikroorganizmů. Mezi tyto plísně patří Chaetomium teplomilnou,Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Humico lagrisea, Melanocarpus albomyces, Paecylomyces variotii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces emersonii, Thermomyces lanuginosus a Thermoascus aurantiacus. Xylanázy z těchto hub mají optimální teplotu mezi 60-80 °C a jsou velmi stabilní [32]. 2.4.3.2 Průmyslové aplikace xylanázy Nejčastěji se xylanázy užívají v pekařském průmyslu na zlepšení žádoucí textury a skladovatelnosti chleba. Xylanázy se dále uplatňují v papírenském pro rozvolnění a bělení buničiny, v textilním průmyslu a při zpracování odpadů ze zemědělské a potravinářského průmyslu. Společně s celulázou a pektinázou jsou používány ve výrobě ovocných šťáv a k předúpravě krmiv [33,31]. 2.4.4 Proteázy Proteázy představují početnou skupinu enzymů, jejichž společným rysem je schopnost hydrolyzovat peptidové vazby bílkovinných substrátů. Celá řada z nich vykazuje další aktivity jako esterovou, koagulační, transpeptidázovou. Vzájemně se pak liší původem, lokalizací, fyzikálně chemickými vlastnostmi, specifitou, mechanismem působení, fysiologickými funkcemi i možnostmi jejich praktického využití [21]. Proteázy katalyzují hydrolýzu proteinů na peptidy a oligopeptidů na aminokyseliny. Z důvodu vysoké molekulové hmotnosti proteinů se uskutečňuje první enzymatický stupeň degradace proteinů na vnější straně mikrobiální buňky. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, jako např. aminokyseliny, mohou být transportovány do buněk specifickými transportními systémy. Zde jsou potom aminokyseliny deaminovány.[22] Mikrobiální proteázy můžeme rozdělit do dvou velkých skupin: proteázy bakteriální a plísňové. Bakteriální proteázy dominují co do objemu výroby i počtu praktických aplikací. Hlavní oblastí aplikace plísňových proteáz je pekárenský průmysl [21]. Obecně se proteázy dělí do dvou skupin: exopeptidázy, které odštěpují aminokyseliny z konců proteinových řetězců a endopeptidázy, které štěpí peptidické vazby uvnitř proteinu. 20
Dále je možné klasifikovat proteázy na základě aminokyseliny vyžadované pro katalytickou funkci (např. serinová proteáza), pH optima (acidické, neutrální nebo alkalické proteázy), lokalizace místa štěpení (aminopeptidázy, které působí na volném N-konci polypeptidového řetězce, či karboxypeptidázy působící na C-konci řetězce) nebo požadavku na volné thiolové skupiny (např. thiolová proteináza) [25]. Pro stanovení proteázové aktivity lze využít různé substráty jako kasein, azokasein, želatinu, peptidy, albuminy. Různé postupy se liší v inkubačních podmínkách vzorků a v délce inkubace [22]. 2.4.4.1 Plísně produkující proteázy Plísně produkují řadu enzymů, které jsou aktivní v širokém rozmezí pH (pH 4 až 11) a vykazují širokou substrátovou specifitu. Například Aspergillus oryzae produkuje kyselé, neutrální a alkalické proteázy. Mezi nejčastější plísňové producenty patří rody Aspergillus, Rhizopus a Mucor [34]. Při kultivaci na dřevní hmotě se k produkci proteáz používá plíseň Phanerochaete chrysosporium [19]. 2.4.4.2 Průmyslová aplikace proteáz Mikrobiální proteolytické enzymy umožňují širokou aplikaci proteáz v praxi. Jejich velkou předností je snadnost výroby ve velkých kvantech a možnost volby vhodných vlastností enzymu změnou produkčního kmene [21]. Proteolytické enzymy jsou využívány při výrobě biologických pracích prostředků, kde se používají v kombinaci s lipázou, amylázou, a celulázou. V potravinářském průmyslu se nejčastěji používají v masném průmyslu, v pivovarnictví, v pekařském průmyslu, při výrobě sýrů a sojových omáček. Další aplikace nacházíme v kožedělném průmyslu, při výrobě krmných směsí, ve farmacii a medicíně, při výrobě bílkovinných hydrolysátů a ve výzkumu [23,25,34]. Proteázy používané v medicíně jsou vyráběny v malém množství a před použitím vyžadují dokonalou purifikaci. V ostatních odvětvích průmyslu jsou enzymy připravovány ve velkých množstvích, ale používají se v nižší čistotě [34]. Proteázy patří mezi hlavními průmyslové enzymy a tvoří více jak 60% světového trhu [35]. Nejpočetnější skupinu průmyslových proteáz jsou alkalické protézy [34]. 2.4.5 Lipázy Lipolytické enzymy jsou definovány jako karboxylesterázy, které hydrolyzují acylglyceroly. Lipolytické enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly s uhlíkatým řetězcem mastných kyselin kratším než 10 C, jsou považovány za esterázy nebo karboxylázy (EC 3.1.1.1). Enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly obsahující řetězce mastných kyselin s počtem uhlíků ≥10, jsou označovány jako lipázy nebo také jako triacylglycerolacylhydrolázy (EC 3.1.1.3). Esterázy jsou aktivní ve vodných roztocích, zatímco „pravé“ lipázy jsou aktivnější spíše na rozhraní voda-lipid než ve vodní fázi [22]. Lipolytické enzymy jsou děleny do tří skupin: · První skupina je nespecifická. Lipolytické enzymy této skupiny uvolňují mastné kyseliny ze všech tří pozic acylglycerolu a kompletně hydrolyzují triacylglyceroly na mastné kyseliny a glycerol. · Druhá skupina lipolytických enzymů je 1,3-specifická. Uvolňuje mastné kyseliny z vnějších pozic triacylglycerolu a dává vznik 1,2-diacylglycerolům, 2,3diacylglycerolům a 2- monoacylglycerolům za uvolnění mastných kyselin. Dlouhá inkubace triacylglycerolu s 1,3-specifickými lipázami vede většinou k úplné hydrolýze triacylglycerolů na mastné kyseliny a glycerol. 21
· Třetí skupina zahrnuje lipolytické enzymy, které preferují jen určité mastné kyseliny. Většina lipáz patří mezi extracelulární enzymy, které jsou uvolňovány do prostředí během pozdní exponenciální a časné stacionární růstové fáze [22]. Produkce lipáz je ovlivněna řadou různých faktorů, jako je teplota, pH, zdroj dusíku, uhlíku a lipidů, stres, a koncentrace rozpuštěného kyslíku a anorganických solí. Optimum lipázové aktivity je většinou kolem pH 6-9. Lipázy z A. niger a Rhizopus sp. jsou však aktivní i v kyselém prostředí při pH 4. Naopak alkalická lipáza aktivní při pH 11 byla izolována od P. nitroreducens. Také teplotní optimum a tepelná stabilita se různí. U mezofilních MO je maximální aktivita lipáz při teplotě 30-35 °C. U termofilních MO je to většinou 60°C. U psychrofilních mikroorganizmů jsou lipázy produkovány již při nízkých teplotách okolo 5°C [21]. Většina mikroorganizmů může také produkovat více než jeden typ extracelulárních lipáz s různou specifitou [22].
Obr. 10 Mechanismus lipázové aktivity [36]
2.4.5.1 Plísně produkující lipázy Většina známých mikroorganizmů je schopna produkovat lipázy, ale jen některé druhy jsou průmyslově využívané. Důvodem je nedostatečná produkce enzymů, nežádoucí fyzikálně chemické vlastnosti lipáz, omezené možnosti izolace z kultivačního media, atd. Komerčně nejvyužívanější plísně jsou rody Aspergillus, Penicillium, Mucor a Rhizopus Hlavními producenty komerčních lipázy jsou Aspergillus niger, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus a R. oryzae [37, 39]. 2.4.5.2 Průmyslové aplikace lipáz Lipolytické enzymy přitahují v dnešní době značnou pozornost kvůli svému biotechnologickému potenciálu. Představují nejvýznamnější skupinu biokatalyzátorů pro biotechnologické aplikace, které se úspěšně využívají při syntézách biopolymerů, bionafty, při produkci agrochemikálií a aromatických sloučenin [37, 38]. Poptávka po průmyslových enzymech, především mikrobiálního původu, je tak stále větší. Enzymy nachází využití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, textilním a kosmetickém průmyslu a při výrobě detergentů [39]. Lipázy se používají v pivovarnictví a vinařství, při výrobě sýrů a potravinových doplňků. Ve farmacii při transesterifikacích a hydrolýzách hrají primární roli v produkci speciálních lipidů. Mají význam při modifikacích monoglyceridů a jejich následném využití jako emulgátorů. Některé průmyslově významné chemikálie vyráběné chemickými procesy z tuků a olejů mohou být produkované i lipázami s mnohem větší a lepší specifitou [38]. Lipázy se také využívají při výrobě náhražky kakaového másla a výrobě esterů pro použití v kosmetickém průmyslu. V mlékárenském průmyslu jsou používány pro hydrolýzu mléčného tuku. Aktuální aplikace jsou zvýšení chuti sýrů, zrychlení zrání sýrů, výrobu sýrů, přísada do jiných výrobků. 22
Využití v pracích prášcích má lipáza z Aspergillus oryzae. Lipázy se používají při úpravě olejů a tuků, jako kosmetická změkčovadla, dále jako průmyslové katalyzátory při přípravě některých prostaglandinů, steroidů, karbocyklických analogů nukleosidů a farmaceuticky významných polyfenolických sloučenin [39].
2.5 Lignolytické enzymy Lignin je třetí nejrozšířenější biopolymer na Zemi (po celulose a hemicelulose). Jedná se o amorfní heterogenní polyfenolický biopolymer tvořený třemi základními monomery, koniferylalkoholem, sinapylalkoholem a p-kumarylalkoholem. Vzhledem ke značné složitosti molekuly ligninu je obtížné určit jeho přesnou chemickou strukturu a molekulovou hmotnost. Rovněž izolace nativního ligninu je velmi komplikovaná. Biodegradace ligninu představuje klíčový krok v koloběhu uhlíku v přírodě [40]. Hlavní lignolytické enzymy představují peroxidázy (ligninperoxidáza, Mn-dependentní peroxidáza, versatilní peroxidáza) a fenoloxidáza lakáza. Jsou to oxidativní a vzhledem k velké polymerní molekule jejich substrátu, ligninu, povětšinou extracelulárně produkované enzymy. Substrátová specifita ligninolytických enzymů je velmi nízká, a to vzhledem k nepravidelné struktuře molekuly ligninu. Právě nízká substrátová specifita dodává ligninolytickým enzymům široký biodegradační potenciál. Navíc bylo prokázáno, že lignolytické enzymy jsou kódovány vždy několika geny, čímž je v houbových kulturách umožněna produkce různých izoenzymů lišících se svými katalytickými vlastnostmi v závislosti na vnějších podmínkách [40]. Mezi nejprostudovanější lignolytické enzymy hub bílé hniloby se řadí ligninperoxidáza (LiP, E.C. 1.11.1.14), mangan-dependentní peroxidáza (MnP, E.C. 1.11.1.13) a lakáza (Lac, E.C. 1.10.3.2)9. S těmito enzymy v biodegradaci ligninu dále spolupracují enzymy, které již nemají schopnost rozkládat lignin samy o sobě. Jsou to např. glyoxaloxidáza (E.C. 1.2.3.5), superoxiddismutáza (E.C. 1.15.1.1), glukosaoxidáza (E.C. 1.1.3.4), arylalkoholoxidáza (E.C. 1.1.3.7) a cellobiosadehydrogenáza (E.C. 1.1.99.18). Tyto enzymy produkují H2O2 vyžadovaný ligninolytickými peroxidázami nebo jinak propojují lignocelulosové degradační dráhy [40]. 2.5.1 Mangan-dependentní peroxidáza Mn-dependentní peroxidáza (MnP) je extracelulární hemová peroxidáza, která katalyzuje H2O2 -dependentní oxidaci Mn2+ na vysoce reaktivní Mn3+. Kation Mn3+ pak následně oxiduje fenolické části ligninu za vzniku volných radikálů. Vysoká reaktivita Mn 3+ vyžaduje stabilizaci houbou produkovanými chelátory. MnP je často produkována ve formě četných izoenzymů, jejichž molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 45−55 kDa. Izoenzymy MnP se liší zejména v izoelektrických bodech, které se nachází spíše v kyselé oblasti (pH 3−4). Katalytický cyklus MnP (obr. 11) je podobný jako u ostatních hemových peroxidáz. Zahrnuje jak nativní formu enzymu obsahující kation Fe3+, tak reaktivní meziprodukty (sloučenina I, sloučenina II). Na rozdíl od jiných peroxidáz preferuje MnP jako substrát Mn2+. Kation Mn2+ vystupuje jako donor jednoho elektronu a je oxidován na Mn3+. Reaktivní Mn3+ je stabilizován karboxylovými kyselinami (šťavelová, malonová, mléčná). Vzniklé chaláty mohou následně katalyzovat jednoelektronovou oxidaci různých substrátů [40].
23
Obr. 11. Katalytický cyklus mangan-dependentní peroxidázy[40] 2.5.2 Ligninperoxidáza Ligninperoxidáza (LiP) je glykoprotein s molekulovou hmotností v rozmezí 40−45 kDa. Jedná se o složený protein obsahující hem. V přítomnosti endogenně vytvářeného peroxidu vodíku katalyzuje oxidaci nefenolických aromatických struktur ligninu za vzniku arylkationtových radikálů.
Obr. 12: Katalytický cyklus ligninperoxidázy [40] Během svého katalytického cyklu (obr. 12) je LiP oxidována H2O2. Dochází k odejmutí dvou elektronů z její molekuly a vzniká meziprodukt (sloučenina I), který poté oxiduje substrát odstraněním jednoho elektronu za vzniku redukovanějšího enzymového meziproduktu (sloučenina II). Tento meziprodukt pak oxiduje další molekulu substrátu odejmutím jednoho elektronu, čímž se enzym vrací do svého původního stavu. 24
V přítomnosti nízké koncentrace substrátu a nadbytku H2O2 může být sloučenina II díky své vysoké reaktivitě s H2O2 přeměněna na neaktivní formu enzymu (sloučenina III). Inaktivaci enzymu v nadbytku H2O2 brání aromatické látky, jako např. veratrylalkohol a tryptofan. Pokud jsou tyto sloučeniny s protektivním účinkem přítomny, stávají se pro sloučeninu II vhodnějším substrátem a umožní dokončení katalytického cyklu LiP [40]. 2.5.3 Lakáza Lakáza (Lac) je N-glykosylovaná fenoloxidáza. Bývá produkována mnoha houbami bílé hniloby. Patří do skupiny oxidáz obsahujících měď, které katalyzují čtyř elektronovou redukci kyslíku na vodu. Lakáza lignolytických hub obsahuje ve své molekule čtyři atomy mědi (všechny v oxidačním stavu 2+), které jsou rozmístěny mezi třemi odlišnými vazebnými místy. Tyto ionty mědi hrají důležitou roli v katalytickém mechanismu enzymu (obr.13) [40]. Lakáza obvykle obsahuje tři typy atomu mědi, z nichž jeden jí dává charakteristickou modrou barvu. Podobné enzymy, které nemají atom mědi zodpovědný za modré zbarvení, jsou nazývány “žluté“ nebo “bílé“ lakázy. Mnoho autorů však nepovažuje tyto enzymy za lakázy [41]. Lakáza představuje velmi nespecifický enzym s molekulovou hmotností v rozmezí 60−70 kDa. Oxiduje mnoho odlišných sloučenin, jako jsou fenoly, polyfenoly, aromatické aminy a nefenolické organické substráty za vzniku reaktivních radikálů, které podléhají další již neenzymatické depolymerizaci, repolymerizaci nebo demethylaci. Kromě účasti Lac při degradaci ligninu zastává tento enzym u hub i další fyziologicky významné funkce. Podílí se např. na sporulaci, detoxifikaci či tvorbě buněčného pigmentu. Lac je taktéž mnohými houbami produkována ve formě různých izoenzymů. Jedná se o intracelulární i extracelulární enzymy, které jsou vylučovány do kultivačního média [40].
Obr.13: Mechanismus aktivity lakázy [42] 2.5.4 Plísně produkující lignolytické enzymy Hlavními producenty jsou houby bílé hniloby. Produkují ligninperoxidázy, manganperoxidázy a lakázu. Některé plísně produkují všechny tyto enzymy, zatímco jiné pouze jeden nebo dva z nich [43]. K nejlépe prostudovaným lignin-degradujícím houbám patří Phanerochaete chrysosporium, která se používá hlavně k produkci ligninperoxidázy a mangan-dependentní peroxidázy [44, 45]. Mezi méně známé houby bílé hniloby produkující peroxidázy patří Trametes versicolor, Daedalea flavida, Phlebia fascicularia, P. floridensi a P. radiata [44]. Známí producenti lakázy jsou Neurospora crassa, Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Pleurotus ostreatus, Phlebia radiata, Trametes versicolor a Coriolus polyporus, Pycnoporus cinnabarinus, Chaeomium thermophilum, a Coprinus cinereus [46].
25
2.5.4.1 Průmyslová aplikace lignolytických enzymů Schopnost hub bílé hniloby transformovat a mineralizovat široké spektrum organopolutantů byla popsána v řadě studií. Tyto houby mohou rozkládat nebezpečné aromatické nitrosloučeniny a účastnit se biodegradaci polychlorovaných bifenylů. Lignolytické enzymy hrají důležitou roli při degradaci a mineralizaci polycyklických aromatických uhlovodíků, také mají schopnost účinně degradovat syntetická barviva. [40]. Lakáza se používá také v potravinářském průmyslu při bioremediaci, v nápojovém průmyslu, při stanovení kyseliny askorbové, při pečení a jako biosenzor. Lakázy mohou být aplikovány v procesech, při kterých se zvýrazní nebo modifikuje barva potraviny nebo nápoje. V tomto případě se aplikací lakázy vyloučí nevhodné fenoly, které jsou zodpovědné za hnědnutí, zakalení v ovocném džusu, pivě a víně [47].
2.6 Izolace a purifikace enzymů Při purifikace enzymů se žádané čistoty dosahuje použitím několika purifikačních kroků. Klíčem k úspěšné a účinné purifikaci je výběr nejvhodnější techniky a její optimalizace. Každý purifikační krok způsobuje určitou ztrátu produktu, proto je nutné kombinovat všechny techniky tak, aby bylo purifikačních kroků minimum. Většina purifikačních kroků je určitou formou chromatografických technik s různou selektivitou. Purifikaci lze rozdělit do třech kroků. Cílem prvního kroku je izolovat, zkoncentrovat a stabilizovat cílový produkt. Druhý krok zahrnuje odstranění většiny nečistot, jako jsou nukleové kyseliny, sacharidy, lipidy atd. Třetí krok má za cíl dosáhnout vysoké čistoty odstraněním stopových nečistot [48]. Na přečištění vzorku se používají následující metody: – Frakční srážení: srážení se požívá k přečištění vzorku, ale může také koncentrovat. Srážecí techniky jsou často ovlivněny teplotou, pH a koncentrací vzorku. – centrifugace, filtrace: první krok pro odstranění pevných částic – ultrafiltrace: odstranění solí a koncentrování vzorku – gelová filtrace: Odstranění solí a balastních bílkovin [48]. Jednotlivé purifikační kroky jsou založené na využití fyzikálních a chemických vlastností biomakromolekul. Rozhodujícím faktorem v případě bílkovin je primární struktura. Pořadí aminokyselin v řetězci totiž určuje funkci a vlastnosti proteinu. Sekundární a terciární struktura pak zodpovídá za jejich biologickou aktivitu. Metody purifikace: – separace na základě velikosti: gelová filtrace, PAGE-SDS elektroforéza, ultrafiltrace – separace na základě náboje: chromatografie na měničích iontů, elektroforéza – separace na základě hydrofobní interakce: chromatografie s reverzní fází, hydrofobní chromatografie – separace na základě biologické aktivity: afinitní chromatografie – separace na základě izoelektrického bodu: chromatofokusace, izoelektrická fokusace [48, 49]. 2.6.1 Srážení (precipitace) Srážení se provádí pomocí neutrálních solí, změnou pH, organickými rozpouštědly a teplotou. Srážecí metody dělíme na negativní (sráží se nečistota, enzym zůstává v roztoku) a pozitivní (sráží se enzym, nečistoty zůstávají v roztoku). Střídáním negativního a pozitivního srážení lze dosáhnout vysoké čistoty enzymů. Nejčastěji používanou solí pro vysolování je síran amonný. Jeho výhodou je vysoká rozpustnost, která jen nepatrně závisí na teplotě a malý denaturační vliv. 26
Tepelná denaturace se používá zejména při izolaci termostabilních enzymů v počátečních fázích purifikačního procesu. Roztok se zahřívá na teplotu, při které ještě nedochází k denaturaci daného enzymu. Poté se roztok rychle ochladí a vysrážené balastní bílkoviny se odstraní centrifugací nebo filtrací [48, 49]. 2.6.2 Membránové separační procesy Membránové procesy jsou separační techniky, při níž se využívá polopropustných membrán, jež umožňují průchod malých molekul a jsou nepropustné pro makromolekulární látky. Tyto techniky nemají vysokou rozlišovací schopnost, ale jsou velmi účinné v počátečních fázích separace [49, 50]. 2.6.2.1 Membránová filtrace (ultrafiltrace) Membránová filtrace, někdy označována jako ultrafiltrace, je technika oddělení molekul roztoku na základě jejich velikosti, průchodem přes selektivně propustnou membránu s póry o známých rozměrech. Membránový filtr zachytí většinu makromolekulárních látek, zatímco většina malých molekul (soli, aminokyseliny, cukry) projde membránou do filtrátu. Protože membránou prochází i molekuly rozpouštědla (vody), snižuje se objem roztoku nad membránou a koncentrace molekul, které membránou neprochází, se zvyšuje. Ultrafiltraci lze tedy použít k odstranění rozpouštědla a solí z roztoku enzymů, k výměně pufrů a zkoncentrování enzymových roztoků [48, 49]. 2.6.2.2 Dialýza Dialýza je membránový separační proces, kterým je možné oddělovat látky makromolekulárního charakteru od nízkomolekulárních. Nízkomolekulární látky, nejčastěji soli, přecházejí přes polopropustnou membránu do vody nebo jiného rozpouštědla na základě gradientu chemického potenciálu. Separační rozmezí závisí na vlastnostech použité membrány, zejména velikosti pórů, případně náboji. Vlastní proces je pomalý, je možné ho urychlit obměnou roztoku, do kterého nízkomolekulární látky difundují a tak udržovat větší koncentrační gradient. Při dialýze dochází ke zvětšování objemu odsolovaného roztoku v důsledku osmosy (protisměrné difuse molekul vody do roztoku makromolekulárních látek), která rovněž vede k vyrovnání chemických potenciálů [50]. 2.6.3 Chromatografie Chromatografické separační metody jsou operace, při nichž dochází k postupnému a mnohokrát opakovanému vytváření rovnovážných stavů dělených látek mezi dvěma fázemi, stacionární a mobilní. Stacionární fáze je nepohyblivá (fixovaná) a je obtékána mobilní fází, která unáší separované látky. Jejich pohyb je ovlivňován vzájemnými interakcemi se stacionární a mobilní fází, čím vyšší afinitu mají ke stacionární fázi, tím je jejich pohyb systémem pomalejší a naopak. Mobilní fází může být kapalina nebo plyn, pak hovoříme o kapalinové chromatografii nebo o plynové chromatografii. Podle uspořádání stacionární fáze je možné rozlišit kolonovou chromatografii – stacionární fáze je umístěna v koloně, nebo na ploše – papírová chromatografie a tenkovrstvá chromatografie.
27
Vlastnosti stacionární fáze, kterou může být kapalina nebo pevná látka, určují převládající separační mechanismus: – adsorpce – sorpce látek na povrch pevné stacionární fáze, mobilní fází mohou být plyn i kapalina (adsorpční chromatografie), – rozdělování – stacionární fází je kapalina a o rozdělení směsi rozhoduje rozpustnost látek v mobilní a stacionární fázi (rozdělovací chromatografie), – sítový neboli permeační efekt – složky se separují na základě velikosti molekuly podle přístupnosti pórů stacionární fáze (gelu), látky s menší molekulou pronikají hlouběji do pórů a jsou eluovány později (gelová filtrace, plynová chromatografie na molekulových sítech) – výměna iontů – o separaci rozhodují elektrostatické síly mezi funkčními skupinami stacionární fáze (iontoměniče) a ionty ve separované směsi (ionovýměnná chromatografie). – biospecifická interakce – základem je vysoce selektivní vazba stacionární fáze a separované složky (afinitní chromatografie) [49, 50]. Mezi metody nejčastěji používané pro izolaci enzymů řadíme gelovou filtraci, iontovýměnnou chromatografii a afinitní chromatografii. 2.6.3.1 Gelová filtrace Gelová filtrace je používána pro orientační určení molekulové hmotnosti, izolaci enzymů a pro tzv. „odsolování“. V gelové filtraci dochází k separaci látek na základě velikosti jejich molekuly. Kolonou nejdříve procházejí velké molekuly a nejdéle jsou zadržovány nízkomolekulární látky, které mohou pronikat hlouběji do pórů stacionární fáze, a tudíž jsou v koloně déle zadržovány. Stacionární fází je v tomto případě gel. Vhodný gel se volí podle vlastností separovaných složek. Jako gely jsou využívány přírodní materiály typu dextranu (např. Sephadex, komerčně dodávaný firmou Pharmacia), agarosy, či synthetické polymery (polyakryamid a jeho kopolymery) s regulovanou velikostí pórů molekulárních rozměrů. Mobilní fází je rozpouštědlo, nejčastěji voda nebo pufr. Preferováno je sloupcové uspořádání v koloně. Zrnka (částice) gelu se suspendují ve vodě a nechají se po krátkou dobu nabobtnat. Takto připraveným gelem je naplněna skleněná kolona. Celkový objem filtrační kolony (Vt) se skládá z objemu samotných hydratovaných částic gelu (Vi) a objemu rozpouštědla mezi částicemi (Vo) – zbytkový objem. Separovaná směs molekul je nanesena na gel. Velké molekuly, které jsou větší než póry v částicích gelu, protékají kolonou rozpuštěny v mobilní fázi, aniž by do částic penetrovaly. Opouštějí chromatografickou kolonu nejdříve. V čase kdy byl eluován zbytkový objem Vo. Malé molekuly mohou prostoupit do gelových částic a pohybovat se tak v objemu rozpouštědla uvnitř a vně gelového síta. Jsou z kolony eluovány v momentě, kdy jí proteče její celkový objem Vt = Vi + Vo. Molekuly tak opouštějí kolonu v pořadí snižující se molekulové hmotnosti [48, 49]. 2.6.3.1 Ionexová chromatografie Inonexová chromatografie je určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj. Stacionární fází je polymerní matrice (celulosa, sepharosa, polydivinylbenzen, polystyren, ...) nesoucí funkční nabité skupiny. Ionoměniče se dělí podle schopnosti měnit buď aniony nebo kationy na anexy a katexy. Katexy mají záporný náboj, vážou tedy kationty. Anexy mají naopak kladný náboj a vzniká tak vazba s anionty. 28
Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny; pokud je pH < pI, bílkovina nese kladný náboj a separuje se na katexu; jeli pH > pI, bílkovina nese záporný náboj a separuje se na anexu. V případě, že je pH = pI, celkový náboj bílkoviny je nulový a nelze provést ionexovou chromatografii. Podle typu funkční skupiny a tím i síly vazby mezi funkční skupinou a protiionem se iontoměniče rozdělují na silné a slabé. Kapacita iontoměniče je dána hustotou funkčních skupin v částici. Jako mobilní fáze se používají roztoky elektrolytů (solí) s gradientem rostoucí koncentrace soli při eluci. Pro vazbu menších iontů jsou preferovány silné anexy a katexy, naopak pro vazbu biomakromolekul jsou výhodnější slabé anexy a katexy, které se snáze regenerují a jejich vazba je reverzibilní [48, 49]. 2.6.3.2 Afinitní chromatografie Afinitní chromatografie je separační technikou, která je založena na biospecifické interakci stacionární fáze a látky ze separované směsi. Využívá se vysoce specifických vazeb např. antigen-protilátka, enzym-substrát, enzym-inhibitor apod. Pro tento typ chromatografie se používá speciálně zkonstruovaných stacionárních fází, kdy jedna látka z dvojice tvořící biospecifickou vazbu je vázána na nosič. Díky vysoké specifitě interakce je metoda použitelná i pro izolaci látky ze surových buněčných extraktů. Po aplikaci vzorku na kolonu, dojde k navázání dané látky, ostatní balastní složky se vymyji (eluují) z kolony, poté se změnou mobilní fáze látka uvolní. V tomto kroku může dojít až k tisícinásobnému zkoncentrování dané látky [48, 49].
Obr. 14: Schéma principů jednotlivých separačních metod používaných při purifikaci proteinů[48] 2.6.4 Elektroforéza Elektroforéza je separační metoda, která spočívá v migraci elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Toto elektrické pole se vytváří vkládáním konstantního stejnosměrného napětí mezi elektrody. Kationty migrují k zápornému pólu, anionty ke kladnému pólu a neutrální molekuly či částice se nepohybují. Vlivem odlišné rychlosti migrace složek vzorku se v průběhu separace vytvářejí oddělené zóny jednotlivých složek.[50] Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (PAGE-SDS elektroforesou) [49, 51]. 29
2.6.4.1 PAGE-SDS Gelová elektroforéza patří mezi nejpraktičtější a nejvýkonnější metody používané pro dělení makromolekul. Používané nosiče by měly být stabilní a inertní, musí být vodivé a jejich struktura nesmí bránit putování iontů ve vodném prostředí. U běžně používaných gelů, jako je agaróza nebo polyakrylamid, je možné ovlivnit velikost jejich pórů. Separace molekul je založena jednak na elektroforetické pohyblivosti dělených látek, jednak na velikosti molekul. Při gelové elektroforéze se velké molekuly oproti malým relativně zpožďují. Běžně používaným nosičem je polyakrylamidový gel, který je inertní, mechanicky pevný, průhledný a skýtá možnost přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota „zesíťování“ gelu, gradient hustoty gelu aj.). Polyakrylamidový gel vzniká polymeraci akrylamidu a N,N´- methylenbisakrylamidu (BIS), která je zahájena volnými radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného. Do směsi se vždy přidává stabilizátor volných radikálů TEMED (N,N,N´,N´-tetramethylendiamin). Fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů jsou dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm zesíťování (lineární řetězce vznikají spojováním monomerů akrylamidu, přičemž vazby mezi nimi jsou tvořeny BIS – stupeň zesíťování lze ovlivnit změnou poměru akrylamidu/BIS). Uspořádání elektroforézy může být v trubičkách nebo v tenké vrstvě (mezi dvěma skleněnými deskami). Zásadní dělení technik elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE) není podle typu gelu či jeho tvaru, ale podle toho, zda je v kontinuálním nebo diskontinuálním systému. Diskontinuita může být jak v koncentracích gelu, tak především v pH a iontové síle. Velmi ostré zóny získáme při diskontinuální elektroforéze, která používá dva různé gely a několik odlišných pufrů o různém pH. Hodnota intenzity proudu je nastavena na určitou konstantní velikost. Seřazené zóny se pohybují stejnou rychlostí, dochází k vzniku ostře ohraničených za sebou následujících zón iontů. Pohyb čela se indikuje přidáním nízkomolekulárního barviva (bromfenolové modři) ke vzorku, které vytváří ostrý pruh putující s čelem. Častou variantou PAGE je elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS), který se váže na bílkoviny v poměru přibližně 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny a udílí jim uniformní náboj. Nabité skupiny jsou pak v kontaktu s pufrem. Celkový náboj částice je přitom záporný. Aby tyto komplexy mohly vzniknout, je nutné rozštěpit disulfidové můstky mezi řetězci bílkovin, nebo uvnitř těchto řetězců pomocí látek redukujících tyto můstky (např. β-merkaptoethanol). Některé bílkoviny je nutné ještě zahřát na 60 či 100°C po několik minut, proto se tento krok provádí ve všech případech [49,51].
2.7 Uchovávání a stabilizace enzymů Zvýšení stability enzymů lze dosáhnout různými způsoby: - Přídavek nízko- nebo vysokomolekulových látek do prostředí. Stabilizační efekt mají některé anorganické ionty a řada organických látek. - Chemickou modifikací. - Vytvoření příčných vazeb v molekule pomocí bi- a více funkčních činidel. - Rozvinutím (denaturacím) a opětným svinutím molekuly. - Vazbou na polymerní nosič [20]. Enzymové preparáty se uchovávají při nízkých teplotách. Zmrazování ale může vést k znehodnocení jejich aktivity. Další metodou pro uchovávání enzymových preparátu je jejich sušení, které se provádí na rozprašovacích sušárnách při teplotách, kdy nedochází k inaktivaci enzymů. Nejpoužívanější sušící metodou je však v současnosti lyofilizace. 30
2.7.1 Lyofilizace Lyofilizace je moderní technologie konzervace organických látek. Biologické materiály, které se konzervují lyofilizací, jsou převážně kapalné materiály. Lyofilizace je nejdokonalejší současnou sušicí metodou, jedná se o sublimační sušení při nízkém tlaku. Proti ostatním metodám sušení, které spočívají v odstraňování vlhkosti odpařením, tj. přechodem vody z fáze kapalné do plynné, je lyofilizace charakteristická odstraněním vody sublimací, tj. přechodem z pevného skupenství přímo do plynného. K tomuto přechodu je nutné připravit vhodné fyzikální podmínky. V látce obsažená vlhkost se převede zmrazením do tuhé fáze. Následující sublimací a desorpcí ve vakuu se odstraní všechna voda. Odstraněním této vody se transport molekul v látce téměř znemožňuje a uchováním ve vakuu se úplně zastavuje vnější látková výměna. První operací při lyofilizaci je zmrazení výchozího materiálu. K sublimačnímu sušení dochází až při teplotách -65 °C. Bylo prokázáno, že rychlost zmrazování materiálu má vliv na kvalitu vysušeného produktu. Při rychlém zmrazení materiálu se při jeho povrchu vytváří ledové krunýře, které brání rychlejšímu sušení. Kvůli zajištění určité intenzity sušení je třeba dodat do sušené hmoty množství tepla, které je potřebné k vypaření vlhkosti. Nejčastěji používaná lyofilizační zařízení jsou konstruována tak, že potřebné teplo je přiváděno z nahřívaného povrchu aparátu (tzv. kontaktní sušení) nebo radiací z infračervených lamp. Jakmile se dosáhne kompletně zmrzlého stavu materiálu, tlak v sublimační sušárně je snížen a je dodáno teplo k iniciaci sublimačních procesů, tak začne probíhat primární sušení materiálu. Sublimační páry odcházejí otvorem ve víku nádoby, která je dokonale utěsněná. Primární proces je ukončen tehdy, jakmile jsou odstraněny všechny ledové krystaly z preparátu. Po skončení primárního procesu sušení je ve vzorku přítomna ještě voda vázaná. Tato vázáná vlhkost může tvořit v závislosti na teplotě a povaze vzorku asi 5 % hmotnosti usušeného produktu. Sekundární sušení desorbuje vázanou vodu ze vzorku a je obvykle konečným krokem lyofilizace. Účinnost lyofilizace závisí na velikosti a tloušťce sušeného materiálu, koncentraci rozpuštěné látky ve vzorku, použitém vakuu a teplotě sběrače. Sublimační sušení patří mezi jedny z nejdražších sušících metod, přesto je jeho použití ve farmacii a v potravinářských aplikacích nenahraditelné. [52]
31
2.8 Cíl práce Hlavním cílem předložené práce je studium produkce extracelulárních hydrolytických enzymů plísněmi s možností využití těchto enzymů k úpravě komplexních substrátů pro biotechnologické výroby. Za tímto účelem byly provedeny následující dílčí úkoly: - Zpracování rešerše zaměřené na charakterizaci hydrolytických enzymů, jejich katalytické vlastnosti a možnosti produkce extracelulárních hydroláz plísněmi - Optimalizace metod stanovení aktivity vybraných enzymů - Analýza produkčních vlastností vybraných kmenů plísní a optimalizace podmínek produkce extracelulárních hydroláz.
32
3
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1 Mikrobiální kmeny, chemikálie a přístrojové vybavení 3.1.1 Použité mikroorganizmy · Plíseň Fusarium solani kmen F-552 z České sbírky mikroorganizmů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně. · Plíseň Phanerochaete chrysosporium kmen 8074 z České sbírky mikroorganizmů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně. · Mikroorganizmus Aureobasidium pullulans kmen CCM F-148 z České sbírky mikroorganizmů PřF MU v Brně 3.1.2 Použité chemikálie ABTS (2,2´-azino-bis-[3-etylbenzothiazolin-6-kyselina sulfonová]), Sigma Aldrich (SRN) Akrylamid, Serva (SRN) Albumin, Serva (SRN) Azoalbumin, Serva (SRN) Azokasein, Serva (SRN) Bakteriologický agar, HiMedia, Indie Bramborový extrakt (Potato extract, India) Bromfenolová modř, Serva (SRN) β-merkaptoethanol, Serva (SRN) Citronan sodný p.a., Lachema (ČR) D-glukóza bezvodá p.a., Lachema (ČR) Dihydrogenfosforečnan draselný p.a., Lach-Ner (ČR) Dodecylsíran sodný (SDS), Serva (SRN) Dusičnan stříbrný, Sigma Aldrich (SRN) Ethanol (96%) p.a., Merci (ČR) Fenolová červeň, Sigma Aldrich (SRN) Folin-Ciocaltauovo činidlo (Vitrum) Formaldehyd(35%) p.a., Lach-Ner (ČR) Fosforečnan sodný dihydrát p.a., Lach-Ner (ČR) Hydrogenarseničnan sodný heptahydrát p.a., Lachema (ČR) Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát p.a., Merci, s.r.o, Brno Hydrogenuhličitan sodný p.a., Lachema (ČR) Hydroxid sodný p.a., Lach-Ner (ČR) Chlorid kobaltnatý p.a., Lachema (ČR) Chlorid sodný p.a., Lachema (ČR) Chlorid vápenatý p.a., Lachema (ČR) Jantaran sodný p.a., J. Kulich (ČR) Karboxymethylcelulosa, Serva (SRN) Kyselina boritá p.a., Lachema (ČR) kyselina citronová p.a., Merci (ČR) Kyselina chlorovodíková (35%) p.a., Merci (ČR) Ledová kyselina octová , Sigma Aldrich (SRN) Kyselina sírová (96%) p.a., Lach-Ner (ČR) 33
Kyselina trichloroctová p.a., Lachema (ČR) Lysozym, Serva (SRN) Molybdenan amonný tetrahydrát p.a., Lachema (ČR) Methanol p.a., Lachema (ČR) N,N'-methylenbisakrylamid (BIS), Serva (SRN) N,N'-tetramethylendiamin (TEMED), Sigma Aldrich (SRN) Octan amonný p.a., Lachema (ČR) p-nitrofenol, Sigma Aldrich (SRN) p-nitrofenyl palmitate, Sigma Aldrich (SRN) Peroxid vodíku, Sigma Aldrich (SRN) Persíran amonný (APS), Serva (SRN) Sladový extrakt, HiMedia, Indie Síran amonný p.a., Lachema (ČR) Síran hořečnatý heptahydrát p.a., Chemapol (ČR) Síran manganatý monohydrát p.a., Lach-Ner (ČR) Síran měďnatý pentahydrát p.a., Lach-Ner (ČR) Síran sodný p.a., Lachema (ČR) Síran zinečnatý heptahydrát p.a., Lachema (ČR) Síran železnatý heptahydrát p.a., Sigma Aldrich (SRN) Šťavelan sodný p.a., Lachema (ČR) Thiamin, Sigma Aldrich (SRN) Thiosíran sodný p.a., Lachema (ČR) Tris((Hydroxymethyl)aminomethan), Serva (SRN) Triton X-100, Sigma Aldrich (SRN) Uhličitan sodný p.a., Lachema (ČR) Vínan sodno-draselný p.a., Lachema (ČR) Veratryl alkohol (3,4-Dimethoxybenzyl alkohol), Sigma Aldrich (SRN) Xylosa p.a., Lachema (ČR) 3.1.3 Přístroje a pomůcky Spektrofotometr VIS, Helios δ (Unicam, UK) Spektrofotometr UV-VIS, Helios α (Unicam, UK) Očkovací box Aura mini (Bioair Instruments, UK) Vodní lázeň EL-20D Kavalier (ČR) Ultrazvuková lázeň PS02000 (ČR) Wortex, Ika Vortex genius 3 (SRN) Elektrický vařič (ETA, ČR) Analytické váhy BOECO (SRN) Mikrocentrifuga Mikro 200 Hettich Zentrifugen (SRN) Centrifuga chlazená U-32 (Boeco, SRN) Termostatovaná třepačka, Heidolph Unimax 1010, Labicom s.r.o. (ČR) Elektroforetická aparatura P9DS (Owel Separation Systems, USA) Elektroforetický zdroj Termostat Lyofylizátor 34
Běžné laboratorní sklo
3.2 Použité odpadní substráty Kukuřičné otruby, (200 g) NATURAL Pšeničné otruby – terminované, (200g) EVIT Žitné otruby, (250g) NATURAL Ovesné otruby, (250g) NATURAL Jablečná vláknina, (250g) NATURAL Bezvaječné těstoviny Vaječné těstoviny Dřevní piliny Rýže
3.3 Kultivace 3.3.1 Kultivace plísně Fusarium solani 3.3.1.1 Tuhé médium Tabulka 1: Složení pevného média Fusarium solani Složky Množství Bramborový extrakt 20 g glukóza 20 g Bakteriologický agar 20 g Voda 1000 ml Médium bylo používáno na uchovávání plísně Fusarium solani. Sterilizace probíhala v tlakovém hrnci 30 min. Kultura byla uchována na Petriho miskách ve tmě při 4 ºC. 3.3.1.2 Tekuté kultivační médium Tabulka 2: Složení minerálního média plísně Fusarium solani Složky Množství Glukosa 15 g (NH4)2SO4
10 g
KH2PO4
1g
MgSO4 NaCl Voda
0,5 g 5g 1000 ml
Pasterace probíhala v autoklávu. Kultura Fusarium solani byla zočkována z Petriho misky do 30 ml sterilního média ve 100 ml Erlenmayerově baňce. Kultivace proběhla za stálého třepání při teplotě 30°C.
35
Tabulka 3: Složení kultivačního média plísně Fusarium solani na odpadních substrátech Složky Množství Glukosa 2g (NH4)2SO4
10 g
KH2PO4
1g
MgSO4 NaCl Odpadní substrát Voda
0,5 g 5g 1g 1000 ml
3.3.2 Kultivace mikroorganizmu Aureobasidium pullulans 3.3.2.1 Tuhé médium Tabulka 4: Složení pevného média Aureobasidium pulllans Složky Množství Sladový extrakt 20 g Bakteriologický agar 20 g Voda 1000 ml Médium bylo používáno na uchovávání kultury Aureobasidium pullulans. Sterilizace probíhala v tlakovém hrnci 30 min. Kultura byla uchována na Petriho miskách ve tmě při 4ºC. 3.3.2.2 Tekuté kultivační médium Tabulka 5: Složení minerálního média mikroorganizmu Aureobasidium pullulans Složky Množství Glukosa 40 g (NH4)2SO4
10 g
KH2PO4
10 g
MgSO4 Voda
0,5 g 1000 ml
Tabulka 6: Složení kultivačního média mikroorganizmu Aureobasidium pullulans Složky Množství Glukosa 4g
36
(NH4)2SO4
10 g
KH2PO4
10 g
MgSO4 Odpadní substrát Voda
0,5 g 1g 1000 ml
Pasterace probíhala v autoklávu. Kultura Aureobasidium pullulans byla zočkována z Petriho misky do 30 ml sterilního média ve 100 ml Erlenmayerově baňce. Kultivace proběhla za stálého třepání při teplotě 28°C. 3.3.3 Kultivace plísně Phanerochaete chrysosporium 3.3.3.1 Tuhé médium Tabulka 7: Složení pevného média Phanerochaete chrysosporium Složky Množství Sladový extrakt 20 g Bakteriologický agar 20 g Voda 1000 ml Médium bylo používáno na uchovávání plísně Phanerochaete chrysosporium. Sterilizace probíhala v tlakovém hrnci 30 min. Kultura byla uchována na Petriho miskách ve tmě při 4ºC. 3.3.3.2 Tekuté kultivační médium Tabulka 8: Složení minerálního média plísně Phanerochaete chrysosporium[53]: Složky Množství Basal III medium 100 ml glukosa
10 g
Roztok stopových prvků
60 ml
Voda Thiamin Octan amonný Vínan sodno-draselný
840 ml 0,0010g 0,1542g 0,2363g
Tabulka 9: Složení kultivačního média plísně Phanerochaete chrysosporium Složky Množství Basal III medium 100 ml glukosa
2g
Roztok stopových prvků
60 ml
Voda Thiamin Octan amonný Vínan sodno-draselný Odpadní substrát
840 ml 0,0010g 0,1542g 0,2363g 1g
Pasterace probíhala v autoklávu. Kultura Aureobasidium pullulans byla zočkována z Petriho misky do 30 ml sterilního média ve 100 ml Erlenmayerově baňce. Kultivace proběhla za stálého třepání při teplotě 39°C.
37
Tabulka 10: Složení media basal III [53] Složky Trace element
Množství 100 ml
KH2PO4
20g
MgSO4
5g
Chlorid vápenatý voda
1g 900 ml
Tabulka 11: Složení roztoku stopových prvků [53] Složky Síran hořečnatý
Množství 3g
Síran manganatý
0,5 g
Chlorid sodný
1g
Síran železnatý heptahydrát Chlorid kobaltnatý Síran zinečnatý heptahydrát Síran měďnatý Kyselina boritá voda
0,1 g 0,1 g 0,1 g 0,1 g 10 mg 1000 ml
3.4 Postupy při stanovení enzymových aktivit Kultury byla po kultivaci centrifugována při 10000 ot/min, 4°C po dobu 10 minut supernatant byl následně použit ke stanovení enzymových aktivit.
a
3.4.1 Stanovení proteolytické aktivity Jako substrát byl použit roztok azokaseinu (5 mg/ml). Azokasein je chemicky modifikovaný mléčný protein kasein s navázanou oranžovou sulfanilamidovou skupinou. Enzymatickou hydrolýzou (37°C, 60 min) se uvolňují barevné peptidy rozpustné v trichloroctové kyselině, které jsou následně detekovány při 440 nm. Jednotka aktivity je pak definována jako množství enzymu katalyzující přeměnu substrátu doprovázenou nárůstem absorbance o 0,001 za 1 minutu za podmínek testu [54]. 3.4.2 Stanovení lipolytické aktivity Stanovení lipolytické aktivity s využitím p-nitrofenzylpalmitátu je založeno na schopnosti lipolytických enzymů štěpit tento substrát za vzniku žlutě zbarveného produktu p-nitrofenolu, který je stanoven spektrofotometricky při 410 nm. 3.4.2.1 Stanovení kalibrační křivky p-nitrofenolu Pro naměření a sestrojeni kalibrační křivky byl použit základní roztok p-nitrofenolu o koncentraci 0,5 mmol/l. Z tohoto roztoku byla připravena kalibrační řada p-nitrofenolu naředěním základního roztoku 0,1 M Tris-HCl pufrem pH 8,2 na koncentrace v rozmezí 0,005 až 0,05 mmol/l. Zkumavky byly dobře promíchány a na spektrofotometru byla změřena absorbance proti pufru při λ = 410 nm. 38
3.4.2.2 Příprava substrátu 0,0135g p-nitrofenylpalmitátu bylo naváženo do odměrné baňky 100 ml a doplněno destilovanou vodou. Roztok byl uchováván při teplotě 4°C nejdéle však 3 dny. 3.4.2.3 Stanovení aktivity lipáz Do zkumavek bylo nepipetováno 2,5 ml pufru pH 8, 2,5 ml substrátu a 1 ml supernatantu. Zkumavky byly inkubovány 30 minut při laboratorní teplotě. Poté byl změřen nárůst absorbance při 410 nm. Jednotka aktivity byla definována jako množství enzymu katalyzující přeměnu substrátu doprovázenou nárůstem absorbance v čase. 3.4.3 Stanovení aktivity mangan-dependetní peroxidáza Jako substrát byl použit roztok fenolové červeně. Do kyvety bylo napipetováno 900 μl substrátu a 100 μl supernatantu. Ihned byla změřena absorbance při 610 nm a následně odečítány změny absorbance v časovém intervalu po 1 minutě. Jednotka aktivity byla definována jako množství enzymu katalyzující přeměnu substrátu doprovázenou nárůstem absorbance v čase, k výpočtu byl použit extinkční koeficient (ε =22000 l.mol–1.cm–1) [55]. 3.4.4 Stanovení aktivity ligninperoxidázy Jako substrát byl použit roztok 5 mM veratrylalkoholu. Do kyvety se napipetovalo 900 μl reakční směsi a 100 μl supernatantu. Ihned byla změřena absorbance při 310 nm a následně odečítány změny absorbance v časovém intervalu po 1 minutě. Jednotka aktivity byla definována jako množství enzymu katalyzující přeměnu substrátu doprovázenou nárůstem absorbance v čase, k výpočtu byl použit extinkční koeficient (ε =9300 l.mol–1.cm–1) [56]. 3.4.5 Stanovení aktivity lakázy Jako substrát byl použit roztok 1 mM ABTS. Do kyvety se napipetovalo 900 μl roztoku ABTS a 100 μl supernatantu. Ihned byla změřena absorbance při 420 nm a následně odečítány změny absorbance v časovém intervalu po 1 minutě. Jednotka aktivity byla definována jako množství enzymu katalyzující přeměnu substrátu doprovázenou nárůstem absorbance v čase, k výpočtu byl použit extinkční koeficient (ε =36000 l.mol–1.cm–1) [56]. 3.4.6 Stanovení celulázy pomocí karboxymethylcelulózy (CMC) Aktivita celuláz byla stanovena spektrofotometricky měřením přírůstku redukujících skupin metodou podle Somogyiho a Nelsona, jako substrát byla použita 1 % CMC. Vzorky byly inkubovány při teplotě 40°C po dobu 1 hodiny. K 1 ml roztoku bylo přidáno 0,5 roztoku I a 0,5 ml roztoku II (kap. 3.4.7.1). Takto připravené zkumavky se ponořily do vroucí vodní lázně po dobu 10 minut. Po 10 minutách ve vodní lázni následovalo ochlazení zkumavek. K ochlazeným zkumavkám bylo přidáno 0,5 ml roztoku III, kde byl obsah zkumavky promíchán do rozpuštění sraženiny. K obsahu zkumavek bylo přidáno 7,5 ml vody (celkový objem činil 10 ml) a následně změřena absorbance při 720 nm proti blanku, který byl připraven stejně jako vzorky, ale roztok byl nahrazen 1 ml destilované vody. Aby mohlo být odečteno množství glukózy uvolněného ze substrátu od celkového množství redukujících cukrů v supernatantu, bylo provedeno paralelní měření, u kterého nebyly vzorky inkubovány. Jednotka aktivity byla definována jako množství enzymu katalyzující rozklad substrátu doprovázený nárůstem absorbance v čase. 39
3.4.7 Stanovení celulázy s pomocí filtračního papíru Aktivita celuláz byla stanovena metodou podle Somogyiho a Nelsona. Jako substrát byl použit proužek filtračního papíru o velikosti 1x2 cm. Další postup je shodný s kap. 3.4.6. 3.4.7.1 Příprava činidel Činidlo I. bylo připraveno rozpuštěním 24 g uhličitanu sodného, 16 g hydrogenuhličitanu sodného a 12 g vínanu sodno-draselného v 200 ml destilované vody. 144 g síranu sodného bylo rozpuštěno v 600 ml destilované vody. Následně byly oba roztoky smíchány. Činidlo II. bylo připraveno rozpuštěním 4 g pentahydrátu síranu měďnatého a 24 g síranu sodného ve 200 ml destilované vody. Činidlo III. bylo připraveno rozpuštěním 25 g molybdenanu amonného ve 450 ml destilované vody, poté bylo přidáno 21 ml koncentrované kyseliny sírové a 3 g heptahydrátu hydrogenarseničnanu sodného. Připravený roztok byl na 48 hodin umístěn do termostatu při teplotě 37°C. 3.4.7.2 Stanovení kalibrační křivky glukózy Pro sestrojení kalibrační křivky glukosy byl použit základní roztok glukosy o koncentraci 0,1 g/l. Z tohoto roztoku byla připravena kalibrační řada o koncentraci 0,01 až 0,1 g/l. Do každé zkumavky bylo k 1 ml roztoku glukosy přidáno po 0,5 ml Somogyiho činidla I a II. Zkumavky byly 10 minut povařeny a ochlazeny na laboratorní teplotu. Pak bylo přidáno 0,5 ml Nelsonova činidla. Obsah zkumavek byl doplněn 7,5 ml destilované vody na celkový objem 10 ml, promíchán a následně byla na spektrofotometru změřena absorbance při vlnové délce 720 nm proti blanku (blank obsahoval místo vzorku 1 ml destilované vody). 3.4.8 Stanovení amylázy Aktivita amyláz byla stanovena metodou podle Somogyiho a Nelsona. Postup je shodný se stanovením celuláz (kap. 3.4.6), pouze roztok CMC byl nahrazen 1% roztokem škrobu. Roztok škrobu byl 5 minut povařen a před každým stanovením byl připraven čerstvý. 3.4.9 Stanovení xylanázy Aktivita xylanáz byla stanovena metodou podle Somogyiho a Nelsona. Postup je shodný se stanovením celuláz (kap. 3.4.6), pouze roztok CMC byl nahrazen 1% roztokem xylanu. 3.4.9.1 Stanovení kalibrační křivky xylózy Pro sestrojení kalibrační křivky byl použit základní roztok xylózy o koncentraci 0,1 g/l. Z tohoto roztoku byla připravena kalibrační řada o koncentraci 0,01 až 0,1 g/l. Další postup je shodný s přípravou kalibrační křivky glukózy (kap. 3.4.7.2 ).
3.5
Stanovení extracelulárních bílkovin
Stanovení dle Hartree-Lowryho je kolorimetrické, založené na dvousložkovém činidle. První složkou je biuretové činidlo, druhou složkou je Folin–Ciocaltauovo činidlo na fenoly. Jde o polykyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové, které se redukují tyrozinovými zbytky proteinů a barví se modře. Metoda byla mnohokrát upravena. Jednu z nejpoužívanějších modifikací vypracoval Hartree v roce 1972.
40
Tato verze využívá celkem tři činidla, z nichž první dvě jsou pro biuretové stanovení, namísto původních pěti činidel. Dochází k tvorbě daleko intenzivnějšího zbarvení (zvýšená citlivost) a stanovení je lineární v širším rozsahu koncentrací. 3.5.1 Složení činidel Roztok A: Vínan sodno-draselný . 4 H2O 2 g, Na2CO3 100 g, 500 ml 1M NaOH, destilovaná. voda 1 l Roztok B: Vínan sodno-draselný . 4 H2O 2 g, CuSO4 . 5 H2O 1 g, 10 ml 1M NaOH Roztok C: Folin-Ciocalteauvo činidlo: dest. voda (1:15) 3.5.2 Stanovení kalibrační křivky Pro sestrojení kalibrační křivky byl použit roztok albuminu, z něhož byla připravena kalibrační řada o koncentraci 0,05 až 0,3 mg/ml. Do každé zkumavky bylo k 1 ml roztoku albuminu přidáno 0,9 ml roztoku A, zkumavky byly temperovány po dobu 10 minut při 50°C ve vodní lázni. Pak byly zkumavky ochlazeny a bylo přidáno 0,1 ml roztoku B, při laboratorní teplotě se zkumavky temperovaly 10 minut. Poté byly přidány 3 ml roztoku C a opět se zkumavky temperovaly po dobu 10 minut ve vodní lázni při 50°C. Nakonec byla změřena absorbance při 550 nm proti blanku, kde byl roztok albuminu nahrazen destilovanou vodou. 3.5.3 Stanovení koncentrace bílkovin Koncentrace extracelulárních bílkovin byla stanovena metodou dle Hartree-Lowryho .Do zkumavky bylo k 1 ml supernatantu přidáno 0,9 ml roztoku A, zkumavky byly temperovány po dobu 10 minut při 50°C ve vodní lázni. Pak byly zkumavky ochlazeny a přidalo se 0,1 ml roztoku B a následovalo ochlazení na laboratorní teplotu a inkubace při laboratorní teplotě zkumavek 10 minut. Poté byly přidány 3 ml roztoku C a opět se zkumavky temperovaly po dobu 10 minut ve vodní lázni při 50°C. Nakonec byla změřena absorbance při 550 nm proti blanku, kde byl supernatant nahrazen destilovanou vodou.
3.6 Izolace a purifikace enzymů 3.6.1 Ultrafiltrace Pro zkoušku účinnosti ultrafiltrace byl připraven roztok lysozymu o koncentraci 230 µg/ml, který byl centrifugován v ultrafiltračních zkumavkách s membránou 1 a 10 kDa. Roztok byl na membráně 1 kDa dvakrát a na membráně 10 kDa třikrát zkoncentrován. Poté byla stanovena koncentrace bílkovin v původním roztoku ve vzorcích po ultrafiltraci a ve filtrátu, který prošel přes membránu. Dalším analyzovaným vzorkem byl supernatant plísně Phanerochaeta chrysosporium po kultivaci na kukuřici. Ten byl koncentrován pomocí ultrafiltračních zkumavek s membránou 1 kDa. Původní roztok o objemu 14 ml byl zkoncentrován na objem 10 ml. Ultrafiltrace byla provedena na chlazené centrifuze při teplotě 4 °C, při 7000 rpm po dobu 60 minut. Poté byly změřeny aktivity vybraných enzymů (celuláz, amyláz, xylanáz a proteáz) a koncentrace bílkovin v původním vzorku, vzorku po ultrafiltraci a ve filtrátu. Supernatanty Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrisosporium po 5 denní kultivaci na kukuřici byly koncentrovány na zkumavkách s membránou o velikosti 10 kDa. Ultrafiltrace byla provedena na chlazené centrifuze při teplotě 4°C, 7000 rpm po dobu 40 minut.
41
3.6.2 Dialýza K analýze byl použit vzorek supernatantu mikroorganizmu Aureobasidium pullulans, který byl získány po pětidenní kultivaci na kukuřičných otrubách. Lyofilizovaný supernatant byl 10x zkoncentrován a naplněn do dialyzační polopropustné membrány, která byla vložena do fosfátového pufru pH 7,4. Dialýza byla provedena při teplotě 4 °C. Po skončení dialýzy byla u vzorku změřena aktivita vybraných enzymů (celulázy, amylázy, xylanázy a proteázy) a porovnána s jejich aktivitou před dialýzou. 3.6.3 Gelová filtrace Gelová filtrace byla provedena na kolonách o objemu 100 a 15 ml. Jako náplň byl použit Sephadex G-100. Jako standard byl použit Gel filtration standard (BioRad). Na kolonu 100 ml se nanášelo 0,4 ml standardu, na 15 ml kolonu se naneslo 0,1 ml standardu. Vzorek se na větší kolonu nanášel po 2 ml a průtok byl nastaven na 1ml/min, na menší koloně se nanášelo 0,3 ml s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min vzorku. Jako mobilní fáze byl použit fosfátový pufr pH 7,4. Na UV detektoru byla snímána změna absorbance (280 nm) a výsledný chromatogram byl zaznamenán pomocí SW. Během gelové filtrace byla také sledována změna iontové síly roztoku pomocí vodivostního detektoru. Pro zkoušku kolony byl nanesen vzorek azoalbuminu o koncentraci 5 mg/ml s přídavkem NaCl o koncentraci 10 g/l, průtoková rychlost byla nastavena na 1 ml/min. V chromatogramu byl zaznamenám pík azoalbuminu a pomocí NaCl byl stanoven celkový objem kolony. Dalším vzorkem byl roztok albuminu o koncentraci 5 mg/ml s přídavkem NaCl o koncentraci 30 g/l. Průtoková rychlost byla nastavena na 2 ml/min. Dalším purifikovaným vzorkem byl lyofilizovaný a následně dialyzovaný supernatant Aerobasidium pullulans (viz. 3.6.2). Během gelové filtrace vzorku AP byly jímány frakce o objemu 10 ml, ve kterých byla následně stanovena aktivita celuláz, amyláz, xylanáz, proteáz a koncentrace bílkovin. 3.6.4 Vsádková ionexová chromatografie Vsádková iontová chromatografie byla provedena na kationtoměniči i aniotoměniči. Stacionární fáze aniontoměniče byla připravena rozpuštěním 1 g práškového DEAE Sephadex-25 (Pharmacia)v 25 ml P-pufr pH 7,4. Stacionární fáze kationtoměniče byla připravena rozpuštěním 1 g práškové karboxymethylcelulosy CM32 (Whatman)v 25 ml Ppufr pH 7,4. Jako mobilní fáze byl použit P-pufr pH 7,4. Pro stanovení byl jako vzorek použit supernatant plísně Aureobsidium pullulans po dialýze, získaný po pětidenní kultivaci na kukuřičných otrubách (viz. 3.6.2). 1 ml připravené stacionární fáze byl napipetován do zkumavky typu Eppendorf, která byla poté centrifugována při 12000 otáčkách po dobu 10 minut. Supernatant byl slit a ke stacionární fázi bylo přidáno 1,5 ml roztoku vzorku. Vzorek byl protřepán společně se stacionární fází a 2 minuty byla směs inkubována při laboratorní teplotě, poté byla směs centrifugována při 12000 otáčkách po dobu 10 minut. Supernatant byl použit ke stanovení koncentrace enzymů a aktivit, které se na stacionární fázi nenavázaly. Ke stacionární fázi bylo dále napipetováno 1,5 ml P-pufr pH 7,4 s 0,5 M NaCl. Směs byla protřepána a po 2 minutách centrifugována při 12000 otáčkách po dobu 10 minut. Supernatant byl použit ke stanovení koncentrace enzymů a aktivit, které se podařilo navázat. Eluce byla stejným způsobem zopakována s pufrem o pH 7,4 s vyšší koncentrace soli (1 M NaCl).
42
3.6.5 Vertikální PAGE SDS elektroforéza K vertikální elektroforetické separaci proteinů byla použita aparatura P9DS (16 x 14 cm). Nosičem byl polyakrylamidový gel a k detekci enzymů bylo použito barvení stříbrem. Jako standardy byly použity proteinové směsi 6; 5 a 4 (Serva). 3.6.5.1 Roztoky Elektrodový pufr – 3 g Tris + 14,4 g glycin + 1 g SDS do 1 l redestilované vody Iniciační činidlo – 100 mg APS (persíran amonný) do 1 ml redestilované vody (vždy čerstvý) Separační (dělící) pufr pH 8,8 – 18,2 g Tris + 2,8 ml 32% HCl do 100 ml redestilované vody Vzorkovací pufr – 5 ml glycerolu + 1 g SDS + 2,56 ml β-merkaptoetanolu + 2,13 ml zaostřovacího pufru + cca 1 mg bromfenolové modři doplnit na objem 10 ml redestilovanou vodou Zaostřovací pufr – 6,1 g Tris + 2,5 ml 32% HCl do 100 ml redestilované vody Zásobní roztok AA/BIS (29:1) – 40% AA : 3,3% BIS 3.6.5.2 Příprava polyakrylamidového gel Pro elektroforézu enzymových vzorků byl použit 12,5 % gel. Do kádinky bylo napipetováno 16 ml zásobního roztoku AA/BIS, 10 ml separačního pufru 13,6 ml redestilované vody a 0,4 ml 10% SDS, 20 μl TEMED a 200 μl APS. Směs na gel byla opatrně zamíchána a napipetována do prostoru mezi dvě skla v nalévacím stojanu. Mezi skla byl vložen plastový hřeben pro vytvoření jamek pro nanášení vzorků. Gel byl ponechán polymerovat po dobu jedné hodiny. 3.6.5.3 Příprava vzorků Vzorky byly smíchány se vzorkovacím pufrem v poměru 1 : 1 a povařeny po dobu 4 minut na vodní lázni. Po nanesení do jamek gelu byly vzorky uchovány pro další použití při – 20°C. Proteinová směs 6 byla naředěna na koncentraci 10 mg/ml. 3.6.5.4 Provedení elektroforézy Po ztuhnutí gelu byl odstraněn plastový hřeben a dále byly skla s gelem pečlivě upevněny do aparatury tak, aby nevytékal elektrodový pufr z elektrodového prostoru. Následně byl nalit elektrofový pufr. Vzorky byly naneseny do jamek v množství 10 – 20 μl. Aparatura byla přikryta průhledným víkem, dobře utěsněna a připojena ke zdroji napětí, proud 100 mA podobu 3 hodin. 3.6.5.5 Barvení stříbrem Fixační roztok – 120 ml ledové kyseliny octové, 500 ml 96% ethanolu a 500 μl 35% formaldehydu doplněno do 1 l deionizovanou vodou Promývací roztok – 200 ml 96% ethanolu a 800 ml deionizované vody Senzibilizační roztok – 200 mg Na2S2O3 · 5H2O rozpustit v malém množství deionizované vody a poté doplnit na objem 1 l Barvící roztok – 2 g AgNO3 rozpustit v malém množství deionizované vody + 760 μl 35% formaldehydu doplnit do 1 l deionizovanou vodou (připravit vždy čerstvý a uchovat před použitím při 4°C) Vyvíjecí roztok – 60 g Na2CO3 rozpustit v malém množství deionizované vody + 4 mg Na2S2O3 a 500 μl 35% formaldehydu doplnit do 1 l deionizovanou vodou 43
Terminační roztok – 120 ml ledové kyseliny octové doplnit na objem 1 l deionizovanou vodou. Po ukončení elektroforézy byl gel opatrně pomocí střičky s destilovanou vodou přenesen do misky s fixačním roztokem. Důležité během přenosu bylo, aby gel nepřišel do kontaktu s žádným kovovým předmětem. Gel byl ponechán ve fixačním roztoku minimálně po dobu 2 hodin. Po odstranění fixačního roztoku byl gel promýván 20% ethanolem po dobu 20 minut. Mycí roztok byl třikrát vyměněn za čerstvý. Gel byl následně převrstven senzibilizačním roztokem a ponechán na třepačce po dobu 2 minut, poté byl gel dvakrát promyt deionizovanou vodou. Dále byl přidán studený barvící roztok, gel byl protřepáván po dobu 20 minut. Po obarvení byl gel dvakrát propláchnut větším množstvím deionizované vody. V dalším kroku byl gel propláchnut malým množstvím vyvíjecího roztoku a poté bylo přidáno 300 ml vyvíjecího roztoku. K vyvinutí proteinového obrazu došlo během 2 minut, po dosažení požadované intenzity obrazu byla redukce zastavena přidáním 50 ml ukončovacího roztoku. Po skončení bublání roztoku, bylo vyvíjení je zastaveno [57]. Po ukončení celého procesu barvení byl gel opatrně přenesen mezi dvě folie a naskenován. Velikost fragmentů separovaných proteinů byla určena pomocí standardů o známé molekulové hmotnosti.
44
4
VÝSLEDKY A DISKUSE
4.1 Stanovení enzymových aktivit Stanovení enzymových aktivit bylo provedeno dle uvedených postupů v kapitole 3.4 u plísní Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani a Aureobasidium pullulans. Produkce enzymů byla sledována u vybraných druhů plísní v závislosti na čase a použitém kultivačním substrátu. Stanovení enzymových aktivit v médiu bylo provedeno 3., 7., a 10. den kultivace. Při výpočtu aktivit enzymů byla pro výpočet intervalu spolehlivosti počítána hladina statistické významnosti 0,05. 4.1.1 Stanovení aktivity celulázy Pro stanovení celulázové aktivity bylo třeba sestavit kalibrační závislost pro stanovení redukujících cukrů dle Somogyi-Nelsona (tabulka 12, graf 1). Závislost byla stanovena pro glukózu, aby mohlo být odečteno množství glukózy v médiu od celkového množství redukujících cukrů a tím provedena korekce na množství glukózy uvolněného ze substrátu. Jako substráty pro stanovení celulázové aktivity byly použity filtrační papír (jako modelový nerozpustný substrát) a 1% CMC (modelový rozpustný substrát). Tabulka 12: Kalibrační křivka redukujících sacharidů na glukóze dle Somogyi-Nelsona koncentrace (g/l) Absorbance (720 nm) 0,0103 0,0206 0,0309 0,0412 0,0515 0,0618 0,0721 0,0824 0,0927 0,1030
0,034 0,076 0,159 0,189 0,244 0,326 0,415 0,449 0,507 0,612
Graf 1: Kalibrační křivka redukujících sacharidů na glukóze dle Somogyi-Nelsona 0,7
A (720 nm)
0,6 0,5 0,4 0,3 y = 5,9312x - 0,0317 R² = 0,9893
0,2 0,1 0 0
0,02
0,04
0,06 c (g/l)
0,08
0,1
0,12
45
4.1.1.1 Stanovení celulázové aktivity na filtračním papíře Aktivita celulázy byla vyjádřena jako množství glukózy, které se uvolnilo z celulózového substrátu působením enzymu; vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát pro stanovení aktivity byl použit proužek filtračního papíru o velikosti 1x2 cm. Graf 2: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans (filtrační papír)
AP celulázová aktivita
40,0
pšeničné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
kukuřičné otuby
35,0 ovesné otruby
30,0
žitné otruby
25,0
minerální médium
20,0
dřevní piliny jablečná vláknina
15,0
vaječné těstoviny
10,0 bezvaječné těstoviny
5,0
rýže
0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Při kultivaci Aureobasidium pullulans na minerálním médiu, otrubách a na bezvaječných těstovinách byla nejvyšší hodnota celulázové aktivity naměřena 3. den kultivace. U ostatních použitých substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 7. den kultivace. 10. den kultivace byla u všech použitých substrátů celulázová aktivita nejnižší. Použitý kmen A.pullulans produkuje celulózy i v minerálním médiu s maximem produkce 3.den kultivace, přičemž produkce enzymu je na tomto médiu nejvyšší. Graf 3: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani (filtrační papír)
FS celulázová aktivita
250,0
pšeničné oruby kukuřičné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
225,0
ovesné otruby
200,0
žitné otruby
175,0
minerální médium dřevní piliny
150,0 125,0 100,0
jablečná vláknina
75,0
vaječné těstoviny
50,0
bezvaječné těstoviny rýže
25,0 0,0 0
46
2
4
6
doba kultivace (dny)
8
10
12
Při kultivaci plísně Fusarium solani na minerálním médiu, na otrubách a rýži byla nejvyšší hodnota celulázové aktivity naměřena 3. den kultivace. Použitý kmen F.solani v minerálním médiu produkuje relativně malé množství celulázy s maximem produkce 3.den kultivace. Nejlepším substrátem byly kukuřičné otruby, kde dochází až k 10-násobně vyšší produkci enzymu ve srovnání s kontrolou (minerální médium). Při kultivaci na jablečné vláknině, vaječných a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší aktivity naměřena až 7. den kultivace. 10. den kultivace aktivita klesala. Graf 4: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium (filtrační papír)
PCH celulázová aktivita
70,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
60,0 ovesné otruby
50,0
žitné otruby
40,0
minerální médium dřevní piliny
30,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny
20,0
bezvaječné těstoviny rýže
10,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kultivace (dny) Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na rýži byla nejvyšší hodnota celulázové aktivity naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na minerálním médiu, jablečné vláknině a vaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita naměřena až 10. den kultivace. U ostatních použitých substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 3. den kultivace. Nejvyšší aktivita enzymu byla naměřena na ovesných otrubách 3.den kultivace, přičemž aktivita je podobná aktivitě enzymu produkovaného na rýžovém substrátu 7.den kultivace. Aktivita extracelulárních celuláz byla výrazně závislá na času kultivace a na použitém odpadním substrátu. Nejvyšší produkce extracelulárních celuláz tak byla u všech kultur naměřena v prvních fázích kultivace v produkčním médiu. Poté enzymatická aktivita celuláz významně poklesla. Je zajímavé, že nejvyšší hodnota celulázové aktivity u Aureobasidium pullulans byla naměřena při kultivaci na minerálním médiu bez přídavku odpadního substrátu. Tuto skutečnost je možné vysvětlit tak, že v případě AP nejsou extracelulární celulázy indukovány přítomností substrátu v médiu, naopak zdá se, že přítomnost složitého substrátu v médiu mírně inhibuje jejich produkci. Celkově však byly produkce celuláz u AP spíše nižší při porovnání s ostatními testovanými MO. Jako nejlepší producent extracelulárních celuláz s aktivitou vůči nerozpustnému substrátu se projevila plíseň Fusarium solani, kdy byla výrazně nejvyšší aktivita (219,0.10-3 U/ml) stanovena při kultivaci na kukuřičných otrubách 3. den kultivace. 47
Také plíseň Phanerochaete chrysosporium se osvědčila jako efektivní producent, nejvyšší aktivita celuláz byla naměřena při kultivaci na ovesných otrubách 3. den kultivace. 4.1.1.1 Stanovení celulázové aktivity na karboxymethylcelulóse Aktivita celulázy byla vyjádřena jako množství glukózy, které se uvolnilo z celulózového substrátu působením enzymu vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát pro stanovení aktivity byl použit 1% roztok CMC. Graf 5: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans (CMC)
AP celulázová aktivita
70,0
pšeničné otuby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
kukuřičné otruby
60,0
ovesné otruby žitné otruby
50,0
minerální médium
40,0 dřevní piliny
30,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny
20,0
bezvaječné těstoviny rýže
10,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Graf 6: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani (CMC)
FS celulázová aktivita
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
275,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby žitné otruby
250,0 225,0 200,0 175,0
minerální médium dřevní piliny
150,0 125,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
100,0 75,0 50,0 25,0 0,0 0
2
4
6
doba kultivace (dny)
48
8
10
12
Graf 7: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium (CMC)
PCH celulázová aktivita
90,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
80,0
ovesné otruby
70,0
žitné otruby
60,0 minerální médium
50,0 dřevní piliny
40,0
jablečná vláknina
30,0
vaječné těstoviny
20,0
bezvaječné těstoviny
10,0
rýže
0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kultivace (dny) Při kultivaci Fusarium solani na dřevných pilinách, vaječných a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší hodnota celulázové aktivity naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na jablečné vláknině a ovesných otrubách byla nejvyšší aktivita naměřena až 10. den kultivace. U ostatních použitých substrátů byla nejvyšší hodnota aktivity stanovena 3. den kultivace. Použitý kmen F.solani v minerálním médiu produkuje podobně jako v případ analýzy s filtračním papírem relativně malé množství celulázy s maximem produkce 3.den kultivace. Při kultivaci Aureobasidium pullulans na minerálním médiu, ovesných a žitných otrubách na dřevních pilinách a rýži byla nejvyšší hodnota celulázové aktivity naměřena 3. den kultivace. V dalších dnech aktivita enzymu klesala. U ostatních použitých substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 7. den kultivace. Nejlépe patrný je tento jev u jablečné vlákniny. 10. den kultivace byla u všech použitých substrátů celulázová aktivita nejnižší. Výrazně vyšší aktivita enzymu byla opět naměřena s použitím kukuřičných otrub 3.den kultivace. Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na minerálním médiu, jablečné vláknině, vaječných a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita naměřena až 10. den kultivace. U ostatních použitých substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 3. den kultivace. V grafech č. 5, 6 a 7 jsou uvedeny aktivity celulázových enzymů produkované různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Produkce extracelulárních celuláz s aktivitou vůči rozpustnému substrátu je velice podobná produkci celuláz s afinitou vůči substrátům nerozpustným. Nevyšší produkce CMC-celuláz byla také zaznamenána převážně na začátku kultivace, tedy 3. až 7. den. Nejvyšší hodnota celulázové aktivity u mikroorganizmu Aureobasidium pullulans byla opět naměřena při kultivaci na minerálním médiu 3. den kultivace. Stejně tak, nejlepším producentem CMCceluláz byla plíseň Fusarium solani kultivovaná na kukuřičných otrubách, kdy v třetí den kultivace byla stanovena aktivita CMC-celulázy 248.10-3 U/ml. Nejvyšší hodnota celulázové aktivity u plísně Phanerochaete chrysosporium byla naměřeny při kultivaci na ovesných otrubách 3. den kultivace.
49
50
Tabulka 13: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium (filtrační papír) Aktivita celulázy (nmol/ml.min) - filtrační papír druh doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) MO 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. 12,35±0,11 5,41±0,22 5,646±0,108 10,638±0,108 5,802±0,108 5,34±0,11 F. S. 19,61±0,98 5,88±0,29 4,94±0,25 219,00±11,00 95,10±4,80 72,60±3,60 P. Ch. 45,00±8,60 8,45±0,32 7,36±0,10 36,81±4,86 5,41±0,00 6,35±0,00 ovesné otruby žitné otruby A. P. 17,42±0,22 4,94±0,22 5,646±0,108 7,75±0,33 6,35±0,01 6,27±0,11 F. S. 7,44±0,27 6,19±0,31 10,25±0,51 68,90±3,40 6,82±0,34 8,06±0,41 P. Ch. 60,20±1,60 6,82±0,65 12,82±0,10 36,03±0,54 23,70±1,90 22,10±0,00 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. 7,83±2,05 11,20±1,70 6,66±0,22 9,31±0,65 18,05±0,43 16,48±0,12 F. S. 6,11±0,10 111,70±5,50 9,00±0,22 8,70±1,50 42,90±1,20 30,76±0,76 P. Ch. 34,90±4,30 13,10±1,10 28,23±0,54 25,89±0,54 13,50±1,60 29,00±1,60 bezvaječné těstoviny dřevní piliny A. P. 22,20±1,20 6,66±0,86 5,88±0,64 6,10±0,12 8,40±0,17 2,71±0,05 F. S. 30,10±1,90 47,10±2,50 24,75±0,76 26,70±1,10 38,80±1,40 25,50±1,10 P. Ch. 25,50±3,30 12,40±1,10 nedetek. 12,61±0,25 5,28±0,12 2,55±0,06 minerální medium rýže A. P. 37,80±4,60 15,65±0,54 3,20±1,10 7,40±0,32 9,90±0,22 5,5±0,11 F. S. 35,90±4,10 11,60±1,10 11,89±0,41 13,80±0,32 nedetek. 7,60±0,22 P. Ch. 32,13±0,54 29,01±0,54 30,96±3,24 42,70±3,20 50,10±2,70 nedetek.
9,2±0,4 11,7±0,6 56,3±1,6
45,2±0,2 8,1±0,4 80,5±7,0
10,3±0,5 5,6±0,2 27,1±1,1
9,9±1,3 27,3±2,1 33,7±5,9
57,6±1,5 46,7±4,3 27,5±0,5
A. P. F. S. P. Ch.
A. P. F. S. P. Ch.
A. P. F. S. P. Ch.
A. P. F. S. P. Ch.
3
A. P. F. S. P. Ch.
druh MO
Aktivita celulázy (nmol/ml.min) - CMC doba kultivace (dny) 7 10 3 pšeničné otruby 10,4±0,2 7,8±1,0 8,84±0,65 7,0±04 10,7±0,5 248,0±11,0 7,2±0,3 12,7±0,1 46,559±0,001 ovesné otruby 10,4±0,2 6,5±0,2 23,5±0,6 5,4±0,3 11,0±0,4 38,0±1,0 26,3±3,9 21,4±0,1 43,8±3,8 jablečná vláknina 46,7±5,3 6,3±1,4 6,4±0,1 20,5±0,2 43,9±0,2 17,8±1,4 29,4±1,1 36,4±1,1 39,9±1,6 bezvaječné těstoviny 20,3±0,1 5,5±0,3 35,6±1,7 99,0±0,9 52,4±0,2 36,4±1,3 38,0±1,1 45,4±3,8 13,2±0,3 minerální medium 13,1±1,1 nedetek. 22,3±0,1 26,3±4,2 19,5±4,3 27,7±0,9 25,9±0,5 22,9±0,5 49,3±1,6 doba kultivace (dny) 7 kukuřičné otruby 7,21±0,11 105,1±4,5 5,96±0,54 žitné otruby 5,4±0,1 7,4±0,32 31,9±1,2 vaječné těstoviny 17,5±1,0 110,6±0,8 31,4±2,7 dřevní piliny 3,8±0,1 46,6±2,0 2,9±0,1 rýže 5,8±0,3 nedetek. nedetek.
5,5±0,1 7,0±0,1 10,9±0,7
3,2±0,1 25,5±1,0 2,6±0,1
nedetek. 37,2±0,4 65,2±1,1
5,8±0,1 13,7±0,6 18,9±0,1
5,4±0,1 131,6±5,1 18,2±0,4
10
51
Tabulka 14: Závislost aktivity celulázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium (CMC)
4.1.2 Stanovení aktivity amylázy Podle kalibrační závislosti (graf 1) byla vypočítána hodnota koncentrace redukujících cukrů. Aktivita amylázy byla vyjádřena jako množství glukózy (redukujícího cukru), které se uvolnilo ze škrobového substrátu působením enzymu vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát pro stanovení amylázové aktivity byl použit 1% roztok škrobu. V grafech č. 8, 9 a 10 jsou uvedeny aktivity amylázových enzymů produkovaných různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Graf 8: Závislost aktivity amylázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
AP amylázová aktivita
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
100,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
75,0
žitné otruby minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
50,0
25,0
0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kultivace (dny) Graf 9: Závislost aktivity amylázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani
FS amylázová aktivita
50,0
minerální médium
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
45,0
jablečná vláknina
40,0 35,0
vaječné těstoviny
30,0 25,0 20,0
bezvaječné těstoviny
15,0
rýže
10,0 5,0 0,0 0
2
4
6
doba kultivace (dny) 52
8
10
12
Graf 10: Závislost aktivity amylázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH amylázová aktivita
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
120,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby žitné otruby
100,0 80,0
minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
60,0 40,0 20,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kultivace (dny) Při kultivaci Aureobasidium pullulans na minerálním médiu a ovesných otrubách byla nejvyšší hodnota amylázové aktivity naměřena 3. den kultivace. U kultivace na vaječných těstovinách, kukuřičných a žitných otrubách byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena až 10. den kultivace. U ostatních substrátů amylázová aktivita dosáhla maxima 7. den kultivace. U AP byla naměřena nejvyšší amylázová aktivita při kultivaci na pšeničných otrubách 7. den kultivace. Zdá se, že produkce amylázy je alespoň v některých případech indukována přítomností škrobového substrátu, i když enzym je produkován i v minerálním médiu, ale v podstatně menší míře. Při kultivaci Fusarium solani na minerálním médiu byla nejvyšší hodnota amylázové aktivity naměřena 10. den kultivace. U ostatních substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity stanovena 7. den kultivace, zřejmě jako odezva na přítomnost vhodného substrátu v médiu. Nejvyšší hodnota amylázové aktivity u plísně Fusarium solani byla stanovena při kultivaci na bezvaječných těstovinách 7. den kultivace. Produkce amyláz také silně závisela na čase i na použitém odpadním substrátu. Na rozdíl od celuláz docházelo k výrazné produkci amyláz spíše ve druhé polovině kultivace v produkčním médiu. Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na minerálním médiu, rýži, vaječných a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita naměřena 7. den kultivace. U ostatních použitých substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena až 10. den kultivace. Nejvyšší produkce amyláz u všech kultur na většině substrátů bylo dosaženo po týdnu kultivace. Celkově se jako nejlepší producent extracelulárních enzymů s aktivitou vůči škrobu při kultivaci na většině substrátů osvědčil kmen PCH, kdy při růstu na rýži bylo 7. den kultivace dosaženo nejvyšší amylolytické aktivity 111,8.10-3 U/ml.
53
54
Tabulka 15: Závislost aktivity amylázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Aktivita amylázy (nmol/ml.min) druh MO doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. 9,2±0,3 73,8±2,0 66,1±4,1 nedetek. nedetek. 43,6±0,4 P. Ch. nedetek. 32,5±4,3 55,5±7,0 nedetek. 23,2±0,7 39,9±8,1 ovesné otruby žitné otruby A. P. 61,7±2,2 17,8±0,5 55,8±1,3 5,5±0,3 10,1±0,4 58,6±0,9 P. Ch. nedetek. 29,0±2,7 37,2±2,2 nedetek. nedetek. 34,1±8,7 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. 53,7±6,1 78,1±9,0 67,9±1,9 nedetek. 3,6±0,6 5,2±0,2 F. S. nedetek. 39,4±2,2 nedetek. 29,0±0,7 34,4±1,2 nedetek. P. Ch. 25,1±3,9 40,7±3,3 57,6±2,9 26,1±1,8 45,6±1,4 nedetek. bezvaječné těstoviny rýže A. P. nedetek. 5,5±0,6 nedetek. 5,7±0,7 40,5±1,1 5,9±0,7 F. S. 25,6±5,4 47,4±1,1 3,9±0,2 18,1±1,6 28,2±1,3 8,7±1,0 P. Ch. 22,7±2,2 38,1±1,8 nedetek. 29,8±1,1 111,8±10,8 26,3±1,6 minerální medium A. P. 24,5±8,3 nedetek. nedetek. F. S. nedetek. 17,5±1,1 20,4±1,8 P. Ch. 3,7±0,1 27,7±1,8 nedetek.
4.1.3 Stanovení aktivity xylanázy Pro stanovení aktivity xylanázy bylo třeba sestavit kalibrační závislost pro stanovení redukujících cukrů dle Somogyi-Nelsona (tabulka 16, graf 11). Závislost byla stanovena pro xylózu, aby mohlo být odečteno množství xylózy uvolněné ze substrátu od celkového množství redukujících cukrů v médiu. Aktivita xylanázy byla vyjádřena jako množství xylózy které se uvolnilo ze substrátu působením enzymu, vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát byl použit 1% roztok xylanu. Tabulka 16: Kalibrační křivka redukujících sacharidů na xylóze dle Somogyi-Nelsona koncentrace (g/l) Absorbance (720 nm) 0,0110 0,043 0,0220 0,071 0,0330 0,094 0,0440 0,125 0,0550 0,182 0,0660 0,261 0,0770 0,295 0,0880 0,387 0,0990 0,435 0,1100 0,526 Graf 11: Kalibrační křivka redukujících sacharidů na xylóze dle Somogyi-Nelsona
kalibrační křivka - xylóza
0,6
A (720 nm)
0,5 0,4 0,3 y = 4,6975x - 0,0385 R² = 0,9683
0,2 0,1 0 0
0,02
0,04
0,06 c (g/l)
0,08
0,1
0,12
V grafech č. 12, 13 a 14 jsou uvedeny závislosti aktivit xylanázových enzymů produkované různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu.
55
Graf 12: Závislost aktivity xylanázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
AP xylanázová aktivita
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
80,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
70,0 60,0
žitné otruby
50,0
minerální médium dřevní piliny
40,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
30,0 20,0 10,0 0,0 0
2
4
6
8
doba kutivace (dny)
10
12
Při kultivaci Aureobasidium pullulans byla u většiny substrátů, podobně jako u celuláz, naměřena nejvyšší xylanázová aktivita již 3. den kultivace, na jablečné vláknině bylo však nejvyšší hodnoty aktivity dosaženo 7. den kutivace a při kultivaci na rýži, kukuřičných a pšeničných otrubách byla nejvyšší xylanázová aktivita naměřena až 10. den kultivace. Použitý kmen A.pullulans produkuje xylanázu podobně jako celulázu i v minerálním médiu s maximem produkce 3.den kultivace, přičemž produkce enzymu je na tomto médiu prakticky nejvyšší a je srovnatelná pouze s produkcí xylanázy AP na jablečné vláknině. Graf 13: Závislost aktivity xylanázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani
FS xylanázová aktivita
180,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby žitné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
160,0 140,0 120,0
minerální médium dřevní piliny
100,0 80,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
60,0 40,0 20,0 0,0 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
56
8
10
12
Při kultivaci Fusarium solani byla u většiny substrátů naměřena nejvyšší xylanázová aktivita již 3. den kultivace na kukuřičných otrubách, dřevních pilinách a vaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita naměřena až 7. den kultivace a u jablečné vlákniny rostla hodnota xylanázové aktivity až do konce kultivace 10. den. Rovněž F.solani produkuje xylanázu i v minerálním médiu s maximem produkce 3.den kultivace, přičemž produkce enzymu je na tomto médiu relativně vysoká, vyšší produkce bylo dosaženo pouze na kukuřičných otrubách a jablečné vláknině, srovnatelná produkce byla i na dřevních pilinách 7.den kultivace. Graf 14: Závislost aktivity xylanázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH xylanázová aktivita 80,0
pšeničné otruby kukuřičné otuby ovesné otruby
70,0
žitné otruby
60,0
minerální médium dřevní piliny
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
90,0
50,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
8
10
12
Při kultivaci Phanerochaete chysosporium byla u většiny substrátů naměřena nejvyšší xylanázová aktivita 3. den kultivace a dále u nich aktivita během kultivace klesala. Při kultivaci na dřevních pilinách a rýži byla nejvyšší aktivita až 7. den kutivace. Při kultivaci na minerálním médiu, jablečné vláknině a vaječných těstovinách byla aktivita xylanázy během kultivace takřka konstantní. Nevyšší produkce xylanáz byly u všech kmenů stanoveny převážně na začátku kultivace, tedy 3. až 7. den. Nejvyšší hodnota xylanázové aktivity u mikroorganizmu Aureobasidium pullulans byla naměřeny při kultivaci na jablečné vláknině 7. den kultivace. Nejvyšší hodnota xylanázové aktivity u plísně Phanerochaete chysosporium byla naměřeny při kultivaci na rýži 7. den kultivace. Celkově se jako nejlepší producent extracelulárních xylanáz jeví Fusarium solani, kdy byla nejvyšší aktivita stanovena při kultivaci na kukuřičných otrubách 7. den kultivace (170,3.10-3 U/ml.). Dosažená hodnota je několikanásobně vyšší než je tomu u ostatních testovaných MO. Také při kultivaci na vaječných a bezvaječných těstovinách produkovala FS do média vysoké množství extracelulárních xylanáz. U některých kmenů a na určitých médiích nebyla aktivita xylanázy detekována vůbec (Tabulka 17).
57
58
Tabulka 17: Závislost aktivity xylanázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Aktivita xylanázy (nmol/ml.min) druh doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) MO 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. 20,9±0,3 16,4±0,3 30,6±0,3 10,2±0,2 14,1±0,0 14,5±0,0 F. S. 14,3±0,4 10,8±1,3 29,2±0,5 114,3±4,3 170,3±5,1 72,2±3,2 P. Ch. 57,3±4,9 10,4±0,5 16,9±1,3 54,9±4,9 15,2±0,7 21,2±0,3 ovesné otruby žitné otruby A. P. 40,3±0,3 11,7±0,0 16,7±0,0 33,4±0,6 14,1±0,0 27,7±0,5 F. S. 12,4±0,5 9,6±0,1 11,7±0,4 44,5±2,1 9,4±2,1 15,0±0,6 P. Ch. 69,1±6,5 44,1±07 31,9±1,8 65,6±3,3 14,2±0,2 16,9±1,0 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. 15,1±0,5 69,9±1,5 32,4±0,5 38,1±0,8 36,2±5,3 16,1±0,2 F. S. 14,9±3,1 32,7±0,3 92,3±5,6 21,7±4,1 169,2±1,2 62,8±1,2 P. Ch. 59,1±5,7 47,9±1,6 49,0±3,3 50,2±3,3 48,5±2,5 51,4±3,3 bezvaječné těstoviny dřevní piliny A. P. 31,9±3,8 27,3±0,7 12,8±3,1 13,4±0,3 nedetek. nedetek. F. S. 41,9±1,9 23,2±3,4 34,5±1,2 nedetek. 109,3±5 47,9±2,2 P. Ch. 53,2±4,1 47,3±0,8 nedetek. 9,10±0,18 27,0±1,5 4,9±0,1 minerální medium rýže A. P. 65,6±4,4 34,6±3,9 11,0±1,0 10,0±0,3 28,0±0,3 29,1±0,8 F. S. 104,0±12,0 33,3±4,8 54,8±3,2 65,3±4,3 nedetek. nedetek. P. Ch. 52,0±2,5 49±11 50,2±1,6 55,5±4,1 79,8±1,6 nedetek.
4.1.4 Stanovení aktivity lakázy Aktivita lakázy byla vyjádřena jako množství oxidovaného substrátu působením enzymu vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát pro stanovení lakázové aktivity byl použít roztok ABTS (2,2´-azino-bis-[3-etylbenzothiazolin-6-kyselina sulfonová]). V grafech č. 15, 16 a 17 jsou uvedeny závislosti aktivit lakázových enzymů produkovaných různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Graf 15: Závislost aktivity lakázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans 30,0
AP lakázová aktivita
pšeničné otruby kukuřičné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
25,0
ovesné otruby
20,0
žitné otruby
15,0
minerální médium dřevní piliny jablečná vláknina
10,0 vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
5,0
0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Graf 16: Závislost aktivity lakázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani 7,0
FS lakázová aktivita
pšeničné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
6,0
kukuřičné otruby ovesné otruby
5,0
žitné otruby
4,0
minerální médium dřevní piliny
3,0
jablečná vláknina
2,0
vaječné těstoviny
1,0
bezvaječné těstoviny rýže
0,0 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
8
10
12
59
Graf 17: Závislost aktivity lakázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH lakázová aktivita
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
1,8
pšeničné otruby kukuřičné otruby
1,6
ovesné otruby
1,4
žitné otruby
1,2
minerální médium
1,0
dřevní piliny
0,8
jablečná vláknina
0,6
vaječné těstoviny
0,4
bezvaječné těstoviny rýže
0,2 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) U mikroorganizmu Aureobasidium pullulans byla u většiny substrátů naměřena nejvyšší lakázová aktivita 10. den kultivace. U rýže a vaječných těstovin byla nejvyšší aktivita stanovena 7. den kultivace a poté klesla. U žitných otrub byla nejvyšší aktivita naměřena již 3. den kultivace a produkce enzymu byla až do konce kultivace konstantní. Při kultivaci na dřevních pilinách nebyla lakázová aktivita detekována. Nejvyšší hodnota byla naměřena při kultivaci na bezvaječných těstovinách. Použitý kmen A.pullulans neprodukuje enzym v minerálním médiu. Při kultivaci Fusarium solani na pšeničných a ovesných otrubách byla nejvyšší aktivita lakázy naměřena 3. den kultivace a poté v průběhu kultivace klesala. Při kultivaci na vaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita stanovena 7.den kultivace. U bezvaječných těstovin a rýže byla aktivita lakázy během kultivace takřka konstantní. Nízké hodnoty aktivity byly také naměřeny na jablečné vláknině, žitných a kukuřičných otrubách 10 den kultivace. Velmi nízká aktivita byla stanovena i na dřevních pilinách. Při kultivaci na minerálním médiu nebyla lakázová aktivita detekována. Nejvyšší lakázová aktivita byla u plísně Fusarium solani naměřena při kultivace na pšeničných otrubách 3. den kultivace. U plísně Phanerochaete chrysosporium byly zaznamenány pouze nízké hodnoty aktivity lakázy 3. den kultivace na rýži a ovesných otrubých a 10. den kultivace na vaječných, bezvaječných těstovinách, dřevních pilinách a žitných otrubách. U ostatních substrátů včetně minerálního média nebyla lakázová aktivita detekována. Žádný z testovaných mikroorganizmů neprodukoval lakázu při kultivaci v minerálním médiu, je tedy velice pravděpodobné, že se jedná o enzym, jehož produkce je indukována přítomností substrátu v médiu. Jako nejlepší producent lakázy se osvědčil mikroorganizmus Aureobasidium pullulans, který produkoval lakázu na prakticky všech testovaných odpadních substrátech. Nejvyšší výtěžek lakázy pak byl dosažen při kultivaci na ovesných otrubách (25,3.10-3 U/ml) a bezvaječných těstovinách (27,0.10-3 U/ml). Naopak plíseň Phanerochaete chrysosporium ve většině případů neprodukovala významné množství lakázy. To je v souladu s literaturou, někteří autoři dokonce soudí, že tato plíseň vesměs disponuje velice nízkou nebo dokonce žádnou lakázovou aktivitou [58]. 60
61
Tabulka 18: Závislost aktivity lakázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Aktivita lakázy (nmol/ml.min) druh doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) MO 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. nedetek. 3,34±0,26 5,79±0,32 nedetek. 9,35±1,03 19,80±1,40 F. S. 6,33±0,95 0,83±0,13 nedetek. nedetek. nedetek. 2,22±0,33 P. Ch. nedetek. nedetek. nedetek. nedetek. nedetek. nedetek. ovesné otruby žitné otruby A. P. nedetek. 5,28±0,62 25,29±0,64 4,4±1,3 1,67±0,25 4,07±0,39 F. S. 4,33±0,65 nedetek. nedetek. nedetek. 0,56±0,08 1,11±0,17 P. Ch. 1,62±0,19 nedetek. nedetek. nedetek. nedetek. 0,09±0,02 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. nedetek. 4,9±2,3 17,96±0,13 2,78±1,03 10,60±0,83 6,85±0,51 F. S. nedetek. nedetek. 0,51±0,00 1,57±0,83 3,94±0,19 0,83±0,13 P. Ch. nedetek. nedetek. nedetek. nedetek. 0,14±0,06 1,44±0,06 bezvaječné těstoviny dřevní piliny A. P. 1,25±0,32 12,59±0,77 27,00±1,90 0,03±0,00 0,03±0,00 0,11±0,02 F. S. 1,10±0,19 1,53±0,06 0,93±0,13 0,04±0,01 0,07±0,01 0,02±0,00 P. Ch. nedetek. 0,19±0,13 0,23±0,06 0,03±0,00 nedetek. 1,06±0,16 minerální medium rýže A. P. nedetek. nedetek. nedetek. 0,23±0,06 16,48±0,64 12,27±0,83 F. S. nedetek. nedetek. nedetek. 2,27±0,06 2,36±0,19 1,85±0,13 P. Ch. nedetek. nedetek. nedetek. 1,71±0,06 nedetek. nedetek.
4.1.5 Stanovení aktivity mangan-dependentní peroxidázy Aktivita mangan-dependentní peroxidázy byla vyjádřena jako množství oxidovaného substrátu působením enzymu vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát pro stanovení aktivity mangan-dependentní peroxidázy byla použita fenolová červeň. V grafech č. 18, 19 a 20 jsou uvedeny závislosti aktivit mangan-dependentní peroxidázy produkované různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Graf 18: Závislost aktivity mangan-dependentní peroxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
AP aktivita Mn-dependentní peroxidázy
9,0
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
8,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
7,0 6,0
žitné otruby
5,0
minerální médium dřevní piliny
4,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
3,0 2,0 1,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Graf 19: Závislost aktivity mangan-dependentní peroxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani
FS aktivita Mn-dependentní peroxidázy
7,0
kukuřičné otruby
6,0
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
pšeničné otruby
ovesné otruby
5,0
žitné otruby minerální médium dřevní piliny
4,0 3,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
2,0 1,0 0,0 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
62
8
10
12
Graf 20: Závislost aktivity mangan-dependentní peroxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH aktivita Mn-dependentní peroxidázy aktivita (nmol.ml-1.min-1)
6,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
5,0
žitné otruby
4,0 minerální médium dřevní piliny
3,0
jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
2,0 1,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Při kultivaci Aureobasidium pullulans na minerálním médiu nebyla aktivita mangandependentní peroxidázy detekována. Při kultivaci na pilinách, vaječných a bezvaječných těstovinách a žitných otrubách byla nejvyšší produkce naměřena 3. den kultivace. Při kultivaci na rýži a kukuřičných otrubách byla nejvyšší aktivita stanovena 7. den. U kultivace na jablečné vláknině, ovesných a pšeničných otrubách byla naměřena nejvyšší aktivita až 10. den kultivace. Při kultivaci Fusarium solani na minerálním médiu, rýži a žitných otrubách byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na pšeničných otrubách a pilinách byla nejvyšší aktivita naměřena již 3. den kultivace. U ostatních substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity stanovena 10. den kultivace. Na minerálním médiu byla zaznamenána minimální produkce enzymu. Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na minerálním médiu, rýži, vaječných těstovinách a kukuřičných otrubách byla nejvyšší aktivita naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na pšeničných a ovesných otrubách byla nejvyšší aktivit stanovena již 3. den kultivace. U ostatních použitých substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 10. den kultivace. Na minerálním médiu byla zaznamenána opět minimální produkce enzymu. U většiny substrátů rostla produkce mangan-dependentní peroxidázy s časem kultivace, proto byly nejvyšší hodnoty stanoveny 7.-10. den kultivace. Nejvyšší hodnota aktivity mangandependentní peroxidázy u mikroorganizmu Aureobasidium pullulans byla naměřeny při kultivaci na pšeničných otrubách 10. den kultivace. U plísně Fusarium solani byla nejvyšší aktivita stanovena při kultivaci na kukuřičných otrubách 10. den kultivace. Nejvyšší hodnota peroxidázové aktivity u plísně Phanerochaete chrysosporium byla naměřeny při kultivaci na ovesných otrubách 3. den kultivace. Celkově byla nejvyšší aktivita dosažena při kultivaci Aureobasidium pullulans na pšeničných otrubách (7,73.10-3 U/ml), nicméně produkce byly u jednotlivých testovaných MO velice podobné, přičemž nejvyšší aktivity byly ve většině případů pozorovány při kultivaci na substrátech bohatých na lignin (otruby). Protože aktivity naměřené při kultivaci v minerálním médiu byli velice nízké, je velice pravděpodobné že také Mn-dependentní peroxidáza je enzym podléhající indukci substrátem. 63
64
Tabulka 19: Závislost aktivity Mn-dependentní peroxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Aktivita mangan-dependentní peroxidázy (nmol/ml.min) druh doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) MO 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. 0,15±0,01 0,61±0,09 7,73±0,63 0,30±0,01 1,52±0,01 0,83±0,10 F. S. 1,36±0,20 1,06±0,99 nedetek. 0,23±0,02 3,33±0,47 5,91±0,90 P. Ch. 1,67±0,11 0,68±0,11 1,06±0,16 nedetek. 0,99±0,32 0,91±0,16 ovesné otruby žitné otruby A. P. nedetek. 1,06±0,16 1,89±0,11 2,27±0,21 0,76±0,11 nedetek. F. S. 1,14±0,21 nedetek. 2,89±0,35 nedetek. 1,21±0,19 0,91±0,16 P. Ch. 4,85±0,63 3,34±0,63 1,67±0,25 nedetek. 1,44±0,53 1,52±0,23 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. nedetek. 0,30±0,09 0,99±0,11 2,96±0,53 2,27±0,42 0,68±0,11 F. S. nedetek. 0,99±0,32 1,44±0,11 3,34±0,42 3,64±1,04 4,62±0,11 P. Ch. nedetek. nedetek. 1,74±0,94 0,38±0,11 1,14±0,11 0,76±0,21 bezvaječné těstoviny dřevní piliny A. P. 2,58±0,21 2,42±0,21 0,91±0,21 0,09±0,01 0,04±0,01 0,08±0,01 F. S. 2,80±0,52 3,18±0,15 4,17±0,08 0,05±0,01 0,02±0,00 nedetek. P. Ch. 0,61±0,21 1,29±0,11 1,82±0,21 nedetek. nedetek. 0,05±0,01 minerální medium rýže A. P. nedetek. nedetek. nedetek. nedetek. 2,42±0,21 1,44±0,73 F. S. nedetek. 0,42±0,12 0,30±0,11 0,53±0,11 1,59±0,11 1,36±0,21 P. Ch. nedetek. 0,30±0,05 nedetek. 0,30±0,21 2,58±0,42 0,53±0,11
4.1.6 Stanovení aktivity ligninperoxidázy Aktivita ligninperoxidázy byla vyjádřena jako množství oxidovaného substrátu působením enzymu vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Jako substrát pro stanovení aktivity ligninperoxidázy byl použit roztok veratrylalkoholu (3,4-Dimethoxybenzyl alkohol). V grafech č. 21, 22 a 23 jsou uvedeny závislosti aktivit ligninperoxidázy produkované různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Graf 21: Závislost aktivity ligninperoxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
12,0
AP aktivita ligninperoxidázy pšeničné otuby
10,0 kukuřičné otruby ovesné otruby
8,0
žitné otruby
6,0
minerální médium jablená vláknina
4,0 vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny
2,0
rýže
0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Graf 22: Závislost aktivity ligninperoxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani
FS aktivita ligninperoxidázy
14,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
12,0 10,0
žitné otruby
8,0
minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
6,0 4,0 2,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny)
65
Graf 23: Závislost aktivity ligninperoxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH aktivita ligninperoxidázy
12,0
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
pšeeničné otruby
10,0
kukuřičné otruby ovesné otruby
8,0 žitné otruby minerální médium
6,0
jablečná vláknina
4,0
vaječné těstoiny bezvaječné těstoviny
2,0 rýže
0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Při kultivaci Aureobasidium pullulans na minerálním médiu nebyla aktivita ligninperoxidázy detekována. Při kultivaci na žitných otrubách byla nejvyšší produkce naměřena 3. den kultivace. Při kultivaci na rýži a kukuřičných otrubách a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita stanovena 7. den. U ostatních substrátů byla naměřena nejvyšší aktivita 10. den kultivace. Při kultivaci Fusarium solani na minerálním médiu, rýži a žitných a pšeničných otrubách byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na ostatních substrátech byla nejvyšší hodnota aktivit stanovena 10. den kultivace. Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na minerálním médiu nebyla aktivita ligninperoxidázy detekována. Při kultivaci na pšeničných otrubách byla nejvyšší produkce naměřena 3. den kultivace. Při kultivaci na rýži, vaječných a bezvaječných těstovinách a ovesných otrubách byla nejvyšší aktivita naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na ostatních substrátu byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 10. den kultivace. U většiny substrátu rostla produkce ligninperoxidázy s časem kultivace, proto byla nejvyšší hodnoty stanovena 10. den kultivace. Nejvyšší hodnota aktivity ligninperoxidázy u Aureobasidium pullulans byla naměřeny při kultivaci na pšeničných otrubách 10. den kultivace. U plísně Fusarium solani byla nejvyšší aktivita stanovena při kultivaci na vaječných těstovinách 10. den kultivace. Nejvyšší produkce ligninperoxidázy u plísně Phanerochaete chrysosporium byla naměřena při kultivaci na ovesných otrubách 7. den kultivace. Stejně jako ostatní sledované enzymy zapojené do procesu degradace ligninu (lakáza a Mndependentní peroxidáza), také ligninperoxidáza je s největší pravděpodobností enzym, jehož produkce je indukována přítomností substrátu v kultivačním médiu. Tomu nasvědčuje i fakt, že její produkce v minerálním médiu nebyly buď vůbec zaznamenány, nebo byly velice nízké. Na většině substrátů byla nejvyšší aktivita lignin-peroxidázy pozorována u plísně P.ch. (pšeničné otruby 6,3.10-3 U/ml; kukuřičné otruby 7,5.10-3 U/ml; ovesné otruby 10,39.10-3 U/ml) nicméně celkově nejvyšší výtěžek byl dosažen při kultivaci F.S. vaječných těstovinách (12,54.10-3 U/ml). 66
67
Tabulka 20: Závislost aktivity ligninperoxidázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Aktivita ligninperoxidázy (nmol/ml.min) druh doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) MO 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. nedetek. 0,90±0,25 10,57±0,75 nedetek. 1,97±0,25 nedetek. F. S. 4,30±0,65 7,20±1,10 nedetek. 4,30±0,63 2,15±0,27 6,09±1,02 P. Ch. 7,30±1,20 6,30±1,20 2,15±0,32 0,90±0,25 2,51±0,50 7,50±1,10 ovesné otruby žitné otruby A. P. nedetek. 3,05±0,73 4,12±0,75 5,02±0,49 1,97±0,25 2,69±0,25 F. S. 3,94±0,50 3,94±0,48 5,73±0,85 2,15±0,31 3,23±0,52 1,43±0,21 P. Ch. 7,90±1,90 10,39±0,99 8,60±1,30 1,61±0,25 3,05±0,75 5,74±0,86 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. nedetek. nedetek. 6,99±0,25 1,08±0,01 6,10±1,50 7,00±2,20 F. S. nedetek. 2,51±0,49 3,58±0,50 1,97±0,25 10,6±2,70 12,54±0,49 P. Ch. 1,61±0,25 1,61±0,25 1,97±0,21 1,97±0,25 2,51±0,49 1,97±0,25 bezvaječné těstoviny minerální medium A. P. 2,33±0,75 9,50±1,90 8,78±0,75 nedetek. nedetek. nedetek. F. S. 3,05±0,25 8,42±0,75 9,31±0,49 nedetek. 1,97±0,93 nedetek. P. Ch. 1,61±0,75 1,97±0,25 0,90±0,25 nedetek. nedetek. nedetek. rýže A. P. nedetek. 5,02±0,25 4,48±0,25 F. S. 1,25±0,99 2,69±0,25 1,61±0,25 P. Ch. 0,54±0,25 1,61±0,25 0,72±0,50
4.1.7 Stanovení aktivity lipázy Pro stanovení aktivity lipázy bylo třeba sestavit kalibrační křivku (tabulka 21, graf 24). Závislost byla stanovena pro p-nitrofenol. Aktivita lipázy byla vyjádřena jako množství pnitrofenolu, které se uvolnilo z p-nitrofenyllaurátu působením enzymu, vztaženo na čas a množství supernatantu [nmol/(min.ml)]. Tabulka 21: Kalibrační křivka lipázy koncentrace (mmol/l)
Absorbance (410 nm)
0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050
0,044 0,112 0,196 0,265 0,349 0,405 0,476 0,548 0,617 0,696
Graf 24: Kalibrační křivka lipázy 0,8
kalibrační křivka
0,7
A (410 nm)
0,6 0,5 0,4 0,3 y = 14,145x - 0,0165 R² = 0,9987
0,2 0,1 0 0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
c (mmol/l)
V grafu č. 25 jsou uvedeny závislosti aktivity lipázy produkované mikroorganizmem Aureobasidium pullulans v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. U plísní Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium nebyla na žádném ze substrátů lipázová aktivita prokázána.
68
Graf 25: Závislost aktivity lipázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
AP lipázová aktivita
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
4,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
3,5 3,0 2,5
žitné otruby minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) U mikroorganizmu Aureobasidium pullulans rostla lipázová aktivita s dobou kultivace. Nejvyšší aktivity byla tak stanoveny 10. den kultivace, přičemž nejvyšší hodnota byla stanovena při kultivaci na pšeničných otrubách. Jelikož byla aktivita lipázy detekována i v minerálním médiu, ve kterém nebyly přítomné žádné potenciální substráty lipáz, jedná se pravděpodobně o enzymy, které jsou do jisté míry pro Aureobasidium pullulans konstitutivní. Avšak přítomnost odpadních substrátů v médiu vedla v řadě případů k několikanásobnému navýšení jejich produkce tak, že při kultivaci na pšeničných otrubách byla 10. den kultivace stanovena lipázová aktivita 3,62.10-3 U/ml což je přibližně 15x více, než bylo pozorováno ve stejnou dobu v minerálním médiu (0,23.10-3 U/ml). Tabulka 22: Závislost aktivity lipázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans Aktivita lipázy (nmol/ml.min) doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) 3 3 7 3 3 7 pšeničné otruby jablečná vláknina 1,16±0,19 1,16±0,19 3,62±0,01 nedetek. nedetek. 0,25±0,01 kukuřičné otruby vaječné těstoviny 0,96±0,07 0,96±0,07 0,67±0,06 0,10±0,01 0,10±0,01 0,30±0,04 bezvaječné těstoviny ovesné otruby 0,57±0,02 0,57±0,02 0,46±0,02 0,14±0,01 0,14±0,01 0,30±0,05 žitné otruby rýže 1,06±0,07 1,06±0,07 1,72±0,06 1,23±0,02 1,23±0,02 1,39±0,12 minerální medium 0,21±0,01 0,21±0,01 0,23±0,02
69
4.1.8 Stanovení aktivity proteázy Aktivita proteázy byla vyjádřena jako nárůst absorbance při rozkladu substrátu. Jako substrát byl použit roztok azokaseinu. Výsledná aktivita byla vyjádřena jako množství substrátu rozloženého působením enzymu vztaženo na čas a množství supernatantu [µmol/(min.ml)]. V grafech č. 26, 27 a 28 jsou uvedeny závislosti aktivit proteáz produkované různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Graf 26: Závislost aktivity proteázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
AP proteázová aktivita
aktivita (µmol.ml-1.min-1)
70,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby žitné otruby
60,0 50,0
minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Graf 27: Závislost aktivity proteázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani
FS proteázová aktivita
aktivita (µmol.ml-1.min-1)
80,0
60,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
50,0
žitné otruby
70,0
minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0
70
2
4
6
doba kutivace (dny)
8
10
12
Graf 28: Závislost aktivity proteázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH proteázová aktivita
aktivita (µmol.ml-1.min-1)
70,000
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby žitné otruby
60,000 50,000 40,000
minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
30,000 20,000 10,000 0,000 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
8
10
12
Při kultivaci Aureobasidium pullulans na žitných otrubách byla nejvyšší produkce naměřena 3. den kultivace. Při kultivaci na vaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita stanovena 7. den kultivace. U ostatních substrátů byla naměřena nejvyšší aktivita 10. den kultivace. Při kultivaci Fusarium solani na rýži, bezvaječných těstovinách a žitných otrubách byla nejvyšší hodnota aktivity naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na ostatních substrátech byla nejvyšší hodnota aktivity stanovena 10. den kultivace. Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na rýži, jablečné vláknině, vaječných a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší aktivita naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na ostatních substrátech byly nejvyšší hodnoty aktivity naměřeny 10. den kultivace. U většiny substrátů tedy rostla produkce proteázy s časem kultivace, proto byly nejvyšší hodnoty stanoveny 10. den kultivace. Nejvyšší hodnota aktivity proteázy u MO Aureobasidium pullulans byla naměřeny při kultivaci na jablečné vláknině 10. den kultivace (68,0 U/ml). U plísně Fusarium solani byla nejvyšší aktivita stanovena při kultivaci na pšeničných otrubách 10. den kultivace. Nejvyšší produkce proteázy u plísně Phanerochaete chrysosporium byla naměřena při kultivaci na vaječných těstovinách 7. den kultivace. V případě mikroorganizmu Aureobasidium pullulans byl pozorován podobný jev jako u lipáz – kultura produkovala proteolytické enzymy i při kultivaci v minerálním médiu, avšak přítomnost odpadního substrátu v médiu významně navýšila proteázovou aktivitu. U ostatních testovaných plísní byly aktivity v minerálním médiu velice nízké a až použití odpadního substrátu vedlo k dramatickému nárůstu produkce proteáz. Celkově se jako nejlepší substrát indukující produkci proteolytických enzymů osvědčily vaječné těstoviny, na kterých bylo 7. den kultivace dosaženo vysokých proteolytických aktivit u všech testovaných kultur.
71
72
Tabulka 23: Závislost aktivity proteázy na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Aktivita proteázy (µmol/ml.min) druh MO doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. 28,5±9,5 29,0±6,9 43,0±13,0 2,5±1,2 16,0±10,0 25,0±5,1 F. S. 43,0±2,7 12,5±1,2 68,0±11,0 nedetek. nedetek. 15,5±7,6 P. Ch. 19,7±1,1 25,1±0,3 28,2±0,9 1,0±0,2 3,8±0,6 5,6±1,2 ovesné otruby žitné otruby A. P. 23,7±3,7 0,5±0,3 26,0±2,8 17,3±4,2 7,3±3,2 13,8±1,2 F. S. nedetek. nedetek. 25,0±10,0 14,3±2,7 35,5±6,7 21,2±5,3 P. Ch. 3,8±0,9 27,1±0,9 29,4±0,2 1,7±0,5 5,3±0,3 18,0±0,3 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. 0,8±0,4 3,2±0,5 64,3±0,6 0,7±0,2 61,8±1,6 54,6±0,8 F. S. 16,9±0,8 18,5±0,5 31,8±7,4 1,5±0,2 52,5±0,7 57,8±6,5 P. Ch. 25,6±1,9 50,5±2,5 24,0±2,1 13,2±2,5 65,3±1,8 31,9±1,5 bezvaječné těstoviny minerální medium A. P. 0,8±0,1 51,2±0,5 61,5±0,7 6,7±1,1 12,6±2,4 16,3±2,8 F. S. 2,7±0,9 57,6±0,4 51,8±0,1 1,4±0,3 2,5±0,7 16,3±6,4 P. Ch. 37,7±0,2 45,7±0,2 36,3±0,6 1,8±0,6 4,9±0,6 6,0±0,3 rýže A. P. 22,2±0,9 24,2±0,9 33,3±1,2 F. S. 22,8±2,6 33,9±1,1 23,4±0,6 P. Ch. 31,7±2,3 42,7±0,9 26,9±0,6
4.2 Stanovení koncentrace extracelulárních bílkovin V průběhu kultivace nebyla sledována jen aktivita enzymů, ale i celková produkce extracelulárních proteinů. Závislost změny koncentrace extracelulárních bílkovin byla vztažena na mililitr supernatantu (µg/ml). Pro stanovení koncentrace bílkovin bylo třeba sestavit kalibrační závislost pro stanovení dle Hartree-Lowryho (tabulka 24, graf 29). Závislost byla stanovena pro albumin. Tabulka 24: Kalibrační křivka albuminu koncentrace (µg/ml) 50 100 125 150 175 200 225 250 275 300
Absorbance (550 nm) 0,211 0,367 0,439 0,527 0,589 0,705 0,740 0,796 0,843 0,916
Graf 29: Kalibrační křivka albuminu 1,000
kalibrační křivka - albumin
A (550 nm)
0,800 0,600 0,400 y = 0,003x + 0,0541 R² = 0,9884
0,200 0,000 0
50
100
150 c (µg/ml)
200
250
300
350
V grafech č. 30, 31 a 32 jsou uvedeny závislosti produkce extracelulárních bílkovin různými plísněmi v závislosti na čase kultivace a použitém kultivačním substrátu. Produkce extracelulárních bílkovin byla prokázána u všech použitých substrátů.
73
Graf 30: Závislost koncentrace extracelulárních bílkovin na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans
AP koncentrace extracelulárních bílkovin
2500,0
pšeničné otruby kukuřičné otruby ovesné otruby
c (µg/ml)
2000,0
žitné otruby
1500,0
minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
1000,0
500,0
0,0 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
8
10
12
Při kultivaci Aureobasidium pullulans na pšeničných otrubách byla nejvyšší produkce extracelulárních bílkovin naměřena 3. den kultivace. U ostatních substrátů rostla koncentrace bílkovin s dobou kultivace. Nejvyšší koncentrace bílkovin tak byla naměřena 10. den kultivace. Graf 31: Závislost koncentrace extracelulárních bílkovin na době a způsobu kultivace produkované pomocí Fusarium solani
FS koncentrace extracelulárních bílkovin
1000,0 900,0
kukuřičné otruby
800,0
c (µg/ml)
pšeničné otruby
ovesné otruby
700,0
žitné otruby
600,0 minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 0
2
4
6
doba kutivace (dny)
74
8
10
12
Graf 32: Závislost koncentrace extracelulárních bílkovin na době a způsobu kultivace produkované pomocí Phanerochaete chrysosporium
PCH koncentrace extracelulárních bílkovin
4000,0
pšeničné otruby
3500,0
kukuřičné otruby
3000,0
c (µg/ml)
ovesné otruby
2500,0
žitné otruby minerální médium jablečná vláknina vaječné těstoviny bezvaječné těstoviny rýže
2000,0 1500,0 1000,0 500,0 0,0 0
2
4
6
8
10
12
doba kutivace (dny) Při kultivaci Fusarium solani na rýži, pšeničných a kukuřičných otrubách byla nejvyšší koncentrace naměřena 7. den kultivace a dále byla konstantní. Při kultivaci na ostatních substrátech byla nejvyšší produkce extracelulárních bílkovin naměřena až 10. den kultivace. Při kultivaci Phanerochaete chysosporium na minerálním médiu, kukuřičných otrubách, vaječných a bezvaječných těstovinách byla nejvyšší produkce extracelulárních enzymů naměřena již 3. den kultivace. Při kultivaci na rýži byla nejvyšší produkce bílkovin naměřena 7. den kultivace. Při kultivaci na jablečné vláknině, pšeničných, žitných a ovesných otrub byla nejvyšší koncentrace bílkovin naměřena 10. den kultivace. U většiny substrátu tedy rostla koncentrace extracelulárních bílkovin s časem kultivace. Koncentrace bílkovin však nezahrnovala pouze stanovované enzymy, ale mohlo se také jednat o další enzymy produkované kulturou, nebo o produkty degradace odpadní suroviny. Proto v mnohých případech koncentrace extracelulárních bílkovinnemusí přesně odpovídat produkci příslušné enzymové aktivity. Je obtížné vyhodnocovat specifické aktivity enzymů.
75
76
Tabulka 25: Závislost koncentrace extracelulárních bílkovin na době a způsobu kultivace produkované pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium Koncentrace extracelulárních bílkovin (µg/ml) druh doba kultivace (dny) doba kultivace (dny) MO 3 7 10 3 7 10 pšeničné otruby kukuřičné otruby A. P. 855,0±12,0 402,3±3,5 148,0±2,3 149,2±5,5 114,0±3,5 239,7±4,6 F. S. 363,9±6,9 597,0±51,0 560,0±62,0 302,0±46,0 478,0±22,0 425,0±33,0 P. Ch. 890,5±3,7 973,9±2,8 1066,5±3,7 760,5±6,5 501,5±4,6 751,2±4,6 ovesné otruby žitné otruby A. P. 237,2±3,7 529,8±6,9 1560±18 657,2±1,9 524,0±3,5 1231,0±25,0 F. S. 261,4±4,8 343,0±11,0 500,4±9,1 328,0±17,0 452,0±26,0 667,0±37,0 P. Ch. 1026,5±5,5 995,2±4,6 1233,2±3,7 901,2±1,8 1073,9±4,6 1219,9±3,7 jablečná vláknina vaječné těstoviny A. P. 286,0±19,0 146±14 642,7±4,6 147,6±0,9 1126,0±27,0 2006,0±28,0 F. S. 297,1±2,1 361,3±6,9 933,0±18,0 175,1±0,2 865,0±16,0 933,0±28,0 P. Ch. 1081,5±2,3 702,7±13,9 1439,7±9,2 3394,0±21,0 1332,7±18,5 267,0±6,9 bezvaječné těstoviny minerální medium A. P. 145,3±1,4 905±13 1909,3±4,6 511,9±2,1 639,4±4,2 711,2±3,8 F. S. 160,1±0,2 221,3±2,3 879,3±9,2 323,5±2,1 563,1±13,9 732,7±4,6 P. Ch. 3142±10 1492,7±46,2 1556,3±32,3 599,2±4,6 415,9±1,9 297,9±4,6 rýže A. P. 168,0±16,2 378,2±9,2 411,3±6,9 F. S. 193,0±13,9 484,8±6,9 419,0±5,8 P. Ch. 1504,7±11,6 1632,3±15,0 756,5±4,6
4.3 Uchovávání a stabilizace enzymů 4.3.1 Změna aktivity enzymů při uchovávání vzorků zmrazováním K analýze postupů manipulace s enzymovým preparátem byly použity vzorky supernatantu mikroorganizmu Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium, které byly získány po pětidenní kultivaci na kukuřičných otrubách. U supenatantů byla změřena aktivita enzymů. Poté byly vzorky zamraženy. Po jejich opětovném rozmražení byla opět stanovena enzymová aktivita. Nejvyšší ztráta aktivity byla zaznamenána u celuláz, kde došlo u plísní Fusarium solani a Aureobasidium pullulans k poklesu aktivit až o 90%. K výraznějšímu poklesu aktivity došlo také u amyláz a xylanáz. Také u plísně Phaneroachaete chrysosporium klesla aktivita ligninperoxidázy o 60%. U ostatních enzymů nedošlo k výrazné změně jejich aktivity. Zmrazování je vhodnou metodou uchování většiny enzymů, je však třeba ověřit individuálně pro každý enzym, zda zmražením a následným rozmražením nedochází ke ztrátě aktivity. Tabulka 26: Změny aktivity enzymů při zmrazování Změna aktivity enzymů při zmrazování MO aktivita před aktivita po aktivita před aktivita po zmražením rozmražení zmražením rozmražení Aktivita lakázy (nmol/ml.min) Aktivita mangan-dep. peroxidázy (nmol/ml.min) A. P. 0,4±0,1 0,5±0,1 0,5±0,1 0,7±0,1 F. S. 0,4±0,1 0,2±0,1 1,1±0,2 1,0±0,3 P. Ch. nedetek. nedetek. 0,9±0,2 0,7±0,1 Aktivita lignin peroxidázy Aktivita xylanázy (nmol/ml.min) (nmol/ml.min) A. P. 0,9±0,3 0,5±0,3 30,8±0,7 23,9±1,8 F. S. 1,6±0,3 1,6±0,3 63,8±2,5 12,3±0,8 P. Ch. 2,0±0,3 0,7±0,5 56,1±6,5 39,8±3,3 Aktivita celulázy - CMC (nmol/ml.min) Aktivita celulázy - filtr. papír (nmol/ml.min) A. P. 58,2±0,8 5,3±0,1 12,6±0,9 5,8±0,1 F. S. 68,8±2,7 5,4±0,2 46,5±1,0 5,3±0,2 P. Ch. 52,4±2,7 31,5±2,2 34,9±4,3 8,1±2,2 Aktivita proteázy (µmol/ml.min) Aktivita amylázy (nmol/ml.min) A. P. 15,2±0,9 12,6±1,5 18,1±0,2 15,2±0,2 F. S. 3,2±0,2 3,2±0,7 23,0±1,1 5,3±0,1 P. Ch. 12,9±1,3 10,4±1,0 81,7±4,3 55,6±3,3 koncentrace bílkovin (µg/ml) A. P. 201,4±6,9 255,3±9,3 F. S. 102,4±5,8 172,0±9,3 P. Ch. 238,0±6,9 273,6±11,6
77
4.3.2 Změna aktivity enzymů při lyofilizaci K analýze byly použity vzorky supernatantu Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrisosporium, které byly získány po pětidenní kultivaci na kukuřičných otrubách. U vzorků supernatantů byla změřena aktivita enzymů. Poté byly vzorky lyofilizovány. Po jejich opětovném naředění na původní koncentraci byla opět stanovena enzymová aktivita. U plísní Fusarium solani a Aureobasidium pullulans došlo ke ztrátě lakázové aktivity. U plísní Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium došlo ke ztrátě celulázové aktivity na filtračním papíře. U plísně Phanerochaete chrysosporium došlo také k poklesu aktivity mangan-dependentní peroxidázy, xylanázy a amylázy. U ostatních enzymů nedošlo k výrazné změně jejich aktivity. Lofilizace je tak vhodnou metodou pro uchování a koncentraci většiny enzymů. Tabulka 27: Změny aktivity enzymů při lyofilizaci Změna aktivity enzymů při lyofilizaci MO aktivita před aktivita po aktivita před aktivita po lyofilizací lyofilizaci lyofilizací lyofilizaci Aktivita lakázy (nmol/ml.min) Aktivita mangan-dep. peroxidázy (nmol/ml.min) A. P. 0,5±0,1 nedetek. 0,7±0,1 0,7±0,1 F. S. 0,2±0,1 nedetek. 1,0±0,3 0,8±0,1 P. Ch. nedetek. nedetek. 0,7±0,1 0,2±0,1 Aktivita lignin peroxidázy Aktivita xylanázy (nmol/ml.min) (nmol/ml.min) A. P. 0,6±0,3 0,7±0,1 23,9±1,8 36,2±0,49 F. S. 1,6±0,3 1,4±0,5 12,3±0,8 9,9±0,16 P. Ch. 0,7±0,5 0,7±0,1 39,8±3,3 6,3±0,11 Aktivita celulázy - CMC Aktivita celulázy - filtr. papír (nmol/ml.min) (nmol/ml.min) A. P. 5,3±0,1 7,0±0,1 5,8±0,1 6,2±0,4 F. S. 5,4±0,2 8,6±0,1 5,3±0,2 nedetek. P. Ch. 31,5±2,2 23,3±0,5 8,1±2,2 nedetek. Aktivita proteázy (µmol/ml.min) Aktivita amylázy (nmol/ml.min) A. P. 12,6±1,5 14,42±0,4 15,2±0,2 25,1±1,2 F. S. 3,2±0,7 17,5±0,7 5,3±0,1 7,0±0,6 P. Ch. 10,4±1,0 9,6±0,3 55,6±3,3 33,0±2,2 koncentrace bílkovin (µg/ml) A. P. 255,3±9,3 332,4±1,2 F. S. 172,0±9,3 287,4±1,2 P. Ch. 273,6±11,6 274,8±4,6
78
4.4 Purifikace a identifikace enzymů 4.4.1 Koncentrování vzorků pomocí ultrafiltrace Ultrafiltrace byla provedena na ultrafiltračních zkumavek s membránou 1 a 10 kDa v chlazené centrifuze při teplotě 4°C a 7000 otáčkách. Tabulka 28: Ultrafiltrace lysozymu Ultrafiltrace lysozymu membrána 1kDa Koncentrace bílkovin (µg/ml) množství původního původní roztok po filtrát vzorku (ml) roztok ultrafiltraci 228,3±0,9 261,9±0,5 98,5±0,7 3,5 membrána 10 kDa Koncentrace bílkovin (µg/ml) množství původního původní roztok po filtrát vzorku (ml) roztok ultrafiltraci 228,3±0,9 410,7±19,6 11,8±1,2 7
množství vzorku po ultrafiltraci (ml) 1,9 množství vzorku po ultrafiltraci (ml) 2,5
Tabulka 29: Ultrafiltrace supernatantů s membránou 10 kDa Kukuřice 5.den (10kDa) druh MO
A. P. F. S. P. Ch. A. P. F. S. P. Ch. A. P. F. S. P. Ch. A. P. F. S. P. Ch. A. P. F. S. P. Ch.
filtrát
původní vzorek
vzorek po ultrafiltrci
celuláza –CMC (nmol/ml.min) nedetek. 12,7±0,1 18,4±0,3 nedetek. 9,6±0,1 9,4±0,4 nedetek. 13,5±0,1 8,8±0,1 xylanása (nmol/ml.min) nedetek. 15,5±0,7 20,6±0,5 nedetek. 15,0±0,4 13,2±0,5 nedetek. 20,9±0,1 24,5±1,6 amyláza (nmol/ml.min) nedetek. 11,5±0,4 12,1±0,7 5,1±0,2 11,3±0,2 12,4±0,1 nedetek. 26,0±3,2 26,8±2,2 proteáza (µmol/ml.min) 2,8±0,5 10,0±0,5 13,9±0,4 3,4±0,6 6,0±0,5 9,3±0,6 8,4±0,4 11,3±0,6 14,8±0,4 koncentrace bílkovin (µg/ml) 54,7±6,9 151,3±6,9 293,0±9,3 128,0±0,5 224,7±6,9 406,0±9,3 15,6±1,4 33,0±4,6 61,3±11,6
množství původního vzorku (ml)
množství vzorku po ultrafiltraci (ml)
4,5 3,5 6,5
3 2 2,5
4,5 3,5 6,5
3 2 2,5
4,5 3,5 6,5
3 2 2,5
4,5 3,5 6,5
3 2 2,5
4,5 3,5 6,5
3 2 2,5 79
Z tabulky č. 28 vyplývá, že vhodnější pro ultrafiltraci plísňového preparátu je membrána s vylučovacím limitem 10 kDa, u které se podařilo vzorek zkoncentrovat, i přesto, že část lysozymu přes membránu prošla. Na membráně 1 kDa se i přes její malé póry vzorek nepodařilo zkoncentrovat a velká část bílkovin se dostala přes membránu do filtrátu, což by odpovídalo spíše poškození membrány. V tabulce č. 29 jsou uvedeny výsledky ultrafiltrace supernatantů na membráně 10 kDa. Vzorky supernatantů MO Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium, byly získány po pětidenní kultivaci na kukuřičných otrubách. U vzorků došlo k dvojnásobnému zkoncentrování extracelulárních bílkovin, aktivita enzymů se však takřka nezměnila. Tabulka 30: Ultrafiltrace supernatantu Phanerochaeta chrysosporium s membránou 1 kDa kukuřice 3.den (1kDa) původní roztok po ultrafiltraci filtrát Celuláza-CMC (nmol/ml.min) 19,0±2,2 15,1±3,4 nedetek. Celuláza-filtr (nmol/ml.min) 22,1±2,2 12,7±2,2 4,0±0,6 xylanáza (nmol/ml.min) 17,4±1,6 20,9±6,6 5,7±0,5 amyláza (nmol/ml.min) 34,6±2,2 35,4±1,1 4,0±0,2 proteáza (µmol/ml.min) 14,8±1,3 15,1±0,6 2,8±0,4 koncentrace bílkovin (µg/ml) 578,0±16,2 563±4,6 359,7±9,3 Při ultrafiltraci na membráně 1kDa byl původní roztok o objemu 14 ml zkoncentrován na objem 10 ml. Vzorek se ale nepodařilo zkoncentrovat. Velké množství enzymů prošlo přes membránu a u celuláz došlo i k výraznějšímu poklesu aktivity. Testované centrifugační zkumavky s membránou 1kDa tedy nejsou pro zakoncentrování vzorků vhodné. 4.4.2 Dialýza K analýze byl použit vzorek supernatantu Aureobasidium pullulans, který byl získán po pětidenní kultivaci na kukuřičných otrubách. V lyofilizovaném supernatantu byla změřena koncentrace extracelulárních bílkovin a aktivita celuláz, xylanáz, amyláz a proteáz. Lyofilizovaný vzorek byl 10x zkoncentrován a následně byla provedena dialýza. Po skončení dialýzy byla u vzorku opět změřena aktivita vybraných enzymů (Tabulka 31). Tabulka 31: Změna vybraných enzymových aktivit při procesu dialýzy Změna aktivity enzymu při dialýze
CMC-celuláza (nmol/ml.min) xylanáza (nmol/ml.min) amyláza (nmol/ml.min) proteáza (µmol/ml.min) bílkoviny (µg/ml)
80
Před dialýzou 15,40±0,12
10x konctrované a po dialýze 44,72±0,22
48,60±0,25 73,80±1,6 28,50±1,1 393,30±4,6
464,03±0,98 648,89±10,48 6,00±0,46 1124,7±25,4
Během dialýzy došlo ke snížení koncentrace extracelulárních bílkovin, ale také ke zvýšení čistoty enzymů. Pouze u proteáz došlo k poklesu aktivity, což by mohlo být způsobeno jejich citlivostí k ředění. U ostatních enzymů byla aktivita i po dialýze zachována, nebo vzrostla. 4.4.3 Gelová filtrace Gelová filtrace byla provedena v chromatografických kolonách o objemu 100 a 15 ml. Lepší separační účinnost byla zaznamenána u kolony o objemu 100 ml. V dalších měření se již kolona o objemu 15 ml nepoužívala. Dále byl optimalizován průtok kolonou. Na koloně bylo provedeno měření s průtokem 1 a 2 ml/min. Jako vhodnější byl zvolen průtok 1ml/min.
Obr. 15: Chromatogram – azoalbumin (67 kDa) 5mg/ml s přídavkem chloridu sodného o koncentraci 10 g/l, kolona o objemu 100 ml, nástřik 2 ml, průtok 1 ml/min.
Obr. 16: Chromatogram – azoalbumin (67 kDa) 5mg/ml s přídavkem chloridu sodného o koncentraci 10 g/l, kolona o objemu 15 ml, nástřik 0,3 ml, průtok 0,5 ml/min.
81
Obr. 17: Chromatogram – albumin (67 kDa) 5mg/ml ml s přídavkem chloridu sodného o koncentraci 30 g/l kolona o objemu 100 ml, nástřik 2 ml, průtok 2 ml/min. Optimalizace průtoku a chromatografických podmínek byla provedena s roztokem albuminu a azoalbuminu. Z chromatogramů je patrná změna retenčního času s průtokem a také čistota či složení použitého standardního proteinu; u vzorku BSA je jasně patrné, že hlavní pík zahrnuje více proteinových frakcí. Tyreoglobulin + γ -globulin
Vaječný albumin
Myoglobin Vitamin B12
Obr. 18: Chromatogram - standard pro gelovou filtraci od firmy BioRad (kolonu o objemu 100 ml, nástřik 0,4 ml, průtok 1 ml/min.
82
Tabulka 32: složení standardu pro gelovou filtraci Bílkovina Tyreoglobulin (skot) γ-globulin (skot) Vaječný albumin (kuřecí) Myoglobin (kůň) Vitamin B12
Molekulová hmotnost (kDa) 670 158 44 17 1,35
Na ekvilibrovanou kolonu byl před separací plísňového preparátu nanesen standard pro gelovou filtraci, který byl použit k určení přibližné velikosti enzymů detekovaných ve vzorku. Vzhledem k použitému chromatografickému médiu (Sephadex G100), nedošlo k úplné separaci všech proteinů přítomných ve standardu. Sephadex G100 je určený k separaci proteinů v rozmezí 140 – 2 kDa. Z toho důvodu pravděpodobně nedošlo k rozdělení větších proteinů (670 a 158 kDa), které se eluovaly v jednom píku (obrázek 18). Pro analýzu byl použit jako vzorek dialyzát média po kultivaci Aureobasidium pullulans na kukuřičných otrubách. Během gelové filtrace vzorku AP byly jímány frakce po deseti minutách, u kterých byla následně stanovena aktivita celuláz, amyláz, xylanáz, proteáz a koncentrace bílkovin (grafy 33,34,35).
Obr. 19: Chromatogram – vzorek Aureobasidium pullulans, kolona o objemu 100 ml, nástřik 2 ml, průtok 1 ml/min.
83
Graf 33: Aktivita vybraných enzymů v jednotlivých frakcí gelové filtrace aktivita (nmol.ml-1.min-1)
70,0 60,0
celuláza
50,0
xylanáza
40,0
amyláza
30,0 20,0 10,0 0,0 10. - 20. min
20. - 30. min
30. - 40. min
40. - 50. min
50. - 60. min
60. - 70. min
70. - 80. min
80. - 90. 90. - 100. 100. - 110. 110. 120. min min min min
Graf 34: Aktivita proteáz v jednotlivých frakcí gelové filtrace
aktivita (nmol.ml-1.min-1)
aktivita proteázy 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 10. - 20. 20. - 30. 30. - 40. 40. - 50. 50. - 60. 60. - 70. 70. - 80. 80. - 90. 90. - 100. 100. - 110. 120. min min min min min min min min min 110. min min
Graf 35: Koncentrace extracelulárních bílkovin v jednotlivých frakcí gelové filtrace
c (µg/ml)
koncentrace bílkovin 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 10. - 20. 20. - 30. 30. - 40. 40. - 50. 50. - 60. 60. - 70. 70. - 80. 80. - 90. 90. - 100. 100. - 110. 120. min min min min min min min min min 110. min min
84
Mezi 10. a 20. minutou byl u vzorku zaznamenán pík odpovídající fragmentům o velikosti vyšší než 150 kDa. Mezi 20. a 50. minutou je zaznamenán pík, který je tvořen řadou těsně za sebou jdoucích píků, která odpovídají fragmentům o velikosti 140 – 40 kDa. Mezi 60. a 120. minutou je zaznamenán široký pík odpovídající fragmentům o velikosti 20 kDa a menší. Aktivita celuláz byla zaznamenána v časech mezi 10. až 20. minutou, mezi 30. až 40. a mezi 90. až 110. minutou procesu gelové filtrace. Aktivita xylanáz tvořila dva pomyslné píky s vrcholy v časech mezi 40. až 50. minutou a mezi 60. až 70. minutou. Také amyláza tvořila dva pomyslné aktivitní píky ale s vrcholy v časech mezi 30. až 40. minutou a mezi 90. až 100. minutou gelové filtrace. Aktivita proteáz vykazovala odhadované maximum mezi 40. až 50. minutou a mezi 80. až 90. minutou gelové filtrace. Koncentrace extracelulárních bílkovin také tvoří dva píky s vrcholy v časech mezi 30. až 40. minutou a mezi 90. až 100. minutou. Detailní popis enzymů produkovaných do média A.pullulans je komplikován přítomností dalších případných proteinových frakcí pocházejících z média. Vícečetné aktivitní píy mohou znamenat přítomnost více typů enzymů s podobnou aktivitou (celuláza, proteázy), případně nedostatečnou separaci enzymů na použitém nosiči. Maximum produkovaných proteinů má molekulovou hmotnost odhadem 60-40 kDa (první část chromatogramu) a zejména menší než 20 kDa, což by spíše odpovídalo degradačním produktům z média. 4.4.4 Vsádkova ionexová chromatografie Pro purifikaci byl použit supernatant MO Aureobsidium pullulans po dialýze, získaný po pěti denní kultivaci na kukuřičných otrubách. Eluce byla provedena dvakrát. V prvním kroku byl použit roztoku pufru 0,5 M NaCl, v druhém kroku byla eluce provedena, roztokem pufru 1 M NaCl. Jako aniontoměnič byl použit DEAE Sephadex-25 (Pharmacia), jako kationtoměniče byla použita karboxymethylcelulóza CM32 (Whatman) Tabulka 33: Vsádkova ionexová chromatografie Vsádkova ionexová chromatografie aktivita proteázy koncentrace bílkovin (µg/ml) (nmol/ml.min) kationtoměnič aniontoměnič kationtoměnič aniontoměnič původní roztok 6,00±0,46 6,00±0,47 1124,7±25,4 1124,7±25,5 po vytřepání do ionexu 2,17±0,46 1,75±0,12 751,4±2,3 809,7±13,9 po vytřepání z ionexu 1,50±0,23 1,25±0,12 289,7±9,3 311,4±2,3 0,5 M NaCl po vytřepání z ionexu nedetek. nedetek. 52,0±9,3 92,1±4,4 1 M NaCl aktivita amylázy aktivita xylanásy (nmol/ml.min) (nmol/ml.min) kationtoměnič aniontoměnič kationtoměnič aniontoměnič původní roztok 648,89±10,48 648,89±10,49 464,03±0,98 464,03±0,99 po vytřepání do ionexu 574,41±1,95 575,19±1,73 399,51±2,62 352,84±2,46 po vytřepání z ionexu 133,70±0,32 179,33±1,30 55,06±0,49 218,13±0,82 0,5 M NaCl po vytřepání z ionexu nedetek. 27,64±0,11 9,69±0,16 61,33±0,66 1 M NaCl 85
Při vsádkové iontové chromatografii se podařilo navázat na iontoměniče zhruba třetinu enzymů. V dalším kroku by tak měla být provedena optimalizace pH, za účelem dosažení co nejvyšší efektivity vazby proteinů na iontoměnič. Většinu navázaných enzymů se podařilo eluovat již 0,5 M NaCl. Aktivita enzymů zůstala během chromatografie zachována. 4.4.5 Elektroforéza 4.4.5.1 PAGE-SDS elektroforéza Elektroforéza byla zařazena jako metoda k přehlednému určení distribuce proteinů ve vzorku podle jejich molekulové hmotnosti. Elektroforetická separace enzymů byla prováděna na 12,5% polyakralamidovém gelu, jako standard byla použita proteinová směs 6 (Serva). Na gel byly nanášeny 100x zkoncentrované vzorky superntatu kultury Aureobasidium pululans, Fusarim solani, Phanerochaete chrysosporium a 10x zkoncentrovaný vzorek supernatantu plísně Aureobasidium pullulans po dialýze. Obrázek 20: PAGE-SDS elektroforéza- barvení stříbrem 1 2 3 4 5 6 7
8
Tabulka 34: Nanášení vzorků na gel Číslo jamky Vzorek 1 Proteinová směs 4 2 Proteinová směs 5 3 Proteinová směs 6 5 AP po dialýze 8 AP 9 FS 10 PCH Podmínky: 12,5% gel, 100 mA, 180 minut
86
9
10
U proteinové směsi 6 byl obsah lahvičky naředěn na koncentraci 10 mg/ml, což je 10x více než je uváděno v návodu od výrobce. Na gel byl standard nanášen v množství 10 μl, vzorky byly nanášena po 20 μl. Tabulka 35: Složení proteinové směsi 6 (Serva) Bílkovina Fosforyláza B Hovězí albumin Vaječný albumin Karboanhydráza Sójový trypsín inhibitor Cytochrom C Hovězí trypsin (inhibitor)
Molekulová hmotnost (Da) 97 400 67 000 45 000 29 000 21 000 12 500 6 500
Podle výsledku elektroforézy na obrázku 20 byly u vzorku Aureobasidium pullulans po dialýze patrné 4 bandy odpovídající enzymům o velikosti cca. 100 kDa, 28kDa, 25kDa a 6,5 kDa. U nedialyzovaného vzorku Aureobasidium pullulans jsou tyto bandy hůře viditelné. U vzorku Fusarium solani jsou bandy velmi špatně čitelné. U vzorek Phanerochaete chrysosporium jsou dobře viditelné 4 bandy odpovídající enzymům o velikosti cca. 28 kDa, 25kDa, 15kDa a 6,5 kDa. Výsledky elektroforetické separace A.pullulans jsou v poměrně dobré shodě s výsledky gelové filtrace (viz výše).
87
5
ZÁVĚRY ·
·
Cílem práce bylo studium možností produkce extracelulárních hydrolytických enzymů vybranými plísněmi. Enzymy byly produkovány pomocí Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium při submerzní kultivaci v minerálním médiu a též v minerálním médiu obsahujícím navíc složitý odpadní substrát. Jako odpadní substráty byly použity pšeničné, kukuřičné, ovesné a žitné otruby, dřevní piliny, rýže, jablečná vláknina, vaječné a bezvaječné těstoviny. V průběhu kultivace byla sledována produkce celuláz, amyláz, xylanáz, lipáz, proteáz a ligninolytických enzymů (lakáza, Mn-dependentní peroxidáza, ligninperoxidáza).
Tabulka 36: Maximální hodnoty aktivit u jednotlivých mikroorganizmů AP celuláza 57,6 nmol/ml.min substrát minerální médium amyláza 78,1 nmol/ml.min substrát jablečná vláknina xylanáza 69,9 nmol/ml.min substrát jablečná vláknina proteáza 64,3 nmol/ml.min substrát jablečná vláknina lakáza 27,0 nmol/ml.min substrát bezvaječné těstoviny ligninperoxidáza 10,6 nmol/ml.min substrát pšeničné otruby Mn-dependentní peroxidáza 7,7 nmol/ml.min substrát pšeničné otruby lipáza 3,6 nmol/ml.min substrát pšeničné otruby
88
FS PCH celuláza celuláza 248,0 nmol/ml.min 80,5 nmol/ml.min substrát substrát kukuřičné otruby ovesné otruby amyláza amyláza 47,4 nmol/ml.min 111,8 nmol/ml.min substrát substrát bezvaječné těstoviny rýže xylanáza xylanáza 170,3 nmol/ml.min 79,8 nmol/ml.min substrát substrát kukuřičné otruby rýže proteáza proteáza 68,0 nmol/ml.min 65,3 nmol/ml.min substrát substrát pšeničné otruby vaječné těstoviny lakáza lakáza 6,3 nmol/ml.min 1,7 nmol/ml.min substrát substrát pšeničné otruby rýže ligninperoxidáza ligninperoxidáza 12,5 nmol/ml.min 10,4 nmol/ml.min substrát substrát vaječné těstoviny ovesné otruby Mn-dependentní peroxidáza Mn-dependentní peroxidáza 5,9 nmol/ml.min 4,9 nmol/ml.min substrát substrát kukuřičné otruby ovesné otruby
V tabulce 36 jsou uvedeny nejvyšší hodnoty naměřených aktivit u jednotlivých mikroorganizmů. · Aktivita extracelulárních celuláz s použitím nerozpustného substrátu byla závislá na době kultivace a na použitém odpadním substrátu. Nejvyšší produkce extracelulárních celuláz byla u všech kultur nalezena v počátečních fázích kultivace v produkčním médiu. Poté enzymatická aktivita celuláz významně poklesla. Je zajímavé, že nejvyšší hodnota celulázové aktivity u Aureobasidium pullulans byla naměřena při kultivaci na minerálním médiu bez přídavku odpadního substrátu. Tuto skutečnost je možné vysvětlit tak, že v případě AP nejsou extracelulární celulázy indukovány přítomností substrátu v médiu, naopak se zdá, že přítomnost složitého substrátu v médiu mírně inhibuje jejich produkci. Jako nejlepší producent extracelulárních celuláz s aktivitou vůči nerozpustnému substrátu se projevila plíseň Fusarium solani, kdy byla výrazně nejvyšší aktivita (219,0.10-3 U/ml) stanovena při kultivaci na kukuřičných otrubách 3. den kultivace. · Produkce extracelulárních celuláz s aktivitou vůči rozpustnému substrátu je velmi podobná produkci celuláz s afinitou vůči substrátům nerozpustným. Nejvyšší produkce CMC-celuláz byla také zaznamenána převážně na začátku kultivace, tedy 3. až 7. den. Rovněž tak nejlepším producentem CMC-celuláz byla plíseň Fusarium solani kultivovaná na kukuřičných otrubách, kdy v třetí den kultivace byla stanovena aktivita CMC-celulázy 248.10-3 U/ml. · Produkce amyláz také silně závisela na době kultivace i na použitém odpadním substrátu. Na rozdíl od celuláz docházelo k výrazné produkci amyláz spíše v pozdější fázi kultivace. Celkově se jako nejlepší producent extracelulárních amyláz při kultivaci na většině substrátů osvědčil kmen PCH, kdy při růstu na rýži bylo 7. den kultivace dosaženo nejvyšší amylolytické aktivity 111,8.10-3 U/ml. · Nejvyšší produkce xylanáz byly stanoveny převážně na začátku kultivace, tedy 3. až 7. den. Celkově se jako nejlepší producent extracelulárních xylanáz jeví Fusarium solani, kdy byla nejvyšší aktivita stanovena při kultivaci na kukuřičných otrubách 7. den kultivace (170,3.10-3 U/ml.). Dosažená hodnota je několikanásobně vyšší než je tomu u ostatních testovaných MO. Také při kultivaci na vaječných a bezvaječných těstovinách produkoval kmen FS do média vysoké množství extracelulárních xylanáz. · Jako nejlepší producent lakázy se osvědčil mikroorganizmus Aureobasidium pullulans, který produkoval lakázu na prakticky všech testovaných odpadních substrátech. Nejvyšší výtěžek lakázy pak byl dosažen při kultivaci na ovesných otrubách (25,3.10-3 U/ml) a bezvaječných těstovinách (27,0.10-3 U/ml). Naopak plíseň Phanerochaete chrysosporium ve většině případů neprodukovala významné množství lakázy. Žádný z testovaných mikroorganizmů neprodukoval lakázu při kultivaci v minerálním médiu, je tedy velice pravděpodobné, že se jedná o enzym, jehož produkce je indukována přítomností substrátu v médiu. · Nejvyšší aktivity mangan-dependentní peroxidázy bylo dosažena při kultivaci Aureobasidium pullulans na pšeničných otrubách (7,73.10-3 U/ml). Produkce byly u jednotlivých testovaných kmenů velmi podobné, přičemž nejvyšší aktivity byly ve většině případů pozorovány při kultivaci na substrátech bohatých na lignin (otruby). Protože aktivity naměřené při kultivaci v minerálním médiu byli velice nízké, je
89
·
·
·
·
·
·
·
·
90
vysoce pravděpodobné, že také Mn-dependentní peroxidáza je enzym podléhající indukci substrátem. Stejně jako ostatní sledované enzymy zapojené do procesu degradace ligninu (lakáza a Mn-dependentní peroxidáza), také ligninperoxidáza je s největší pravděpodobností enzym indukovaný přítomností substrátu v kultivačním médiu. Produkce ligninperoxidázy v minerálním médiu nebyly buď vůbec zaznamenány, nebo byly velice nízké. Na většině substrátů byla nejvyšší aktivita ligninperoxidázy pozorována u plísně PCH (pšeničné otruby 6,3.10-3 U/ml; kukuřičné otruby 7,5.10-3 U/ml; ovesné otruby 10,39.10-3 U/ml) nicméně celkově nejvyšší výtěžek byl dosažen při kultivaci FS na vaječných těstovinách (12,54.10-3 U/ml). U plísní Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium nebyla na žádném ze substrátů prokázána lipázová aktivita. U mikroorganizmu A. pullulans byla aktivita lipázy detekována i v minerálním médiu, ve kterém nebyly přítomné žádné potenciální substráty lipáz. Jedná se tedy pravděpodobně o enzymy, které jsou do jisté míry pro Aureobasidium pullulans konstitutivní. Avšak přítomnost odpadních substrátů v médiu vedla v řadě případů k několikanásobnému navýšení jejich produkce. Při kultivaci na pšeničných otrubách byla 10. den kultivace stanovena lipázová aktivita 3,62.10-3 U/ml, což je přibližně 15x více než bylo pozorováno ve stejnou dobu v minerálním médiu (0,23.10-3 U/ml). Mikroorganizmy produkovaly proteolytické enzymy i při kultivaci v minerálním médiu, avšak přítomnost odpadního substrátu v médiu významně navýšila proteázovou aktivitu. Celkově se jako nejlepší substrát indukující produkci proteolytických enzymů osvědčily vaječné těstoviny, kde bylo 7. den kultivace dosaženo vysokých proteolytických aktivit u všech testovaných kultur. Nejvyšší hodnota aktivity proteázy byla však naměřena u MO Aureobasidium pullulans při kultivaci na jablečné vláknině 10. den kultivace (68,0 U/ml). V průběhu kultivace nebyla sledována jen aktivita enzymů, ale i produkce extracelulárních proteinů. U většiny substrátu rostla koncentrace extracelulárních bílkovin s časem kultivace. Koncentrace bílkovin však nemusela zahrnovat pouze enzymy produkované kulturou, ale i produkty štěpení odpadu. Proto v mnohých případech koncentrace extracelulárních bílkovin nemusí přesně odpovídat produkci příslušné enzymové aktivity. V dalších experimentech byly testovány některé postupy uchovávání a zpracování enzymového preparátu. Enzymové preparáty byly uchovávány zmrazováním, při němž však docházelo k výraznému poklesu aktivity celuláz u plísně Fusarium solani až o 90%. Zmrazování je vhodnou metodou uchování většiny enzymů, je však třeba ověřit individuálně pro každý enzym zda při rozmražení nedochází ke ztrátě aktivity. Jako vhodnější metoda pro uchovánání a zkoncetrování enzymů byla stanovena lyofilizace. U preparátu získaného z média A. pullulans byla také testována možnost purifikace produkovaných enzymů pomocí vybraných separačních metod - ultrafiltrace, ionexové chromatografie a gelové filtrace. K ultrafiltraci byly použity centrifugační zkumavky se selektivní membránou. Při ultrafiltraci na membráně s vylučovacím limitem 10kDa se podařilo vzorek částečně zkoncentrovat, docházelo však k určitým ztrátám aktivity enzymů. Při vsádkové iontové chromatografii se podařilo navázat na iontoměniče zhruba třetinu enzymů. V dalším kroku by tak měla být provedena optimalizace pH, za
·
·
účelem dosažení co nejvyšší efektivity vazby proteinů na iontoměnič a následné separace. Při gelové filtraci byly ve vzorku supernatantu A.pullulans detekovány tři hlavní píky odpovídající fragmentům o velikost vyšší než 150 kDa, pak 140 – 40 kDa a 20 – 1 kDa. Podle výsledku PAGE-SDS elektroforézy byly u téhož vzorku po dialýze patrné 4 majoritní bandy odpovídající proteinům o velikosti cca 100 kDa, 28kDa, 25kDa a 6,5 kDa. Výsledky obou metod si odpovídají. V předložené práci byly vypracovány a ověřeny postupy produkce směsných enzymových preparátů z několika druhů plísní a kvasinek na vybraných typech odpadních substrátů. Enzymové preparáty byly částečně charakterizovány za využití separačních metod, z nichž část byla nově zavedena v rámci práce. Získané enzymové preparáty budou dále modifikovány za účelem dalšího potenciálního využití k úpravě komplexních substrátů pro biotechnologické výroby.
91
6 LITERATURA [1]
Šilhánková, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. dopl. vyd. Praha : Academia, 2002. 363 s. ISBN 80-200-1024-6.
[2]
[online] [cit. 2010-11-10] URL:
. [online] [cit. 2010-14-11] URL:. [online] [cit. 2011-04-20] URL:
[3] [4] [5]
[online] [cit. 2011-03-10] URL:
[6] [7]
[online] [cit. 2011-03-10] URL: [online] [cit. 2011-03-10] URL:
[8] [9]
[online] [cit. 2011-04-11] URL: . [online] [cit. 2011-04-11] URL: .
[10]
Kosková-Kratochvílová, A. Taxónomia kvasiniek a kvasinkovitých mikroorganizmov . 1. vyd. Bratislava : ALFA, 1990. 704 s. ISBN 80-05-00644-6.
[11]
Chi Z, Wang F, Chi Z, Yue L, Liu G, Zhang T.: Bioproducts from Aureobasidium pullulans a biotechnologically important yeast. Applied Microbiology and Biotechnology. 2009, vol. 82, no 5, pp. 793-804.
[12]
Oller Anna R: Nutrient limitation promotes pigment production in Aureobasidium pullulans, Transactions of the Missouri Academy of Science, 2006. Dostupný z WWW:. [online] [cit. 2010-14-11] URL: < http://www.aloallergy.com/mold.html>. [online] [cit. 2010-14-11] URL: .
[13] [14] [15]
[16]
[online] [cit. 2010-14-11] URL: . Veselá, M.; Drdák, M. Praktikum z obecné mikrobiologie. 2.vydání. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická : 1999. 88 s. ISBN 80-214-1305-0.
[17]
Viniegra-Gnonzález, Gustavo , et al.: Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems . Biochemical Engineering Journal. 2003, vol. 13, no. 2-3, pp. 157-167.
[18]
Hölker, U.; Höfer , M.; Lenz , J.: Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi . Applied Microbiology and Biotechnology. 2004, vol. 64, no. 2, pp. 175-186.
92
[19]
[20]
Pandey, A, Selvakumar, P, Soccol, CR and Singh - Nee Nigam, Poonam: Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Current Science. 1999, vol. 77, no. 1, pp. 149-162. Vodrážka, Zdeněk: Biochemie. 2. oprav. vyd. Praha : Academia, 2002. ISBN 80-2000600-1.
[21]
Vodrážka, Zdeněk; Káš, Jan; Rauch, Pavel: Enzymologie. 3. přeprac. vyd. Praha : VŠCHT, 1998. 171 s. ISBN 80-708-0330-4.
[22]
Horáková, D., Němec M., Szostková M.: Laboratorní cvičení z fyziologie bakterií. Brno, Masarykova univerzita, 2007, Dostupné z: .
[23]
Haki, G.D., Rakshit, S.K.: Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresource Technology, 2003, vol. 89, no. 1, pp. 17-34.
[24]
Gynci, Marina Mathew; Rajeev, K Sukumaran; Reeta , Rani Singhania. Progress in resach on fungal cellulases for lignocellulose degradation. Journal of Scientific & Industrial Research. 2008, vol. 67, pp. 898-907. Dostupný také z WWW: .
[25]
Maheshwari, R. et al.: Thermophilic fungi: Their physiology and enzymes. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2000, vol. 64, no. 3, pp. 461-488.
[26]
Rajeev, K Sukumaran; Reeta, Rani Singhania; Ashok, Pandey. Microbial cellulases Production, applications and challenges. Journal of Scientific & Industrial Research. Listopad 2005, vol. 64, pp. 832-844. Dostupný také z WWW: .
[27]
Howard R.L. et al.: Review Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology, 2003, vol. 2, p. 602-619
[28]
Souza, Paula Monteiro de; Magalhães, Pérola de Oliveira e.: Application of microbial amylase in industry – a review. Brazilian journal of microbiology, 2010, vol. 41, no. 4, pp. 850-861, Dostupný z WWW: .
[29]
[online] [cit. 2011-04-20] URL: .
[30]
[online] [cit. 2011-04-20] URL: .
[31]
Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS.: Microbiol xylanases and their industrial applications: a review. Appl Microbiol Biotechnol. 2001, vol. 56, pp. 326– 338
[32]
Polizeli, M. L. T. M., et al.: Xylanases from fungi: properties and industrial applications . Applied Microbiology and Biotechnology. 2005, vol. 5, pp. 577-591.
[33]
Wong K. K. et al.: Multiplicity of beta-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications. Microbiology Reviews, 1988, vol. 52, pp. 305–317.
93
[34]
Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, and Vasanti V. Deshpande: Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases. Microbiol Mol Biol Rev, 1998, vol. 62, no. 3, pp. 597–635. Dostupné z WWW: .
[35]
Proteases [online]. 2001 [cit. 2011-04-13]. .
[36]
Metabolismus lipidů [online]. [cit. 2011-04-20]. Dostupný z WWW: . Hasan F., Shah A.A., Hameed A.: Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology. 2006, vol. 39, pp. 235-251.
[37]
Dostupné
z
WWW:
[38]
Joseph, B., Ramteke P. W., Thomas, G., Shrivastava, N.: Standard Rewiew Coldactive microbial Lipases: a versatile tool for industrial applications. Biotechnology and Molecular Biology Rewiew, June 2007, vol. 2, pp. 39-48. ISSN 1538/2273.
[39]
Saxena, R.K.; Gosh, P.K.; Gupta, R.; Davidson, W. Sheba; Bradoo, Sapna and Gulati, Ruchi. Microbial lipases: potential biocatalysts for the future industry. Current Science, July 1999, vol. 77, no. 1, pp. 101-115. Dostupný z WWW: .
[40]
Šušla M. a Svobodová K.: Ligninolytické enzymy jako účinné nástroje pro biodegradaci obtížně rozložitelných organopolutantů. Chem. Listy, 2006, číslo 100, str. 889-895
[41]
Baldrian P.: Fungal laccases – occurence and properties. FEMS Microbiol. Rev., 2006, vol. 30, pp. 215-242
[42]
[online] [cit. 2011-04-25] URL: . Daljit, Singh Arora; Paramjit , Kaur Gill.: Laccase production by some white rot fungi under different nutritional conditions. Bioresource Technology. 2000, vol. 73, pp. 283285.
[43]
[44]
Arora S. D. et al.: Involvement of lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase in the degradation and selective ligninolysis of wheat straw. International Biodeterioration & Biodegradation, 2002, vol. 50, pp. 115–120
[45]
Ruggeri B, Sassi G.: Experimental sensitivity analysis of a trickle bed bioreactor for lignin peroxidases production by Phanerochaete chrysosporium. Process Biochemistry, 2003, vol. 38, pp. 1669-1676
[46]
Sharma P. et al.: Bacterial laccases. World Journal of Microbiology &. Biotechnology, 2007, vol. 23, pp. 823-832 Rodríguez Couto S., Toca Herrera J. L.: Industrial and biotechnological applications of laccases: A review. Biotechnology Advances, 2006, vol. 24, pp. 500-513
[47] [48] [49]
Amersham Pharmacia Biotech: Protein Purification. Handbook, 1999, 18-1132-29 Káš , J.; Kodíček , M.; Valentová , O.: Laboratorní techniky biochemie. 1. vyd. Praha : Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, 2006. ISBN 80-7080-586-2.
[50]
Klouda, Pavel. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava : Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-863-6907-2.
94
[51]
Márová I., Vránová D. : Praktikum z biochemie - pracovní sešit. FCH VUT v Brně, Brno 2002
[52]
Hanika Jiří. Speciální separační procesy. Vyd. 1. Praha : Vydavatelství VŠCHT, 1995. 77 s. ISBN 80-708-0242-1.
[53]
Tien, M. & Kirk, T. K.: Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. Methods Enzymol, 1988, vol. 161, pp. 238–249 Morita Y., Hasan Q., Sakaguchi T., Murakami Y., Yokoyama K.: Properties of coldactive protease from psychrotrophic Flavobacterium balustinum P104. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, vol. 50, pp. 669-675. Kuwahara M., Glenn J.K., Morgan M.A., Gold M.H.: Separation and characterization of two extracellular H2O2-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium, FEBS Letters, 1984, vol. 169, pp. 247-250.
[54]
[55]
[56]
Elisashvili V., Kachlishvili E., Penninckx M.: Effect of growth substrate, method of fermentation, and nitrogen source on lignocellulose-degrading enyzmes production by white-rot basidiomycetes, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2008, vol. 35, pp. 1531-1538.
[57]
Celis J. E., Carter N., Hunter T., Simoes K., Small J. V. and Shotton D.: Cell Biology:A Laboratory Handbook, 3rd Eds, Elsevier, Academic Press, 2006. Srinivasan C., Dsouza T.M., Boominathan K., Reddy C.A.: Demostration of Laccase in the White Rot Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium BKM BKM-F1767, Applied and Environmental Microbiology, 1995, vol. 61, pp. 4274-4277.
[58]
95
7 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ A AA ABTS AP APS BIS c CCM CMC FS Lac LiP MM MnP MO PAGE PCH SDS SSF TEMED Tris UV VIS
96
absorbance akrylamid 2,2´-azino-bis-(3-etylbenzothiazolin-6-kyselina sulfonová) Aureobasidium pullulans persíran amonný N,N´-methylenbisakrylamid koncentrace Czech Collection of Microorganisms karboxymetylcelulosa Fusarium solani lakáza lignin peroxidáza minerální médium mangan-dependentní peroxidáza mikroorganizmus elektroforéza v polyakrylamidovém gelu Phanerochete chrysosporium dodecylsíran sodný solid state fermentacion N,N,N´,N´- tetramethylethylendiamin tris(hydroxymethyl)aminomethan záření v ultrafialové oblasti spektra záření ve viditelné oblasti spektra
8 OBRÁZKOVÁ PŘÍLOHA
F.S. minerální médium 3. den kultivace
F.S. minerální médium 10. den kultivace
F.S. jablečná vláknina 3. den kultivace
F.S. jablečná vláknina 10. den kultivace
F.S. rýže 3. den kultivace
F.S. rýže 10. den kultivace
F.S. vaječné těstoviny 3. den kultivace
F.S. vaječné těstoviny 10. den kultivace
F.S. kukuřičné otruby 3. den kultivace
F.S. ovesné otruby 3. den kultivace
F.S. pšeničné otruby 3. den kultivace
F.S. žitné otruby 3. den kultivace
A. P. minerální médium 3. den kultivace
A. P. minerální médium 10. den kultivace
A. P. rýže 3. den kultivace
A. P. rýže 10. den kultivace
A. P. jablečná vláknina 3. den kultivace
A. P. jablečná vláknina 10. den kultivace
A. P. vaječné těstoviny 3. den kultivace
A. P. vaječné těstoviny 10. den kultivace
A. P. kukuřičné otruby 7. den kultivace
A. P. pšeničné otruby 7. den kultivace
A. P. žitné otruby 7. den kultivace
A. P. ovesné otruby 7. den kultivace
P. Ch. minerální médium 3. den kultivace
P. Ch. minerální médium 10. den kultivace
P. Ch. vaječné těstoviny 3. den kultivace
P. Ch. vaječné těstoviny 10. den kultivace
P. Ch. rýže 3. den kultivace
P. Ch. rýže 10. den kultivace
P. Ch. jablečná vláknina 3. den kultivace
P. Ch. jablečná vláknina 10. den kultivace
P. Ch. kukuřičné otruby 3. den kultivace
P. Ch. kukuřičné otruby10. den kultivace
P. Ch. ovesné otruby 3. den kultivace
P. Ch. ovesné otruby 10. den kultivace
P. Ch. žitné otruby 3. den kultivace
P. Ch. žitné otruby 10. den kultivace
P. Ch. pšeničné otruby 3. den kultivace
P. Ch. pšeničné otruby 10. den kultivace
