Penetapan kadar/potensi antibiotik dengan cara mikrobiologi Slamet Ibrahim Marlia Singgih School of Pharmacy ITB
Pendahuluan • Antibiotik : sintetik, semi-sintetik • Kasus retensi mikroba patogen menaikkan dosis nya atau mengganti dengan antibiotik baru • banyak penemuan2 antibiotik baru, sehingga perlu ditetapkan potensi nya
Acuan • Farmakope Indonesia • CLSI • USP (United States Pharmacopoeia), • EP (European Pharmacopoeia), • BP (British Pharmacopoeia), • JP (Japanese Pharmacopoeia), • AOAC (American Association of Analytical Chemists), • US-CFR (Code of Federal Registry) and a custom single plate method.
Skrining antimikroba dari mikroorganisme di alam
Pengertian kadar vs potensi
• Kadar jumlah per satuan berat/volume • Potensi ukuran kekuatan /daya hambat atau daya bunuh zat aktif terhadap mikroorganisme tertentu
Mengapa harus dengan cara mikrobiologi? • Respons mikroba terhadap antibiotik berbeda-beda • Spesifik • Sensitif
Metode penetapan potensi suatu senyawa • Antibiotik • Hormon • Vitamin
Penetapan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi • Dilakukan untuk senyawa antibiotik baru atau untuk tujuan konfirmasi • Tidak semua antibiotik ditentukan potensinya secara mikrobiologi • Penetapan dilakukan terhadap Bahan baku dan sediaan
Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan Farmakope Indonesia edisi IV 1995
Estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik, dan umum digunakan sebagai rujukan.
Metode Umum 1. Lempeng (silinder / kertas cakram)
2. Turbidimetri (tabung)
Metode Lempeng Silinder Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng yang berisi biakan mikroba uji pada jumlah tertentu
Mikroba dihambat pertumbuhannya
Desain pengujian 5+1 • Larutan baku pembanding yang dibuat pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5 dengan tingkat perbandingan 1,25. • Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya 10 IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4 IU/mL, S4=12,5 IU/mL dan S5=15,6 IU/mL
Dosis baku Dosis sampel
• Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam selinder atau serapkan pada kertas cakram sebanyak 100 μL di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji. • Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada 35-37 ºC selama 18-24 jam. • Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.
Pola letak uji pada desain (5+1) S3
S3
S1
S2
S3 S5
S4
S3 U
S3
Dosis S3 Dosis lainnya
Desain pengujian (5+1) • Sebelum menghitung potensi , dilakukan terlebih dahulu koreksi garis tengah ratarata diameter daerah hambat dosis larutan baku S1, S2, S4 dan S5 • Cara :
• Hitung diameter rata-rata S3 di semua cawan (Y3T) • Hitung diameter rata-rata S3 pada masingmasing cawan larutan baku S1,2,4 dan 5 (Y31, Y32, Y34 dan Y35) • Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y1, Y2, Y4 dan Y5)
Maka diameter koreksi masing-masing larutan baku adalah : • • • • •
S1 (a) = Y1 + (Y3T – Y31) S2 (b) = Y2 + (Y3T – Y32) S3 (c) = Y3T S4 (d) = Y4 + (Y3T – Y34) S5 (e) = Y5 + (Y3T – Y35)
Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis terendah dan tertinggi yaitu :
YR =
(3a + 2b + c – e ) 5
YR = diameter hambat dosis terendah YT = diameter hambat
YT
=
(3e + 2d + c – a ) 5
dosis tertinggi
• Selanjutnya dibuat kurva baku pada kertas semilog : • Sumbu X : log dosis • Sumbu Y : diameter hambat • Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai S5 (YT)
Cara Perhitungan potensi sampel Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji, dilakukan koreksi diameter larutan sampel U: YU koreksi = YS + (YU – Y3U) Y3U = diameter rata-rata S3 pada pengujian larutan U YU = diameter rata-rata U pada cawan larutan U YS = Hasil interpolasi S3 pada kurva baku
Perhitungan Potensi sampel • Potensi sediaan uji ditentukan dengan menginterpolasi YU pada sumbu Y ke garis kurva baku dan tarik garis ke sumbu X (diperoleh XU) • Dosis U = XU/S3 x dosis S3 • Potensi U = dosis U x faktor pengenceran
Linearity (Kelinieran) (lanjutan) a. Menggunakan persamaan garis
Perhitungan Kadar
D = b log C + a
log Cs = Ds – a/ b Diameter Hambat
x x x x x
dimana : Cs = kons. analit dlm sampel Ds = Diameter hambat
b. Menggunakan satu larutan baku dan larutan blangko log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb dimana : Log Ci Cb = kons. analit dlm lar.baku
Membandingkan hasil pengukuran diameter hambat 20
15 mm
Limit value 10
5
11 DIFFERENT
14
11 SAME
14
Interpretasi hasil
Pengukuran diameter hambat
Contoh hasil uji potensi antibiotik
Contoh BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1. PMCID: PMC2640365 Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.
Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics Andres F Zuluaga,1,2 Maria Agudelo,1 Carlos A Rodriguez,1,2 and Omar Vesga1,3 1GRIPE:
Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, Colombia of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia 3Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia Corresponding author. Andres F Zuluaga:
[email protected] ; Maria Agudelo:
[email protected] ; Carlos A Rodriguez:
[email protected] ; Omar Vesga:
[email protected] 2Department
Received June 14, 2008; Accepted January 16, 2009.
Metode • Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p dan Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic Media), menghasilkan hubungan linear antara konsentrasi zat -respons e linear dengan dua parameter : y-intercept (concentration) and slope (potency). • Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3 produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism 5.0).
Pengolahan data dalam proses validasi • Ditentukan linearity, limit of quantification, precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasi method for testing pharmaceutical equivalence. • Untuk tujuan tersebut, log-transformed concentrations (x-axis, log10 mg/L) dari setiap produk diplot terhadap masing-masing diameter hambat nya (y-axis, rata-rata diameter dalam mm); intercept (perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi linear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai yintercept dan m sebagai nilai kemiringan nya
• 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masingmasing antibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin), 0.125 – 64 mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128 mg/L (vancomycin) • The goodness of fit to the model (linearity) : dinyatakan dalam coefficient of determination (r2) dan standard error of estimate (Syx). • Dihitung pula x-intercept (log10 mg/L) dan kemiringan garis regresi dengan kepercayaan 95% confidence intervals (95% CI)
Results • Validasi metode menghasilkan linearitas (r2 ≥ 0.98), precision (intra-assay variation ≤ 11%; inter-assay variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests , sesuai dengan syarat international pharmacopoeial . • Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25% API (Py-intercept = 0.001), penentuan potensi antibiotik menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik memberikan undistinguishable slopes dan intercepts (P > 0.66). • Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 - 100.5 , gentamisin 99.7 - 100.2, dan vancomycin 98.5 - 99.9%
Precision of the vancomycin bioassay Vancomycin concentration (mg/L)
Inhibition zone diameters (mean in mm ± SD)
128
18.00 ± 0.04
8.3
10.3
64
16.33 ± 0.02
5.6
10.5
32
14.16 ± 0.11
11.0
1.0
16
11.62 ± 0.37
7.4*
2.3
8
9.59 ± 0.00
4.6
6.5
Coefficient of variation Coefficient of variation (%) Intra-day (%) Inter-day
*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV) BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1. Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.
Kurva baku masing2 antibiotik
Penetapan nilai potensi antibiotik
