CHARAKTERIZACE SPECIFICKÝCH PROTEINŮ Z VYBRANÝCH ŽIVOČIŠNÝCH PRODUKTŮ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

CHARAKTERIZACE SPECIFICKÝCH PROTEINŮ Z VYBRANÝCH ŽIVOČIŠNÝCH PRODUKTŮ. CHARACTERIZATION OF SPECIFIC PROTEINS FORM SELECTED ANIMAL PRODUCTS.

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS

AUTOR PRÁCE

Bc. FILIP JANHUBA

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2014

doc. RNDr. IVANA MÁROVÁ, CSc.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-DIP0824/2013 Akademický rok: 2013/2014 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Filip Janhuba Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) doc. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Název diplomové práce: Charakterizace specifických proteinů z vybraných živočišných produktů.

Zadání diplomové práce: 1. Vypracujte literární přehled - proteinové složení vybraných živočišných produktů (vejce, mléko) 2. Metody - analýza proteinového složení pomocí elektromigračních a chromatografických metod, enkapsulace vybraných proteinů, charakterizace částic 3. Charakterizace proteinů s antimikrobiálním účinkem; jejich enkapsulace do vhodných typů částic; stabilita v modelových a reálných podmínkách, aplikace. 4. Vyhodnocení a diskuse výsledků

Termín odevzdání diplomové práce: 9.5.2014 Diplomová práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.

----------------------Bc. Filip Janhuba Student(ka)

V Brně, dne 31.1.2014

----------------------doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Diplomová práce byla zaměřena na specifické obranné proteiny z ţivočišných produktů, zejména na charakterizaci antimikrobiálního proteinu ovotransferinu (téţ „conalbuminu“) pocházejícího z vaječného bílku, který patří do skupiny transferinů a je do jisté míry analogem laktoferinu v mléce. Ovotransferin má velmi široké spektrum účinků, především antivirové, protirakovinové a imunomodulační. Jeho antimikrobiální aktivita vycházející z moţnosti vázat ţelezo je stále předmětem velkého zájmu. Pro srovnání charakteristik ovotransferinu byl pouţit další obranný vaječný protein, a to lysozym (Nacetylmuramidglykanhydrolasa). V teoretické části diplomové práce byl vypracován přehled o specifických antimikrobiálních proteinech ve vybraných ţivočišných produktech, kdy byl důraz kladen především na ovotransferin a lysozym. Experimentální část je zaměřena na optimalizaci metod stanovení antimikrobiální aktivity, koncentrace a čistoty těchto proteinů. Pro kvantitativní stanovení celkových proteinů byla vyuţita optimalizovaná Hartree – Lowryho metoda a pro zjištění molekulové hmotnosti a čistoty byla provedena SDS-PAGE s vizualizací pomocí Coomassie Brilliant Blue G250 nebo pomocí barvení stříbrem. V rámci charakterizace byl reálný vzorek vaječného bílku souběţně srovnáván se vzorky antimikrobiálních tablet a s lyofilizovanými vzorky antimikrobiálních proteinů dodanými průmyslovým partnerem a bylo určeno jejich přesné proteinové sloţení a čistota. Studium antimikrobiální aktivity ovotransferinu bylo prováděno na kulturách bakterie Bacillus subtilis a pro srovnání i na gramnegativní bakterii E. coli. Ovotransferin vykázal antimikrobiální účinek i přes vysoký přídavek (100 mM) hydrogenuhličitanových iontů aţ při velmi vysokých koncentracích okolo 75 mg/ml (Bacillus subtilis) a 50 mg/ml (E. coli). Inhibiční efekt byl nejvíce patrný v tekutých médiích. U enzymu lysozymu bylo zjištěno, ţe vykazuje v případě kultury grampozitivních bakterií významnou inhibiční aktivitu jiţ od 0,3 mg/ml. Naopak inhibiční účinek na E. coli pozorován nebyl. V další části byl ovotransferin izolován z vaječného bílku gelovou filtrací na koloně s náplní Sephadex G100. Jako mobilní fáze byly testovány 0,1 M fosfátový a 0,05 M TrisHCl pufr. Čistota ovotransferinu byla srovnána s komerčním standardem pomocí SDSPAGE. Na závěr byla testována moţnost enkapsulace ovotransferinu a lysozymu do liposomových a chitosanových částic. Vlastnosti připravených částic byly studovány pomocí DLS a měření zeta potenciálu. Studována byla také stabilita částic v modelových fyziologických podmínkách.

Klíčová slova: Conalbumin, ovotransferin, lysozym, Bacillus subtilis, E. coli, SDS-PAGE, enkapsulace, GPC, DLS;

5

ABSTRACT The master's thesis is focused on study of specific protective proteins from animal products. Two different types of antimicrobial egg white proteins were studied in detail antimicrobial protein ovotransferrin (conalbumin) and enzyme lysozyme. Ovotransferrin belongs to transferrin group of proteins and exhibits activities similar to milk protective protein lactoferrin. The main effects of ovotransferrin are antiviral, anticancer and immunomodulatory. Antimicrobial activity of ovotransferrin based on the possibility to bind iron is still a subject of interest. For comparison the second egg protein lysozyme (N-acetyl muramidglycan hydrolase) was used. Lysozyme is a hydrolytic enzyme which primary attack cell wall of bacteria. In the theoretical part of the thesis an overview of the specific antimicrobial proteins in selected animal products was introduced mainly focused on ovotransferrin and lysozyme. The experimental part of this work was focused on optimization of methods for the determination of antimicrobial activity, protein concentration and purity. For quantitative analysis of total proteins, optimized Hartree – Lowry spectrophotometric method was used. For the determination of molecular weight and purity SDS-PAGE was used and stained by Coomassie Brilliant Blue G250 and silver. In experimental part the real sample of egg white was compared with samples of lyophilized antimicrobial proteins and therapeutical pills supplied by industrial partner. Protein composition and purity of these preparative has been determined. Antimicrobial activity of ovotransferrin was studied on cultures of G+ bacterium Bacillus subtilis and for comparison on G– E. coli. Ovotransferrin showed antimicrobial effect only at very high concentrations of about 75 mg/ml (Bacillus subtilis) and 50 mg/ml (E coli) even with addition of high amount (100 mM) of hydrogen carbonate ions. The inhibitory effect was most evident in liquid media. On the other hand, lysozyme exhibited significant inhibitory activity from 0.3 mg/ml on gram positive bacteria. Inhibitory effect on E. coli was not observed. Another part of study was focused on isolation of ovotransferrin from egg white using gel permeation chromatography on Sephadex G100. As mobile phases 0.1 M phosphate buffer and 0.05 M Tris-HCl buffer were tested. By SDS-PAGE the purity of ovotransferin comparing to standard was evaluated. Finally, the encapsulation of ovotransferrin and lysozyme was tested. Ovotransferrin and lysozyme was encapsulated into liposome and chitosan particles. Particles stability, distribution and average size distribution were studied by dynamic light scattering and zeta potential measurement. The stability of particles in the model physiological conditions was studied too.

Keywords: Conalbumin, ovotransferin, lysozyme, Bacillus subtilis, E. coli, SDS-PAGE, encapsulation, GPC, DLS;

6

JANHUBA,F. Charakterizace specifických proteinů z vybraných živočišných produktů. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2014. 108 s. Vedoucí bakalářské práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc..

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci vypracoval samostatně a ţe všechny pouţité literární zdroje jsem správně a úplně citoval. Diplomová je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a můţe být vyuţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT.

………………... podpis studenta

Poděkování Tímto bych chtěl poděkovat vedoucí mé práce doc. RNDr. Ivaně Márové, CSc. za moţnost vedení diplomové práce a za čas věnovaný konzultacím k diplomové práci. Dále také kolektivu v laboratoři a hlavně Ing. Petře Matouškové za cenné rady při práci v laboratoři a celkovou nápomoc při získávání dat. 8

OBSAH Obsah ........................................................................................................................................ 9 1 Úvod................................................................................................................................ 11 2 Teoretická část ................................................................................................................ 12 2.1 Ţivočišné produkty................................................................................................... 12 2.1.1 Vejce ................................................................................................................. 12 2.1.2 Mléko ................................................................................................................ 16 2.2 Studované ţivočišné proteiny................................................................................... 18 2.2.1 Ovotransferin .................................................................................................... 18 2.2.2 Lysozym ............................................................................................................ 23 2.2.3 Laktoferin .......................................................................................................... 25 2.3 Kultivace mikroorganismů ....................................................................................... 27 2.3.1 Rozdělení mikrobů ............................................................................................ 27 2.3.2 Charakteristika testovacích bakterií druhu Bacillus subtilis ............................. 27 2.3.3 Charakteristika testovacích bakterií druhu E. coli ............................................ 28 2.3.4 Ţivná média ...................................................................................................... 28 2.3.5 Kultivační metody............................................................................................. 29 2.3.6 Vyuţití mikrobiálních systémů při analytických stanoveních .......................... 29 2.4 Vybrané metody analýzy, charakterizace a purifikace bílkovin .............................. 30 2.4.1 Spektrofotometrické určení celkového obsahu bílkovin................................... 30 2.4.2 Gelová elektroforéza ......................................................................................... 31 2.4.3 Vyuţití chromatografie v dělení směsi proteinů ............................................... 32 2.5 Metody enkapsulace proteinů a analýzy enkapsulovaných částic ........................... 35 2.5.1 Liposomové částice ........................................................................................... 35 2.5.2 Chitosanové částice ........................................................................................... 36 2.5.3 Enkapsulace látek.............................................................................................. 37 2.5.4 Moţnosti aplikace a stabilizace antimikrobiálních látek .................................. 37 2.5.5 Charakterizace částic metodou DLS ................................................................. 37 3 Cíl práce .......................................................................................................................... 40 4 Experimentální část ......................................................................................................... 41 4.1 Pouţité mikroorganismy .......................................................................................... 41 4.2 Pouţité standardní a speciální chemikálie ................................................................ 41 4.3 Spektrofotometrické stanovení koncentrace proteinů a peptidů .............................. 42 4.3.1 Metoda dle Hartree-Lowryho ........................................................................... 42 4.4 SDS-PAGE (Laemmli) ............................................................................................. 43 4.5 Rozdělení proteinů pomocí gelové filtrace .............................................................. 46 4.5.1 Volba stacionární fáze (kolony) ........................................................................ 46 4.5.2 Volba mobilní fáze ............................................................................................ 46 4.5.3 Zakoncentrování získaných frakcí pomocí ultrafiltrace ................................... 47 4.6 Testování antimikrobiálního účinku......................................................................... 47 4.6.1 Kultivace Bacillus subtilis ................................................................................ 47 4.6.2 Kultivace Escherichia coli ................................................................................ 48 4.6.3 Kalibrační závislost koncentrace sušiny a růstová křivka pouţitých mikroorganismů .............................................................................................................. 48 4.6.4 Antimikrobiální testy ........................................................................................ 49 9

5

4.7 Enkapsulace .............................................................................................................. 50 4.7.1 Příprava liposomů .............................................................................................. 50 4.7.2 Příprava polysachridových částic ...................................................................... 50 4.7.3 Stanovení enkapsulační účinnosti...................................................................... 50 4.7.4 Měření parametrů částic pomocí DLS ............................................................... 51 4.7.5 Studium stability enkapsulovaných částic v modelových podmínkách ............ 51 Výsledky a diskuse .......................................................................................................... 52 5.1 Optimalizace metod stanovení koncentrace proteinů konvenčními metodami ........ 52 5.1.1 Kalibrační závislosti .......................................................................................... 52 5.1.2 Stanovení absorpčního spektra .......................................................................... 54 5.1.3 Stanovení obsahu bílkovin ve vzorcích dodaných průmyslovým partnerem .... 55 5.2 Identifikace proteinů pomocí SDS-PAGE ................................................................ 56 5.2.1 Laemmli-SDS-PAGE ........................................................................................ 56 5.3 Dělení reálné směsi proteinů pomocí gelové filtrace................................................ 58 5.3.1 Dělení směsi proteinů z vaječného bílku metodou gelové permeační chromatografie ................................................................................................................. 58 5.4 Testy antimikrobiálních vlastností ............................................................................ 61 5.4.1 Testování antimikrobiální aktivity na agarových plotnách ............................... 61 5.4.2 Optimalizovaná metoda detekce lýze buněk ..................................................... 67 5.4.3 Testování antimikrobiální aktivity v tekutých médiích ..................................... 70 5.5 Enkapsulace .............................................................................................................. 80 5.5.1 Enkapsulační účinnost ....................................................................................... 80 5.5.2 Analýza částic s enkapsulovanými proteiny...................................................... 82 5.5.3 Studium stability částic v modelových podmínkách ......................................... 88 Závěry .............................................................................................................................. 95 Literatura ......................................................................................................................... 97 Seznam pouţitých zkratek ............................................................................................. 108

6 7 8

10

1

ÚVOD

V posledních letech je stále více kladen důraz na vyuţívání přírodních produktů a všech jejich jedinečných biologických funkcí. Tomuto trendu odpovídá i studium látek s antimikrobiálním účinkem, především rostlinného původu, a to zejména za účelem náhrady antibiotik v řadě potravinářských či farmaceutických aplikací. V menším rozsahu se studují antimikrobiální produkty ţivočišných organismů. Hlavní náplní této práce je studium antimikrobiální aktivity vaječného proteinu ovotransferinu, jehoţ funkce není do dnešní doby zcela detailně prozkoumaná, a to zejména ve srovnání s nejznámějším antimikrobiálním proteinem lysozymem. Vaječný lysozym je malý enzym (14,4 kDa), klasifikovaný jako N-acetylmuramidglykanhydrolasa a katalyzuje hydrolýzu β-1,4-glykosidických vazeb peptidoglykanů nacházejících se v buněčné stěně výhradně grampozitivních bakterií. Ovotransferin nebo také conalbumin je naopak středně velký glykoprotein (76 kDa) skládající se z 686 aminokyselin. Obsahuje dvě podjednotky a náleţící do skupiny transferinů stejně jako sérový transferin či mléčný laktoferin, který má jako součást mléka podobnou funkci i účinky. Ovotransferin vykazuje rozmanité účinky, jako jsou antimikrobiální, antivirové, antimykotické či imunomodulační. Ovšem tyto účinky nejsou stále detailně prozkoumané. Nicméně podstatou primární antimikrobiální aktivity ovotransferinu je tvorba komplexu s dvojmocnými a trojmocnými kationty, přičemţ jedna molekula dokáţe vázat dva takové kationty a tvořit růţově (Fe3+), nebo ţlutě (Cu2+) zbarvenou komplexní sloučeninu. Díky této vlastnosti můţe protein působit antibakteriálně, poněvadţ je schopen odjímat bakteriím esenciální ţelezo a inhibovat tak jejich růst. Na tento mechanismus byla vypracována spousta studií, kdy bylo zjištěno, ţe donor-akceptorní vazba s ţelezem je ovlivnitelná přítomností různých přídatných látek, zejména hydrogenuhličitanových, resp. uhličitanových iontů [1], kdy tyto ionty pozitivně ovlivňují schopnost inhibice i dalších typů bakterií. Mechanismus jejich účinku souvisí s určitou kompenzací lokálního náboje v molekule proteinu před samotnou vazbou kladného ţeleza. Další studie prokázaly vliv zinečnatých kationtů [2] či EDTA [3]. Vzhledem k potravinářské nezávadnosti je ovšem zvýhodněn hydrogenuhličitan sodný. Mikroorganismy na ovotransferin reagují velmi odlišně. Mnohdy významně, např. E. coli, či velmi málo, např. S. aureus. Rovněţ zajímavé je, ţe ačkoli přítomnost hydrogenuhličitanového aniontu zvyšuje antimikrobiální účinek ovotransferinu proti běţným mikroorganismům, nezpůsobuje zvýšení antimikrobiální aktivity u velmi rezistentních kmenů, jako je S. aureus. Tady se poté otevírá diskuze o sekundárním antimikrobiálním účinku ovotransferinu, který nijak nesouvisí se schopností vázat ţelezo. Tento zatím neobjevený mechanismus je pravděpodobně realizovaný díky specifickým membránovým receptorům na určitých mikroorganismech, ovšem to je stále jen domněnka. V předloţené práci je studován antimikrobiální účinek ovotransferinu na kulturách Bacillus subtilis a E. coli s přídavkem hydogenuhličitanu. Dále je testována moţnost izolace ovotransferinu z vaječného bílku pomocí gelové filtrace, stanovení koncentrace s vyuţitím kolorimetrických technik a stanovení čistoty a molekulové hmotnosti pomocí elektromigračních technik. Rovněţ jsou otestovány moţnosti enkapsulace ovotransferinu, lysozymu a jejich směsi do liposomových a polysacharidových částic včetně studia stability těchto částic v modelových fyziologických podmínkách. 11

2

TEORETICKÁ ČÁST

2.1

Ţivočišné produkty

Mezi ţivočišné produkty nebo také zvířecí produkty, patří veškeré produkty získané z těl ţivočichů. Na jedné straně se jedná o přímé produkty ţivočichů, které zvíře produkuje, např. tělní tekutiny a na straně druhé o produkty získané usmrcením ţivočicha, tzn. především maso, vnitřnosti a tuk. Další důleţité dělení produktů můţe být realizováno například dle původního ţivočicha, nebo na potravinářsky významné (vyuţitelné), či na potravinářsky nevýznamné, resp. nevyuţitelné produkty. Tato práce je primárně zaměřena na obranné proteiny ţivočichů, takţe v následujících kapitolách budou diskutovány pouze reprodukčně významné produkty poskytující jejich zdroj, a to vejce a mléko. 2.1.1 Vejce Jedním z hlavních potravinářsky významných ţivočišných produktů získaných ze zvířete bez usmrcení, je vejce. Vejce je produkováno především ptáky, plazy a vejcorodými savci, ovšem z potravinářského hlediska mají význam převáţně konzumní vejce produkovaná drůbeţí, a to především slepičí. Slepičí vejce tak patří mezi nejvýznamnější potravinářské suroviny a pouţívá se celé nebo jeho část pro výrobu nejrůznějších potravinářských produktů, především v odvětví pekařském a cukrářském. Důleţitým aspektem slepičího vejce je mimo potravinářskou významnost i zdroj specifických chemických látek pro farmaceutický, chemický, textilní či koţedělný průmysl. Jde především o vyuţití lecithinu a vaječných enzymů jako lysozymu a ovotransferinu. Navíc v neposlední řadě spočívá vyuţití vajec ve veterinární medicíně pro výrobu některých očkovacích látek. Hlavní funkcí vejce je reprodukční funkce, kdy z vejce vzniká po oplození nový jedinec. Vejce vzniká výhradně v těle samice a obsahuje vše potřebné pro zrození a další vývoj jedince. Velikost a tvar vejce (obecný tvar je oválný) závisí na druhu ţivočicha, od kterého pochází [4; 5; 6; 7]. Vejce je tvořeno vaječným ţloutkem (29 %), bílkem (61,5 %) a vápenatou skořápkou (9,5 %), která je tvořena z uhličitanu vápenatého spolu s menším obsahem uhličitanu hořečnatého a fosforečnanu vápenatého. Celé vejce obsahuje přibliţně 66 % vody, 11 % minerálních látek a 23 % organických látek, mezi které patří především proteiny (12 %) a lipidy (11 %). Co se týče zdroje proteinů, je nejhodnotnější bílek. Naopak ţloutek tvoří aţ 75 % vyuţitelné energie (u průměrného vejce velikosti M je tak celková energetická hodnota 332-387 kJ). Dále je vejce zdrojem ω-6 polynenasycených mastných kyselin, cholesterolu (v mnoţství 250-300 mg/vejce), fosfolipidů (lecithinu) a všech vitaminů, kromě vitaminu C. [7,8] 2.1.1.1 Vaječný bílek Vaječný bílek (angl. „egg white“) se skládá převáţně z vody a bílkovin. Jde o velmi neobvyklý ţivočišný produkt, kdy obsah proteinů v sušině je aţ 90 %. Navíc obsahuje také volnou glukózu (ve dvojnásobné koncentraci neţ v krevní plasmě), která má slouţit jako primární zdroj energie pro embryo. Kaţdý protein vaječného bílku má svoji specifickou funkci, ať uţ výţivovou, či funkční (Tab. 1). Obecně se dá říci, ţe bílek plní obranou a výţivovou funkci a obsahuje především obrané antimikrobiální a inhibiční proteiny [8]. 12

Tab. 1: Složení vaječného bílku [8]

Z přehledu vyplývá, ţe mezi nejvíce zastoupené proteiny vaječného bílku patří zásobní ovalbumin, antimikrobiální a co se týče ţeleza zásobní ovotransferin a inhibitor trypsinu ovomukoid. Z méně zastoupených, ale velmi významných proteinů obsahuje vaječný bílek ještě antimikrobiální enzym lysozym tvořící 3,5 % obsahu sušiny. 





Ovalbumin o Nejvíce zastoupený protein v bílku, jde o fosfoglykoprotein. Molekuly ovalbuminu obsahují čtyři volné sulfhydrilové skupiny a dva disulfidické můstky. Ovšem v průběhu doby uchovávání můţe docházet ke vzniku formy S-ovalbuminu, který obsahuje sulfidických vazeb více. Poměr těchto dvou forem ovolabumin/S-ovoalbumin, tak závisí na délce a teplotě skladování. Ovotransferin („conalbumin“) o Jde o glykoprotein obsahující dvě podjednotky, náleţící do skupiny transferinů. Dokáţe tvořit komplex vazbou s dvoj- a trojmocnými kationty, zejména s Fe3+ či Cu2+ a tím inhibovat růst bakterií. Jedna molekula dokáţe vázat dva takové kationty a tvořit růţové (Fe3+), resp. ţluté (Cu2+) zbarvení. Výsledné komplexy jsou oproti nativnímu stavu „conalbuminu“ výrazně termostabilnější. Pro úspěšnou vazbu ţeleza je nezbytný kompenzační iont. Ovomukoid o Další glykoprotein, v tomto případě skládající se ze tří podjednotek. Je termostabilní a vykazuje inhibiční aktivitu vůči trypsinu, jakoţto zástupci trávicích proteáz.

13





Lysozym o Známý antibakteriální enzym působící na stěnu pouze grampozitivních bakterií, díky β-glukosamidázové aktivitě dokáţe zapříčiňovat lýzi buněk. Zajímavostí je, ţe jde o protein s velmi vysokou hodnotou pI. Ovomucin o Ve vodě nerozpustný protein. Je rozpustný pouze v případě alkalických podmínek v roztoku solí. Je zodpovědný za viskozitu bílku, kdy roztaţná struktura molekuly je výsledkem elektrostatických sil mezi záporně nabitými zbytky kyseliny sialové [8].

2.1.1.2 Vaječný žloutek Ţloutek tvoří střed vejce a je specificky tvořen disperzí částic ve vodné fázi (Obr. 1). Toto řešení je nutné z důvodu vysokého obsahu hydrofobních látek, zejména lipidů. Ţloutek disponuje velkým mnoţstvím vyuţitelné energie. Ačkoli tvoří pouze třetinu vejce, poskytuje aţ 75 % vyuţitelné energie celého vejce. Tab. 2: Složení vaječného žloutku [8]

Ţloutek, jakoţto disperze hydrofobních částic o různé hustotě ve vodné fázi, lze centrifugací separovat na tři hlavní frakce [8]: 

14

LDL frakce („low-density“ lipoproteiny) o Tato lipoviteleninová frakce obsahuje 90 % lipidů, především ve formě triacylglycerolů a tvoří přibliţně dvě třetiny celé sušiny ţloutku. o Lipoviteleniny mohou být děleny dle molekulové hmotnosti do frakcí L1 a L2. o Molekulová hmotnost této frakce se pohybuje jiţ ve velmi vysokých hodnotách.



HDL frakce („high-density“ lipoproteiny) o Tvoří částicový sediment (zbylých 23 % sušiny), obsahuje fosfitin a lipoproteiny lipoviteliny, které mohou být separovány ještě na dvě subskupiny dle molekulové hmotnosti – skupinu α a β. o Naopak fosfitin je podobně jako bílkový ovotransferin schopen vázat ţelezo, a to rovněţ ve formě Fe3+. Zde ovšem působí primárně jako zásoba ţeleza a pravděpodobně neplní obdobnou antimikrobiální funkci jako transferiny.



Rozpustná proteinová frakce („continuous phase“) o Obsahuje livetiny a stopové mnoţství dalších sérových proteinů. o Livetiny jsou globulární proteiny dělící se dle molekulové hmotnosti na tři skupiny α, β, γ.

Obr. 1: Snímek částic žloutku v nativním stavu získaný rastrovacím elektronovým mikroskopem (SEM). Zmražení sedimentu z vysoleného roztoku (0,085M NaCl, T=10 °C) žloutku (ředění 1:1) na -160 °C pod vakuem [8] Obecně obsah lipidů ve ţloutku je zajištěn z 65-70% triacylglyceroly a z 25-30% fosfolipidy, které mají zpravidla fosfatidylcholinový základ a mohou po extrakci organickými rozpouštědly (aceton-ethanolová extrakce) slouţit jako zdroj lecithinu. V lipoproteinech jsou polární proteinové a fosfolipidové skupiny situovány na povrchu struktur a jádra struktur naopak obsahují výhradně hydrofobní triglyceridy a cholesterol. Poslední a nejméně zastoupený protein ţloutku je YRBP, tzn. „Yolk Riboflavin Binding Protein“, resp. riboflavin vázající ţloutkový protein. Jak jiţ z názvu vyplývá, jde o flavoprotein schopný vázat riboflavin (vitamin B2) v mnoţství jeden mol na mol YRBP [8]. 15

2.1.1.3 Vizualizace vaječných proteinů pomocí SDS-PAGE Většinu vaječných proteinů lze úspěšně vizualizovat pomocí elektroforetického dělení na polyakrylamidovém gelu (Obr. 2), konkrétně pomocí modifikované metody zahrnující denaturaci pomocí dodecylsíranu, tzn. SDS-PAGE.

Obr. 2: Modelový elektroforeogram vaječných proteinů pomocí SDS-PAGE za podmínek: 7,5% gel, Tris-Gly 0,04 M pufr pH 8,3, (v závorce uvedena velikost v Da) [8] 2.1.2 Mléko Mléko je na vodě zaloţená tekutina produkována mléčnými ţlázami většiny savců. Primárně slouţí jako zdroj základních nutričních látek pro růst novorozence. První mléko, tvořící se několik hodin po porodu, tzv. kolostrum, obsahuje velmi vysoký obsah nutričních sloţek, především imunomodulačních a obranných substancí. Majoritní sloţkou mléka je voda, tvořící např. u kravského mléka 84,5-87,7 %, tuk (3,75,0 %), laktóza (4,7-4,9 %) a zbytek tvoří teprve proteiny (3,0-3,6%). Ty jsou děleny na kaseinovou a syrovátkovou frakci, kdy kaseinová obsahuje čtyři varianty (αs1-kasein, αs2kasein, β-kasein, κ-kasein). Naopak syrovátková frakce, která mimo dominantní βlaktogloubulin a α-laktalbumin, obsahuje i důleţité minoritní proteiny jako imunoglobuliny, laktoferin, sérový albumin a v neposlední řadě lysozym (Tab. 3 a 4) [9]. 2.1.2.1 Proteinové složení mléka Co se týče významu jednotlivých součástí mléka, největší význam mají jednoznačně mléčné proteiny. Díky unikátním vlastnostem mléčných proteinů patří mléko k nejprostudovanějším potravinám [10]. Největší zastoupení z mléčných proteinů má kasein (aţ 80 %). Ten je tvořen čtyřmi různými typy, které mají vysoký obsah prolinu a dalších hydrofobních aminokyselin a jejich struktura není stabilizována disulfidickými vazbami. Po kyselém vysráţení kaseinů pod hodnotou izoelektrického bodu (pH 4,5) nebo pomocí jiného postupu, např. sráţením pomocí syřidel (běţně při produkci sýra) nebo alternativně oddělením ultrafiltrací (výţiva pro 16

sportovce), zbývá roztok obsahující další specifické proteiny, tzv. syrovátkové proteiny (Tab. 4) [9]. Zde mají dominantní zastoupení vysokomolekulární imunoglobuliny, následované β-laktoglobulinem a α-laktalbuminem. Vzácného laktoferinu obsahuje mléko, resp. syrovátka velmi malé mnoţství a lysozymu ještě méně, ten je ovšem velmi účinný [10; 11]. Koncentrace laktoferinu velmi závisí na druhu mléka a i v rámci jednoho druhu velmi kolísá. Standardně jeho koncentrace silně narůstá v době kojení, kdy kolostrum disponuje aţ patnáctkrát vyšším obsahem laktoferinu. Zajímavostí je, ţe laktoferin je obsaţen ve velmi malé koncentraci i v lidské krvi. Obecně je součástí nejen antimikrobiální, ale i antivirové a antimykotické ochrany mléka spolu s lysozymem. Mléko, co se týče obsahu obranných proteinů, vykazuje do jisté míry analogii k vaječnému bílku, kde je lysozym opět přítomen, ovšem zde v kombinaci s odlišným transferinem – ovotransferinem. Tab. 3: Sloţení kravského mléka (kaseinová a syrovátková frakce) [9]

Tab. 4: Sloţení mléka (bioaktivní syrovátkové proteiny kravského mléka) [11]

17

2.2

Studované ţivočišné proteiny

2.2.1 Ovotransferin Ovotransferin nebo také alternativně „conalbumin“, náleţí do skupiny transferinů, schopných vázat a přenášet ionty, primárně však ţelezité ionty. Dokáţe tvořit komplexní vazbu s dvojmocnými a trojmocnými kationty, zejména s Fe3+ nebo Cu2+, ovšem byly popsány i vazby Zn2+ [2]. Jedna molekula dokáţe vázat dva takové kationty a tvořit růţové (Fe3+) nebo ţluté (Cu2+) zbarvení. Výsledné komplexy jsou oproti nativnímu stavu ovotransferinu výrazně stabilnější, a to převáţně teplotně. Této vazby se dá vyuţít i při jeho izolaci či purifikaci, kde je ideální pouţít metodu IMAC („Immobilized Metal Affinity Chromatography“). Ovotransferin byl poprvé identifikován v roce 1944 při výzkumech antimikrobiálních vlastností bílku na rozličných bakteriálních a kvasinkových kulturách, které prováděli Schade a Caroline [12]. Nejprve jej pojmenovali jako „conalbumin“, ale v roce 1968 byl po potvrzení jeho struktury a funkce vazby ţeleza Williamsem [13] přejmenován na ovotransferin. V současné době jsou moţná obě tato pojmenování, nicméně správnější je ovotransferin. Hlavním rozdílem oproti sérovému transferinu, jakoţto modelovému transferinu je nejen odlišné pI, ale hlavně glykoproteinový základ tvořený jedním glykanovým řetězcem skládajícím se z manózy a N-acetylglukosaminových zbytků v C-koncové oblasti [14]. Tab. 5: Obecné informace o ovotransferinu získaného z vaječného bílku [15; 16; 17] C.A.S.: „conalbumin“ z vaječného bílku Molekulová hmotnost: Kód enzymu (číslo EC): Alternativní názvy: Optimum pH

1391-06-6 76 000 g·mol-1 (76,0 kDa) 215-727-0 ovotransferin, „conalbumin“ 5,8

2.2.1.1 Ovotransferin jako zástupce transferinů Jako transferiny lze označovat glykoproteiny, které jsou přítomny v různých biologických systémech, a jejich hlavní funkcí je vazba ţeleza. Primárně slouţí k transportu ţeleza, ale tohoto mechanismu lze vyuţít i proti neţádoucím bakteriím, kdy jsou transferiny schopny odebírat bakteriím esenciální ţelezo. Ovotransferin má proti ostatním výrazně niţší izoelektrický bod. Skupinu reprezentují čtyři varianty transferinů:  Sérový transferin o Slouţí výhradně k transportu ţeleza v krevní plasmě.  Laktoferin o Nachází se v mléce a jiných savčích sekretech, má nezvykle vysoké pI a má variabilnější funkce, jako např. součást vrozené imunitní ochrany.  Melanotransferiny o Identifikovány na povrchu melanocytů, obsahují pouze jedno vazebné místo pro ţelezo.  Ovotransferin o Poskytuje primárně antimikrobiální obranu ptačímu vejci, resp. embryu, navíc slouţí k zásobě a dopravě ţeleza pro ptačí embryo. 18

Tab. 6: Srovnání čtyř zástupců skupiny transferinů [18] Sérový Laktoferin Melanotransferiny Ovotransferin transferin Mateřské mléko, Povrch melanocytů Krevní sérum slzy, sliny, krevní Vaječný bílek Zdroj lidského těla sérum Počet zbytků 678 641 719 686 aminokyselin Molekulová 80 kDa 80 kDa 80 kDa 76 kDa hmotnost Izoelekrický 7,4 8,8 6,8 - 7,1 6 bod Antimikrobiální aktivita, Antimikrobiální Transport imunomodulační aktivita, ţeleza, proces účinky, regulace Zapojení protiplísňové myelinace, buněčného růstu, v chondrogenezi a účinky, antivirová Biofunkce zapojení při antivirová angiogenezi; aktivita, vazbě s DNA; aktivita, imunomodulační protiplísňové účinky; účinky; 2.2.1.2 Struktura Jak jiţ bylo zmíněno, ovotransferin je jedno řetězcový glykoprotein obsahující 686 aminokyselinových zbytků. Molekulová hmotnost je přibliţně 76 kDa a izoelektrický bod pI má hodnotu 6,0. Ve své struktuře obsahuje patnáct disulfidických vazeb a ţádné volné sulfhydrilové skupiny. Řetězec proteinu je zabalen do dvou globulárních struktur v závislosti na N a Ckoncových polovinách spojených α-helixovou strukturou devíti aminokyselin, konkrétně v pořadí 333 aţ 341 [19]. Obě koncové globulární struktury jsou realizované hydrofobními interakcemi. Kaţdá z obou globulárních struktur N a C je dělena na podstruktury N1, N2 a C1, C2, kdy společné substruktury jsou vzájemně protkány antiparalelně pomocí β-vláken, dovolující je otevírat a uzavírat pomocí kloubového mechanismu popsaného Kurokawou, et. al. v roce 1995 [20]. Kaţdá z těchto dvou globulárních struktur je pomocí charakteristických ligandů schopná tímto mechanismem reversibilně vázat trojmocné ţelezo. Důleţitá je pro navázání ţeleza i přítomnost (hydrogen) uhličitanového anionu (Obr. 4), který se váţe jako první, aby neutralizoval kladný náboj asociovaný pravděpodobně s Arg 121 na N-konci [21; 22]. Vazbu zprostředkující ligandy jsou u ovotransferinu stejné jakou u dalších transferinů a skládají se ze dvou tyrosinových zbytků (Tyr 92 a Tyr 191), jedné asparagové kyseliny (Asp 60) a jednoho histidinu (His 250) [18]. Analogickou strukturu vykazuje i laktoferin, který rovněţ pro vazbu vyuţívá čtyř výše zmíněných aminokyselinových zbytků a ve vazbě aniontu hraje roli argininový řetězec. Podle způsobu vazby ţeleza, tak přicházejí do úvahy tři formy ovotransferinu, a to apoforma („nonferric“/bez ţeleza), holo- forma („diferric“/se dvěma Fe3+ kationty) a tzv. mezní forma („monoferric“/s jedním kationtem Fe3+).

19

Obr. 3: Protein Data Bank (PDB) render struktury ovotransferinu izolovaného z vaječného bílku slepice (Gallus gallus), A – apo-ovotransferin, B – holo-ovotransferin s železem [16; 20; 23]

Obr. 4: Znázornění vazby železa pomocí ligandů (Tyr 92, Tyr 191), His 250, Asp 60) se zapojením uhličitanového aniontu [18; 24] 20

2.2.1.3 Účinky ovotransferinu Je třeba zdůraznit, ţe hlavním cílem přítomnosti ovotransferinu ve vejci je kromě antimikrobiální ochrany zejména přenos ţeleza pro potřebu embrya [25]. Antimikrobiální účinek ovotransferinu byl prokázán uţ při jeho objevení v roce 1944 [12]. Ovšem aţ do doby zjištění jeho příslušnosti ke skupině transferinů nebyl znám mechanismus antimikrobiální aktivity. Transferiny, jak jiţ bylo řečeno, odebírají mikrobům esenciální ţelezo [24]. Ovšem zajímavostí je, ţe ovotransferin vykazuje inhibiční účinek na široké spektrum mikroorganismu ve formě jak s nenavázaným ţelezem (apo-transferin), tak i ve formě s navázaným ţelezem (holo-ovotransferin) a zatím není zcela jasné, proč tomu tak je [26]. Tab. 7: Shrnutí všech účinků ovotransferinu [18] Druh aktivity Mechanismus Zabraňuje růstu bakteriím pomocí odjímání esenciálního ţeleza. Antimikrobiální aktivita

Antimykotický účinek Antivirová aktivita Imunomodulační účinky

Protirakovinový účinek Antioxidační aktivita

Hydrogenuhličitanový ion zvyšuje antibakteriální aktivitu za tvorby komplexu protein-ţelezohydrogenuhličitanový ion. EDTA zvyšuje antibakteriální aktivitu ovotransferinu Baktericidní aktivita v obou apo- i holo- formách proti G+ i Gbakteriím. Zn+-ovotransferin komplex zvyšuje antimikrobiální aktivitu. Účinek proti kvasinkám rodu Candida. Přítomnost ţeleza u ovotransferinu neovlivňuje antimykotický účinek.

Originální práce Bullen et al. (1978) Tranter and Board (1982) Valenti et al. (1983) Valenti et al. (1981) Ko et al. (2009) Seol et al. (2009) Ibrahim (1997) Beekman et al. (2007) Van Droogenbroeck et al.(2008) Valenti et al. (1987) Valenti et al. (1985) Valenti et al. (1986)

Antivirová aktivita MDV viru.

Giansanti et al. (2005)

Biomarker zánětlivých onemocnění kuřat a protein akutní fáze (APP).

Xie et al. (2002) Rath et al. (2009)

Imunomodulační účinek na makrofágy a ptačí granulocyty.

Xie et al. (2002)

Ovotransferin můţe po redukci podléhat thiolovému autoštěpení a poté inhibovat proliferaci rakovinových buněčných linií. Ovotransferin vykazuje aktivitu podobnou SOD

Ibrahim et al (2006) Ibrahim and Kiyono (2009) Ibrahim et al. (2007)

21

Mikroorganismy na ovotransferin reagují velmi významně, např. Pseudomonas sp., E. coli a S. mutans přes normální reakci aţ po velmi malou, např. u S. aureus, Proteus sp., či Klebsiella [27; 28; 29; 30]. Zajímavé je, ţe ačkoli přítomnost hydrogenuhličitanového aniontu zvyšuje antimikrobiální účinek proti mikroorganismům citlivým na transferin, jako S. epidermis nebo S. saprophyticus, nezpůsobuje zvýšení antimikrobiální aktivity u rezistentních kmenů jako S. aureus [1]. Navíc v literatuře bylo popsáno mnoho způsobů zvyšujících antimikrobiální aktivitu proti patogenním kmenům, z nichţ nejúspěšnější je přídavek EDTA, kdy po aplikaci vykazuje EDTA-aktivovaný ovotransferin aktivitu i proti L. monocytogenes nebo E. coli O157:H7 [3; 31]. Antimykotický účinek byl testován na mnoha kmenech rodu Candida a pouze C. krusei vykazovala rezistenci k ovotransferinu. Bylo zjištěno, ţe přídavek hydrogenuhličitanových iontů k ovotransferinu nezvyšuje antimykotický účinek a dokonce ani přítomnost ţeleza [29; 32]. Navíc bylo zjištěno, ţe ovotransferin se absorbuje na povrch kvasinky C. albicans, kterou poté inhibuje. Autoři se domnívají, ţe jde o specifický účinek zahrnující účast povrchových specifických receptorů v kontrastu s nespecifickým antimikrobiálním účinkem proti bakteriím. Antivirovou aktivitu popsal roku 2005 Giansanti [33], kdy bylo zjištěno, ţe ovotransferin můţe potenciálně zajišťovat ochranu kuřat před lymfoproliferativním neoplastickým onemocněním způsobeným herpesvirem (MDV), nazývaným jako Markova nemoc. Podstatou účinku je moţnost vazby s DNA a RNA podobně jako u laktoferinu. Zajímavostí je, ţe se ovotransferin mimo antibakteriálních, antivirových a antimykotických účinků vykazuje i imunomodulačními účinky. Pozorovaný byl dokonce i protirakovinový účinek či antioxidační účinky podobné SOD (Tab. 7) [18]. 2.2.1.4 Separace a purifikace Poprvé byl ovotransferin purifikován klasicky pomocí precipitace vaječného bílku síranem amonným při kyselém pH v roce 1950 [34] a v roce 1951 frakcionovaným sráţením vaječného bílku s vyuţitím ethanolu v rozmezí pH 6-9 [35]. Ovšem tyto metody poskytovaly ovotransferin velmi nízké čistoty, kdy výsledný precipitát byl znečištěn ostatními proteiny. Naopak v dnešní době jsou zavedeny a široce vyuţívány výhradně chromatografické metody purifikace kombinované s krystalizačními či lyofilizačnimi technikami [36; 37; 38]. Zajímavou metodou je pouţití IMAC („Immobilized Metal Affinity Chromatography“), konkrétně pouţití „Cu-Sepharose“ kolony vyuţívající interakci mědnatých kationtů a ovotransferinu [39], či dále dvoustupňového purifikačního procesu zaloţeného na kombinaci gelové permeační chromatografie a iontové chromatografie, kdy v prvním kroku je odstraněn lysozym a ovomucin pomocí GPC a v následném kroku je ovotransferin purifikován na ionexové koloně [40]. Bylo vyvinuto a optimalizováno mnoho metod zahrnující separaci pomocí gelové permeační chromatografie s vyuţitím „Q-Sepharose“ [41; 42]. V roce 2008 byla vyvinuta metoda purifikace zaloţená na rozdílném sráţení apo- a holoformy ovotransferinu ethanolem (43%) při pH 9. Nejprve je pomocí chloridu ţelezitého ovotransferin konvertován na holotransferin za účelem zvýšení stability při následném sráţení ethanolem. Po precipitaci je konvertován zpět pomocí iontoměniče a výsledná čistota takto získaného ovotransferinu činí aţ 80 % [43].

22

2.2.1.5 Biosyntéza Ptačí gen pro transferin kóduje sérový transferin v játrech a ovotransferin ve vejci. Oba transferiny se od sebe ale liší v glykosylaci. Jak jiţ bylo zmíněno v předešlém textu, glykan ovotransferinu se skládá ze čtyř zbytků manózy a čtyř zbytků N-acetylglukosaminu, sérový transferin ze dvou zbytků manózy, dvou zbytků galaktózy, tří zbytků N-acetylglukosaminu a aţ dvou zbytků kyseliny sialové v C-koncové části [44; 45]. Exprese tohoto genu ve vejci je přímo ovlivňována hladinami estrogenu a progesteronu, nicméně tyto hormony neovlivňují expresi téhoţ genu v játrech, ústícího v produkci sérového transferinu [46]. Produkce ovotransferinu je pak realizována přímo ve vejci za steroidní kontroly stimulované adenohypofýzou. 2.2.1.6 Využití v potravinách Pouţití ovotransferinu vzhledem k velmi dobrým antimikrobiálním účinkům v souvislosti se Salmonella sp. se jeví jako perspektivní v pouţití konzervace potravin, především v případě kuřecího masa [26; 30]. Další zajímavou aplikací, která vychází ze specifik skupiny transferinů, je přítomnost určitých domén ve struktuře, které mohou být štěpením v gastrointestinálním traktu uvolněny na krátké polypeptidy se zajímavým účinkem, ať uţ antibakteriálním či jiným [47]. Na rozdíl od laktoferinu, který v průběhu trávení v GIT uvolňuje antimikrobiální peptidy mnohdy s vyšším antimikrobiálním účinkem, k podobnému efektu u ovotransferinu nedochází. Ovšem v případě ovotransferinu vykazuje z N-koncové skupiny uvolněný štěp s 92 zbytky (OTAP-92) antimikrobiální aktivitu, aniţ by jakýmkoli způsobem vázal ţelezo [44]. Navíc byly potvrzeny některé zvláštní vlastnosti polypeptidických ovotransferinových štěpů, jako je inhibice angiotensin-konvertujícího enzymu (ACE), který je jedním z klíčových enzymů v oblasti regulace krevního tlaku. Některé ovotransferinové štěpy tedy do jisté míry vykazují antihypertensivní účinky [48; 49]. 2.2.2 Lysozym Lysozym nebo také N-acetylmuramidglykanhydrolasa [50; 51; 52] je enzym patřící do skupiny hydroláz. Jde o enzym vyskytující se v tělesných sekretech - slinách, slzách, nosním hlenu, v mateřském mléce, dále také v krevní plazmě a nakonec velký obsah lysozymu má také studovaný vaječný bílek. Lysozym je velmi vyuţívaný pro své významné antibakteriální účinky. Antibakteriální účinky lysozymu poprvé popsal v roce 1909 Laschtschenko [53], ovšem identifikován a izolován z vaječného bílku byl aţ objevitelem penicilinu Alexandrem Flemingem v roce 1922 [54; 55]. Teprve v roce 1930 bylo zjištěno, ţe lysozym produkuje kaţdý obratlovec [55; 56]. V přírodě se tak vyskytuje mnoho forem a není překvapivé, ţe se lysozym produkovaný člověkem liší od enzymu produkovaného zvířaty. V této práci byl jako srovnávací komerční standard pouţit preparát od firmy SERVA, který byl izolován z vaječného bílku a jeho aktivita je deklarována na 152 000 U/mg. Dle JEFCA byl lysozym povolen pro potravinářské aplikace s odůvodněním, ţe pokud se získává z ţivočišných tkání (vejce), běţně pouţívaných jako potraviny, je moţné jej povaţovat také za potravinu a jeho číslo EEC pro potravinářská aditiva bylo zvoleno E1105. V roce 1998 byl FDA klasifikován jako GRAS – „Generally Recognized As Safe“ [57]. Naopak nevýhodou lysozymu získávaného z vaječného bílku je potenciální moţnost způsobovat, jakoţto vaječný produkt, alergickou reakci u citlivých osob. 23

Tab. 8: Obecné informace o lysozymu získaném z vaječného bílku [58; 59; 60] C.A.S.: lysozym z vaječného bílku Molekulová hmotnost: Kód enzymu (číslo EC): Alternativní názvy: Toxicita (LD50, perorálně, krysa): Optimum pH

12650-88-3 ~ 14 400 g·mol-1 (14,4 kDa) 3.2.1.17 E1105; Muramidase; mucopeptideglycohydrolase; mucopeptide N-acetylmuramoylhydrolase 4 g·kg-1 9,2

2.2.2.1 Struktura lysozymu Strukturně jde o velmi malý protein o přibliţné velikosti 14,4 kDa, jehoţ jednoduchý polypeptidový řetězec se skládá ze 129 aminokyselinových zbytků a je vnitřně zesíťován čtyřmi disulfidickými můstky. Obsahuje několik víceméně helikálních segmentů a jeden třípramenný antiparalelní β-skládaní list. Podle očekávání je většina nepolárních postranních řetězců uvnitř molekuly, tedy bez kontaktu s vodným rozpouštědlem [56].

Obr. 5: Protein Data Bank (PDB) render struktury lysozymu izolovaného z vaječného bílku slepice (Gallus gallus) [61] 2.2.2.2 Vlastnosti Lysozym vykazuje antibakteriální účinky především proti grampozitivním bakteriím, jako jsou např. rody Bacillus, Clostridium, Listeria, Streptococcus nebo Lactococcus. Dále je také velmi stabilní při vyšších teplotách [55]. 2.2.2.3 Mechanismus účinku na buněčnou stěnu Podstatou účinku je schopnost katalyzovat hydrolýzu β-1,4-glykosidických vazeb peptidoglykanů, nacházejících se v buněčné stěně především grampozitivních bakterií. Konktrétně jde o vazbu mezi molekulami N-acetylmuramové kyseliny a N-acetyl-Dglukosaminu. Z pohledu chemické reakce jde o přeměnu acetalu na poloacetal [56]. Pro srovnání neenzymová hydrolýza acetalu je reakce katalyzovaná v kyselém prostředí H+ ionty, zahrnující protonaci atomu kyslíku a následné štěpení vazby C–O za vzniku alkoholu a rezonančně stabilizovaného karbokationtu. Adicí vody na karbokation vzniká poloacetal a 24

regeneruje se kyselé prostředí H+ iontů. Pro enzymatickou katalýzu pomocí lysozymu je tak moţné v jeho struktuře v blízkosti reakčního centra nalézt kyselé katalytické skupiny a skupiny stabilizující karbokation, především Glu 35 a Asp 52 [56]. Dle Philipsova mechanismu tak enzymaticky katalyzovaná reakce vypadá ve zjednodušené formě následovně. V prvním kroku se lysozym připojuje na bakteriální buněčnou stěnu vazbou na příslušnou hexasacharidovou jednotku, ve druhém kroku Glu-35 poskytuje svůj proton k protonaci atomu kyslíku ve sloţce buněčné stěny a vazba C–O je poté rozštěpena za vzniku rezonančně stabilizovaného karbokationtu, který je stabilizován ionizovanou skupinou Asp52. Nakonec v posledním kroku dochází k adici vody z roztoku a reprotonaci Glu 35 [56]. 2.2.2.4 Funkce v živých systémech Lysozym v organismu zabezpečuje především ochranu vstupních cest do organismu před invazí patogenních bakterií. Tuto roli plní jako sloţka slin, a to při ochraně vstupu dále do trávicího traktu. Dále působí také jako sloţka hlenu nosní sliznice chránící vstup do dýchacích cest nebo sloţka slz pro ochranu očního kanálku a celkově očí, jakoţto vysoce důleţitého smyslového orgánu. Jeho přítomnost v mateřském mléce je nutná pro zachování kvality a aseptických vlastností mléka, kde účinkuje lysozym spolu s laktoferinem. 2.2.3 Laktoferin Obranný mléčný analog vaječného ovotransferinu – laktoferin byl poprvé objeven v roce 1939 Sorensenem v kravském mléce [62]. Ovšem aţ roku 1960 byla nezávisle ve třech laboratořích Grovesem, Johansonem a Montreuilem potvrzena jeho struktura a schopnost vázat ţelezo, resp. ţelezité kationty. Patří do skupiny transferinů a se sérovým transferinem vykazuje podobnost aţ 60 % [63], jenţe naproti němu vykazuje aţ dvojnásobnou schopnost vázat ţelezo. Díky zvyšování koncentrace laktoferinu v průběhu některých zánětlivých a virových onemocněních se stal předmětem zájmu jako protein akutní fáze, kdy jde pravděpodobně o mechanismus sníţení dostupnosti přechodných kovů, kdy důsledkem je zabránění vzniku reaktivních kyslíkových radikálů ve Fentonově reakci [64; 65]. Nicméně laktoferin disponuje obdobně jako ovotransferin velkou řadou dalších účinků, které se nezdají být jakkoli spojené se schopností vazby ţeleza [66]. Koncentrace laktoferinu v krvi dospělého člověka byla stanovena na 0,02-1,52 μg/ml. Ovšem v mateřském mléce (1,0-3,2 mg/ml) jde o koncentraci několikanásobně vyšší a v kolostru jde koncentrace ještě dál (3,1-6,7 mg/ml) [67]. V kravském mléce je naopak obsah signifikantně niţší (maximálně 485 μg/ml) [68]. Tab. 9: Obecné informace o bovinního laktoferinu [69] C.A.S.: laktoferin (bovinní) Molekulová hmotnost: Kód enzymu (číslo EC): Alternativní názvy:

146897-68-9 ~ 80 000 g·mol-1 (80,0 kDa) 3.4.21.laktotransferin, laktosiderofilin

2.2.3.1 Struktura a vlastnosti Opět jako u ovotransferinu jde o glykoprotein. Jeho polypetidový řetězec obsahuje 703 aminokyselinových zbytků. Povrch molekuly je glykosylován zejména mannosou. Laktoferin má molekulovou hmotnost okolo 80 kDa a existuje ve třech isoformách, a to laktoferin-α, který jako jediný dokáţe vázat ţelezo, laktoferin-β a laktoferin-γ, které schopnost vázat ţelezo postrádají, ovšem naopak vykazují ribonukleásovou aktivitu [70]. Se sniţováním pH 25

postupně klesá schopnost vázat ţelezo a mění se terciální struktura, kdy je ztracené ţelezo nahrazováno vodíky. Existují tak tři moţné varianty laktoferinu podle saturace ţelezem: apolaktoferin (bez ţeleza), „monoferric“ laktoferin (pouze jeden Fe3+ ion) a holo-laktoferin (dva ionty Fe3+). Pro vazbu ţeleza jsou obdobně jako u ovotransferinu důleţité čtyři aminokyselinové zbytky (histidinový, dva tyrosinové a zbytek od kyseliny asparagové). Vazbu uhličitanového iontu zajišťuje naopak argininový řetězec.

Obr. 6: Schématické znázornění konformačních změn mezi apo a holo formou transferinů [71]

Obr. 7: Render 3D struktury laktoferinu hLc (human laktoferin z Homo Sapiens) získaný Xray krystalografií [72] Mimo trojmocné ţelezo je schopný laktoferin vázat i jiné kationty, jako např. Al 3+, Ga3+, Mn3+, Co3+, Cu2+, Zn2+, atd. nebo dokonce i jiné komponenty – lipopolysacharidy, heparin, glykosaminoglykany a nukleové kyseliny. Slouţí tak pravděpodobně k transportu řady důleţitých látek celkového metabolismu. Jako ekvivalenty hydrogenuhličitanového iontu, resp. uhličitanového je moţné vázat i oxaláty, karboxyláty či EDTA [73]. 26

2.2.3.2 Antimikrobiální účinky Díky schopnosti vázat ţelezo disponuje laktoferin přirozeně nepřímou antibakteriální aktivitou vůči bakteriím striktně vyţadujícím ţelezo. Typickým zástupcem je E. coli [74]. Ovšem existují i bakterie na ţelezo citlivé, a tak můţe být holo-forma laktoferinu vyuţita rovněţ jako antibakteriální agens. Nicméně určité druhy bakterií se dokáţou i s tímto vypořádat, kdy uvolňují do prostředí sloučeniny, které dokáţou chelatovat ţelezo z laktoferinu [75]. Zajímavé je, ţe baktericidní aktivita není analogicky jako u ovotransferinu způsobena vazbou ţeleza, ale pravděpodobně přítomností specifických receptorů na povrchu mikroorganismů. Pravděpodobně tedy přirozená koexistence s lysozymem umoţňuje synergismus těchto dvou látek u grampozitivních bakterií, kdy vazba lakto/ovotransferinu na povrch bakterie umoţní zesílení účinku lysozymu, ať uţ uvolněním důleţitých sloţek stěny, nebo změnou elektrostatických interakcí [76; 77]. Parciálním trávením laktoferinu pepsinem v ţaludku dochází zase analogicky jako u ovotransferinu ke vzniku jednodušších peptidů, rovněţ s antimikrobiálním účinkem. Konkrétně u laktoferinu se tyto peptidové štěpy nazývají laktofericin H (human) u mateřského mléka a laktofericin B (bovine) u mléka kravského [78].

2.3

Kultivace mikroorganismů

Pro studium antimikrobiálních vlastností antimikrobiálních látek je nejprve potřeba zvolit vhodný mikroorganismus a následně vytvořit vhodné podmínky pro jeho kultivaci a správně zvolit a provést antimikrobiální test na patřičných ţivných půdách. Pro antimikrobiální testy byl vybrán jako zástupce grampozitivních bakterií B. subtilis, kde se očekává především citlivost na lysozym, a jako zástupce gramnegativních E. coli. 2.3.1 Rozdělení mikrobů Mikroorganismy jsou velmi malé jednobuněčné organismy a jejich jednotlivé buňky jsou pozorovatelné výhradně jen mikroskopicky. Dělí se převáţně na Prokaryota (bakterie) a Eukrayota (vláknité houby, kvasinky). Bakterie se dělí na dvě hlavní skupiny podle výsledku metody barvení dle Grama. První skupinou jsou bakterie grampozitivní, které mají na konci modrofialové zbarvení díky přítomnosti vysokého obsahu peptidoglykanů v buněčné stěně a absenci vnější vrstvy povrchových lipopolysacharidů. Druhou skupinou jsou naopak gramnegativní bakterie, které se barví podle Grama pouze do světle růţova. Další dělení bakterií můţe být podle patogenity na nepatogenní a patogenní, které mohou způsobovat nejrůznější závaţné nemoci, buďto přímo pomnoţením v organismu, nebo nepřímo, např. vlivem produkce toxinů různých vlastností [79]. 2.3.2 Charakteristika testovacích bakterií druhu Bacillus subtilis Bakterie rodu Bacillus, tedy grampozitivní sporulující tyčinkovité bakterie patří mezi nejrozšířenější bakterie, ať uţ jde o prostředí vody, vzduchu nebo půdy. Zařazují se do čeledi Bacillaceae. Tvoří velmi rezistentní spory, které přeţívají i vysoký var, extrémní pH, radiaci či vystavení toxickým organickým rozpouštědlům. Tento mikroorganismus je také obávaným kontaminantem v potravinářské praxi, ovšem otravy nejsou časté. Průmyslový význam spočívá v produkci proteolytického enzymu subtilisinu [79; 81]. 27

Obr. 8: Bakterie Bacillus subtilis barvené dle Grama [82] 2.3.3 Charakteristika testovacích bakterií druhu E. coli E. coli, jakoţto gramnegativní, fakultativně anaerobní, spory netvořící, tyčinkovitá bakterie, patří k nejprostudovanějším bakteriím vůbec. Je zařazována do čeledi Enterobacteriacae. Je podmíněné patogenní a běţně se vyskytuje v gastrointestinálním traktu teplokrevných ţivočichů a některé její sérotypy jsou vysoce patogenní a způsobují alimentární onemocnění, jako např. E. coli O157:H7. Je hojně vyuţívaná v molekulární biologii a biotechnologiích pro moţnosti genových manipulací a existuje velká spousta rekombinantních kmenů s vneseným cizím genem určená k produkci velkého mnoţství variabilních látek, např. lidského inzulínu [79; 83].

Obr. 9: Bakterie E. coli (ATCC 11775) barvené dle Grama [84] 2.3.4 Ţivná média Ţivná média by měla obsahovat ţivotně důleţité látky a hlavně vodu jako rozpouštědlo. V praxi se jako zdroj základních ţivin, peptidů, aminokyselin a růstových faktorů pouţívá výtaţek z hovězího masa („Beef Extract“), bílkovinný hydrolyzát (Pepton, Trypton) a kvasničný hydrolyzát („Yeast Extract“). Ovšem nároky mikroorganismů jsou velmi variabilní a některé druhy vyţadují přítomnost NaCl, Mn2+, či případně dalších specifických látek. Důleţitý je také zdroj ţeleza, které je pro bakterie esenciální. V případě pevných médií je potřeba pouţít látky zpevňující médium. Běţně se pouţívá agar, jakoţto sušená substance z mořské řasy (Agar agar), která zpětně bobtná v přítomnosti vody. Vhodná hodnota pH média je pro běţné druhy okolo 5-9. Jako zdroj esenciálních iontů je vhodný přídavek malého mnoţství síranu nebo chloridu iontu [85].

28

2.3.5 Kultivační metody Kultivací se rozumí umělé namnoţení bakterií, které je prováděno na ţivných půdách za různým účelem, např. k získání čisté kultury, izolaci enzymů, biodegradaci specifických látek nebo ke studiu antimikrobiálních látek. Kultivačních metod je velká řada různého zaměření. Dělí se především podle poţadavků mikroorganismu na kyslík (aerobní a anaerobní) a různých typů sloţek ţivných půd. Ty jsou děleny dle původu na přirozené a umělé. Podle obsahu ţivin dělíme média na základní a obohacená a podle konzistence na tekutá, polotuhá a pevná. Pokud kultivace probíhá v tekutém médiu, hovoříme o submerzní kultivaci, pokud na pevném agaru, tak o povrchové kultivaci. Dále existuje i polosuchá kultivace, která ovšem při studiu antimikrobiálního účinku nemá většího významu [86]. 2.3.5.1 Submerzní kultivace Metoda kultivace v tekutých substrátech se pouţívá spíše pouze pro revitalizaci kultury nebo pro různá stanovení zákalu, barvy či pro biodegradaci v tekutých substrátech, méně pak na antimikrobiální testy. Tato metoda je nevhodná k izolaci čistých kultur bakterií [86]. 2.3.5.2 Povrchová kultivace Naopak metoda kultivace na pevných médiích je vyuţívána pro zisk čistých kultur. Tato metoda je vhodná např. na různé selektivní testy, např. Endův agar, MacConkeyův agar, k diskové difuzní metodě pouţívané k zjištění inhibičního účinku antibiotik a v neposlední řadě také na počítání narostlých kolonií [86]. 2.3.6

Vyuţití mikrobiálních systémů při analytických stanoveních

2.3.6.1 Stanovení antimikrobiální aktivity Podstatou je aplikace antimikrobiální látky na začátku kultivace pro omezení růstu, resp. potlačení růstu daného mikroorganismu, případně přidání antimikrobiální látky do jiţ narostlé kultury a sledování jejího inhibičního vlivu. Je obvykle vyuţíváno diskové difuzní metody, kdy se na agarovou plotnu vloţí papírový kruh o průměru 5 mm nasáklý antimikrobiální látkou a je sledována inhibiční zóna. Alternativou je prosté nanesení roztoku antimikrobiální látky na plotnu, případně do předem vytvořené jamky. V případě stanovování antimikrobiální aktivity v tekutých médiích je vyuţíváno měření zákalu při 630 nm [52]. A) Disková difusní metoda Disková difusní metoda zahrnuje stanovení antimikrobiální aktivity pomocí antimikrobiální látkou nasyceného kotouče filtračního papíru (obvykle cca 5 mm), který se vloţí na agarovou plotnu zaočkovanou větším mnoţstvím inokula pro vytvoření jednolité vrstvy. Poté je po určitém čase inkubace sledována inhibiční zóna, tzn. okruh kolem disku, kde kultura nenarostla [85; 87]. B) Přímá aplikace vzorku na narostlé kolonie Další moţností je sledování vlivu antimikrobiální látky na jiţ narostlé kolonie, např. několik dní kultivované za vhodných podmínek. Nejčastěji je test realizován nanesením roztoku antimikrobiální látky na agarovou plotnu do předem vytvořené jamky v agaru. Rovněţ po určitém čase je moţné sledovat ústup kolonie a detekce inhibiční zóny [85]. 29

C) Testy antimikrobiální aktivity v rámci submerzní kultivace Podstatou stanovení antimikrobiálního účinku je submerzní kultivace zaočkovaných tekutých médií obsahujících určité mnoţství antimikrobiální látky ve srovnání s kontrolní baňkou, která neobsahuje ţádnou antimikrobiální látku. Zákal jednotlivých suspenzí buněk je měřen spektrofotometricky při 630 nm v 1 cm kyvetách. U kontrolní baňky bude odečtený zákal vţdy nejvyšší a se vzrůstajícím obsahem antimikrobiální látky se bude sniţovat. D) Test monitorující účinnost lýze buněk Princip tohoto stanovení vychází z podstaty účinku antibakteriálního lysozymu, kterou je schopnost katalyzovat hydrolýzu β-1,4 glykosidických vazeb peptidoglykanů, nacházejících se v buněčné stěně grampozitivních bakterií. Ze suspenze buněk, resp. z kaţdé buňky se po enzymovém rozrušení buněčné stěny uvolní její obsah do roztoku, coţ bude mít za následek zvýšení zákalu. Mnoţství 100 μl příslušného roztoku enzymu se nechá působit na suspenzi buněk zředěnou destilovanou vodou (1:10). Jako míra antimikrobiálního účinku se hodnotí změna absorbance měřená při 630 nm v 1 cm kyvetě v čase přidání (t0) a po 5 minutách (t300).

2.4

Vybrané metody analýzy, charakterizace a purifikace bílkovin

2.4.1 Spektrofotometrické určení celkového obsahu bílkovin Podstatou všech metod je reakce proteinu s činidlem příslušné metody za vzniku zbarvení, které je úměrné koncentraci proteinu (za konstantních podmínek) dle Lambert-Beerova zákona a je změřitelné pomocí spektrofotometru při známé vlnové délce, kdy dochází k maximu absorpce. Zdroj záření spektrofotometru vysílá světlo o dané vlnové délce (určitý zářivý tok Φ0) a pomocí detektoru se detekuje kyvetou prošlé záření (určitý zářivý tok Φ). Z rozdílu hodnot se vypočítá transmitance (1), tzn. relativní hodnota prošlého záření, která nabývá hodnot od nuly do jedné, případně po vynásobení stokrát pro odpovídají hodnoty v procentech [88]. (1)

T

 0

Obr. 10: Absorpce při průchodu záření kyvetou se vzorkem [88] Lambert-Beerův zákon je vztah mezi absorbancí a koncentrací dané látky. Vyjadřuje jej rovnice (2), kde A je bezrozměrná hodnota absorbance, ελ je extinkční koeficient (závislý na vlnové délce, jednotka dm3·mol-1·cm-1), l je délka optické dráhy (tloušťka kyvety, obvykle 30

1 cm) a c je koncentrace stanovované látky ve vzorku v mol·dm-3. Absorbance souvisí s transmitancí dle rovnice (3).

(2) (3)

A     l  c  konst.  c A   log T

Obr. 11: Oblast platnosti Lambert-Beerova zákona [88] Z naměřených hodnot absorbance u řady vzorků o vzrůstající koncentraci lze tak sestrojit kalibrační závislost. Lambert-Beerův zákon je splněn jen pro zředěné roztoky. Proto při pouţití příliš koncentrovaných roztoků nebo případném nadbytku barviva či činidla můţe docházet k deformaci kalibrační křivky [88]. 2.4.1.1 Metoda Hartree-Lowryho Původní metoda Lowryho z roku 1951 je zaloţena na dvousloţkovém činidle. Prvním je biuretové a druhým je Folin-Ciocalteauovo činidlo. Jde o reakci polykyselin fosfomolybdenové a fosfowolframové, které jsou redukovány tyrozinovými zbytky proteinů a barví se modře a poskytují nejvyšší absorbanci při 650 nm. V roce 1972 Hartree metodu modifikoval, kdy pouţil odlišnou kompozici činidel a metoda se tak stala citlivější [89; 90]. 2.4.2 Gelová elektroforéza Elektroforéza je obecně pouţívaná metoda pro analytické dělení a stanovení molekulové hmotnosti proteinů. Vyuţívá migrace iontů proteinů ve stejnosměrném elektrickém poli v porézním gelu, separace je tak zaloţena na rozdílné elektroforetické pohyblivosti a na velikosti molekul, dle velikosti pórů gelu. Běţně pouţívaným gelem je inertní, mechanicky pevný a průhledný polyakrylamidový gel, který skýtá moţnost přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota zesíťovaní, gradient hustoty aj.). Tento druh elektroforézy se označuje zkratkou PAGE. Mezi další metody patří elektroforéza na agarosovém gelu vhodná především pro dělení nukleových kyselin. Polyakrylamidový gel vzniká kopolymerizací akrylamidu (AA) a metylenbisakrylamidu (BIS), která je zahájena volnými radikály vzniklými při rozpadu APS (amonium persulfate, neboli peroxodisíran amonný). Radikály jsou stabilizovány přídavkem látky TEMED, coţ je tetrametyletylendiamin. Fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů jsou dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm zesíťování (stupeň lze měnit změnou poměru AA/BIS). 31

Nejčastější koncentrace AA jsou v rozmezí 3 - 15% (značeno % T), přičemţ koncentrace BIS obvykle odpovídá 5% celkového mnoţství AA (značí se % C) [89]. Uspořádání elektroforézy bývá obvykle tenkovrstvé, a to nejčastěji ve vertikální poloze podle typu aparatury. Ovšem vzorkovací pufr (přidávaný do vzorku) obsahuje Tris-HCl pufr, jehoţ pH (6,8) je zhruba o dvě jednotky niţší, neţ pH pufru dělícího gelu (8,8; 9,2). Elektrodový roztok obsahuje ovšem Tris-Glycinový pufr o pH 8,3 nebo 8,8. Podstatou je, ţe v prostředí gelu je nejpohyblivějším aniontem chloridový a pohyblivost vzorků (proteinu) je výrazně niţší. Za zónou chloridů následují zóny bílkovin seřazené podle elektroforetických pohyblivostí. Poslední zónu tvoří glycin. Takto seřazené ionty se pohybují stejnou rychlostí. Po vstupu seřazených iontů do dělícího gelu, který má vyšší pH, se glycin stává druhým nejpohyblivějším hned po chloridech. Pohyb čela se indikuje přidáním nízkomolekulárního barviva (bromfenolová modř) ke vzorku, které vytváří ostrý pruh putující s čelem. Hodnoty intenzity proudu a napětí jsou obvykle nastaveny po celou dobu elektroforézy na konstantní velikost [89]. 2.4.2.1 Laemmli-SDS-PAGE Častou variantou PAGE je elektroforéza v přítomnosti SDS, kdy jsou proteiny děleny výhradně jen dle velikosti. SDS se váţe na bílkoviny v poměru přibliţně 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny a uděluje jim uniformní náboj. Přesná povaha takto vzniklých útvarů není přesně známá, ale je pravděpodobné, ţe jde o micelární strukturu, uvnitř které dochází k nekovalentním interakcím mezi uhlovodíkovými řetězci dodecylsíranu a hydrofobními oblastmi bílkoviny. Nabité skupiny na povrchu micely jsou pak v kontaktu s pufrem. Celkový náboj částice je přitom záporný [89]. Aby tyto částice mohly vzniknout, je třeba nejprve zredukovat disulfidické můstky, např. pomocí merkaptoethanolu a proteiny celkově denaturovat i zvýšenou teplotou v rozmezí 60100 °C. Vzniklé asociáty mají uniformní záporný náboj, tvar tyčinky o konstantním průměru a délce úměrné relativní molekulové hmotnosti. Nutný je přídavek SDS jak ke vzorku, tak i do gelu. Metoda je vhodná k dělení proteinů ideálně nad 20-30 kDa. Pro separaci menších proteinů je nutno pouţít vyšších koncentrací gelu, případně je nutné pouţít např. tricinové pufry [91]. Barvení gelu pro detekci bývá běţně realizováno pomocí barviva Coomassie Brilliant Blue G250, případně stříbrem pomocí AgNO3 v případě velmi zředěných vzorků [89]. 2.4.3

Vyuţití chromatografie v dělení směsi proteinů

2.4.3.1 Princip chromatografie Chromatografie patří do analytických separačních metod. Jejím základním principem je průchod stanovované látky unášené mobilní fází (pohyblivou) a rozdělení mezi mobilní a stacionární (nepohyblivou) fází. Jednotlivé sloţky vzorku tak mohou být stacionární fází zachycovány a na určitý čas zdrţeny oproti mobilní fázi. Více se zdrţují ty sloţky, které jsou stacionární fází poutány silněji. Poté jsou v různém čase opět eluovány a na výstupu zachyceny např. on-line průtokovým detektorem nebo jako frakce a následně detekovány jiným způsobem [88].

32

2.4.3.2 Základní dělení chromatografických metod Chromatografické metody mohou být děleny podle různých parametrů, především podle skupenství mobilní fáze na kapalinovou a plynovou chromatografii, ovšem plynová chromatografie je pro separaci proteinů nevhodná. Podle uspořádání stacionární fáze se chromatografické techniky dělí na kolonovou, kdy je stacionární fáze umístěna v trubici, papírovou, kdy je stacionární fází papír a tenkovrstvou, kde jde o hliníkovou fólii potaţenou porézním materiálem. Podle povahy děje převládajícího při separaci je moţno uskutečnit základní dělení na rozdělovací chromatografii, kdy je vzorek rozdělován mezi stacionární a mobilní fázi a adsorpční, kdy je separace závislá na rozdílné schopnosti adsorbovat se na povrch stacionární fáze. Pokročilé dělení poté přechází na specifické techniky, jako jsou iontoměničová chromatografie, kde je separace řízena elektrostatickými silami mezi ionty vzorku a stacionární fází, nebo afinitní chromatografie, kdy stacionární fáze váţe pouze určité sloţky, ke kterým má vysokou afinitu, zvláštním typem je rovněţ gelová chromatografie vyuţívající gelu jako stacionární fáze a uplatňující tzv. sterické efekty (menší molekuly se zdrţují déle). Do této skupiny se zařazuje rovněţ gelová filtrace s vodnými rozpouštědly [88]. 2.4.3.3 Gelová filtrace Typ gelové chromatografie pracující na principu sterického vyloučení (SEC – „Size Exclusion Chromatography“) zahrnující pouţití vodných mobilních fází, resp. pufrů a hydrofilních gelů jako stacionárních fází. Retence sloţek roste s jejich sniţující se velikostí, resp. molekulovou hmotností. Tento typ rozdělovací chromatografie je vhodný především pro dělení látek velkých rozdílů relativních molekulových hmotností [88]. Je nejčastěji pouţívána v biochemii k oddělování sloučenin o velkém rozdílu molekulových hmotností nebo k přímému odsolování či další purifikaci proteinů. Mobilní fází je zde nejčastěji pufr, např. fosfátový, Tris-HCl či EDTA. Stacionární náplň kolony tvoří speciální hydrogel, zpravidla tzv. „Sephadex“, coţ je zesíťovaný dextran nebo „Sepharosa“, neboli zesíťovaná agarosa. Moţné je pouţití i polyakrylamidového gelu. Kaţdý nosič má své specifické pouţití a liší se velikostí pórů pro různá rozpětí molekulových hmotností dělených vzorků. Chromatograf se skládá z čerpadla a z vhodné kolony. Kolony mohou mít různou délku, vnitřní průměr a především náplň. Mezi metody detekce patří UV detektor nastavený na snímání proteinů, tzn. 280 nm v kombinaci s vodivostním detektorem umoţňující měřit změny vodivosti mobilní fáze v reálném čase [88].

33

Obr. 12: Schématické znázornění dělení a následné eluce s detekcí při gelové filtraci [92; 93] Celkový objem kolony Vtje moţné vyjádřit jako součet (4) mrtvého objemu V0 , který lze vyjádřit jako eluce největší sloţky, která není v systému nijak zadrţována, interního objemu, jakoţto objemu prostor v částicích gelu Vi, tedy objemu nízkomolekulární látky, která má přístup do všech prostor gelu a objemu zaujímající přímo částice gelu Vg, který lze stanovit experimentálně pouze jako rozdíl V0 a Vi [93]. (4)

Vt  V0  Vi  Vg

Pro všechny dělené sloučeniny vycházející z kolony v objemu Ve dle rovnice (5), tak mohou nastat pouze tři varianty, kdy distribuční koeficient σ nebo KD (6) bude nabývat hodnot od nuly do jedné (Obr. 13) [94].

(5)

Ve  V0  σVi

(6)

σ

VS Ve  V0  Vi Vi

Spojením předchozích rovnic vniká vyjádření distribučního koeficientu KD: ( 7)

34

KD 

Ve  V0 Ve  V0  Vt  V0 Vi

Obr. 13: Schématické znázornění eluce se zohledněním σ [94]

Obr. 14: Schématické znázornění zadržování nízkomolekulárních látek a vyloučení vysokomolekulárních v pórech gelu [93]

2.5

Metody enkapsulace proteinů a analýzy enkapsulovaných částic

2.5.1 Liposomové částice Liposomové částice jsou malé vesikuly tvořené hydrofobní fosfolipidovou dvojvrstvou, které mohou být uni- nebo i multilamelární. Mezi vrstvami fosfolipidů je uzavřená hydrofilní fáze, kam mohou být enkapsulovány různé polární látky. Pokud je záměrem enkapsulovat látky hydrofobní, je moţné je naopak zabudovat do lipidové dvojvrstvy. První liposomy připravil A.D. Bangham jiţ v 60. letech [95]. V následujících desetiletích byly liposomy intenzivně studovány za účelem terapeutické aplikace v podobě léčiv se zvýšenou účinností a pozvolným uvolňováním. Bylo vyvinuto několik metod přípravy a je moţné vytvořit liposomy s různým povrchovým nábojem nebo velikostí.

Obr. 15: Model liposomu [96] 35

Základní sloţkou pro přípravu liposomů je kyselina fosfatidová, resp. její estery s alkoholem, např. deriváty glycerolu, sterolu. Pro přípravu se tak pouţívá například fosfatidylcholin (lecithin), pro stabilizaci membrán se přidává cholesterol. Fosfolipidy jsou ve vodném prostředí velmi omezeně rozpustné, a tak se v takovéto disperzi reorganizují do dvojvrstev. Dvě vrstvy fosfolipidů obsahující hydrofobní řetězce se orientují těmito řetězci k sobě a hydrofilní fosfátovou hlavičkou k okolnímu vodnému polárnímu prostředí [97]. Dle struktury lze dělit liposomy na:  Malé unilamelární vesikuly (SUV) o velikosti 20 - 50 nm  Velké unilamelární vesikuly (LUV)o velikosti nad 100 nm  Multilamelární vesikuly (MLV)o velikosti 100 - 20 000 nm

Obr. 16: Typy liposomálních částic [98] Dle náboje je moţno částice dělit na:  Neutrální  Kladně nabité (kationické)  Záporně nabité (anionické) 2.5.2 Chitosanové částice Principiálně jde o polysacharidové částice tvořené z chitosanu, který je získávaný parciální deacetylací chitinu (60+ %), získávaného primárně z krunýřů raků, humrů, krevet a krabů. Chemicky jde o polymer β-1,4-D-glukosaminu, resp. o poly [β-1,4-2-amino-2-deoxyD-glukopyranosu] a jde o druhý nejrozšířenější biopolymer. Je jako jediný polysacharid kationický, díky čemuţ nespecificky interaguje s buňkami. Rovněţ jako jediný polysacharid je štěpen proteolytickými enzymy [99]. Jeho oligosacharidy vykazují slabou antimikrobiální aktivitu proti bakteriím. Má řadu biomedicínských aplikací, zahrnující především hojení ran, či nosiče pro léčiva, coţ je umoţněno, jak jiţ bylo zmíněno, jeho biokompatibilitou, kompletní biodegradabilitou a vynikající adhezivitou [100; 101; 102].

Obr. 17: Chemická struktura chitosanu [99] 36

2.5.3 Enkapsulace látek Pro enkapsulaci je obvykle potřebné definovat následující pojmy:  Enkapsulovaný objem (μl/μmol) Jde o membránou uzavřený objem látky vztaţený na jednotku lipidů.  Enkapsulační účinnost (%) Jde o podíl enkapsulované látky k jejímu původnímu mnoţství. Postup enkapsulace je závislý na konkrétní metodě přípravy určitých částic, ovšem obecně se provádí v případě liposomů přidáním fosfolipidu lecithinu a cholesterolu k roztoku enkapsulované látky, resp. přidáním chitosanu a tripolyfosfátu, s následným intenzivním rozmícháním, ideálně ultrazvukem. Enkapsulační účinnost je primárně ovlivňována enkapsulovanou látkou, ovšem svoji významnou roli zde hraje i pouţitá metoda enkapsulace. 2.5.3.1 Ultrazvuková enkapsulace K vodnému roztoku vzorku enkapsulované látky (proteinu, resp. směsi proteinů) je přidán např. sójový lecithin či lecithin získaný z vaječného ţloutku a pro stabilizaci membrán cholesterol. Tyto součásti jsou smíseny v určitém poměru a pomocí silného zdroje ultrazvuku je směs po určitý čas intenzivně promíchávána. Výsledkem je zformování liposomálních částic, které lze od původního roztoku separovat sedimentací, filtrací, či centrifugací. Příprava chitosanových částic pomocí ultrazvuku je provedením obdobná jako u přípravy liposomů, ovšem principiálně je vyuţíváno ionotropické ţelatinace kladných aminoskupin se záporným polyfosfátem (zde tripolyfosfát sodný) [100]. 2.5.3.2 Stabilita nanočástic Pro udrţení fyzikální stability částic v suspenzi je důleţitý náboj, protoţe zabraňuje agregaci částic. Z toho důvodu jsou např. neutrální částice náchylné na agregaci a následnou sedimentaci. Velikost povrchového náboje určuje zeta potenciál. Chemická stabilita můţe být narušena hydrolýzou vazeb sloţek stěny částice, případně oxidací vazeb na uhlovodíkovém konci. 2.5.4 Moţnosti aplikace a stabilizace antimikrobiálních látek Liposomy jsou netoxické, protoţe jsou přirozenou součástí všech buněk celého těla. U polysacharidových částic uţ to tak jednoduché není, neboť nejsou přirozenou látkou pro lidské tělo. Výjimkou je ale chitosan, který je díky své kationické povaze buňkami tolerovaný a takto připravené částice by mohly být pouţívány jako součást terapeutických biomedicínských prostředků [103; 104]. Primárním cílem je tyto částice udrţet stabilní, coţ je pro konečné aplikace velmi sloţité. Existuje řada metod, jak potenciální fyziologické podmínky simulovat, např. pomocí modelových roztoků/prostředí, či potravinových simulantů a na míru tak ladit částice vhodné pro danou aplikaci. Na druhou stranu relativně nízká stabilita částic je výhodu po určitá pouţití, např. jednoduché liposomy jsou v první části trávicího traktu rozloţeny vlivem nízkého pH a postupně degradovány. 2.5.5 Charakterizace částic metodou DLS Jde o metodu vyuţívající dynamického rozptylu světla (DLS), kdy je pomocí osvětlování částic vzorku laserem měřena fluktuace intenzity rozptýleného světla. Rozptyl světla je 37

tvořen právě koloidními částicemi, které se v roztoku náhodně pohybují podle Brownova pohybu. Měřením získané informace o Brownově pohybu jsou poté pomocí vhodného software převáděny do vztahu s velikostí částic [106]. Výsledkem je integrální a distribuční funkce daného souboru částic. Pomocí nástavce na kyvetu (elektrod) je moţné měřit další parametr, a to zeta potenciál (ζ-potenciál) [107].

Obr. 18: Distribuce částic dle počtu, objemu a intenzity [106; 108]

Obr. 19: Schématické znázornění rozptylu světla a jeho následné detekce [106] 2.5.5.1 Zeta potenciál Pro veškeré elektrokinetické jevy je potřeba nenulová hodnota elektrokinetického potenciálu (ζ- potenciálu), jinak by nemohla ţádná z elektrokinetických metod fungovat. Rovněţ pro stabilitu nanočástic je jeho hodnota vysoce důleţitá. Hodnota tohoto ζ-potenciálu se obvykle pohybuje od -30 mV do -100 mV u liposomů, resp. od 30 mV do 100 mV u chitosanových částic a hodnoty potenciálu okolo nuly se souhrnně nazývají hraniční ζpotenciál, kdy jsou jiţ částice málo stabilní. Potenciál je přímo ovlivňován přítomností elektrolytů [107].

38

Obr. 20: Schématické znázornení elektrostatického potenciálu [106]

39

CÍL PRÁCE

3

Cílem práce je charakterizace vybraných ţivočišných proteinů, studium jejich antimikrobiální aktivity a testování moţností jejich enkapsulace. Součástí práce je řešení následujících dílčích úkolů:

40



Optimalizace metod charakterizace a stanovení koncentrace ţivočišných proteinů pomocí elektroforetických a spektrofotometrických technik.



Otestování izolace vybraných proteinů z reálného vzorku



Charakterizace vzorků dodaných průmyslovým partnerem.



Studium antimikrobiální aktivity specifických ţivočišných proteinů na kulturách Bacillus subtilis a E. coli.



Enkapsulace ţivočišných proteinů do vybraných typů částic, analýza částic a studium jejich stability v modelových podmínkách.

4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1

Pouţité mikroorganismy

V této práci byly pro studium antimikrobiálních vlastností pouţity bakteriální kultury Bacillus subtilis CCM 2793 a Escherichia coli CCM 109 z České sbírky mikroorganismů při Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity.

Pouţité speciální chemikálie a přístroje

4.2                    

Conalbumin from chicken egg white (iron free), Sigma-Aldrich (Německo) Lysozym from chicken egg white, Serva (Německo) BSA Fraction V, Serva (Německo) Egg albumin from chicken egg white, Serva (Německo) Folin-Ciocalteau činidlo, Serva (Německo) Coomassie Brilliant blue G250, Serva (Německo) Akrylamid/N,N’-metylenbisakrylamid (Rothiphorese), Roth (Německo) Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan), Lachner (ČR) SDS, Serva (Německo) APS, Sigma-Aldrich (Německo) TEMED, Serva (Německo) Dusičnan stříbrný, Sigma-Aldrich (Německo) Thiosíran sodný, Sigma-Aldrich (Německo) Recombinant protein test mixture Dual Color pro SDS PAGE, BioRad (USA) Sephadex G-200, Pharmacia (Švédsko) Sephadex G-100, Pharmacia (Švédsko) LB (Luria-Berthani) médium, Sigma-Aldrich (Německo) Agar Powder, Himedia (India) Pepton, Himedia (India) Hovězí extrakt, Difco laboratories (USA)

Přístroje a pomůcky               

Koloidní DLS analyzátor Zetasizer ZS, Malvern (UK) IMPLEN Nanophotometer UV-VIS Nízkotlaký kapalinový chromatograf BioLogic LP, BioRad (USA) Aparatura pro elektroforézu - Mini-PRTOEAN, BioRad (USA) Aparatura pro elektroforézu - Owl P9DS, Owl Separation Systems (USA) ELISA Reader BioTek ELx808, Biotek (DE) Ultrazvukový homogenizátor Sonopuls HS3200, Bandeline Ultrazvuková lázeň PS02000 (ČR) Laminární box Aura mini, Bioair Centrifuga Boeco U-32R, Hettich Zentrifugen, (Německo) Centrifuga Laboratotzentrifugen 3-15, Sigma (Německo) Vortex, TK3S, Kartell spa (USA) Termostat LS-35, (ČR) a termostat IP 60, LTE Scientific, (Německo) Temperovaná třepačka Heidolph Unimax 1010, Labicom (ČR) Analytické váhy, Boeco, (Německo) 41

4.3

Spektrofotometrické stanovení koncentrace proteinů a peptidů

V rámci optimalizace metod stanovení proteinu ovotransferinu a lysozymu byla vybrána jedna metoda kvantitativní analýzy proteinů, která se jeví jako nejvhodnější a to stanovení celkového obsahu proteinů dle Hartree-Lowryho [90]. Jako srovnávací protein byl pouţit komerční bovinní albumin (BSA, Fraction V) ve formě lyofilizátu (SERVA), velmi čistý komerční ovotransferin (SIGMA) a komerční lysozym (SERVA). Nakonec bylo také proměřeno absorpční spektrum v UV části spektra u všech proteinů včetně referenčního BSA pro přibliţné zjištění intenzity absorpce při 280 nm pro detekci výstupu z chromatografické kolony u gelové permeační chromatografie. Kalibrační závislost koncentrace proteinu na absorbanci byla sestrojena na základě dat získaných měřením absorbance roztoků o známé koncentraci (po reakci s příslušnými činidly) na spektrofotometru při vlnové délce odpovídající pouţité metodě. Ředění roztoků bylo provedeno destilovanou vodou a ve všech případech byla zvolena širší série kalibračních standardů pro omezení náhodných fluktuací hodnot a hrubých chyb. 4.3.1 Metoda dle Hartree-Lowryho Byl připraven zásobní roztok kaţdého proteinu o koncentraci 300 µg/ml a z něj byla vytvořena série kalibračních standardů o koncentraci v rozmezí 30-120 µg/ml. Do kaţdé zkumavky bylo přidáno 0,9 ml Hartree-Lowryho činidla A a roztoky byly inkubovány při 50 °C po dobu 10 minut. Po inkubaci byly ochlazeny na laboratorní teplotu a po přidání 0,1 ml činidla B byly ponechány 10 minut při laboratorní teplotě. Nakonec bylo přidáno mnoţství 3 ml činidla C (čerstvě zředěné Folin-Ciocalteauovo činidlo 1:15) a opět inkubováno při 50 °C po dobu 10 minut. Následně byla na spektrofotometru změřena absorbance při 650 nm proti slepému vzorku neobsahujícímu protein. HL činidlo A: na přípravu 100 ml činidla A bylo připraveno a smícháno následující mnoţství chemikálií: [89; 90]  10 g uhličitanu sodného  1 g vínanu sodno-draselného (tetrahydrátu)  50 ml hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol·dm-3 Po rozpuštění uhličitanu a vínanu v hydroxidu byla směs doplněna na 100 ml dest. vodou. HL činidlo B: na přípravu 100 ml činidla B bylo připraveno a smícháno následující mnoţství chemikálií: [89; 90]  1 g pentahydrátu síranu mědnatého  2 g vínanu sodno-draselného (tetrahydrátu)  10 ml hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol·dm-3 Po rozpuštění skalice a vínanu v hydroxidu byla směs doplněna na 100 ml dest. vodou. HL činidlo C: příprava činidla C byla v nezbytném v mnoţství realizována naředěním komerčního Folin-Ciocalteau činidla (SERVA) s vodou v poměru 1:16: [89; 90]

42

4.4

SDS-PAGE (Laemmli)

Příprava vertikální elektroforézy s pufry podle Laemmliho probíhala podle protokolu firmy Bio-Rad pro PAGE [109], modifikovaným na základě zavedeného postupu [110] pro daný typ elektoforetické aparatury (Owl P9DS). Na rozdíl od pouţitého 40% roztoku AA/BIS byl v této práci pouţit komerční 30% roztok akrylamid/bisakrylamid Rothiphorese od firmy Roth a celkový postup ředění byl upraven s vyuţitím protokolu firmy Bio-Rad pro docílení koncentrace gelu 12,5 %. Pro potřeby elektroforézy byla pouţita ultračistá deionizovaná voda dle standardu ISO 3696:1987 [111]. Gel o poţadované koncentraci 12,5% byl připraven následujícím způsobem s vyuţitím ultračisté vody, komerčního 30% roztoku akrylamidu, gelového separačního Tris-HCl pufru a 10% roztoku SDS. Polymerizace byla iniciována ihned po přidání TEMED, 10% roztokem čerstvě připraveného APS. 4.4.1.1 Příprava 12,5% polyakrylamidového gelu Na přípravu 40,26 ml roztoku (1 gel) bylo připraveno následující mnoţství chemikálií a smíseno v přesném pořadí:  16,7 ml akrylamidu (Rothiphorese 30% AA)  12,9 ml ultračisté deionizované vody  10,0 ml gelového separačního Tris-HCl pufru o pH 8.8 Směs byla 5 minut ultrazvukována pro eliminaci rozpuštěného kyslíku.  0,40 ml 10% SDS Rychle byla přidána kombinace TEMED/APS a roztok byl nadávkován do aparatury.  0,06 ml TEMED  0,20 ml 10% APS Jako proteinový standard byl zvolen komerční proteinový standard Dual Color pro SDS PAGE od firmy BioRad. Elektroforéza probíhala za podmínek 100 V, 400 mA a za doby nutné k rozdělení i nejmenšího ze studovaných proteinů lysozymu, tzn. cca 180-210 minut. Barvení gelu bylo provedeno standardně pomocí Coomassie Briliant Blue G250 a odbarvení pomocí organického činidla skládajícího se z kyseliny octové, methanolu a vody. Otestováno bylo i barvení pomocí stříbra (AgNO3). 4.4.1.2 Složení elektroforetických pufrů Elektrodový pufr (koncentrovaný): [110] Elektrodový pufr byl vţdy pro potřeby elektroforézy ředěn na 10% roztok, který byl v mnoţství cca 800 ml nalit do prostor elektroforetické aparatury. Na přípravu 1000 ml koncentrovaného elektrodového pufru bylo připraveno následující mnoţství chemikálií:  3 g Tris  14,4 g glycinu  1 g SDS  1000 ml ultračisté deionizované vody

43

Gelový separační pufr: [110] Udávané pH roztoku bylo ověřeno pomocí pH metru. Na přípravu 100 ml gelového TrisHCl pufru o pH 8,8 bylo připraveno následující mnoţství chemikálií:  18,1 g Tris  100 ml ultračisté deionizované vody  2,7 ml kyseliny chlorovodíkové (35%) Vzorkový pufr: Vzorkový pufr byl přidáván v poměru 1:1 ke vzorku charakterizovaného proteinu a směs byla před nadávkováním na gel 4 min povařena na vodní lázni. Na přípravu 10 ml vzorkového pufru bylo připraveno následující mnoţství chemikálií:  5 ml glycerolu (bezvodý)  2,13 ml 0,5M Tris-HCl o pH 6,8  2,56 ml β-merkaptoethanolu  1 mg bromfenolové modři  1 g SDS  Doplněno na 10 ml ultračistou deionizovanou vodou 4.4.1.3 Barvení pomocí Coomassie G250 Rozdělený gel byl zbaven skel a přenesen do připravené barvící nádoby. Zde byl překryt nezbytným mnoţstvím barvícího roztoku a na 15 min ponechán třepat na třepačce při 90120 ot./min. Po 15 minutách byl gel promyt odbarvovacím činidlem a v novém odbarvovacím činidle byl vţdy odbarvován přes noc do druhého dne. Barvící činidlo: Na přípravu 100 ml barvícího činidla Coomassie bylo připraveno následující mnoţství chemikálií:  50 ml methanolu  40 ml destilované vody  10 ml kyseliny octové (99,8%)  0,25 g Commassie Brilliant Blue G250 Odbarvovací činidlo: na přípravu 500 ml odbarvovacího činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií.  250 ml destilované vody  200 ml methanolu  50 ml kyseliny octové (99,8%) 4.4.1.4 Barvení stříbrem Barvení bylo realizováno modifikovaným postupem vzniklým kombinací několika zavedených postupů a zavedených protokolů [112; 113; 114; 115]. Rozdělený gel byl opět zbaven skel a opatrně přenesen do připravené barvící nádoby. Gel byl v barvící nádobě překryt nezbytným mnoţstvím fixačního činidla a fixován minimálně 1,5-2 h. Poté byl třikrát po 10 minutách promyt vţdy čistým promývacím činidlem. Nakonec byl důkladně promyt ultračistou deionizovanou vodou a přesně na 1 minutu převrstven senzibilizačním roztokem. Po této proceduře byl opět důkladně promýt vodou. 44

Na 20 minut byl gel ponechán k barvení ochlazeným roztokem dusičnanu stříbrného a formaldehydu, kdy po tomto kroku byl před samotným vyvíjením několikrát promyt vodou. Samotné vyvíjení začíná ihned po převrstvení vyvíjecím činidlem. Vyvíjení bylo ukončeno přibliţně po dvou minutách, aţ byl výsledek vybarvení uspokojující. Nakonec byl gel promyt terminačním roztokem a vizualizován na skeneru. Pozn. Gel by neměl po celou dobu procedury přijít do styku s kovovým předmětem ani s kůţí, zároveň se nedoporučuje pouţívat stejné roztoky opakovaně pro moţnost kříţové kontaminace dalšího gelu. Fixační činidlo: na přípravu 500 ml fixačního činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií:  250 ml methanolu  60 ml kyseliny octové (99,8%)  0,24 ml formaldehydu (37%)  Doplněno na 500 ml ultračistou deionizovanou vodou Promývací činidlo: na přípravu 500 ml promývacího činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií.  100 ml methanol  400 ml ultračisté deionizované vody Senzibilizační činidlo: na přípravu 500 ml senzibilizačního činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií.  63,7 mg thiosíranu sodného  500 ml ultračisté deionizované vody Barvící činidlo: Činidlo bylo vţdy připraveno čerstvé a před pouţitím vychlazeno na 4 °C. Formaldehyd byl přidáván vţdy těsně před pouţitím činidla. Na přípravu 250 ml barvícího činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií.  0,5 g dusičnanu stříbrného  0,179 ml formaldehydu (37%)  Doplněno na 250 ml ultračistou deionizovanou vodou Vyvíjecí činidlo: na přípravu 500 ml vyvíjecího činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií.  30 g uhličitanu sodného (bezvodý)  0,237 ml formaldehydu (37%)  2 ml senzibilizačního činidla  Doplněno na 500 ml ultračistou deionizovanou vodou Terminační činidlo: na přípravu 500 ml terminačního činidla bylo připraveno následující mnoţství chemikálií.  440 ml destilované vody  60 ml kyseliny octové (99,8%) 45

4.5

Rozdělení proteinů pomocí gelové filtrace

Dělení reálných proteinových vzorků bylo provedeno na 300x16 mm chromatografické vertikální koloně s porézní náplní Sephadex G100 (Pharmacia). Vyuţito bylo LPLC aparatury od firmy Bio-Rad se směšovačem mobilních fází, peristaltickým čerpadlem a frakčním kolektorem. Detekce byla realizována pomocí průtokové UV detekční cely, s vlnovou délkou nastavenou na 280 nm (absorpční maximum proteinů) v tandemu s vodivostním detektorem vyuţívaným pro detekci celkového elučního času, resp. objemu kolony pomocí malého mnoţství NaCl. Vaječný bílek jakoţto reálná směs proteinů byl před nanesením na kolonu oddělen od ţloutku a 10x zředěn destilovanou vodou, pro vysoký obsah vysokomolekulárních mukoidních sloučenin byl rovněţ přefiltrován přes filtrační papír KA-1. Poté byl nanesen v mnoţství 1 ml na kolonu a chromatogram byl zaznamenán pomocí software LP Data View. Jednotlivé frakce o objemu 3,75 ml byly jímány pomocí automatického frakčního kolektoru do 10 ml zkumavek. Získaný chromatogram byl porovnán s výsledky dělení modelové směsi vaječných proteinů skládající se z ekvimolární směsi vaječného albuminu, ovotransferinu a lysozymu o celkové koncentraci proteinů 3 mg/ml ve vzorku. Výsledky byly získány za stejných podmínek dávkování vzorku v mnoţství 1 ml při průtoku 0,25 ml/min a s obsahem pomocné sloţky NaCl v mnoţství 10 mg/ml. 4.5.1 Volba stacionární fáze (kolony) Jako stacionární fáze byl zvolen v souvislosti se záměrem dělit proteinové vzorky do 100 kDa nosič Sephadex G100 (Pharmacia) s udávaným rozsahem dělení 4-100 kDa. Porézní sypký materiál s velikostí částic 40-120 μm byl naváţen v mnoţství 1 g na 15-20 ml kolony a po 5 minutách vystavení ultrazvuku ponechán k bobtnání přes noc. Po vytvoření hydrogelu byla kolona v dostatečném mnoţství naplněna a následně ekvilibrována mobilní fází [18]. 4.5.2 Volba mobilní fáze Jako mobilní fáze byla testována dvojice pufrů. Fosfátový pufr o koncentraci 100 mM byl připravený naváţením směsi příslušných fosforečnanů. Dalším pufrem byl zvolen Tris-HCl o koncentraci 50 mM, [18] který byl připraven rozpuštěním tris(hydroxymethyl)aminomethanu v deionizované vodě s přídavkem 2,5 ml 35% HCl. Průtok mobilní fáze byl zajištěn peristaltickým čerpadlem a testován v rozmezí 0,25-1 ml/min. Nakonec byl průtok optimalizován na 0,25 ml/min. Doba analýzy byla při tomto průtoku 210 min. Příprava mobilní fáze A – 100 mM fosfátového pufru (pH 7): bylo připraveno následující mnoţství chemikálií a rozpuštěno ve vodě, hodnota pH byla ověřena pH metrem [116]  6,60 g dihydrogenfosforečnanu sodného (dihydrátu)  20,66 g hydrogenfosforečnanu sodného (dekahydrátu)  1000 ml ultračisté deionizované vody Příprava mobilní fáze B – 50 mM Tris-HCl pufru (pH 8): [117]  6,06 g tris(hydroxymethyl)aminomethanu  2,5 ml HCl (35%)  1000 ml deionizované vody

46

4.5.3 Zakoncentrování získaných frakcí pomocí ultrafiltrace Z důvodu aplikace pouze 1 ml vzorku na kolonu v kombinaci s nastaveným průtokem 0,25 ml/min byly získány velmi zředěné frakce o objemu 3,75 ml, proto bylo nutné získané frakce zakoncentrovat. Samotná koncentrace byla realizována pomocí centrifugačních zkumavek s membránou o „cut-off“ 1 kDa, na kterých bylo 3 ml vzorku desetkrát zakoncentrováno na 0,3 ml a tento koncentrát byl podroben analýze pomocí SDS-PAGE s následným barvením pomocí stříbra i Coomassie Brilliant Blue G250. Pro rozsáhlejší pouţití by bylo vhodné vzorky pro zakoncentrování ještě lyofilizovat.

4.6

Testování antimikrobiálního účinku

Jako testovací modelové mikroorganismy pro sérii antimikrobiálních testů byly zvoleny: 1) grampozitivní bakterie B. subtilis a 2) gramnegativní bakterie E. coli. 4.6.1 Kultivace Bacillus subtilis Kultura B. subtilis byla dlouhodobě uchovávána v podobě kříţového roztěru na agarové plotně při 4 °C v lednici. Vţdy před samotnou kultivací bylo připraveno z dlouhodobě uchovávané kultury inokulum zaočkováním sterilního příslušného tekutého média v laminárním boxu očkovací kličkou pomocí stěru z agarové plotny. Zaočkované tekuté médium bylo poté inkubováno 24h v termostatu při 30 °C za stálého třepání s intenzitou 120 ot./min. 4.6.1.1 Živná média Pro kultivaci bakteriální kultury B. subtilis bylo pouţito médium o následujícím sloţení (Tab. 10). V případě submerzní kultivace bylo pouţito médium o stejném sloţení bez přídavku agaru. Tab. 10: Sloţení tuhých i tekutých ţivných médií [91] Mnoţství na 50 ml Mnoţství na 500 ml Látka tekutého média tuhého/tekutého média Agar -g 10 g / - g Pepton 0,25 g 2,5 g Beef extract 0,15 g 1,5 g 0,0005 g 0,005 g MnSO4 H2O Destilovaná voda 50 ml 500 ml Sterilizace probíhala v tlakovém hrnci 30-50 minut. Inokulum kultury B. subtilis bylo zočkováno z uchovávaného média do 50 ml sterilního média ve 100 ml Erlenmayerově baňce. Z připraveného inokula byly po 24 hodinách zaočkovány (po 0,4 ml kultury) pevné agarové plotny a byly připraveny 10krát zředěné roztoky kultury pro zákalové stanovení antimikrobiální aktivity lysozymu a lysozym obsahujících vzorků. Agarové plotny byly kultivovány rovněţ v termostatu při teplotě 30 °C a následně pouţity pro stanovení antimikrobiální aktivity studovaných proteinů.

47

4.6.2 Kultivace Escherichia coli Kultura E. coli byla dlouhodobě uchovávána rovněţ na agarové plotně při 4 °C. Vţdy před samotnou kultivací bylo analogicky jakou předchozího mikroorganismu připraveno z dlouhodobě uchovávané kultury inokulum zaočkováním sterilního tekutého média v laminárním boxu. Zaočkované tekuté médium bylo poté inkubováno 24 hodin ve speciálním termostatu při 37 °C bez třepání. 4.6.2.1 Živná média Pro kultivaci bakteriální kultury E. coli bylo pouţito komerční Luria-Berthani médium (Sigma-Aldrich) obsahující 10 g/l tryptonu, 5 g/l kvasničného extraktu a 5 g/l NaCl. V případě tuhého média s přídavkem agaru 20 g/l [118]. Tab. 11: Sloţení tuhých i tekutých ţivných médií [118] Mnoţství na 50 ml Látka tekutého média Agar Lysogeny Broth Medium (LB) 1,25 g Destilovaná voda 50 ml

Mnoţství na 500 ml tuhého/tekutého média 10 g / 12,5 g 500 ml

Sterilizace probíhala rovněţ v tlakovém hrnci 30-50 minut. Inokulum kultury E. coli bylo zočkováno z uchovávaného média do 50 ml sterilního média ve 100 ml Erlenmayerově baňce. Kultivace proběhla při teplotě 37 °C. Z takto připraveného inokula byly po 24 hodinách zaočkovány (po 0,4 ml kultury) pevné agarové plotny, které byly kultivovány v termostatu při teplotě 37 °C a následně pouţity pro stanovení antimikrobiální aktivity. Kalibrační závislost koncentrace sušiny a růstová křivka pouţitých mikroorganismů U pouţitých mikroorganismů byla sestrojena závislost zákalu při 630 nm na koncentraci sušiny pro pozdější pouţití při vyhodnocení submerzních antimikrobiálních testů. Zároveň byla stanovena růstová křivka obou mikroorganismů. Růstová křivka byla sestrojena pomocí série odběrů s následným měřením zákalu při 630 nm, vţdy po 4 h, resp. noční měření nebylo realizováno. Data pro tvorbu kalibrační závislosti byla získána pomocí gravimetrického stanovení 10 ml reprezentativního vzorku sušiny, kdy byl odebraný vzorek vysušen při 80 °C v sušárně na předem zváţených analytických vahách s přesností na čtyři desetinná místa a následně zváţen po vysušení. Obě hmotnosti byly od sebe odečteny a přiřazeny k paralelně změřenému zákalu kultury v době odebrání. Pro další data byla tato kultura ředěna v rozsahu 3,0-0,3 ml a koncentrace sušiny byla vypočítána aritmeticky z gravimetricky stanovené koncentrace sušiny. 4.6.3

48

4.6.4

Antimikrobiální testy

4.6.4.1 Testy antimikrobiální aktivity na pevných médiích Pro studium antimikrobiální aktivity byly ze sterilní vody připraveny sterilní roztoky antimikrobiálních látek a vhodnou metodou aplikovány na narostlé kolonie ve vysterilovaném laminárním boxu. Metody aplikace vzorků na plotny byly následující: Do předem připravené jamky vytvořené 1 ml sterilní špičkou od pipety bylo napipetováno sterilní mikropipetou 2,5 μl vzorku a po 24 h byla odečtena inhibiční zóna. Pro kontrolu byla do zvláštní jamky aplikována ve stejném mnoţství sterilní voda pouţitá pro přípravu roztoků. Druhou metodou byla aplikace vzorkem nasycených filtračních papírků 5 mm průměru. Tyto disky obsahující vzorek byly pomocí nad plamenem opálené pinzety aplikovány na agarové plotny a rovněţ byla sledována inhibiční zóna. 4.6.4.2 Testy antimikrobiální aktivity v tekutých médiích Testy antimikrobiální aktivity prováděné v rámci submerzní kultivace byly realizovány připravením série 100 ml baněk obsahující 50 ml média, které byly zaočkovány 1 ml suspenze buněk inokula a přidán příslušný roztok antimikrobiální látky mnoţství 0,25 ml. Rovněţ byla pro kontrolu vţdy kultivována kontrolní baňka obsahující přídavek 0,25 ml sterilní vody pouţité pro přípravu roztoků antimikrobiálních látek. Pro zvýšení účinku ovotransferinu byly do všech médií přidány hydrogenuhličitanové ionty v koncentraci 40 mM. 4.6.4.3 Testy antimikrobiální aktivity monitorující kinetiku lýzy buněk G+ bakterií Princip tohoto stanovení vychází z podstaty účinku antibakteriálního lysozymu, kterou je schopnost katalyzovat hydrolýzu β-1,4 glykosidických vazeb peptidoglykanů, nacházejících se v buněčné stěně grampozitivních bakterií. Ze suspenze buněk, resp. z kaţdé buňky se po enzymovém rozrušení buněčné stěny uvolnění jejich obsah do roztoku coţ bude mít za následek teoretické zvýšení zákalu. Pro tuto variantu antimikrobiálního testu byla připravena suspenze buněk z inokula zředěná 1:10 destilovanou vodou a zmraţena pro pozdější stanovení. Po rozmrazení buněčné kultury byl ověřen počáteční zákal, resp. homogenita suspenze postupně u všech vzorků při 630 nm v 1,5 ml kyvetě proti destilované vodě jako blanku. Vlastní antimikrobiální test byl proveden přidáním 100 μl příslušného roztoku enzymu v destilované vodě přímo do kyvety s 10krát zředěnou kulturou a odečtena hodnota absorbance při 630 nm v čase t0. Poté byl po 3 minutách zkontrolován zákal a po 5 minutách (t300) byla odečtena konečná hodnota zákalu. Odečtením t0 od t300 vznikla relativní porovnatelná antimikrobiální účinnost reprezentovaná rychlostí lýzy buněk. 4.6.4.4 Stanovení cytotoxicity na eukaryotických buněčných kulturách Na kultuře kvasinky Saccharomyces cerevisiae (106 buněk) byla pro srovnání stanovena cytotoxicita s vyuţitím kolorimetrického komerčního kitu Toxicology Assay kit XTT based (Sigma) zaloţeného na redukci sodné soli tetrazolia (XTT - sodium 2,3,-bis(2-methoxy-4nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium) na oranţový derivát formazanu, která je způsobena mitochondriálními dehydrogenázami buněk. Vzorek antimikrobiálního proteinu, resp. směsi proteinů byl přidán v mnoţství 200 μl k 800 μl kultury a k vzniklému roztoku bylo přidáno XTT barvivo v mnoţství 200 μl. Po 49

dvouhodinové inkubaci byla směs promíchána, dávkována na mikrotitrační destičku a s vyuţitím spektrofotometru ELISA readeru byla odečtena hodnota absorbance při 450 a 630 nm. Společně byly inkubovány i vzorky pozitivní kontroly obsahující jako cytotoxické činidlo pufr s obsahem EDTA a metkaptoethanolu a negativní kontroly obsahující namísto vzorku čistou vodu [119].

4.7

Enkapsulace

4.7.1 Příprava liposomů Jako nejvhodnější metoda přípravy liposomových částic byla na základě předchozích prací [91] zvolena příprava částic pomocí ultrazvuku. Připravený roztok proteinu, resp. směsi proteinů v mnoţství 20 ml a koncentraci 1 mg/ml byl v kádince smíchán s naváţeným mnoţstvím sojového lecitinu a cholesterolu (Tab. 12). Směs byla poté vystavena ultrazvukové sonikaci po dobu jedné minuty. Zároveň byla provedena kontrola pouze s 20 ml čisté vody. Před kaţdou sonikací byl z kaţdého roztoku odebrán 1 ml pro stanovení celkového mnoţství proteinů před enkapsulací pomocí Hartree-Lowryho metody a byla vypočítána enkapsulační účinnost. Tab. 12: Mnoţství přidávaných chemikálií (liposomové částice) 450 mg Lecitin 50 mg Cholesterol 4.7.2 Příprava polysachridových částic Jako zástupce polysacharidových částic byly vybrány chitosanové částice připravované rovněţ pomocí ultrazvuku. Připravený roztok proteinu, resp. směsi proteinů v mnoţství 20 ml a koncentraci 1 mg/ml byl v kádince smíchán s chitosanem v mnoţství dle tab. 13. Pro celkové rozpuštění chitosanu bylo nutné přidat 0,25 ml kyseliny octové. Směs byla poté vystavena ultrazvukové sonikaci po dobu jedné minuty, kdy byl po malých dávkách (cca po 1 ml) přidáván tripolyfosfát sodný. Zároveň byla provedena kontrola pouze s 20 ml čisté vody. Před kaţdou sonikací byl z kaţdého roztoku odebrán 1 ml pro stanovení celkového mnoţství proteinů před enkapsulací pomocí Hartree-Lowryho metody a vypočítaní enkapsulační účinnosti. Tab. 13: Mnoţství přidávaných chemikálií (chitosanové částice) 125 mg Chitosan 0,25 ml Kyselina octová (99,8%) 2 ml Tripolyfosfát sodný (2%) 4.7.3 Stanovení enkapsulační účinnosti Enkapsulační účinnost byla vyhodnocena pomocí stanovení celkových neuzavřených proteinů dle Hartree-Lowryho, kdy byl v roztoku nad dekantovanými částicemi stanoven obsah neenkapsulovaných volných proteinů s vyuţitím předem získané kalibrační závislosti, načeţ odečtením od prvotního celkového mnoţství před enkapsulací byla stanovena hodnota enkapsulovaných proteinů.

50

Enkapsulační účinnost (v %) byla spočítána jako podíl enkapsulovaného mnoţství k celkovému mnoţství v původním roztoku, které bylo stanoveno bdobným způsobem z 1 ml části vzorku odebraných ještě před samotnou sonikací. 4.7.4 Měření parametrů částic pomocí DLS Připravené částice byly analyzovány koloidním analyzátorem Malvern Zetasizer ZS a byla zjištěna distribuce velikosti částic pomocí technologie DLS. Proměřeny byly vzorky liposomových částic, chitosanových částic a vzorků umístěných v modelových podmínkách simulující fyziologické podmínky pod dobu 24 h. Vţdy byla u kaţdých vzorků měřena i kontrolní skupina částic připravených pouze s vodou, tedy s neuzavřeným proteinem. Pro potřeby měření na koloidním analyzátoru byly vzorky vţdy 100krát zředěny. 4.7.4.1 Distribuce velikosti částic a zeta potenciál Do kyvety byl umístěn stokrát zředěný vzorek enkapsulovaných částic. Poté byla kyveta umístěna do DLS přístroje a byla zjištěna distribuce velikosti částic. Poté v druhém měření byl s přidaným elektrodovým nástavcem změřen zeta potenciál. Výsledky byly zaznamenány a porovnány. Stabilita byla odvozena z hodnot zeta potenciálu a porovnána s referenční hodnotou částic s neuzavřeným proteinem. 4.7.5 Studium stability enkapsulovaných částic v modelových podmínkách Jako modelové prostředí pro studium stability částic byl zvolen fyziologický roztok, tedy 0,9% roztok NaCl ve vodě. Částice byly umístěny do tohoto roztoku na 24 h při 37 °C a byla nepřímo změřena stabilita pomocí stanovení zeta potenciálu ve srovnání s měřením v čase před umístěním a ve srovnání s referenční hodnotou částic bez enkapsulovaného proteinu. Zároveň byla zjištěna i změna distribuce velikosti částic a indexu polydisperzity.

51

5

VÝSLEDKY A DISKUSE

5.1

Optimalizace metod stanovení koncentrace proteinů konvenčními metodami

5.1.1 Kalibrační závislosti Kalibrační závislosti absorbance naměřené při 650 nm na koncentraci proteinu byly sestrojeny na základě postupu stanovení celkových proteinů metodou dle Hartree – Lowryho popsaného v metodické části (4.3.1). Kaţdá hodnota kalibrační závislosti byla měřena třikrát a grafy jsou sestrojeny z aritmetického průměru těchto hodnot. Zohlednění statistických nepřesností není pouţito z důvodu minimální směrodatné odchylky naměřených dat. Do kalibračních závislostí byl zanesen i bod [0; 0] pro zjednodušení aproximace dat a v tom případě i rovnice přímky lineární regrese, která tak obsahuje pouze směrnici. Ve všech případech byla zvolena širší série kalibračních standardů pro omezení náhodných fluktuací hodnot a hrubých chyb. 5.1.1.1 Stanovení proteinů dle Hartee – Lowryho Z naměřených hodnot je patrné, ţe zvolená metoda vykazuje v pouţitém rozsahu koncentrací proteinu lineární průběh a v případě referenčního bovinního albuminu vykazuje parametry pouţitelné jako standardní hodnoty pro další stanovení.

BSA 0,4

A650 [-]

0,3

y = 3,0992x R² = 0,9977

0,2

0,1

0,0 0,00

0,02

0,04

0,06 0,08 c [mg/ml]

0,10

0,12

0,14

Obr. 21: Kalibrační závislost koncentrace bovinního albuminu na absorbanci při 650 nm získaná stanovením dle Hartree – Lowryho Získané kalibrační závislosti v případě lysozymu vykazují vyšší hodnoty absorbance a strmější průběh, coţ je pravděpodobně způsobeno vyšším obsahem tyrosinových zbytků ve struktuře lysozymu či menším stíněním těchto struktur v malé molekule jako je lysozym. Tento fakt potvrzují i výsledky absorpčních spekter, kdy lysozym vykazuje velmi vysokou absorpci při 280 nm.

52

Pro srovnání u ovotransferinu není nárůst absorbance natolik významný jako u lysozymu, ale je rovněţ patrný. Celkově ovšem pouţitá kolorimetrická metoda vykazuje lineární průběh a je aplikovatelná i u obou dalších proteinů.

Lysozym

0,6

0,5 y = 4,5021x R² = 0,9971

A650 [-]

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,00

0,02

0,04

0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 c [mg/ml] Obr. 22: Kalibrační závislost koncentrace vaječného lysozymu na absorbanci při 650 nm získaná stanovením dle Hartree – Lowryho

Ovotransferin

0,5

A650 [-]

0,4 y = 3,4336x R² = 0,9957

0,3 0,2 0,1 0,0 0,00

0,02

0,04

0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 c [mg/ml] Obr. 23: Kalibrační závislost koncentrace vaječného ovotransferinu na absorbanci při 650 nm, získaná stanovením dle Hartree – Lowryho

53

Absorbance (A)

Absorbance (A)

5.1.2 Stanovení absorpčního spektra Z absorpčního spektra kaţdého proteinu je patrné, při jaké vlnové délce daný protein absorbuje a v jakém mnoţství se dané sloţky (chromofory) způsobující absorpci v proteinu nacházejí. Při 280 nm absorbují převáţně aromatické sloučeniny, které jsou v lysozymu pravděpodobně lépe přístupné a vykazují vyšší absorpci UV záření neţ v případě albuminu, který je větší a část aromatických skupin můţe být stíněna uvnitř molekuly [89]. Jak lysozym, tak albumin patří ke globulárním proteinům, u nichţ je zastoupení aromatických aminokyselin přibliţně stejné [89]. Pod 240 nm absorbují převáţně disulfidické můstky a aminokyseliny obsahující disulfidické můstky (Cys), případně další struktury jako fenolické (Tyr, Phe) a heterocyklické (His) skupiny. Nejblíţe hodnotě 205 nm vykazují absorpční maximum peptidické vazby.

54

2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 200,0

2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 200,0

Bovinní sérový albumin 1 mg/ml 0,25 mg/ml

250,0

300,0 350,0 Vlnová délka (nm) Obr. 24: UV absorpční spektrum albuminu při 200-400 nm

400,0

Ovalbumin 1 mg/ml 0,25 mg/ml

250,0

300,0 350,0 Vlnová délka (nm) Obr. 25: UV absorpční spektrum ovalbuminu při 200-400 nm

400,0

Absorbance (A) Absorbance (A)

2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 200,0

2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 200,0

Lysozym 1 mg/ml 0,25 mg/ml

250,0

300,0 350,0 Vlnová délka (nm) Obr. 26: UV absorpční spektrum lysozymu při 200-400 nm

400,0

Ovotransferin 1 mg/ml 0,25 mg/ml

250,0

300,0 350,0 Vlnová délka (nm) Obr. 27: UV absorpční spektrum ovotransferinu při 200-400 nm

400,0

5.1.3 Stanovení obsahu bílkovin ve vzorcích dodaných průmyslovým partnerem Celková koncentrace proteinů ve vzorku byla určena na základě Hartree – Lowryho kolorimetrické metody analogicky k postupu sestrojení kalibračních závislostí. Naměřená absorbance byla s vyuţitím příslušné kalibrační rovnice převedena na koncentraci v mg/ml. Pro stanovení koncentrace byla pouţita kalibrační závislost pro ovotransferin, protoţe lépe odpovídá charakteru vaječnému bílku, neţ bovinní sérový albumin, který je pouţíván jako referenční běţně. Absorpční maximum ovotransferinu při 280 nm, a tedy pro kolorimetrické

55

stanovení dostupný obsah aromatických aminokyselin jsou podobné vaječnému ovalbuminu, který je ve vejci dominantní. Z naměřených výsledků vyplývá, ţe tablety dodané průmyslovým partnerem obsahují proteiny v mnoţství asi 8,77 a 10,16 % z hmotnosti tablety (Tab. 14), kdy vyšší hodnoty dosahovala tableta se šalvějí, coţ mohlo být způsobeno mimo jiné i touto přísadou. Dodané komerční vzorky komplexních či částečně purifikovaných proteinů obsahují kolem 98% bílkovinného podílu (Tab. 15). Tab. 14: Výsledky stanovení koncentrace bílkovin v tabletách Naváţka tablety Zjištěný obsah proteinů Procentuální obsah [mg] v naváţce [mg] proteinů [%] Tableta se šalvějí a vit. C 692,1 63,49 9,17 Tableta s vit. C 724,1 59,02 8,15 Tab. 15: Výsledky stanovení koncentrace bílkovin ve vzorcích od průmyslového partnera Zásobní roztok Zjištěný obsah proteinů Procentuální obsah [mg/ml] v 1 ml [mg] proteinů [%] „Conalbumin“ 1,0100 0,9902 98,04 Lyofilizovaný bílek 1,0300 1,0057 97,65

5.2

Identifikace proteinů pomocí SDS-PAGE

Metoda SDS-PAGE byla provedena dle postupu uvedeného v kapitole (4.4). Namísto pouţití 40% vlastního roztoku ředěného akrylamidu a bisakrylamidu k namíchání 12,5% gelu byl pouţit komerční roztok 30% akrylamidu (37,5:1) Rothiphorese od firmy Roth a obsah dalších komponent gelu byl pro tento roztok přepočítán na základě manuálu k elektroforetické sadě Mini Protean od firmy Bio-Rad [109]. Proteinové komerční standardy a lyofilizované vzorky od průmyslového partnera byly shodně připraveny v mnoţství 1 mg/ml, aby bylo moţné srovnání jejich čistoty. Dávkování vzorků na gel bylo provedeno v mnoţství 5-25 μl. V případě mnoţství standardu Bio-Rad Dual Color bylo z důvodu velmi dobrých výsledků i při niţších mnoţstvích sníţeno dávkování na 5 μl. Elektroforéza probíhala za podmínek 100 V, 400 mA a po nutnou dobu k rozdělení i nejmenšího ze studovaných proteinů – lysozymu, tzn. cca 180-210 min. 5.2.1 Laemmli-SDS-PAGE Vertikální elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS byla provedena dle postupu uvedeného v kapitole (4.4) metodické části. Na polyakrylamidový gel byla nanesena kromě proteinového standardu pro určení molekulární hmotnosti řada kalibračních standardů potřebných pro identifikaci jednotlivých proteinů ve vzorcích. Jednalo se o komerční preparáty lysozymu, vaječného albuminu a conalbuminu. Pro srovnání se vzorkem lyofilizovaného bílku od průmyslového partnera byl nanesen i reálný vzorek slepičího vaječného bílku. Ve vzorcích získaných od průmyslového partnera byl stanoven obsah specifických proteinů a na základě takto získaných dat byla posouzena čistota vzorků.

56

Obr. 28: Elektroforeogram SDS-PAGE při použití 12,5 % gelu (Coomassie G250) Nejvíce zastoupenou sloţkou vaječného bílku pod 100 kDa je ovalbumin se 43 kDa, ovotransferin se 76 kDa a lysozym se 14 kDa v tomto pořadí. Z výsledků elektroforetického dělení vyplývá, ţe komerční preparát vaječného albuminu (Serva) obsahuje malé mnoţství ovotransferinu, naopak lysozym (Serva) je velmi čistý a obsahuje výhradně jen lysozym. Preparát ovotransferinu (Sigma-Aldrich) obsahuje pouze ovotransferin, ovšem není absolutně čistý, protoţe obsahuje malé mnoţství ovoalbuminu a v naváţeném mnoţství se vyskytovalo i určité mnoţství blíţe nedetekovaných pravděpodobně stabilizačních příměsí. Výsledky analýzy čerstvého vaječného bílku, který byl na gel nanesen ve formě 50krát a 100krát zředěného vodného roztoku, poskytují cennou a přesnou informaci, které komponenty se ve vaječném bílku skutečně nacházejí a jaké jsou jejich migrační vzdálenosti. Na základě těchto výsledků lze objektivně posoudit obsah vaječných proteinů u ostatních preparátů a u vzorků od průmyslového partnera. Výsledek potvrzuje mimo jiné skutečně malý obsah lysozymu ve vaječném bílku (3,5 %) [8], coţ je zřejmě hlavní důvod, proč zředěný vaječný bílek vykazuje nízké antimikrobiální vlastnosti. 5.2.1.1 Charakterizace vzorků od průmyslového partnera Výsledky analýz vzorků získaných od průmyslového partnera ukázaly, ţe v případě vzorku „Conalbumin“ jde o směs ovotransferinu, ovoalbuminu a lysozymu v poměru zhruba 3:1:2. Naopak lyofilizovaný bílek i přes pouţití roztoku o koncentraci 1 mg/ml vykázal poměrně malou odezvu (Obr. 28). Přestoţe sloţení preparátu zcela odpovídá vaječnému bílku, koncentrace vaječných proteinů ve vzorku je však velmi nízká, přibliţně jako u 200krát zředěného bílku.

57

Tablety dodané průmyslovým partnerem byly analyzovány stejným způsobem jako vzorky „Conalbumin“ a lyofilizovaný bílek. Analýzou SDS-PAGE bylo zjištěno, ţe v obou variantách tablety, tedy s vitaminem C a šalvějí a s vitaminem C bez přídavku šalvěje, obsahují tablety proteiny odpovídající sloţení vaječného bílku, i co se týče poměrů jednotlivých komponent. K přípravě tablet tak byl pravděpodobně pouţit lyofilizovaný vaječný bílek. Ovšem koncentrace vaječných proteinů v tabletách je rovněţ velmi nízká (srov. Tab. 14), coţ můţe být způsobeno i vysokým obsahem dalších pomocných látek potřebných pro tvorbu tablety, jako je stearan hořečnatý či oxid křemičitý.

Dělení reálné směsi proteinů pomocí gelové filtrace

5.3

Dělení směsi proteinů z vaječného bílku metodou gelové permeační chromatografie Dělení reálných vzorků bylo provedeno na chromatografické vertikální koloně s porézní náplní Sephadex G100 dle postupu popsaného v kapitole 4.5. Získaný chromatogram byl porovnán s výsledky dělení modelové směsi vaječných proteinů skládající se z ekvimolární směsi vaječného albuminu, ovotransferinu a lysozymu o celkové koncentraci proteinů 3 mg/ml ve vzorku. Výsledky byly získány za stejných podmínek - 1 ml směsi byl separován na koloně při průtoku 0,25 ml/min a s obsahem pomocné sloţky NaCl v mnoţství 10 mg/ml. Z výsledků eluce modelové směsi proteinů (Obr. 29) vyplývá, ţe ovotransferin je eluován z kolony v čase 45-60 minut a ne zcela dokonale se dělí od ovoalbuminu. Vhodná se tak jeví analýza frakce z času 45-60 min. Co se týče srovnání úspešnosti dělení při pouţití fosfátového pufru (Obr. 30) ve srovnání s Tris-HCl pufrem (Obr. 31), vychází fosfátový pufr jako lepší alternativa. U Tris-HCl maxima absorbce ovotransferinu jiţ výrazně splývají s maximem píkem ovalbuminu. 5.3.1

73

Absorbce při 280 nm Vodivost

63

0,20

A280 [-]

53 0,15 Lysozym

43

0,10 Ovotransferin

33 Ovalbumin

0,05

23

0,00

13 0

80 100 120 140 160 180 200 Doba analýzy [min] Obr. 29: Modelová směs komerčních standardů albuminu, ovotransferinu a lysozymu – separace na Sephadexu G-100 58

20

40

60

Vodivost [mS/cm]

0,25

0,25

Absorbce při 280 nm Vodivost

29

25 0,15 A280 [-]

23 21

0,10 19

Vodivost [mS/cm]

27

0,20

17

0,05

15 0,00

13 20

80 100 120 140 160 180 200 Doba analýzy [min] Obr. 30: Dělení reálného vzorku (10x zředěný bílek) při použití fosfátového pufru o pH 7 – separace na Sephadexu G-100 0,25

40

60

20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5

Absorbce při 280 nm Vodivost

0,20

A280 [-]

0,15

0,10

0,05

0,00

0

20

40

60

80 100 120 140 Doba analýzy [min]

160

180

200

Vodivost [mS/cm]

0

220

Obr. 31: Dělení reálného vzorku (10x zředěný bílek) při použití Tris-HCl pufru při pH 8 – separace na Sephadexu G-100

59

Lze shrnout, ţe nejvíce zastoupenou sloţkou vaječného bílku pod 100 kDa je ovalbumin se 43 kDa, ovotransferin se 76 kDa a lysozym se 14 kDa v tomto pořadí. Ovšem lysozymu je zde opravdu velmi málo (3,5 %), ale díky velmi dobré detekci při 280 nm je moţné i tento protein detekovat [8]. Gelovou filtrací lze za optimalizovaných podmínek proteiny vaječného bílku purifikovat, zejména lze získat čistou frakci lysozymu. Větší proteiny se touto metodou dají oddělit jen částečně, coţ je zřejmě i důvod, proč komerční i standardní preparát ovotransferinu obsahuje vţdy alespoň malý podíl vaječného albuminu. Identifikace a kontrola čistoty proteinů získaných dělením vaječného bílku gelovou filtrací Vybraná frakce (frakce č. 5) získaná frakcionací eluátu u gelové filtrace s vyuţitím fosfátového pufru jako mobilní fáze, byla zkoncentrována ultrafiltrací 10krát (4.5.3) a nadávkována na polyakrylamidový gel v mnoţství 25 μl. Ve srovnání s komerčním standardem ovotransferinu (1 mg/ml) vykazuje frakce přibliţně stejnou čistotu (Obr. 32, 32), ovšem pro skutečně koncentrovaný vzorek by bylo nutné pouţít vyšší výchozí mnoţství vzorku při aplikaci na kolonu, pravděpodobně navíc v kombinaci s lyofilizací po frakcionaci. V případě provedení SDS-PAGE pro identifikaci eluovaných proteinů v jednotlivých frakcích získaných gelovou filtrací popsanou v kapitole (4.4) byly na gel naneseny kromě proteinového standardu pouze komerční standardy lysozymu, vaječného albuminu a ovotransferinu. 5.3.1.1

Obr. 32: Elektroforeogram frakce č.5 (fosfátový pufr) z gelové filtrace (Coomassie G250, 12,5 % gel) 60

Obr. 33: Elektroforeogram frakce č. 5 z gelové filtrace (barvení stříbrem, 12,5 % gel)

Testy antimikrobiálních vlastností

5.4

Testy antimikrobiálního účinku byly provedeny na kulturách B. subtilis a E. coli podle postupů popsaných v metodické části práce (4.6.4). Byly vyzkoušeny tři různé metody stanovení inhibičních vlastností zahrnující jak vizuální detekci inhibičních zón na tuhých agarových plotnách, tak měření změny zákalu kultury při 630 nm v průběhu kultivace v tekutých médiích a jako třetí bylo provedeno zaznamenávání změny zákalu způsobené lýzou bakteriálních buněk při 630 nm po přidání vzorků obsahujících lysozym. Testování antimikrobiální aktivity na agarových plotnách

5.4.1

Velikost inhibiční zóny [mm]

5.4.1.1 Testování inhibičního účinku lysozymu Nejprve byly na předem připravených agarových plotnách s jiţ narostlou kulturou B. subtilis (kultivace 3 dny, očkováno 0,5 ml inokula), nadávkovány dvěma odlišnými způsoby (jamková a disková metoda) různě koncentrované vzorky komerčního lysozymu (Serva) a byla po 24 hodinách zjištěna inhibiční aktivita a sestrojena příslušná kalibrační křivka. Při provedení analogického testu s lysozymem na kulturách E. coli (za stejných podmínek), nebyla dle očekávání detekována ţádná inhibiční aktivita z důvodu minimálního účinku enzymu lysozymu na gramnegativní bakterie. 12 11,0 Jamková metoda Disková metoda 10

9,0 8,0

8

7,0

7,0 6,0

6

5,5

6,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

4,0 4

3,0 2,0

2

1,0

0,3

0,0

0 60,0

40,0 20,0 10,0 5,0 2,5 1,3 0,6 0,3 0,0 Dávkovaná koncentrace lysozymu [mg/ml] Obr. 34: Výsledky testování inhibiční aktivity lysozymu na kultuře B. subtilis. (u diskové metody je nutné brát v potaz velikost samotného disku, která činí 5 mm) 61

Lysozym vykázal velmi dobrou inhibiční aktivitu vůči grampozitivní bakterii B. subtilis, kdy minimální inhibiční koncentrace byla určena na cca 0,3 mg/ml. Ovšem výraznější aktivita je patrná aţ nad 1 mg/ml. Lysozym působí enzymatickou destrukci bakteriálních buněčných stěn a z toho důvodu je jeho inhibiční aktivita velmi dobře detekovatelná, poněvadţ rozpadající se buňky tvoří transparentní kruhovou zónu okolo místa nadávkování. Tab. 16: Výsledky testování inhibiční aktivity lysozymu B. subtilis E. coli Koncentrace Velikost inhibiční zóny Velikost inhibiční zóny vzorku lysozymu jamky, t=24h disky, t=24h jamky, t=24h disky, t=24h [mg/ml] [mm] [mm] [mm] [mm] 60,0

7,0

11,0

0,0

5,0

40,0

6,0

9,0

0,0

5,0

20,0

5,5

8,0

0,0

5,0

10,0

5,0

7,0

0,0

5,0

5,0

4,0

6,0

0,0

5,0

2,5

3,0

5,0

0,0

5,0

1,25

2,0

5,0

0,0

5,0

0,625

1,0

5,0

0,0

5,0

0,3125

0,3

5,0

0,0

5,0

Kontrola

0,0

5,0

0,0

5,0

Velikost inhibiční zóny [mm]

Z porovnání výsledků stanovení pomocí jamkové a diskové metody je patrné, ţe jamková metoda je přesnější, a to především při niţších koncentracích, kdy se u diskové metody obtíţněji detekují inhibiční zóny. Závislost koncentrace lysozymu na velikosti inhibičních zón vykazuje logaritmický průběh; y = 1,2554ln(x) + 1,7752 a lze proloţit rovnicí koeficientem determinace R2 = 0,99. 12 10

8 6 y = 1,2554ln(x) + 1,7752 R² = 0,9915

4 2 0 0

62

5

10

15

20 25 30 35 40 45 50 55 60 Koncentrace lysozymu [mg/ml] Obr. 35: Kalibrační křivka inhibičního účinku lysozymu na B. subtilis

65

5.4.1.2 Testování inhibičního účinku vzorků dodaných průmyslovým partnerem Analogicky jako u stanovení inhibiční aktivity lysozymu byly na agarové plotny nadávkované vzorky získané od průmyslového partnera - conalbumin, lyofilizovaný bílek a dvě varianty tablet s obsahem vitamínu C a šalvěje. Elektroforetickou analýzou pomocí SDSPAGE bylo zjištěno (5.2.1), ţe vzorek „Conalbumin“ obsahuje kromě ovotransferinu velké mnoţství lysozymu. V podstatě jde o lyofilizovaný vaječný bílek zbavený převáţně ovalbuminu a dalších proteinů. Dále byl analyzován lyofilizovaný bílek, který vykazuje stejné proteinové sloţení jako referenční vaječný bílek, ovšem jednotlivé antimikrobiální látky jako lysozym a ovotransferin jsou obsaţeny v menším mnoţství (Obr. 28). Tablety rovněţ obsahují proteiny odpovídající přesně vaječnému bílku, i co se týče poměrů jednotlivých komponent (Obr. 28). Příprava vzorků tablet pro stanovení inhibičního účinku probíhala nadrcením tablety v třecí misce, kdy byla vzniklá sypká poté kvantitativně převedena do 25 ml sterilní destilované vody důkladně rozmíchána. Tab. 17: Výsledky testování vzorků od průmyslového partnera na kultuře B. subtilis B. subtilis E. coli Označení vzorku od Koncentrace Velikost inhibiční zóny Velikost inhibiční zóny průmyslového [mg/ml] jamky, t=24h disky, t=24h jamky, t=24h disky, t=24h partnera [mm] [mm] [mm] [mm] 100 5,5 10,0 3,5 6,5 „Conalbumin“

Lyofilizovaný bílek Tableta se šalvějí a vit. C Tableta s vit. C Kontrola

50

4,5

8,0

3,0

6,0

25

3,5

6,0

2,0

5,0

200

5,0

7,0

3,0

6,0

100

3,0

6,0

2,0

5,5

50

1,5

5,0

2,0

5,0

28

4,0

5,0

2,5

5,0

28

3,0

5,0

2,2

5,0

0,0

0,0

5,0

0,0

5,0

Výsledky odpovídají očekávání; nejvyšší antimikrobiální efekt vykázal vzorek „Conalbumin“, který oproti lyofilizovanému bílku obsahuje vyšší koncentraci antimikrobiálních sloţek, lysozymu a ovotransferinu. Důleţitým aspektem inhibiční aktivity je také synergický efekt těchto dvou obranných proteinů, který se naplno projevil u grampozitivní testovací bakterie. Překvapující je rovněţ ne zcela zanedbatelná inhibiční aktivita těchto směsných vzorků na gramnegativní bakterii E. coli, kdy pravděpodobně nebylo moţné vyuţít enzymatického účinku lysozymu. Co se týče srovnání antimikrobiálního účinku tablet, vychází o něco lépe tableta s obsahem šalvěje, coţ můţe být způsobeno právě touto přísadou.

63

64

2,0 3,0

2

3 2,5

2

1

0

2,0

2,0

Tableta Vit.C (PP) 28 mg/ml

5,0

Tableta Vit.C (PP) 28 mg/ml

5,0

Tableta Šalvěj/Vit.C (PP) 28 mg/ml

6,0

Bílek (PP) 50 mg/ml

10,0

Tableta Šalvěj/Vit.C (PP) 28 mg/ml

3,0

Bílek (PP) 50 mg/ml

3,5

Bílek (PP) 100 mg/ml

8

Bílek (PP) 100 mg/ml

4,5

Bílek (PP) 200 mg/ml

5,5

Bílek (PP) 200 mg/ml

Ovotransferin (PP) 25 mg/ml

4

Ovotransferin (PP) 25 mg/ml

4 Ovotransferin (PP) 50 mg/ml

Ovotransferin (PP) 100 mg/ml

Velikost inhibiční zóny [mm] 6

Ovotransferin (PP) 50 mg/ml

Ovotransferin (PP) 100 mg/ml

Velikost inhibiční zóny [mm] 12 Jamková metoda Disková metoda

10

8,0 7,0 6,0 5,0 5,0

4,0 3,0

1,5

0

Obr. 36: Výsledky testování inhibiční aktivity vzorků od PP na kultuře B. subtilis 7 6,5 Jamková metoda Disková metoda 6,0 6,0 6 5,5 5,0 5,0 5,0 5,0 5

3,5 3,0 2,2

Obr. 37: Výsledky testování inhibiční aktivity vzorků od PP na kultuře E. coli

5.4.1.3 Testování inhibičního účinku ovotransferinu Analogicky k lysozymu byl na dvou sadách předem připravených agarových ploten s jiţ narostlými kulturami B. subtilis a E. coli (kultivace 3 dny, očkováno 0,4 ml inokula), otestován inhibiční účinek komerčního apo-ovotransferinu (Sigma). Rovněţ zde byly vzorky dávkovány dvěma odlišnými způsoby (jamková a disková metoda) a po 24 hodinách byla odečtena inhibiční aktivita a sestrojena příslušná kalibrační křivka. Pro přípravu vzorků ovotransferinu byl namísto sterilní vody vyuţit roztok hydrogenuhličitanu sodného, kdy byla ředěním zabezpečena jeho koncentrace 100 mM v kaţdém vzorku [1; 120]. 7

Velikost inhibiční zóny [mm]

6,0

Jamková metoda

6

Disková metoda

5,5 5,0

5,0

5,0

5,0

5 4

3,5

3 2 1 0,0

0,0

0,0

0 100

75 50 40 Kontrola Dávkovaná koncentrace ovotransferinu [mg/ml]

Obr. 38: Výsledky testování inhibiční aktivity ovotransferinu na kultuře B. subtilis 7 Velikost inhibiční zóny [mm]

6,0

Jamková metoda

6

Disková metoda

5,5 5,0

5,0

5,0

5 4 3

2,5 2,0

2

1,5 1,0

1 0,0 0 100

75 50 40 Kontrola Dávkovaná koncentrace ovotransferinu [mg/ml]

Obr. 39: Výsledky testování inhibiční aktivity ovotransferinu na kultuře E. coli 65

Ovotransferin vykázal patrný inhibiční účinek především na grampozitivní bakterii B. subtilis, ovšem u gramnegativní E. coli je průběh v závislosti na koncentraci u jamkové metody lineárnější a je tak patrný vliv vzájemné odlišnosti kultur (Tab. 18). Rovněţ zajímavým a očekávaným zjištěním je odlišná vizuální detekce inhibičních zón, které jsou na rozdíl od lysozymu, jenţ tvoří transparentní inhibiční zónu, oranţové aţ narůţovělé díky tvorbě oranţovo-růţového komplexu ţelezitými kationty nasyceného holoovotransferinu. Tento prvek byl patrný u obou testovaných kultur, u obou variant dávkování (jamková a disková), výrazněji však v koncentraci od 75 mg/ml. Tab. 18: Výsledky testování ovotransferinu na kultuře B. subtilis Koncentrace Velikost inhibiční zóny Velikost inhibiční zóny ovotransferinu [mg/ml] (jamky, t=24h) [mm] (disky, t=24h) [mm] 100 5,0 6,0 75 3,5 5,5 50 0,0 5,0 40 0,0 5,0 0 0,0 5,0 Co se týče srovnání pouţitelnosti metod dávkování vzorků na pevná média, vychází výrazně lépe jamková metoda, která poskytuje citlivější odezvu na koncentraci vzorku. Naopak disková metoda vykazuje inhibiční zónu pouze u vyšších koncentrací a odezva je i tak slabá (Obr. 38 a 39). Kalibrační závislost velikosti inhibiční zóny na koncentraci ovotransferinu je u obou pouţitých kultur velmi odlišná a nedá se uspokojivě proloţit ani regresní přímkou ani logaritmickou závislostí jako u lysozymu (Obr. 40). Kalibrační závislost v případě diskové metody je u obou kultur shodná (Obr. 40 a 41) a v případě E. coli se k ní blíţí i kalibrační závislost jamkové metody (Tab. 19).

Velikost inhibiční zóny [mm]

7 6 5 4 y = 0,0919x - 3,9654 R² = 0,9552

3 2 1 0 35

55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 Koncentrace ovotransferinu [mg/ml] Obr. 40: Kalibrační křivka inhibičního účinku ovotransferinu na kultuře B. subtilis

66

40

45

50

Tab. 19: Výsledky testování ovotransferinu na kultuře E. coli Koncentrace Velikost inhibiční zóny Velikost inhibiční zóny ovotransferinu [mg/ml] (jamky, t=24h) [mm] (disky, t=24h) [mm] 100 2,5 6,0 75 2,0 5,5 50 1,5 5,0 40 1,0 5,0 0 0,0 5,0

Velikost inhibiční zóny [mm]

7 6 5 4 3 2 y = 0,0236x + 0,1844 R² = 0,9689

1 0 35

40

45

50

55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 Koncentrace ovotransferinu [mg/ml] Obr. 41: Kalibrační křivka inhibičního účinku ovotransferinu na kultuře E. coli 5.4.2 Optimalizovaná metoda detekce lyze buněk Pro vzorky obsahující lysozym byla otestována i moţnost přímé detekce antibakteriálního účinku díky schopnosti katalyzovat rozklad buněčné stěny grampozitivních bakterií. Desetkrát zředěná suspenze buněk byla v kyvetě smíchána se vzorkem a postupně byl odečítán nárůst zákalu při 630 nm (pozitivní změna zákalu) způsobený lyzou buněk. Tab. 20: Výsledky testování antibakteriálního účinku lysozymu na kultuře B. subtilis Koncentrace A A A A A (změna A (změna [mg/ml] (kultura) (t=0min) (t=3min) (t=5min) od t=0min) od kultury) 30 0,048 0,156 0,632 0,735 0,579 0,687 15

0,044

0,195

0,646

0,752

0,557

0,708

10

0,036

0,158

0,539

0,605

0,447

0,570

5

0,039

0,192

0,482

0,541

0,349

0,502

3

0,034

0,112

0,337

0,385

0,274

0,351

1,25

0,041

0,111

0,186

0,211

0,165

0,170

0,63

0,028

0,049

0,062

0,081

0,032

0,053

0,31

0,029

0,030

0,030

0,031

0,001

0,002 67

Výsledky ukazují, ţe tato metoda je s úspěchem pouţitelná pro čistý lysozym, který disponuje při tomto rychlém stanovení velmi dobrou aktivitou (Tab. 20). Sestrojená kalibrační závislost vykazuje jak při vyuţití absolutního rozdílu absorbance, tak při vyuţití rozdílu od t0 logaritmickou závislost. Co se týče přesnosti, lepší výsledky poskytuje změna zákalu od nulového stavu (před přidáním enzymu), jelikoţ po přidání více koncentrovaných enzymů jiţ nebylo moţné díky velmi rychlému účinku enzymu zabezpečit rychlé změření vzorku v čase t0. Rovněţ je patrné, ţe při vyšších koncentracích lysozymu (okolo 30 mg/ml) jiţ není antibakteriální aktivita přímo závislá na koncentraci a zvyšuje se jen nepatrně (Obr. 42). 0,8 y = 0,1721ln(x) + 0,1753 0,7 R² = 0,9689 0,6 y = 0,1384ln(x) + 0,1355 R² = 0,9845

A630 [-]

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

0,0 0

5

10 15 20 25 30 35 Koncentrace lysozymu [mg/ml] Obr. 42: Kalibrační křivka antibakteriálního účinku lysozymu na kulturu B. subtilis 1,4 1,3

A630 [-]

1,2

y = 0,2784ln(x) + 0,0704 R² = 0,9996

1,1 1,0 0,9 0,8

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 Koncentrace směsného vzorku ovotransferinu a lysozymu [mg/ml] Obr. 43: Kalibrační křivka antibakteriálního účinku vzorku od průmyslového partnera „Conalbumin“ na kultuře B. subtilis 68

Tab. 21: Výsledky testování antibakteriálního účinku vzorků od průmyslového partnera ve srovnání s komerčním ovotransferinem a referenčním bílkem na kultuře B. subtilis Konc. A A A A A (změna A (změna Označení vzorku [mg/ml] (kultura) (t=0) (t=3) (t=5) od t=0) od kultury) Ovotransferin 40 0,236 0,268 0,268 0,267 -0,001 0,031 (Sigma) Ovotransferin 10 0,232 0,171 0,000 -0,232 (Sigma) Ovotransferin (PP) 100 0,237 0,656 1,465 1,592 0,936 1,355 Ovotransferin (PP)

50

Ovotransferin (PP) 25 Lyofilizovaný bílek 200 (PP) Lyofilizovaný bílek 100 (PP) Lyofilizovaný bílek 50 (PP) Tableta se šalvějí a 28 mg vit.C (PP) tablety/ml 28 mg Tableta s vit.C (PP) tablety/ml 1x Vaječný bílek zředěný 10x Vaječný bílek zředěný

0,244

0,549 1,319 1,399

0,850

1,155

0,234

0,398 0,509 1,203

0,805

0,969

0,252

0,352 0,662 0,550

0,198

0,298

0,250

0,491 0,265 0,265

-0,226

0,015

0,237

0,376

0,000

-0,237

0,245

0,327

0,000

-0,245

0,249

0,351

0,000

-0,249

0,238

0,238 0,269 0,269

0,031

0,031

0,250

0,247

0,000

-0,250

I přes dobré výsledky lysozymu se na základě dat získaných měřením vzorku obsahujících lysozym ukazuje, ţe přítomnost dalších proteinů stanovení znesnadňuje. Jedná se především o ovalbumin obsahující vzorky, jmenovitě o referenční čerstvý vaječný bílek, lyofilizovaný bílek a obě varianty tablet (Tab. 21). Jediný vzorek, který poskytoval srovnatelné výsledky, byl vzorek „Conalbumin“ od průmyslového partnera, kdy kalibrační závislost získaná ze tří měřených koncentrací je znázorněna na Obr. 43. Tento vzorek ovšem obsahuje pouze ovotransferin a lysozym. Je tedy zbaven ovalbuminu a pravděpodobně i dalších vaječných proteinů, coţ mohou být interferující sloţky. Jak ukazují výsledky čistého ovotransferinu, nevykázal v tomto testu ţádný účinek (Tab. 21). Ovotransferin jednak nepůsobí enzymatický rozklad buněk jako lysozym, ani nijak jinak nepůsobí na buňky v tak krátkém čase a také s lysozymem neinterferuje. Příčinou interferencí jsou tak zřejmě skutečně ostatní proteiny vaječného bílku, nejpravděpodobněji zmíněný ovalbumin, který způsobuje pravděpodobně agregaci buněk a znesnadňuje měření zákalu touto metodou. Zákalový přímý test nebyl proveden na kultuře E. coli, to z důvodu minimálního účinku lysozymu. Zároveň nebylo pravděpodobné, ţe by ovotransferin se zcela odlišným antimikrobiálním účinkem vykázal za tak krátkou dobu při pozitivním zákalovém stanovení nějaké signifikantní výsledky.

69

Testování antimikrobiální aktivity v tekutých médiích

5.4.3

5.4.3.1 Kalibrační závislost koncentrace biomasy Pro přepočet naměřené hodnoty zákalu na koncentrace sušiny byla pro obě pouţívané kultury sestrojena kalibrační závislost koncentrace sušiny v g/l na hodnotě absorbance, resp. zákalu při 630 nm. Při konstrukci kalibračních závislostí bylo vyuţito gravimetrického stanovení. 10 ml homogenního vzorku kultury bylo odebráno po 24 h inkubace a vysušeno na předem zváţených a při 80 °C vysušených hliníkových miskách (Tab. 22). Zjištěný přírůstek hmotnosti byl přepočítán na koncentraci média. Toto stanovení bylo provedeno paralelně třikrát. Pro sestrojení závislosti byla paralelně změřena hodnota zákalu kultury. Tab. 22: Výsledky gravimetrie pro sestrojení kalibrační závislosti po 24h hmotnost sušiny Koncentrace Číslo Hmotnost Hmotnost misky Kultura v 10 ml (průměr) sušiny misky prázdné misky [g] se sušinou [g] [g] v médiu [g/l] 1 23,6151 23,6918 0,0767 B. 2 23,1956 23,2772 0,0816 0,0787 7,87 ± 0,21 subtilis 3 23,3607 23,4386 0,0779 4 23,8002 24,0504 0,2502 E. coli 5 23,8491 24,0908 0,2417 0,2476 24,76 ± 0,42 6 24,2844 24,5354 0,2510 Odebraná kultura byla potom podrobena ředění čistým médiem v sestupné geometrické řadě od 3,0 ml po 0,3 ml, kdy při kaţdém ředění byl změřen zákal při 630 nm a koncentrace byla aritmeticky přepočítána z výchozí koncentrace stanovené gravimetrií. U kultury B. subtilis bylo nutné vzorky díky vysoké hodnotě zákalu 10krát ředit. Z vypočítaných hodnot koncentrace a zjištěného zákalu byla sestrojena kalibrační křivka, kterou byla proloţena regresní přímka a s její rovnice byla dále pouţita ke stanovení koncentrace u antimikrobiálních testů (Obr. 44 a 45). 3,0 2,5 y = 0,3518x R² = 0,9970

A630 [-]

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0

4,0 6,0 8,0 Koncentrace biomasy [g/l] Obr. 44: Kalibrační závislost zákalu na koncentraci sušiny bakterie B. subtilis 70

2,0

0,40 0,35

A630 [-]

0,30 y = 0,0150x R² = 0,9877

0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00

0,0

5,0

10,0 15,0 20,0 25,0 Koncentrace biomasy [g/l] Obr. 45: Kalibrační závislost zákalu při 630 nm na koncentraci sušiny bakterie E. coli Tab. 23: Výsledky pro sestrojení kalibrační závislosti pro B. subtilis Objem Objem Koeficient A1 A2 A3 kultury [ml] média [ml] zředění 3,0 0,0 10 0,278 0,276 0,280 2,7 0,3 10 0,252 0,250 0,255 2,4 0,6 10 0,217 0,220 0,224 2,1 0,9 10 0,193 0,188 0,185 1,8 1,2 10 0,170 0,171 0,164 1,5 1,5 10 0,151 0,147 0,148 1,2 1,8 1 1,059 1,028 1,050 0,9 2,1 1 0,757 0,765 0,759 0,6 2,4 1 0,502 0,511 0,506 0,3 2,7 1 0,288 0,276 0,280 0,0 3,0 1 0,000 0,000 0,000

A 0,278 0,252 0,220 0,189 0,168 0,149 1,046 0,760 0,506 0,281 0,000

Koncentrace biomasy [g/l] 7,87 7,09 6,30 5,51 4,72 3,94 3,15 2,36 1,57 0,79 0,00

Tab. 24: Výsledky pro sestrojení kalibrační závislosti pro E. coli Objem Objem Koncentrace A1 A2 A3 A kultury [ml] média [ml] biomasy [g/l] 3,0 0,0 0,350 0,356 0,350 0,352 24,76 2,7 0,3 0,340 0,345 0,332 0,339 22,29 2,4 0,6 0,320 0,323 0,312 0,318 19,81 2,1 0,9 0,245 0,242 0,240 0,242 17,33 1,8 1,2 0,214 0,210 0,207 0,210 14,86 1,5 1,5 0,200 0,201 0,197 0,199 12,38 1,2 1,8 0,161 0,159 0,157 0,159 9,91 0,9 2,1 0,126 0,125 0,116 0,122 7,43 0,6 2,4 0,085 0,083 0,077 0,082 4,95 0,3 2,7 0,040 0,036 0,035 0,037 2,48 0,0 3,0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 71

5.4.3.2 Růstová křivka použitých MO Růstová křivka pouţitých MO byla sestrojena z naměřených hodnot zákalu při 630 nm v průběhu 72 h inkubace při optimální teplotě 30 °C u kultury B. subtilis a 37°C u E. coli. Odběry probíhaly pokud moţno po 4 hodinách a noční odběry nebyly prováděny. V případě vysokého zákalu, byl odebraný vzorek 10krát ředěn čistým médiem a výsledná koncentrace vynásobena 10krát (Tab. 25 a 26). Vlivem přirozených odlišností obou pouţitých kultur a především vzhledem k odlišným kultivačním podmínkám je patrný rozdíl obou růstových křivek. Bakterie E. coli se ve stejném objemu média mnoţila výrazně pomaleji, pravděpodobně díky nepouţití termostatované třepačky jakou u druhé bakterie B. subtilis. Ovšem co se týče tvorby biomasy, produkovala bakterie E. coli její výrazně větší mnoţství neţ B. subtilis. Vrcholu exponenciální fáze tak u tohoto konkrétního způsobu kultivace dosahuje grampozitivní Bacillus přibliţně po 24 h (Obr. 46), naopak gramnegativní Escherichia aţ po 48 h (Obr. 47), ovšem díky výrazně větší koncentraci biomasy to není pro antimikrobiální stanovení větší problém. Tab. 25: Naměřené hodnoty pro sestrojení růstové křivky B. subtilis Koef. Čas odběru Koncentrace Zředění A1 A2 A3 A [h] [g/l] vzorku 0 0,255 0,266 0,265 0,262 0,74 ± 0,01 1 4 0,595 0,578 0,568 0,580 1,65 ± 0,03 1 20 0,310 0,311 0,306 0,309 8,77 ± 0,06 10 24 0,367 0,370 0,369 0,368 10,47 ± 0,04 10 30 0,207 0,204 0,215 0,208 5,92 ± 0,13 10 45 0,140 0,139 0,149 0,142 4,05 ± 0,13 10 50 1,196 1,217 1,236 1,216 3,46 ± 0,05 1 54 1,147 1,162 1,136 1,148 3,26 ± 0,03 1 72 0,999 0,981 0,986 0,988 2,81 ± 0,02 1 Tab. 26: Naměřené hodnoty pro sestrojení růstové křivky E. coli Koef. Čas odběru Koncentrace Zředění A1 A2 A3 A [h] biomasy [g/l] vzorku 0 0,67 ± 0,00 1 0,010 0,010 0,010 0,010 4 1,49 ± 0,16 1 0,024 0,024 0,019 0,022 20 1 0,723 0,727 0,725 0,725 48,43 ± 0,11 24 1 0,949 0,930 0,900 0,926 61,88 ± 1,35 30 1 1,164 1,166 1,165 1,165 77,82 ± 0,05 45 10 0,225 0,220 0,220 0,222 148,07 ± 1,57 50 10 0,162 0,157 0,152 0,157 104,88 ± 2,73 54 10 0,184 0,200 0,164 0,183 122,02 ± 9,84 72 10 0,105 0,111 0,106 0,107 71,70 ± 1,75

72

12

Koncentrace biomasy [g/l]

10 8

6 4 2

0 0

10

20

30 40 Doba kultivace [h]

50

60

70

Obr. 46: Růstová křivka bakterie B. subtilis při 30 °C a třepání 150 ot./min. 160

Koncentrace biomasy [g/l]

140 120 100 80 60 40 20 0 0

10

20

30 40 Doba kultivace [h]

50

60

70

Obr. 47: Růstová křivka bakterie E. coli při 37 °C bez třepání

73

5.4.3.3 Stanovení antimikrobiálního účinku u kultivace v tekutém médiu Vlastní antimikrobiální test v tekutých médiích byl proveden za stejných podmínek kultivace jako u kultivace inokula pro zaočkování agarových ploten a stanovení závislosti koncentrace biomasy na zákalu či růstové křivky. Teplota byla pro obě kultury vţdy konstantní (30 °C u B. subtilis a 37 °C u E. coli), kdy grampozitivní bakterie byla kultivována na temperované třepačce a E. coli z karanténních důvodů pouze ve dvoudvířkovém termostatu bez moţnosti třepání. Kultivace probíhala po celkovou dobu 24 h, kdy nejprve byl změřen počáteční zákal média v čase t0 a po 24 h byla změřena druhá hodnota. Naměřené hodnoty byly s vyuţitím kalibrační závislosti přepočítaný na koncentraci biomasy v médiu. Kaţdé médium včetně kontroly obsahovalo koncentraci 40 mM NaHCO3. 10

Koncentrace biomasy [g/l]

9

8,96

Bacillus subtilis

8 7 6 5 4

3,35 2,79

3 2

3,46

1,08

1 0 0,50

0,38 0,25 0,20 Koncentrace ovotransferinu v médiu [mg/ml]

Kontrola

Obr. 48: Výsledky antimikrobiálního účinku ovotransferinu na bakterii B. subtilis 120 E.coli

97,04

Koncentrace biomasy [g/l]

100 80 60 40 20 0

11,89 -0,40 0,50

13,32

1,98

0,38 0,25 0,20 Kontrola Koncentrace ovotransferrinu v médiu [mg/ml] Obr. 49: Výsledky antimikrobiálního účinku ovotransferinu na bakterii E. coli 74

Tab. 27: Vypočítané hodnoty koncentrace bakterie B. subtilis Koncentrace Koncentrace Označení Koncentrace v biomasy (t0) biomasy (t24) média médiu [mg/ml] [g/l] [g/l]

Koncentrace biomasy [g/l]

1

0,50

0,51

1,59

1,08

2

0,38

0,54

3,33

2,79

3

0,25

0,58

3,93

3,35

4

0,20

0,54

3,99

3,46

5

0,00

0,58

9,47

8,90

Tab. 28: Vypočítané hodnoty koncentrace bakterie E. coli Koncentrace Koncentrace Označení Koncentrace v biomasy (t0) biomasy (t24) média médiu [mg/ml] [g/l] [g/l] 1 0,50 0,60 0,20 2 0,38 0,33 2,32 3 0,25 0,40 12,29 4 0,20 0,33 13,65 5 0,00 0,53 97,57

Změna koncentrace biomasy [g/l] -0,40 1,98 11,89 13,32 97,04

Z naměřených výsledků (Obr. 48 a 49) vyplývá, ţe bezţelezitý ovotransferin (apoovotransferin) s podporou hydrogenuhličitanových iontů vykazuje určitý inhibiční efekt na růst jak grampozitivní bakterie B. subtilis, tak i gramnegativní bakterie E. coli (Tab. 27 a 28). Dále je z grafického znázornění (Obr. 48 a 49) na první pohled patrný větší inhibiční efekt u E. coli i přes vyšší počet bakteriálních buněk v médiu. Inhibiční účinek vykazuje obdobný trend shodně u obou testovaných kultur a je obecně patrnější při vyšších koncentracích. Opět se se vzrůstající koncentrací ovotransferinu zbarvovalo v obou případech médium intenzivněji do růţova vlivem tvorby komplexu ovotransferin-Fe3+ (holo-ovotransferin). Zbarvení bylo u nejvyšší koncentrace jiţ velmi intenzivní, a to i přesto, ţe médium obsahovalo u nejvyšší koncentrace pouze 25 mg ovotransferinu. Při provedení analogického testu se vzorky od průmyslového partnera a pro úplnost i s lysozymem bylo zjištěno, ţe inhibiční efekt lysozymu na grampozitivní bakterie je velmi významný a zcela odpovídá svému enzymatickému charakteru (Tab. 29). Dokonce byl zjištěn i úbytek koncentrace biomasy způsobené pravděpodobně destrukcí buněk inokula ihned po zaočkování. Co se týče vzorků dodaných průmyslovým partnerem, lyofilizovaný bílek i přes nízkou koncentraci lysozymu a ovotransferinu vykázal stejný inhibiční účinek jako lysozym o koncentraci okolo 0,6 mg/ml. Vzorek „Conalbumin“ byl rovněţ stejně účinný (Obr. 50). Pro citlivější detekci by bylo vhodné pouţít niţší koncentrace antimikrobiálních látek, coţ by ovšem znesnadňovalo vzájemné porovnání výsledků obou kultur. Naopak u provedení testu s gramnegativní bakterií E. coli nebyl inhibiční účinek u čistého lysozymu dle očekávání zaznamenán (Obr. 51). Co se týče vzorků dodaných průmyslovým partnerem, lyofilizovaný bílek díky nízké koncentraci ovotransferinu v porovnání se vzorkem „Conalbumin“, který koncentraci buněk mírně sníţil, rovněţ jako lysozym nevykázal ţádný významný inhibiční účinek (Tab. 30). 75

10

Koncentrace biomasy [g/l]

9

8,96

Bacillus subtilis

8 7 6 5 4 3 2 1 0 Lysozym Lysozym Lyofilizovaný Ovotransferin Kontrola (Serva) (Serva) bílek (PP) (PP) 1,5 mg/ml 0,6 mg/ml 1 mg/ml 1,5 mg/ml Obr. 50: Výsledky antimikrobiálního účinku lysozymu a vzorků od průmyslového partnera na bakterii B. subtilis

120 E.coli Koncentrace biomasy [g/l]

100

96,50

95,19

97,04

96,26

85,82 80 60 40 20 0 Lysozym Lysozym Lyofilizovaný Ovotransferin Kontrola (Serva) (Serva) bílek (PP) (PP) 1,5 mg/ml 0,6 mg/ml 1 mg/ml 1,5 mg/ml Obr. 51: Výsledky antimikrobiálního účinku lysozymu a vzorků od průmyslového partnera na bakterii E. coli

76

Tab. 29: Vypočítané hodnoty koncentrace bakterie B. subtilis v médiu Koncentrace Koncentrace Koncentrace Označení Přídávaný v médiu biomasy (t0) biomasy (t24) média vzorek [mg/ml] [g/l] [g/l] Lysozym 1 0,60 0,53 0,02 (Serva) Lysozym 2 1,00 0,54 0,03 (Serva) Lyofilizovaný 3 1,50 0,51 0,02 bílek (PP) Ovotransferin 4 1,50 0,51 0,03 (PP) 5 0,00 0,51 9,47 Tab. 30: Vypočítané hodnoty koncentrace bakterie E. coli v médiu Koncentrace Koncentrace Koncentrace Označení Přidávaný v médiu biomasy (t0) biomasy (t24) média vzorek [mg/ml] [g/l] [g/l] Lysozym 1 0,60 0,67 97,17 (Serva) Lysozym 2 1,00 0,73 95,93 (Serva) Lyofilizovaný 3 1,50 0,67 96,93 bílek (PP) Ovotransferin 4 1,50 0,60 86,42 (PP) 5 0,00 0,33 97,57

Změna koncentrace biomasy [g/l] -0,51 -0,51 -0,50 -0,48 8,96

Změna koncentrace biomasy [g/l] 96,50 95,19 96,26 85,82 97,24

Lze shrnout, ţe v rámci optimalizace stanovení antimikrobiálního účinku byly zavedeny tři různé metody inhibičního stanovení, přičemţ jedna z nich, vizuální detekce inhibičních zón při povrchové kultivaci, byla testována ve dvou variantách. Bylo zjištěno, ţe metoda detekce pozitivní změny zákalu v průběhu spektrofotometrického měření vykazuje velmi dobré výsledky pro vzorky osahující lysozym, ovšem za předpokladu absence interferujících sloţek. Metoda se tak stává pouţitelnou pouze pro vzorky obsahující čistý lysozym, případně lysozym v kombinaci s ovotransferinem při pouţití grampozitivních testovacích kultur. Metoda vizuální detekce inhibičních zón se naopak osvědčila v případě grampozitivních bakterií u všech typů vzorků obsahujících lysozym. Byla vyzkoušena metoda jamkového dávkování i modifikovaná disková difusní metoda určená primárně pro agresivnější antibiotika. Disková metoda vykazovala přijatelné výsledky, ale detekce při niţších koncentracích byla výrazně horší neţ u jamkové metody. Detekce inhibičních zón v případě ovotransferinu byla odlišná z důvodu jiného mechanismu účinku na bakteriální kultury, ovšem lze říci, ţe i ovotransferin vykazuje určitý inhibiční účinek na obě testované bakterie. V poslední metodě stanovení inhibičního účinku v tekuté kultuře byl stanoven v rámci submerzní kultivace účinek ovotransferinu, lysozymu a vzorků od průmyslového partnera na obě testované kultury. Tuto metodu lze označit za dostatečně citlivou pro stanovení i velmi malé antimikrobiální aktivity nebo málo koncentrovaných vzorků. 77

5.4.3.4 Stanovení cytotoxicity na eukaryotických buněčných kulturách Modifikovaná metoda byla provedena dle protokolu XTT, kdy byly připraveny vzorky přidáním 200 μl antimikrobiálního proteinu k 800 μl buněčné suspenze a ke směsi bylo přidáno mnoţství 200 μl XTT barviva. Tato směs byla 120 minut inkubována při 30 °C. Vzorek pozitivní kontroly obsahoval místo vzorku antimikrobiálního proteinu LET pufr skládající se z 0,5M EDTA, 7,5% β-merkaptoethanolu a 10mM Tris. Roztok pufru byl připraven rozpuštěním odpovídající naváţky EDTA a Tris v destilované vodě. Pomocí NaOH bylo pH upraveno na hodnotu 7,5. Poté bylo přidáno 7,5 ml β-merkaptoethanolu na 100 ml roztoku. Pufr byl doplněn do výsledného objemu pomocí sterilní destilované vody. Kolorimetrická metoda stanovení cytotoxického účinku na eukaryotické kultury Saccharomyces cerevisiae neprokázala, ţe by studované antimikrobiální proteiny měly cytotoxické účinky. Téměř všechny vzorky vykázaly obdobné hodnoty absorbance při 450 nm, tedy shodně okolo 0,6 a v případě měření zákalu (při 630 nm) hodnoty okolo 0,5. Hodnoty byly podobné negativní kontrole, neobsahující ţádný antimikrobiální protein. Hodnoty specifické absorbance vzniklé odečtením těchto dvou hodnot se tak pohybovaly okolo 0,1, a to u téměř všech vzorků. Pouze u vyšší koncentrace vzorku lyofilizovaného bílku byl zákal i absorbance naměřená při 450 nm výrazně vyšší neţ u ostatních vzorků, pravděpodobně šlo o zakalení vzorku, či v případě absorpce při 450 nm o redukci sloučeniny XTT vlivem dalších vaječných proteinů (Obr. 54).

2,647

3,0

2,5

2,381

450 nm 630 nm Specifická absorbance 450 nm - 630 nm

0,0

Lysozym 1 a 10 mg/ml

Conalbumin (PP) Lyof. bílek (PP) Pozitivní Negativní 1 a 100 mg/ml 1 a 100 mg/ml kontrola kontrola

Obr. 54: Grafické porovnání cytotoxického účinku v rámci metody XTT

78

0,077

0,590 0,513 0,266

0,311

0,552 0,128

0,117

0,627 0,498

0,655 0,538

0,669 0,502 0,078

0,469 0,390

0,592 0,490

Ovotransferin 1 a 100 mg/ml

0,102

0,127

0,5

0,145

0,569 0,424

0,620 0,494

1,0

0,863

1,5

0,167

A [-]

2,0

Naměřené hodnoty pozitivní kontroly obsahující LET pufr poukazují na skutečný cytotoxický účinek, kdy došlo k významně vyšší absorbanci při 450 nm (Tab. 30.), a tedy k vysoké redukci barviva. Nakonec je třeba podotknout, ţe určitá odlišnost hodnot byla způsobena také neideální homogenitou buněčné suspenze v jamkách mikrotitrační destičky Dalším zajímavým zjištěním je niţší absorbance u koncentrovanějšího ze dvojice vzorků některých vaječných proteinů. Tento jev byl pozorován u vzorků ovotransferinu, lysozymu a u směsného vzorku „Conalbumin“. Naopak lyofilizovaný bílek vykázal v případě koncentrovanějšího vzorku výrazně vyšší absorpci jak při 450 nm, tak při 630 nm viz Tab. 30. Jelikoţ odlišnost absorpce těchto různě koncentrovaných dvojic vzorků při obou vlnových délkách je vzhledem k výsledku pozitivní kontroly velmi malá, je moţné tento jev přičíst nehomogenitě suspenze buněk, zákalu či k destrukci části buněk suspenze díky vysoké koncentraci antimikrobiálního agens. Tab. 30: Naměřené hodnoty absorbance u stanovení cytotoxického účinku Vlnová délka [nm]

450

630

450-630

Ovotransferin 1 mg/ml

0,620

0,494

0,127

Ovotransferin 100 mg/ml

0,569

0,424

0,145

Lysozym 1 mg/ml

0,592

0,490

0,102

Lysozym 10 mg/ml

0,469

0,390

0,078

Conalbumin PP 1 mg/ml

0,669

0,502

0,167

Conalbumin PP 100 mg/ml

0,655

0,538

0,117

Bílek PP 1 mg/ml

0,627

0,498

0,128

Bílek PP 100 mg/ml

0,863

0,552

0,311

Pozitivní kontrola

2,647

0,266

2,381

Negativní kontrola

0,590

0,513

0,077

79

5.5

Enkapsulace

V rámci testování moţnosti enkapsulace antimikrobiálních látek do lipidických a polysacharidových částic byly enkapsulovány jako referenční vzorky komerční standardy ovotransferinu a lysozymu a pak i vybrané vzorky dodané průmyslovým partnerem, tj. „Conalbumin“ a lyofilizovaný bílek. Vzorky byly připraveny dle postupu (4.7.1 a 4.7.2), kdy koncentrace proteinů, resp. směsi proteinů byla zvolena shodně na 1 mg/ml. U všech variant částic byla stanovena enkapsulační účinnost, proměřena charakteristika metodou DLS a měření Zeta potenciálu a částice byly studovány v modelových podmínkách fyziologického roztoku.

Enkpsulační účinnost [%]

5.5.1 Enkapsulační účinnost Pro určení enkapsulační účinnosti bylo provedeno kvantitativní stanovení bílkovin dle Hartree – Lowryho a naměřená data získaná kolorimetrickým stanovením koncentrace proteinů ve vzorku před enkapsulací byla srovnána s hodnotami po enkapsulaci. 100 Liposomové částice 90 Chitosanové částice 80 78,7 77,5 70 64,5

60

63,1

50 47,2

40 30 20 10

34,3 20,7

18,4

0 Ovotransferin (PP) Lyofilizovaný bílek (PP)

Ovotransferin (Sigma)

Lysozym (Serva)

Obr. 53: Grafické porovnání enkapsulační účinnosti vzorků u obou variant částic Jak je na Obr. 53 graficky znázorněno, analýzou enkapsulační účinnosti bylo zjištěno, ţe chitosanové částice s enkapsulační účinností 63,1-78,7 % vykazovaly signifikantně lepší výsledky neţ liposomové částice s enkapsulační účinností 20,7-47,2 %. Velký rozdíl je způsoben zřejmě odlišným způsobem tvorby částic, kdy lipidické částice jsou tvořeny pouze lipidickou dvojvrstvou a jsou méně stabilní. Dále bylo zjištěno, ţe se výrazně lépe neţ ostatní proteinové vzorky se enkapsuloval relativně malý lysozym. V případě liposomových částic byl ve srovnání s komerčním ovotransferinem zjištěn rozdíl téměř 30 %. V případě chitosanových částic jiţ nebyl rozdíl tak patrný. Zajímavý výsledek byl detekován u lyofilizovaného bílku, který byl enkapsulován velmi dobře u obou typů částic (Obr. 53). Pravděpodobně je to způsobeno tím, ţe se během sonikace rozpouštěl výrazně lépe neţ ostatní vzorky. Zajímavý je dále i téměř shodný výsledek i v rámci obou typů částic u vzorku komerčního ovotransferinu a ovotransferinu 80

dodaného průmyslovým partnerem, coţ svědčí o podobných charakteristikách obou preparátů (Tab. 32, 33). Tab. 32: Výsledky stanovení enkapsulační účinnosti metodou kvantitativního stanovení celkových bílkovin dle Hartree-Lowryho u lipidických částic Ovotransferin Lysozym Ovotransferin Lyofilizovaný (Sigma) (Serva) (PP) bílek (PP) Před enkapsulací A1 0,345 0,495 0,346 0,350 A2 0,355 0,499 0,341 0,344 A3 0,351 0,501 0,333 0,342 A 0,350 0,498 0,340 0,345 Koncentrace 1,020 ± 0,012 1,107 ± 0,006 0,990 ± 0,016 1,006 ± 0,010 [mg/ml] Po enkapsulaci A1 0,286 0,263 0,269 0,225 A2 0,290 0,261 0,268 0,231 A3 0,282 0,266 0,272 0,225 A 0,286 0,263 0,270 0,227 Koncentrace 0,833 ± 0,010 0,585 ± 0,006 0,785 ± 0,005 0,661 ± 0,008 [mg/ml] Enkapsulační účinnost [%]

18,4 ± 0,8

47,2 ± 0,9

20,7 ± 0,3

34,3 ± 0,9

Tab. 33: Výsledky stanovení enkapsulační účinnosti metodou kvantitativního stanovení celkových bílkovin dle Hartree-Lowryho u polysacharidových částic Ovotransferin Lysozym Ovotransferin Lyofilizovaný (Sigma) (Serva) (PP) bílek (PP) Před enkapsulací A1 0,345 0,495 0,346 0,350 A2 0,355 0,499 0,341 0,344 A3 0,351 0,501 0,333 0,342 A 0,350 0,498 0,340 0,345 Koncentrace 1,020 ± 0,012 1,107 ± 0,006 0,990 ± 0,016 1,006 ± 0,010 [mg/ml] A1 A2 A3 A Koncentrace [mg/ml]

0,377 ± 0,014

Enkapsulační účinnost [%]

63,1 ± 1,2

0,123 0,130 0,135 0,129

Po enkapsulaci 0,102 0,120 0,115 0,112

0,118 0,125 0,119 0,121

0,080 0,068 0,073 0,074

0,250 ± 0,016

0,351 ± 0,009

0,215 ± 0,008

77,5 ± 3,1

64,5 ± 0,6

78,7 ± 0,8 81

Velikost částic [nm]

5.5.2 Analýza částic s enkapsulovanými proteiny Připravené částice byly analyzovány na koloidním analyzátoru Malvern Zetasizer ZS, který poskytl základní data o částicích jako distribuce velikosti částic, průměrná velikost částic a index polydisperzity. Pomocí zvláštního nástavce s elektrodou byl změřen zeta potenciál, ze kterého byla přímo odhadnuta přibliţná stabilita částic. 700 Liposomové částice Chitosanové částice 660,3 600 589,2 500 476,7 471,0 400 300 297,9 200

100

174,9

174,2 109,0

116,3

103,7

0 Prázdné částice Ovotransferin Lyofilizovaný Ovotransferin (PP) bílek (PP) (Sigma)

Lysozym (Serva)

Obr. 54: Průměrná velikost připravených částic

Index polydisperzity [-]

V případě liposomů byly připraveny částice v rozměrech 109,0-174,9 nm, ale bohuţel se nepodařilo připravit nanočástice (menší neţ 100 nm). U chitosanových částic se nepovedlo přiblíţit hodnotě 100 nm ani u vzorku s lysozymem (nejmenší byly chitosanové částice 297,9 nm). Částice připravené uzavřením obou vzorků ovotransferinu i přes přítomnost lysozymu ve vzorku od průmyslového partnera ukazují podobné vlastnosti i v případě napříč typem částice (Obr. 54). 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

Liposomové částice Chitosanové částice

0,624 0,443 0,349 0,334 0,227

0,444 0,366

0,142 Prázdné částice Ovotransferin Lyofilizovaný Ovotransferin (PP) bílek (PP) (Sigma) Obr. 55: Index polydisperzity u připravených částic

82

0,330

0,251

Lysozym (Serva)

U chitosanových částic dosahovala polydisperzita nejniţší hodnotuy 0,142. Ve vzorku tak nebylo přítomno více agregovaných shluků částic jako u ostatních proteinů, kdy se hodnoty pohybovali výrazně nad 0,3 (Obr. 55). Tab. 34: Základní charakteristika připravených liposomových částic Průměrná velikost Index Enkapsulovaný vzorek částic [nm] polydisperzity Prázdné částice 174,2 0,227 Ovotransferin (PP) 109,0 0,349 Lyofilizovaný bílek (PP) 174,9 0,251 Ovotransferin (Sigma) 103,7 0,366 Lysozym (Serva) 116,3 0,330 Tab. 35: Základní charakteristika připravených chitosanových částic Průměrná velikost Index Enkapsulovaný vzorek částic [nm] polydisperzity Prázdné částice Ovotransferin (PP) Lyofilizovaný bílek (PP) Ovotransferin (Sigma) Lysozym (Serva)

589,2 471,0 476,7 660,3 297,9

0,624 0,334 0,443 0,444 0,142

5.5.2.1 Distribuce velikosti částic Pro potřeby charakterizace vlastností částic byla z variant intenzitní, objemové a početní distribuce zvolena jako nejvhodnější intenzitní distribuce velikosti částic, která poskytuje nejpřesnější měření skutečné velikosti (Tab. 34 a 35). Vzorek částic byl pro menší zkreslení před měřením vţdy 100krát zředěn u obou typů částic. Spolu s částicemi s uzavřeným vzorkem byla změřena i kontrola obsahující pouze rozpouštědlo bez proteinu. Liposomové částice (bez enkapsulované látky)

12 intenzita [%]

10 8 6 4 2 0 0

200

400 600 800 1000 Velikost částic [nm] Obr. 56: Distribuční (intenzitní) křivka liposomových částic bez proteinu

83

Liposomové částice (ovotransferin PP) 14 intenzita [%]

12 10 8 6 4

2 0 0

200

400 600 800 Velikost částic [nm] Obr. 57: Distribuční křivka liposomových částic s uzavřeným ovotransferinem dodaným průmyslovým partnerem

1000

intenzita [%]

Liposomové částice (lyofilizovaný bílek PP) 16 14 12 10 8 6 4 2 0

0

200

400 600 800 Velikost částic [nm] Obr. 58: Distribuční křivka liposomových částic s uzavřeným lyofilizovaným bílkem dodaným průmyslovým partnerem

1000

Liposomové částice (ovotransferin Sigma) 14 intenzita [%]

12 10 8 6 4 2 0

0

400 600 800 Velikost částic [nm] Obr. 59: Distribuční křivka liposomových částic s uzavřeným komerčním ovotransferinem (Sigma) 84

200

1000

Liposomové částice (lysozym Serva) 14 intenzita [%]

12 10 8 6 4

2 0 0

200

400 600 800 1000 Velikost částic [nm] Obr. 60: Distribuční křivka liposomových částic s uzavřeným komerčním lysozymem Chitosanové částice (bez enkapsulované látky)

12 intenzita [%]

10 8 6 4 2 0 1000 1500 Velikost částic [nm] Obr. 61: Distribuční křivka chitosanových částic bez proteinu

intenzita [%]

0

500

2000

Chitosanové částice (ovotransferin PP)

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0

500

1000 1500 Velikost částic [nm] Obr. 62: Distribuční křivka chitosanových částic s uzavřeným ovotransferinem dodaným průmyslovým partnerem

2000

85

Chitosanové částice (lyofilizovaný bílek PP)

14 intenzita [%]

12 10 8 6 4

2 0 0

500

1000 1500 Velikost částic [nm] Obr. 63: Distribuční křivka chitosanových částic s uzavřeným lyofilizovaným bílkem dodaným průmyslovým partnerem

2000

Chitosanové částice (ovotransferin Sigma)

12 intenzita [%]

10 8 6 4 2 0

0

1000 1500 Velikost částic [nm] Obr. 64: Distribuční křivka chitosanových částic s uzavřeným komerčním ovotransferinem (Sigma)

2000

Chitosanové částice (lysozym Serva)

20 intenzita [%]

500

15 10 5 0

0

1000 1500 Velikost částic [nm] Obr. 65: Distribuční křivka chitosanových částic s uzavřeným komerčním lysozymem (Serva) 86

500

2000

5.5.2.2 Zeta potenciál Zeta potenciál byl s příslušným nástavcem s elektrodou proměřen u stejných 100krát zředěných vzorků, jako byla získána distribuce velikosti částic. Díky odlišnému charakteru testovaných částic jsou pro liposomové částice stabilní záporné hodnoty zeta potenciálu a pro chitosanové částice kladné hodnoty. Ve všeobecnosti lze částice povaţovat za stabilní nad 30 mV absolutní hodnoty. Částice blíţící se nule jsou povaţovány za nestabilní. Z naměřených dat vyplývá, ţe nejstabilnější vţdy byly prázdné částice bez enkapsulovaného proteinu, ovšem ve všeobecnosti byly všechny připravené částice přibliţně stejně stabilní s rozdílem do 5 mV (Tab. 36 a 37; Obr. 66). 60 Liposomové částice

ζ-potenciál [mV]

40

42,2

Chitosanové částice

41,5

40,3

41,7

-44,2

-45,3

-44,8

39,4

20 0 -20 -40

-49,8

-49,8

-60 Prázdné částice Ovotransferin Lyofilizovaný Ovotransferin Lysozym (PP) bílek (PP) (Sigma) (Serva) Obr. 66: Grafické porovnání zeta potenciálu připravených částic. Tab. 36: Získané výsledky zeta potenciálu liposomových částic Enkapsulovaný vzorek Zeta potenciál [mV] Prázdné částice Ovotransferin (PP) Lyofilizovaný bílek (PP) Ovotransferin (Sigma) Lysozym (Serva)

-49,8 -44,2 -45,3 -44,8 -49,8

Tab. 37: Získané výsledky zeta potenciálu chitosanových částic Enkapsulovaný vzorek

Zeta potenciál [mV]

Prázdné částice Ovotransferin (PP) Lyofilizovaný bílek (PP) Ovotransferin (Sigma) Lysozym (Serva)

42,2 41,5 40,3 41,7 39,4 87

5.5.3 Studium stability částic v modelových podmínkách Pro studium stability byl jako modelový systém zvolen fyziologický roztok (model trofické tkáně), do kterého byly částice na 24 h uloţeny v poměru 1:1 a inkubovány při 37 °C. Po provedení testu byl opět změřen zeta potenciál a změna hodnoty byla srovnána s původní hodnotou. Navíc byla srovnána i distribuce částic včetně průměrné hodnoty velikosti částic v nanometrech a indexu polydisperzity. 15 12,6

10 Změna ζ-potenciálu [mV]

Liposomové částice Chitosanové částice 9,8

9,6 5 4,3 0 -3,7

-0,1 -2,2

-3,5

-4,6

-5 -9,5

-10 Prázdné částice Ovotransferin (PP)

Lyofilizovaný bílek (PP)

Ovotransferin (Sigma)

Lysozym (Serva)

Obr. 67: Grafické porovnání změny zeta potenciálu po provedení testu

Změna indexu polydisperzity [-]

0,10

Liposomové částice

Chitosanové částice

0,05 0,012

0,000

0,002

0,218

0,00 -0,044 -0,05

-0,070 -0,102

-0,10 -0,109 -0,15

-0,136

-0,116

-0,20 Prázdné částice Ovotransferin Lyofilizovaný Ovotransferin (PP) bílek (PP) (Sigma)

Lysozym (Serva)

Obr. 68: Grafické porovnání změny polydisperzity po provedení testu Obecně lze z výsledků vyvodit závěr, ţe lipidickým částicím na rozdíl od chitosanových inkubace ve fyziologickém roztoku spíše prospěla a hodnoty zeta potenciálu se signifikantně zvýšily. Chitosanové částice byly připraveny v kyselém prostředí kyseliny octové a změna 88

pH naředěním fyziologickým roztokem tak zapříčinila sníţení stability (Obr. 67). Polydisperzita se naopak pozitivně sníţila aţ o 0,1 či zůstala na původní hodnotě. Pouze u lysozymu v případě chitosanových částic se anomálně zhoršila o 0,218. Tento fakt byl způsoben pravděpodobně agregací koloidních částic při přípravě vzorku (Obr. 68). Naopak průměrná velikost částic po provedení inkubace v modelových podmínkách opět vykázala rozdíly mezi oběma typy částic, kdy v případě lipidických liposomů se měnila jen velmi málo a u polysacharidových částic se výrazně sníţila aţ o 100 nm včetně kontrolního vzorku (Obr. 69). 50

Liposomové částice Chitosanové částice

Změna průměrné velikosti [nm]

30 18,0

10 -10

3,1

-23,0

-29,8 -8,8

-9,7

-30 -50

-64,7

-70 -90

-110

-107,5

-119,7

-121,3

-130 Prázdné částice Ovotransferin Lyofilizovaný Ovotransferin (PP) bílek (PP) (Sigma)

Lysozym (Serva)

Obr. 69: Grafické porovnání změny indexu polydisperzity po provedení testu Tab. 38: Změna zeta potenciálu po 24h ve 0,9% NaCl (37 °C) u liposomových částic Enkapsulovaný vzorek Prázdné částice Ovotransferin (PP) Lyofilizovaný bílek (PP) Ovotransferin (Sigma) Lysozym (Serva)

Zeta potenciál Zeta potenciál po 24h/37 °C [mV] v 0,9% NaCl [mV] -49,8 -44,2 -45,3 -44,8 -49,8

Změna zeta potenciálu [mV] 4,3 9,6 12,6 9,8 -0,1

-54,0 -53,9 -57,9 -54,6 -49,6

Tab. 39: Změna zeta potenciálu po 24h ve 0,9% NaCl (37 °C) u chitosanových částic Enkapsulovaný vzorek Prázdné částice Ovotransferin (PP) Lyofilizovaný bílek (PP) Ovotransferin (Sigma) Lysozym (Serva)

Zeta potenciál Zeta potenciál po 24h/37 °C [mV] v 0,9% NaCl [mV] 42,2 41,5 40,3 41,7 39,4

38,5 38,0 30,8 37,2 37,2

Změna zeta potenciálu [mV] -3,7 -3,5 -9,5 -4,6 -2,2

89

Tab. 40: Změna polydisperzity po 24h ve 0,9% roztoku NaCl (37 °C) u liposomových částic Index Index polydisperzity po Změna indexu Enkapsulovaný vzorek polydisperzity 24h/37 °C v 0,9% NaCl polydisperzity 0,000 Prázdné částice 0,227 0,227 -0,102 Ovotransferin (PP) 0,349 0,247 -0,070 Lyofilizovaný bílek (PP) 0,251 0,182 -0,136 Ovotransferin (Sigma) 0,366 0,230 -0,044 Lysozym (Serva) 0,330 0,286 Tab. 41: Změna polydisperzity po 24h ve 0,9% roztoku NaCl (37 °C) u chitosanových částic Index Změna indexu Index polydisperzity po Enkapsulovaný vzorek polydisperzity polydisperzity 24h/37 °C v 0,9% NaCl -0,109 Prázdné částice 0,624 0,515 0,012 Ovotransferin (PP) 0,334 0,346 0,002 Lyofilizovaný bílek (PP) 0,443 0,445 -0,116 Ovotransferin (Sigma) 0,444 0,328 0,218 Lysozym (Serva) 0,142 0,360 Tab. 42: Změna průměru částic po 24h ve 0,9% roztoku NaCl (37 °C) u liposomových částic Průměr částic Změna průměru Průměr částic po 24h/37 Enkapsulovaný vzorek [nm] částic [nm] °C v 0,9% NaCl [nm] -23,0 Prázdné částice 174,2 151,2 18,0 Ovotransferin (PP) 109,0 127,0 -29,8 Lyofilizovaný bílek (PP) 174,9 145,1 3,1 Ovotransferin (Sigma) 103,7 106,9 -9,7 Lysozym (Serva) 116,3 106,6 Tab. 43: Změna průměru částic po 24h ve 0,9% roztoku NaCl (37 °C) u chitosanových částic Průměr částic Změna průměru Průměr částic po 24h/37 Enkapsulovaný vzorek [nm] částic [nm] °C v 0,9% NaCl [nm] -121,3 Prázdné částice 589,2 468,0 -107,5 Ovotransferin (PP) 471,0 363,5 -8,8 Lyofilizovaný bílek (PP) 476,7 468,0 -119,7 Ovotransferin (Sigma) 660,3 540,6 -64,7 Lysozym (Serva) 297,9 233,2 Podrobná změna distribuce velikosti částic byla rovněţ zaznamenána pomocí DLS u 100x zředěných vzorků obdobně jako u základní charakterizace částic (Tab. 38-43). Na následujících grafických znázorněních je vyobrazeno jejich vzájemné porovnání. Téměř ve všech případech je pozorovatelné vylepšení distribuce, coţ koreluje s pozitivní změnou indexu polydisperzity u vzorků inkubovaných ve fyziologickém roztoku (Obr. 70-79).

90

Liposomové částice (bez proteinu)

14 intenzita [%]

12

Voda 0,9% NaCl

10 8 6 4 2 0 0

200

400 600 800 1000 Velikost částic [nm] Obr. 70: Srovnání distribučních křivek liposomových částic bez proteinu vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku Liposomové částice (ovotransferin PP) 14 Voda 0,9% NaCl

intenzita [%]

12 10 8 6 4 2 0 0

200

400 600 800 1000 Velikost částic [nm] Obr. 71: Srovnání distribučních křivek liposomových částic s uzavřeným ovotransferinem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku

intenzita [%]

Liposomové částice (lyofilizovaný bílek PP) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Voda 0,9% NaCl

0

200

400 600 800 1000 Velikost částic [nm] Obr. 72: Srovnání distribučních křivek liposomových částic s uzavřeným bílkem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku

91

Liposomové částice (ovotransferin Sigma)

intenzita [%]

20 Voda 0,9% NaCl

15 10 5 0 0

200

400 600 800 1000 Velikost částic [nm] Obr. 73: Srovnání distribučních křivek liposomových částic s uzavřeným ovotransferinem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku Liposomové částice (lysozym Serva) 14 Voda 0,9% NaCl

intenzita [%]

12 10 8 6 4 2 0

0

200

.

400 600 Velikost částic [nm]

800

1000

Obr. 74: Srovnání distribučních křivek liposomových částic s uzavřeným lysozymem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku Chitosanové částice (bez proteinu)

25

Voda 0,9% NaCl

intenzita [%]

20 15 10 5 0 0

1000 1500 2000 Velikost částic [nm] Obr. 75: Srovnání distribučních křivek chitosanových částic bez proteinu vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku 92

500

intenzita [%]

Chitosanové částice (ovotransferin PP)

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Voda 0,9% NaCl

0

500

1000 1500 2000 Velikost částic [nm] Obr. 76: Srovnání distribučních křivek chitosanových částic s uzavřeným ovotransferinem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku

Chitosanové částice (lyofilizovaný bílek PP)

25

Voda 0,9% NaCl

intenzita [%]

20 15 10 5 0

0

500

1000 1500 2000 Velikost částic [nm] Obr. 77: Srovnání distribučních křivek chitosanových částic s uzavřeným bílkem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku Chitosanové částice (ovotransferin Sigma)

25

Voda 0,9% NaCl

intenzita [%]

20 15 10 5 0

0

500

1000 1500 2000 Velikost částic [nm] Obr. 78: Srovnání distribučních křivek chitosanových částic s uzavřeným ovotransferinem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku 93

Chitosanové částice (lysozym Serva)

intenzita [%]

20

Voda 0,9% NaCl

15 10 5 0 0

500

1000 1500 2000 Velikost částic [nm] Obr. 79: Srovnání distribučních křivek chitosanových částic s uzavřeným lysozymem vystavených na 48h podmínkám fyziologického roztoku V poslední sérii experimentů byly testovány moţnosti stabilizace antimikrobiálních proteinů enkapsulací pro případ, ţe by bylo třeba uchovat stabilitu ve fyziologickém prostředí po delší dobu, případně zajistit pozvolné uvolňování antimikrobiálních látek. Byly připraveny a charakterizovány dva odlišné typy částic, z nichţ jako stabilnější v modelovém prostředí trofické tkáně se ukázaly být liposomy. Tato skutečnost by mohla být významná například při návrhu farmaceutických preparátů pro hojení ran a zevní krytí.

94

ZÁVĚRY

6 













Tato práce byla zaměřena na studium obranných ţivočišných proteinů, primárně vaječného glykoproteinu ovotransferinu a enzymu lysozymu. Byla řešena na přímé zadání průmyslové praxe v rámci inovačního voucheru JIC. V teoretické části byla zpracována rešerše zaměřená na problematiku proteinů ţivočišného původu, především proteinů vaječných a pro srovnání i mléčných. Detailně byla popsána charakteristika důleţitých vaječných proteinů s důrazem na obranné proteiny ovotransferin a lysozym. Byla diskutována mimo jiné jejich struktura, mechanismus účinku a současné poznatky o jejich specifickém účinku včetně způsobů izolace. Nakonec byly podrobně zpracovány metodické postupy analýzy a separace, metody enkapsulace do liposomů a chitosanových částic. V praktické části byl vyuţit standardní preparát ovotransferinu, standardní preparát lysozymu a komerční vzorky dodané průmyslovým partnerem – vzorek ovotransferinu ve směsi s lysozymem, lyofilizovaný bílek a terapeutické tablety s antimikrobiálním účinkem. Všechny pouţité vzorky byly charakterizovány metodou SDS-PAGE a kolorimetrickou metodou dle Hartree – Lowryho, kdy byla určena jejich koncentrace a čistota. Pro srovnání byl analyzován i reálný vzorek vaječného bílku. Byla zavedena a optimalizována metoda laboratorní separace a purifikace ovotransferinu z vaječného bílku gelovou filtrací na Sephadexu G100. Purifikovaný ovotransferin koncentrovaný ultrafiltrací byl rovněţ charakterizován metodou SDS-PAGE. Jeho čistota byla prakticky stejná jako u standardního komerčního preparátu, ovšem pro produkci ve větším mnoţství by bylo nutné frakce dále koncentrovat lyofilizací. V rámci optimalizace stanovení antimikrobiálního účinku ovotransferinu a lysozymu byly vyzkoušeny tři různé metody inhibičního stanovení. Vizuální detekce inhibičních zón při povrchové kultivaci byla provedena ve dvou variantách včetně modifikované diskové difusní metody určené primárně pro antibiotika. Další dvě metody jsou zaloţeny na detekci změny zákalu tekutého média spektrofotometricky při 630 nm. Pro doplnění byl otestován i potenciální cytotoxický vliv testovaných antimikrobiálních látek na eukaryotické buněčné kultury s vyuţitím komerčního kitu zaloţeného na redukci XTT barviva. V rámci provedených experimentů bylo zjištěno, ţe metoda detekce změny zákalu v průběhu spektrofotometrického měření vykazuje velmi dobré výsledky pro vzorky obsahující lysozym za předpokladu absence interferujících sloţek, z nichţ jako nejpravděpodobnější se jeví ovalbumin. Metoda je tedy pouţitelná pouze pro vzorky obsahující čistý lysozym, případně lysozym v kombinaci s ovotransferinem, a to výhradně při testech na citlivých grampozitivních kulturách. Metoda vizuální detekce inhibičních zón se naopak osvědčila v případě grampozitivních testovacích bakterií u všech vzorků obsahujících lysozym, přičemţ lysozym poskytoval dobrou odezvu jiţ od koncentrace 0,3 mg/ml. Naopak v případě ovotransferinu bylo nutné pouţít koncentrace i kolem 40-50 mg/ml u E. coli a více neţ 75 mg/ml u kultury B. subtilis. Metoda zaloţená na aplikaci vzorku do jamky vytvořené v agarovém médiu se ukázala jako vhodnější neţ disková metoda, u které detekce inhibičních zón při niţších koncentracích byla výrazně horší. Detekce inhibičních zón v případě ovotransferinu byla poněkud odlišná od detekce inhibičních 95







96

zón lysozymu, a to z důvodu jiného mechanismu účinku na bakteriální kultury. Lze ovšem říci, ţe i ovotransferin vykazuje určitý typ inhibičního účinku na obě testované bakterie. Třetí pouţitá metoda stanovení inhibičního účinku, zaloţená na submerzní kultivaci testovacích bakterií rovněţ potvrdila výrazný účinek lysozymu na grampozitivní bakterie a v případě ovotransferinu i aktivitu proti oběma testovaným kulturám. Tuto metodu lze označit za výrazně citlivější neţ v případě povrchových testů. Ovšem pro podrobnější stanovení antimikrobiálního účinku by bylo nutné vyuţít průtokového cytometru. V poslední sérii experimentů byly testovány moţnosti stabilizace antimikrobiálních peptidů enkapsulací pro případ, ţe by bylo třeba uchovat stabilitu ve fyziologickém prostředí po delší dobu, případně zajistit pozvolné uvolňování antimikrobiálních látek. Z pouţívaných vzorků byly enkapsulovány proteiny, směsi proteinů i komplexní vzorky, z nichţ byly připraveny lipidické a polysacharidové částice, které byly charakterizovány metodou DLS a studovány v modelových fyziologických podmínkách. Jako stabilnější v modelovém prostředí trofické tkáně se ukázaly být liposomy. Tato skutečnost by mohla být významná například při návrhu farmaceutických preparátů pro hojení ran a zevní krytí. Závěrem lze shrnout, ţe ovotransferin na rozdíl od lysozymu, který má svůj specifický enzymový účinek a specifické zaměření, vykazuje celou řadu biologicky významných vlastností, jako jsou antimikrobiální, antivirové nebo protirakovinové účinky a v neposlední řadě imunomodulační, antioxidační a antihypertensivní účinky. Nicméně pro aplikace pro farmaceutické, případně potravinářské účely je stále ještě nutné provést mnoho klinických studií a nejprve detailně porozumět roli a účinku ovotransferinu a od něj odvozených štěpených polypeptidů.

7

LITERATURA

[1]

VALENTI, P., A. STASIO, P. MASTROMERINO, L. SEGANTI, L. SINIBALDI a N. ORSI. Influence of bicarbonate and citrate on the bacteriostatic action of ovotransferrin towards Staphylococci. FEMS Microbiology Letters [online]. Amsterdam: Elsevier, 1981, vol. 10, issue 1, s. 77-79 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1981.tb06210.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1574-6968.1981.tb06210.x

[2]

VALENTI, P., P. VISCA, G. ANTONINI, N. ORSI a E. ANTONINI. The effect of saturation with Zn2+ and other metal ions on the antibacterial activity of ovotransferrin. Medical Microbiology and Immunology [online]. 1987, vol. 176, issue 3, s. - [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1007/BF00193893. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF00193893

[3]

KO, K. Y., A. F. MENDONCAM, H. ISMAIL a D. U. AHN. Ethylenediaminetetraacetate and lysozyme improves antimicrobial activities of ovotransferrin against Escherichia coli O157: H7. Poultry Science [online]. 2009-0201, vol. 88, issue 2, s. 406-414 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.3382/ps.2008-00218. Dostupné z: http://ps.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.3382/ps.2008-00218

[4]

ŠATAVA, Miroslav. Chov drůbeže. 1. vyd. Praha: SZN, 1984.

[5]

WHITTOW, G. Sturkie's avian physiology. 5th ed. San Diego: Academic Press, 2000, XIII, 685 p. ISBN 01-274-7605-9.

[6]

KOŢUŠNÍK, Zdeněk. Drůbež - zdravotní problematika velkochovů. 1. vyd. Praha: SZP, 1979.

[7]

MÍKOVÁ, Kamila. Vejce a jejich role ve výţivě. Potravinářská Revue. 2006, č. 1., str. 6-9.

[8]

LORIENT, Denis a Guy LINDEN. New ingredients in food processing biochemistry and agriculture: Egg products. Boca Raton, Fla: CRC Press, 2001. ISBN 978-1591241-300. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpNIFP0004/newingredients-in-food

[9]

WILLIAMS, G.O. a P.A. PHILLIPS. Handbook of hydrocolloids: Milk proteins. 2nd ed. Boca Raton, FL: CRC Press, 2009. ISBN 978-161-5831-135. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpHHE00002/handbook-hydrocolloids

[10]

THOMPSON, Abby, Mike BOLAND a Harjinder SINGH. Milk proteins from expression to food. Amsterdam: Academic Press/Elsevier, 2009. ISBN 978-0080920-689. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpMPEF0001/milkproteins-from-expression

[11]

KORHONEN, H. a A. PIHLANTO. Food-derived Bioactive Peptides - Opportunities for Designing Future Foods. Current Pharmaceutical Design [online]. 2003-06-01, vol. 9, issue 16, s. 1297-1308 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.2174/1381612033454892. Dostupné z: http://www.eurekaselect.com/openurl/content.php?genre=article

[12]

SCHADE, A. L. a L. CAROLINE. Raw hen egg white and the role of iron in growth inhibition of Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Science [online]. 1944-07-07, vol. 100, issue 2584, s. 1497

15 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1126/science.100.2584.14. http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.100.2584.14

Dostupné

z:

[13]

WILLIAMS, J. A comparison of glycopeptides from the ovotransferrin and serum transferrin of the hen. Biochemical Journal [online]. 1968, č. 108, s. 57-67 [cit. 201404-22]. Dostupné z: http://www.biochemj.org/bj/108/0057/1080057.pdf

[14]

HUOPALAHTI, R, R LÓPEZ-FANDIÑO, M ANTON a R SCHADE. Bioactive egg compounds - Ovotransferrin. Berlin: Springer, 2007. ISBN 978-354-0378-853.

[15]

Conalbumin from chicken egg white: Ovotransferrin - substantially iron free. SIGMA-ALDRICH CO. LLC. [online]. 2014 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0755?lang=en®ion=CZ

[16]

KUROKAWA, H, J.C DEWAN, B MIKAMI, J.C SACCHETTINI a M HIROSE. APO OVOTRANSFERRIN: Crystal structure of hen apo-ovotransferrin. RCSB. Protein Data Bank [online]. 1999 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1aiv

[17]

CONALBUMIN Basic information. SHANGHAI HENG YUE CHEMICAL TECHNOLOGY CO., Ltd. Chemical Book [online]. 2008 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB4358985_EN.htm

[18]

WU, Jianping a Alexandra ACERO-LOPEZ. Ovotransferrin: Structure, bioactivities, and preparation. Food Research International [online]. 2012, vol. 46, issue 2, s. 480487 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.07.012. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0963996911004522

[19]

CHARTER, E a G LAGARDE. Encyclopedia of food microbiology: Natural antimicrobial systems/lysozyme and other proteins in eggs. San Diego: Academic Press/Elsevier, 2004.

[20]

KUROKAWA, Hirofumi, Bunzo MIKAMI a Masaaki HIROSE. Crystal Structure of Diferric Hen Ovotransferrin at 2.4 Å Resolution. Journal of Molecular Biology [online]. 1995, vol. 254, issue 2, s. 196-207 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1006/jmbi.1995.0611. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022283685706110

[21]

LIN, Lung Nan, Anne B. MASON, Robert C. WOODWORTH a John F. BRANDTS. Calorimetric Studies of Serum Transferrin and Ovotransferrin. Estimates of Domain Interactions, and Study of the Kinetic Complexities of Ferric Ion Binding. Biochemistry [online]. 1994, vol. 33, issue 7, s. 1881-1888 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1021/bi00173a035. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi00173a035

[22]

MIZUTANI, Kimihiko, Bunzo MIKAMI a Masaaki HIROSE. Domain closure mechanism in transferrins: new viewpoints about the hinge structure and motion as deduced from high resolution crystal structures of ovotransferrin N-lobe. Journal of Molecular Biology [online]. 2001, vol. 309, issue 4, s. 937-947 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1006/jmbi.2001.4719. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022283601947199

[23]

IBRAHIM, Hisham R, Eiko IWAMORI, Yasushi SUGIMOTO a Takayoshi AOKI. Identification of a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin.

98

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research [online]. 1998, vol. 1401, issue 3, s. 289-303 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1016/S0167-4889(97)00132-8. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0167488997001328 [24]

IBRAHIM, H.R. Insights into the structure-function relationships of ovalbumin, ovotransferrin, and lysozyme. Hen eggs their basic and applied science: CRC Press [online]. 1997 [cit. 2014-04-22].

[25]

ABDALLAH, Fadi Bou a Jean-Michel El Hage CHAHINE. Transferrins, the mechanism of iron release by ovotransferrin. European Journal of Biochemistry [online]. 1999, vol. 263, issue 3, s. 912-920 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1046/j.14321327.1999.00596.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1046/j.14321327.1999.00596.x

[26]

SIM, J, Shuryo NAKAI, W. GUENTER, F. BARON, S. FAUVEL a M. GAUTIER. Egg nutrition and biotechnology: Behaviour of Sallmonella enteritidis in industrial egg white: Egg naturally contains factors inhibitory to salmonela growth. New York, NY, USA: CABI Pub., 2000, XXIV, 495 p. ISBN 08-519-9330-3.

[27]

VALENTI, P., G.R.H ANTONINI, P VISCA, N ORSI a E ANTONINI. Studies of the antimicrobial activity of ovotransferrin. International Journal of Tissue Reactions [online]. 1983, č. 5, s. 97-105 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6345431

[28]

VALENTI, P., A. STASIO, L. SEGANTI, P. MASTROMARINO, L. SINIBALDI a N ORSI. Capacity of staphylococci to grow in the presence of ovotransferrin or CrCl 3 as a character of potential pathogenicity. Journal of Clinical Microbiology [online]. Washington: American Society for Microbiology, 1975-1980, č. 11 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC273428/

[29]

VALENTI, Piera, Paolo VISCA, Giovanni ANTONINI a Nicola ORSI. Interaction between lactoferrin and ovotransferrin and Candida cells. FEMS Microbiology Letters [online]. 1986, vol. 33, 2-3, s. 271-275 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1986.tb01285.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1574-6968.1986.tb01285.x

[30]

BARON, Florence, Michel GAUTIER a Gerard BRULE. Factors Involved in the Inhibition of Growth of Salmonella enteritidis in Liquid Egg White. Journal of Food Protection [online]. 1997, č. 11, s. 1302-1471 [cit. 2014-04-24].

[31]

KO, K. Y., A. F. MENDONCA a D. U. AHN. Influence of Zinc, Sodium Bicarbonate, and Citric Acid on the Antibacterial Activity of Ovotransferrin Against Escherichia coli O157: H7 and Listeria monocytogenes in Model Systems and Ham. Poultry Science [online]. 2008-12-01, vol. 87, issue 12, s. 2660-2670 [cit. 2014-0422]. DOI: 10.3382/ps.2007-00503. Dostupné z: http://ps.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.3382/ps.2007-00503

[32]

VALENTI, Piera, Paolo VISCA, Giovanni ANTONINI a Nicola ORSI. Antifungal activity of ovotransferrin towards genus Candida. Mycopathologia [online]. 1985, vol. 89, issue 3, s. 169-175 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1007/BF00447027. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF00447027

[33]

GIANSANTI, Francesco, M. Teresa MASSUCCI, M. Federica GIARDI, Fabrizio NOZZA, Emy PULSINELLI, Claudio NICOLINI, Dario BOTTI a Giovanni 99

ANTONINI. Antiviral activity of ovotransferrin derived peptides. Biochemical and Biophysical Research Communications [online]. 2005, vol. 331, issue 1, s. 69-73 [cit. 2014-04-24]. DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.03.125. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006291X05006327 [34]

FRAENKEL, H. a R.E. FEENEY. The metal-binding activity of conalbumin. Archives of Biochemistry and Biophysics [online]. New York: Academic Press, 1951, roč. 1, č. 29, s. 101-113 [cit. 2014-04-24]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14790798

[35]

WARNER, R.C. a I. WEBER. The preparation of crystalline conalbumin. The Journal of Biological Chemistry [online]. Baltimore: American Society of Biological Chemists, 1951, č. 191, s. 173-180 [cit. 2014-04-24]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14850457

[36]

AZARI, Parviz a Robert F. BAUGH. A simple and rapid procedure for preparation of large quantities of pure ovotransferrin. In: Archives of Biochemistry and Biophysics [online]. 1967, s. 138-144. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/0003-9861(67)90289-5.

[37]

GUERIN, C. a G. BRULE. Separation of three proteins from egg white. Sciences Des Aliments. 1992, roč. 4, č. 12, s. 705-720 [cit. 2014-04-24].

[38]

RHODES, M.B., P.R. AZARI a R.E. FEENEY. Analysis, fractionation, and purification of egg white proteins with cellulose-cation exchanger. The Journal of Biological Chemistry [online]. Baltimore: American Society of Biological Chemists, 1958, č. 230 [cit. 2014-04-24]. Dostupné z: http://www.jbc.org/content/230/1/399.full.pdf

[39]

AL-MASHIKHI, S. A. a Shuryo NAKAI. Separation of ovotransferrin from egg white by immobilized metal affinity chromatography. Agricultural and Biological Chemistry [online]. 1987, vol. 51, issue 11, s. 2881-2887 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1271/bbb1961.51.2881.

[40]

AWADÉ, A.C., S. MOREAU, D. MOLLÉ, G. BRULÉ a J.-L. MAUBOIS. Two-step chromatographic procedure for the purification of hen egg white ovomucin, lysozyme, ovotransferrin and ovalbumin and characterization of purified proteins. Journal of Chromatography A [online]. 1994, vol. 677, issue 2, s. 279-288 [cit. 201404-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/0021-9673(94)80156-8.

[41]

VACHIER, M.C., M. PIOT a A.C. AWADÉ. Isolation of hen egg white lysozyme, ovotransferrin and ovalbumin, using a quaternary ammonium bound to a highly crosslinked agarose matrix. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications [online]. 1995, vol. 664, issue 1, s. 201-210 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/0378-4347(94)00411-w.

[42]

CROGUENNEC, Thomas, Françoise NAU, Stéphane PEZENNEC, Michel PIOT a Gérard BRULÉ. Two-step chromatographic procedure for the preparation of hen egg white ovotransferrin. European Food Research and Technology [online]. 2001, vol. 212, issue 3, s. 296-301 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1007/s002170000242.

[43]

KO, K. Y. a D. U. AHN. An Economic and Simple Purification Procedure for the Large-Scale Production of Ovotransferrin from Egg White. Poultry Science [online].

100

2008, vol. 87, issue 7, s. 1441-1450 http://dx.doi.org/10.3382/ps.2007-00434.

[cit.

2014-04-24].

DOI:

[44]

IBRAHIM, Hisham R, Yasushi SUGIMOTO a Takayoshi AOKI. Ovotransferrin antimicrobial peptide (OTAP-92) kills bacteria through a membrane damage mechanism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects [online]. 2000, vol. 1523, 2-3, s. 196-205 [cit. 2014-04-24]. DOI: 10.1016/S0304-4165(00)00122-7. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304416500001227

[45]

MIZUTANI, Kimihiko, Bunzo MIKAMI a Masaaki HIROSE. Domain closure mechanism in transferrins: new viewpoints about the hinge structure and motion as deduced from high resolution crystal structures of ovotransferrin N-lobe. In: Journal of Molecular Biology [online]. 2001, s. 937-947. DOI: http://dx.doi.org/10.1006/jmbi.2001.4719.

[46]

MCKNIGHT, G.S. a R.D. PALMITER. Transcriptional regulation of the ovalbumin and conalbumin genes by steroid hormones in chick oviduct. The Journal of Biological Chemistry [online]. Baltimore: American Society of Biological Chemists, 1979, roč. 18, č. 254 [cit. 2014-04-24].

[47]

IBRAHIM, Hisham R, Eiko IWAMORI, Yasushi SUGIMOTO a Takayoshi AOKI. Identification of a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research [online]. 1998, vol. 1401, issue 3, s. 289-303 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/s01674889(97)00132-8.

[48]

HARTMANN, Rainer a Hans MEISEL. Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current Opinion in Biotechnology [online]. 2007, vol. 18, issue 2, s. 163-169 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2007.01.013.

[49]

FUJITA, Hiroyuki a Masaaki YOSHIKAWA. LKPNM: a prodrug-type ACEinhibitory peptide derived from fish protein. Immunopharmacology [online]. 1999, vol. 44, 1-2, s. 123-127 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/s01623109(99)00118-6.

[50]

IMOTO, Taiji, Hidenori YAMADA, Kiyotaka OKAZAKI, Tadashi UEDA, Ryota KUROKI a Takanori YASUKOCHI. Modifications of stability and function of lysozyme. Journal of Protein Chemistry. 1987, roč. 6, č. 2, s. 95-105. ISSN 02778033. DOI: 10.1007/BF00247759. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/BF00247759

[51]

SAMBROOK, Joseph a David W RUSSELL. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd. ed. New York: Cold spring harbor laboratory press, 2001, 3 s. ISBN 978-0-87969577-4.

[52]

AUSUBEL, Frederick M. MASSACHUSETTS GENERAL HOSPITAL & HARVARD MEDICAL SCHOOL. Current Protocols in Molecular Biology. Massachusetts: Media, Pa. J. Wiley, 1994. ISBN 97804715033782.

[53]

LASCHTSCHENKO, P. Uber die keimtötende und entwicklungshemmende Wirkung von Hühnereiweiß. Zeitschrift für Hygiene und Infektionskrankheiten. 1909, roč. 64, č. 1, s. 419-427. ISSN 0300-8584. DOI: 10.1007/BF02216170. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/BF02216170 101

[54]

FLEMING, A. On a Remarkable Bacteriolytic Element Found in Tissues and Secretions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 1922-05-01, roč. 93, č. 653, s. 306-317. ISSN 0962-8452. DOI: 10.1098/rspb.1922.0023. Dostupné z: http://rspb.royalsocietypublishing.org/cgi/doi/10.1098/rspb.1922.0023

[55]

Lysozyme: Activity, Stability, Safety. FORDRAS S.A. Fordras: Official websites [online]. Lugano, Switzerland, 2012 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://www.fordras.com/lysozyme/

[56]

VOET, Donald. Biochemie. 1. vyd. Praha: VICTORIA PUBLISHING, 1995, 1325 s. ISBN 80-856-0544-9.

[57]

LAKE, Robert. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. 89G0393. Direct Food Substances Affirmed as Generally Recognized as Safe;: Egg White Lysozyme. USA, 1998, 12421-12426. Dostupné z: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/FR1998-03-13/html/98-6571.htm

[58]

Lysozyme from chicken egg white. SERVA. Serva Electrophoresis [online]. 2007 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://www.serva.de/enDE/ProductDetails/592_28262_Lysozyme_from_chicken_egg _white_min_100_000_units_mg_cryst.html

[59]

SPEIJERS, G. J. A a M. E VAN APELDOORN. Lysozyme: National Institute of Public Health and Environmental Protection, Laboratory for Toxicology. INCHEM. International Programme on Chemical Safety: Chemical Safety Information from Intergovernmental Organizations [online]. Bilthoven, The Netherlands, 2012 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v30je04.htm

[60]

THAMMASIRIRAK, Sompong, Sutthidech PREECHARRAM, Pornpimol PONKHAM, Sakda DADUANG, Tomohiro ARAKI a Jisnuson SVASTI. New variant of quail egg white lysozyme identified by peptide mapping. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 2007, roč. 147, č. 2, s. 314-324. ISSN 10964959. DOI: 10.1016/j.cbpb.2007.01.019. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1096495907000747

[61]

The PDB structure of HEN EGG WHITE LYSOZYME. PDBE. Protein Data Bank Europe: Bringing Structure to Biology [online]. 1993 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://www.pdbe.org/132l

[62]

SØRENSEN, M. a S. P. L. SØRENSEN. The proteins in whey. Copenhague, 1939.

[63]

METZ-BOUTIGUE, M. H., J. JOLLES, P. JOLLES, J. MAZURIER, G. SPIK a J. MONTREUIL. Amino acid sequence, location and phylogenetic aspects of the glycopeptides of human lactotransferrin.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure. 1980, vol. 622, issue 2, s. 308-314. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/0005-2795(80)90041-0

[64]

KANYSHKOVA, T. G., V. N. BUNEVA a G. A. NEVINSKY. Lactoferrin and its biological functions.Biochemistry (Moscow). vol. 66, issue 1, s. 1-7. DOI: 10.1023/A:1002817226110. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1023/A:1002817226110

102

[65]

BIRGENS, Henrik S. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: Evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia. Scandinavian Journal of Haematology [online]. 1985, vol. 34, issue 4, s. 326-331 [cit. 2014-04-24]. DOI: 10.1111/j.16000609.1985.tb00757.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.16000609.1985.tb00757.x

[66]

BROCK, Jeremy H. The physiology of lactoferrin. Biochemistry and Cell Biology. 2002, vol. 80, issue 1, s. 1-6. DOI: http://dx.doi.org/10.1139/o01-212

[67]

LEVAY, P.F. a M. VILJOEN. Lactoferrin: a general review. Haematologica [online]. 1995, roč. 80, č. 3, s. 252-267 [cit. 2014-04-24]. Dostupné z: http://www.haematologica-thj.org/content/80/3/252.full.pdf ADLEROVÁ, L., A. BARTOŠKOVÁ a M. FALDYNA. Lactoferrin: a review. Veterinarní Medicína [online]. 2008, č. 53, s. 457-468 [cit. 2014-04-24].

[68] [69]

[70]

[71]

[72]

[73] [74]

[75]

[76]

LACTOFERRIN Basic information. SHANGHAI HENG YUE CHEMICAL TECHNOLOGY CO., Ltd. Chemical Book [online]. 2008 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB1741610_EN.htm FURMANSKI, P. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron- binding capacity. Journal of Experimental Medicine. 1989, vol. 170, issue 2, s. 415-429. DOI: http://dx.doi.org/10.1084/jem.170.2.415 ABDALLAH, Fadi Bou a Jean-Michel EL HAGE CHAHINE. Transferrins: iron release from lactoferrin. Journal of Molecular Biology [online]. 2000, vol. 303, issue 2, s. 255-266 [cit. 2014-04-24]. DOI: 10.1006/jmbi.2000.4101. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022283600941019 SUN, Xiao-Lin, Heather M. BAKER, Steven C. SHEWRY, Geoffrey B. JAMESON a Edward N. BAKER. Structure of recombinant human lactoferrin expressed in Aspergillus awamori. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography [online]. 1999, vol. 55, issue 2, s. 403-407 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1107/S0907444998011226. Dostupné z: http://scripts.iucr.org/cgibin/paper?S0907444998011226 BAKER, E.N. Structure and reactivity of transferrins. Advances in inorganic chemistry and radiochemistry. New York: Academic Press, 1994, č. 41. BROCK, J H. Lactoferrin in human milk: its role in iron absorption and protection against enteric infection in the newborn infant. Archives of Disease in Childhood. 1980, vol. 55, issue 6, s. 417-421. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/adc.55.6.417 SCHRYVERS, Anthony B., Robert BONNAH, Rong-hua YU, Henry WONG a Mark RETZER. Bacterial Lactoferrin Receptors. s. 123. DOI: 10.1007/978-1-4757-90689_15. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4757-9068-9_15 ARNOLD, R., M. COLE a MCGHEE. A bactericidal effect for human lactoferrin. Science. 1977-07-15, vol. 197, issue 4300, s. 263-265. DOI: 10.1126/science.327545. Dostupné z:http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.327545

103

[77]

YAMAUCHI, K., M. TOMITA, T.J. GIEHL a R.T. ELLISON. Antibacterial activity of lactoferrin and pepsin-derived lactoferrin peptide fragment. Infection and Immunity. 1993, č. 61, s. 719-728 [cit. 2014-04-24].

[78]

BELLAMY, Wayne, Mitsunori TAKASE, Koji YAMAUCHI, Hiroyuki WAKABAYASHI, Kouzou KAWASE a Mamoru TOMITA. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1992, vol. 1121, 1-2, s. 130-136. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/0167-4838(92)90346-f

[79]

GÖRNER, Fridrich a Ľubomír VALÍK. Aplikovaná mikrobiológia poţívatín: princípy mikrobiológie poţívatín, potravinársky významné mikroorganizmy a ich skupiny, mikrobiológia potravinárskych výrob, ochorenia mikrobiálneho povodu, ktorých zárodky sú prenášané poţívatinami. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967-0649-7.

[80]

KLABAN, Vladimír. Ilustrovaný mikrobiologický slovník. První české vydání. Na Bělidle 34, 150 00 Praha 5 : Galén, 2005. 654 s. ISBN 80-7262-341-9.

[81]

Bacillus subtilis: Final Risk Assessment. U.S. ENVIROMENTAL PROTECTION AGENCY. Biotechnology Program under the Toxic Substances Control Act (TSCA) [online]. 2007, 31.1.2011 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://www.epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra009.htm

[82]

TAMBE, Y. Microscopic image of Bacillus subtilis (ATCC 6633): Gram staining, magnification: 1,000. The oval unstained structures are spores. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001-2014 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Bacillus_subtilis_Gram.jpg. GNU Licence.

[83]

WILLIAMS, D., R. VAN FRANK, W. MUTH a J. BURNETT. Cytoplasmic inclusion bodies in Escherichia coli producing biosynthetic human insulin proteins. Science [online]. 1982-02-05, vol. 215, issue 4533, s. 687-689 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1126/science.7036343. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.7036343

[84]

TAMBE, Y. Microscopic image of Escherichia coli (ATCC 11775): Gram staining, magnification: 1,000. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001-2014 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Escherichia_coli_Gram.jpg. GNU Licence.

[85]

Kultivace bakterií: Půdy, podmínky a metody. VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO. Fakulta veterinárního lékařství: Mikrobiologie pro farmaceuty [online]. 2006 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/mikrobiologie_pro_farmaceuty/praktiku m03/index.html

[86]

Encyclopedia of Bioprocess Technology – Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Volumes 1-5. John Wiley &Sons, 1999. 2024-2133 p. ISBN 1-59124457-9 CHROMÝ, Vratislav, Jiří FISCHER, Josef HAVEL a Miroslav VOTAVA. Bioanalytika. Brno: MU Brno, 2002. 267 s. ISBN 80-210-2917-X

[87]

104

[88]

KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-863-6907-2

[89]

MÁROVÁ, I., VRÁNOVÁ, D.: Praktikum z biochemie. Pracovní sešit, FCH VUT Brno, 2008 HARTREE, E.F. Determination of protein: A modification of the lowry method that gives a linear photometric response. Analytical Biochemistry [online]. 1972, vol. 48, issue 2, s. 422-427 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1016/0003-2697(72)90094-2. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0003269772900942 JANHUBA, F. Antimikrobiální peptidy a možnosti jejich aplikace do potravin. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 69 s. Vedoucí bakalářské práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc..

[90]

[91]

[92]

[93]

[94]

[95]

[96]

[97]

[98]

[99]

[100]

[101]

ABBOTT, A a ELLISON. Biologically inspired textiles. Boca Raton: CRC Press, 2008. ISBN 978-161-5835-850. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpBIT00003/biologically-inspired COOPER, Alan. Biophysical chemistry. 2nd ed. Cambridge: RSC Pub., 2011, ix, 233 p. ISBN 978-184-9730-815. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpBCE0000B/biophysical-chemistry CREIGHTON, Thomas E. The physical and chemical basis of molecular biology. Great Britain: Helvetian Press, 2010, xxxix, 642 s. ISBN 978-095-6478-108. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpPCBMB002/physical-chemicalbasis BANGHAM, A.D., M.M. STANDISH a J.C. WATKINS. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology [online]. 1965, vol. 13, issue 1, 238-IN27 [cit. 2014-04-24]. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/s0022-2836(65)80093-6. KORVASOVÁ, Zina. Příprava liposomů s antivirálním účinkem. Brno, 27.4.2006. Dostupné z: http://is.muni.cz/th/67561/. Dipolomová práce. Masyrykova unizerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta. Vedoucí práce RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. MOGHIS, Ahmad. Lipids in nanotechnology: Bioactive Egg Compounds. Urbana, IL: AOCS Press, 2012, s. 53-68. ISBN 9781613449967. Dostupné z: http://app.knovel.com/hotlink/toc/id:kpLN000001/lipids-in-nanotechnology Science and Technology: Liposomes. COLLAGENRX. CollagenRX: Creates beautiful skin [online]. USA, 2012 [cit. 2012-04-25]. Dostupné z: http://collagenrx.com/content/science-and-technology VELEBNÝ, Vladimír. ŠKOLA MOLEKULÁRNÍCH BIOTECHNLOGIÍ. Biopolymery v medicíně: Webcast. Contipro Group s.r.o, 2011. Dostupné z: http://webcast.skola-profession.cz/Contexts/profession/Documents/velebny.pdf ŠTINDLOVÁ, J. Možnosti enkapsulace přírodních antioxidantů. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 109 s. Vedoucí diplomové práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. LIU, Guogen, Lei SHAO, Fei GE a Jianfeng CHEN. Preparation of ultrafine chitosan particles by reverse microemulsion. China Particuology. 2007, roč. 5, č. 6, s. 384-390. ISSN 16722515. DOI: 10.1016/j.cpart.2007.08.002. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1672251507001236

105

[102]

[103]

[104]

[105]

[106]

[107] [108]

[109]

[110]

[111]

[112]

106

ASPDEN, Trudi J., Julian D. T. MASON, Nicholas S. JONES, James LOWE, Øyvind SKAUGRUD a Lisbeth ILLUM. Chitosan as a nasal delivery system: The effect of chitosan solutions onin vitro andin vivo mucociliary transport rates in human turbinates and volunteers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 1997, roč. 86, č. 4, s. 509-513. ISSN 0022-3549. DOI: 10.1021/js960182o. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1021/js960182o MAO, Hai-Quan, Krishnendu ROY, Vu L. TROUNG-LE, Kevin A. JANES, Kevin Y. LIN, Yan WANG, J.Thomas AUGUST a Kam W. LEONG. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency. Journal of Controlled Release. 2001, roč. 70, č. 3, s. 399-421. ISSN 01683659. DOI: 10.1016/S0168-3659(00)00361-8. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0168365900003618 BHATTARAI, Narayan, Jonathan GUNN a Miqin ZHANG. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews [online]. 2010-01-31, vol. 62, issue 1, s. 83-99 [cit. 2014-04-22]. DOI: 10.1016/j.addr.2009.07.019. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0169409X09002828 DUSTGANI, Amir, Ebrahim VASHEGHANI FARAHANI a Mohammad IMANI. Preparation of Chitosan Nanoparticles Loaded by Dexamethasone Sodium Phosphate. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2008, č. 4, s. 111-114. Dostupné z: http://www.sid.ir/en/VEWSSID/J_pdf/106720080201.pdf Malvern Zetasizer Nano ZS: Dynamický rozptyl světla, zeta potenciál. KUZEL, Radomír. KRYSTALOGRAFICKÁ SPOLEČNOST. Karlova univerzita v Praze, Fakulta Matematicko-fyzikální, Katedra fyziky kondenzovaných látek, Oddělení strukturní analýzy [online]. Praha, 8.2.2008 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: http://www.xray.cz/kfkl-osa/eng/zetasizer/ NOVÁK, Josef. Fyzikální chemie: bakalářský a magisterský kurz. Vyd. 1. Praha: Vydavatelství VŠCHT, 2008. ISBN 978-80-7080-675-3 MALVERN INSTRUMENTS LTD. Zetasizer Nano Series: User Manual. Worcestershire, UK, 2004. Dostupné z: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/files/Zetasizer_Nano_user_manual_Man03171.1.pdf BIO-RAD LABORATORIES, Inc. Mini-Protean Tetra-cell: Instruction Maual. Hercules, 2012. Dostupné z: https://www.biorad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10007296.pdf. ČEŠKOVÁ, I. Monitoring obsahu vybraných nutričně významných látek v mateřském mléku v české populaci. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2006. 110 s. Vedoucí diplomové práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. ISO 3696:1987. Water for analytical laboratory use - Specification and test methods. 2011. Dostupné z: http://www.iso.org/iso/home/store/catalogue_tc/catalogue_detail.htm?csnumber=916 9 LEBENDIKER, Mario. Silver Stain Protocol. THE WOLFSON CENTRE FOR APPLIED STRUCTURAL BIOLOGY. The Protein Purification Facility: The Hebrew University of Jerusalem [online]. 2002 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/Silver%20Stain.html

[113]

[114]

[115]

[116]

[117]

[118]

[119]

[120]

HOWARD HUGHES MEDICAL INSTITUTE AND SMITH COLLEGE - CENTER FOR PROTEOMICS. Silver staining protocol: Compatible with mass spectrometry. Northampton, Massachusetts, 2014. Dostupné z: http://www.science.smith.edu/departments/cfp/Silverstainingprotocol.doc Protocol for Silver Staining. THE ROCKEFELLER UNIVERSITY. Proteomics Resource Center [online]. NewYork, 2014 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://proteomics.rockefeller.edu/ms_silverStaining MATOUŠKOVÁ, P. Produkce a charakterizace extracelulárních hydroláz z vybraných druhů plísní. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 100 s. Vedoucí diplomové práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc BARTON, Scott. Phosphate Buffer Calculation: A Javascript that calculates the amount of monosodium phosphate and disodium phosphate necessary to achieve a buffer at a given pH and strength. MICHIGAN STATE UNIVERSITY. Chemical Engeneering and Materials Science: Laboratory Tools [online]. Michigan, 2000 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.egr.msu.edu/biofuelcell/tools/phosphate/phosphate.html ROLAND, Joseph. Henderson-Hasselbalch Calculator for Tris Buffers: Using Trisbase and Hydrochloric Acid. CYTOGRAPHICA. Lab tools: Calculators [online]. 2009 [cit. 2014-04-22]. LB broth, Miller. Enriched bacterial growth medium for E coli. SIGMA-ALDRICH CO. LLC. Sigma-Aldrich Web. [online]. 2014 [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/l3152?lang=en®ion=CZ In Vitro Toxicology Assay Kit, XTT based: Assays and Reagents for Measuring Cytotoxicity, Proliferation and Viability. SIGMA-ALDRICH CO. LLC. SigmaAldrich Web [online]. 2014 [cit. 2014-04-24]. Dostupné z: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/tox2?lang=en®ion=CZ AHN, D.U., E.J. LEE a Aubrey MENDONCA. ANIMAL SCIENCE DEPARTMENT, Iowa State University. Production of Ovotransferrin from Egg White for Antimicrobial Application. Iowa

107

SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK

8 

BSA – Bovine Serum Albumin (hovězí sérový albumin)



GRAS – Generally Recognized As Safe (Obecně shledáno jako bezpečné)



FAO – Food and Agriculture Organization (Organizace pro výţivu a zemědělství)



WHO – World Health Organization (Světová zdravotnická organizace)



JECFA – The Joint FAO/WHO Committee on Food Additives (Kontrolní komise FAO/WHO pro potravinářské přísady)



SDS – Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecylsíran sodný)



PAGE – Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu)



AA – akrylamide (akrylamid)



BIS – N,N’-methylenbisakrylamide (N,N’-metylenbisakrylamid)



APS – amonium persulfate (Peroxodisíran amonný)



TEMED – N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (N,N,N’,N’tetrametyletylendiamin)



TRIS – 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol



ELISA – Enzyme-Linked Imunosorbent Assay (Imunologická metoda pro detekci protilátek)



DLS – Dynamic Light Scattering (Dynamický rozptyl světla)



GPC – Gel Permeation Chromatography (Gelová permeační chromatografie)

108