Petr Henke FOTOAKTIVNÍ SULFONOVANÉ POLYSTYRENOVÉ NANOMATERIÁLY. Photoactive Sulfonated Polystyrene Nanomaterials

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE P ř ír o d o v ě d e c k á f a k u lt a Studijní program: Klinická a toxikologická analýza

Petr Henke

FOTOAKTIVNÍ SULFONOVANÉ POLYSTYRENOVÉ NANOMATERIÁLY Photoactive Sulfonated Polystyrene Nanomaterials

D i p l o mo v á p r á c e

Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Jiří Mosinger, Ph.D.

Praha 2011

Tato

diplomová

práce

vznikla

v

souvislosti

s

řešením

výzkumného

záměru

MSM0021620857.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědom toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity.

V Praze dne 28. srpna 2011

--2--

Rád bych zde poděkoval svému školiteli Doc. RNDr. Jiřímu Mosingerovi, Ph.D. za vedení mé diplomové práce. Také bych rád poděkoval RNDr. Pavlu Kubátovi, CSc. za pomoc při měření na aparatuře časově rozlišené spektroskopie a Mgr. Lukáši Plíštilovi za poskytnutí snímků ze skenovacího elektronového mikroskopu.

--3--

ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá přípravou a studiem tří nových typů fotoaktivních nanomateriálu, a to sulfonované polystyrenové (PS) nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným fotosensitizerem sulfonovaných

5,10,15,20-meso-tetrafenylporfyrinem PS

nanovlákenných

vrstev

(TPP)

s povrchově

uvnitř vázanými

nanovláken

a

kationtovými

fotosensitizery (5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porfyrinem (TMPyP) a Sn(IV) (5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porfyrinem (TMPyP(Sn)). Vedle spektrálních charakteristik těchto materiálů je v práci studována iontová výměnná kapacita a dále fotogenerace

1

O2 a H2O2. U všech studovaných materiálů byla časově rozlišenou

spektroskopií sledováním fosforescence 1O2, a zpožděné fluorescence fotosensitizeru, prokázána fotogenerace 1O2. Fotogenerace H2O2 detekovaná metodou zhášení fluorescence scopoletinu byla nalezena u nanomateriálů s povrchově vázanými fotosensitizery. Fotobaktericidní vlastnosti vůči E. Coli byly zjištěny u všech studovaných nanomateriálů. Bez viditelného záření nebyly baktericidní vlastnosti zaznamenány. To ukazuje, že baktericidní vlastnosti nanovlákenných nanomateriálů způsobuje fotogenerovaný případně H2O2.

Předmětová hesla: fotochemie, fotofyzika, fotocytotoxicita Klíčová slova:

singletový kyslík, peroxid vodíku, nanovlákna, fotosensitizer, polystyren

--4--

1

O2,

ABSTRACT This thesis deals with the preparation and study of three new types of photoactive nanomaterials.

Sulphonated

polystyrene

(PS)

nanofiber

layer

with

encapsulated

photosensitiser 5,10,15,20-meso-tetraphenylporphyrin (TPP) inside the nanofibers and sulfonated PS nanofiber layers with surface-bound cationic photosensitiser (5,10,15,20tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porphyrin (TMPyP) and Sn(IV) (5,10,15,20-tetrakis(Nmethylpyridinium-4-yl)porphyrin (TMPyP(Sn)). In addition to the spectral characteristics of these materials were studied ion exchange capacity and photogeneration of H2O2 and 1O2. For all studied materials were using time-resolved spectroscopy monitoring of 1O2 phosphorescence

or

delayed

fluorescence

of

photosensitiser

demonstrated

1

O2

photogeneration. H2O2 photogeneration detected by scopoletin fluorescence quenching was found in nanomaterials with surface-bound photosensitiser. Photobactericidal properties against E. coli were detected in all studied nanomaterials. Bactericidal properties were not recorded without the visible light irradiation. This shows that the bactericidal properties of nanofiber nanomaterials are caused by photogenerated 1O2 or H2O2. Subject headings:

photochemistry, photophysics, photocytotoxicity

Keywords:

singlet oxygen, hydrogen peroxide, nanofibers, photosensitizer, polystyrene

--5--

OBSAH 1. TEORETICKÝ ÚVOD........................................................................................................................ - 9 1.1. SINGLETOVÝ KYSLÍK A DALŠÍ REAKTIVNÍ KYSLÍKOVÉ ČÁSTICE...........................................................- 9 1.2. FOTOSENSITIZOVANÉ REAKCE ........................................................................................................- 10 1.3. FOTOSENSITIZERY ..........................................................................................................................- 11 1.4. NANOVLÁKENNÉ VRSTVY ...............................................................................................................- 13 1.5. DOSAVADNÍ POZNATKY ..................................................................................................................- 14 2. CÍL PRÁCE....................................................................................................................................... - 16 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................................. - 17 3.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE, BAKTERIE A NANOVLÁKENNÉ VRSTVY ..........................................................- 17 3.1.1. Chemikálie............................................................................................................................ - 17 3.1.2. Nanovlákenné vrstvy ............................................................................................................. - 17 3.1.3. Bakterie................................................................................................................................ - 18 3.1.4. Agarová půda ....................................................................................................................... - 18 3.2. PŘÍSTROJE A METODY .....................................................................................................................- 18 3.2.1. Sulfonace PS nanovlákenných vrstev ..................................................................................... - 18 3.2.2. Snímky ze skenovacího elektronového mikroskopu ................................................................. - 18 3.2.3. Stanovení adsorbovaného Fe2+.............................................................................................. - 19 3.2.4. Příprava sulfonovaných PS nanovlákenných vrstev s externě vázanými porfyriny.................. - 20 3.2.5. UV-VIS absorpční spektra..................................................................................................... - 21 3.2.6. Fluorescenční a excitační spektra.......................................................................................... - 21 3.2.7. Stanovení fotoprodukovaného H2O2....................................................................................... - 21 3.2.8. Ozařovací aparatůra............................................................................................................. - 22 3.2.9. Detekce singletního kyslíku ................................................................................................... - 22 3.2.9.1. Fosforescence 1O2 ......................................................................................................................... - 22 3.2.9.2. Zpožděná fluorescence .................................................................................................................. - 22 3.2.9.3. Kyselina močová........................................................................................................................... - 23 -

3.2.10. Fotocytotoxicita .................................................................................................................. - 23 3.2.11. Statistické vyhodnocení dat ................................................................................................. - 24 3.2.12. Použitý software.................................................................................................................. - 25 4. VÝSLEDKY A DISKUZE................................................................................................................. - 26 4.1. STANOVENÍ ADSORBOVANÉHO FE2+ NA SULFONOVANÉ NANOVLÁKENNÉ VRSTVY.............................- 26 4.2. SNÍMKY NANOVLÁKENNÝCH VRSTEV ZE SKENOVACÍHO ELEKTRONOVÉHO MIKROSKOPU...................- 29 4.3. ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRA NANOVLÁKENNÝCH VRSTEV ............................................................- 30 4.4. DETEKCE SINGLETOVÉHO KYSLÍKU .................................................................................................- 36 4.4.1. Fosforescence 1O2 ................................................................................................................. - 36 4.4.2. Zpožděná flourescence .......................................................................................................... - 37 4.4.3. Kyselina močová................................................................................................................... - 37 -

--6--

4.5. DETEKCE A STANOVENÍ FOTOPRODUKOVANÉHO H2O2 .....................................................................- 38 4.6. TESTY FOTOCYTOTOXICITY NANOVLÁKENNÝCH VRSTEV .................................................................- 42 5. ZÁVĚR .............................................................................................................................................. - 44 6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ............................................................................................... - 46 -

--7--

SEZNAM ZKRATEK A SYMBOLŮ ROS

„reactive oxygen species“ reaktivní kyslíkové částice

ic

„internal conversion“, vnitřní konverze

isc

„intersystem crossing”, mezisystémový přechod

1

singletový kyslík

O2

O2(1g)

energeticky bohatší forma singletového kyslíku

O2(1g)

stabilnější forma singletového kyslíku

3

kyslík v základním tripletovém stavu

O2

OH˙

hydroxylový radikál

O2–

superoxidový anion radikál

PS

polystyren

PUR

polyuretan

S0

fotosensitizer v základním singletovém stavu

S1

fotosensitizer v nejnižším excitovaném singletovém stavu

T1

fotosensitizer v nejnižším excitovaném tripletovém stavu

TMPyP

(5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porfyrin

TMPyP(Sn)

Sn(IV) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porfyrin

TPP

5,10,15,20-meso-tetrafenylporfyrin

SEM

„scanning electron microscope“ skenovací elektronový mikroskop

IEC

„iont exchange capacity“ iontová výměnná kapacita

SODF

„singlet oxygen delayed fluorescence“ zpožděná fluorescence

--8--

1. TEORETICKÝ ÚVOD 1.1. SINGLETOVÝ KYSLÍK A DALŠÍ REAKTIVNÍ KYSLÍKOVÉ ČÁSTICE Většina látek má v základním stavu spárované elektrony a tedy multiplicitu spinu jedna. Jejich reakce s běžně se vyskytujícím molekulárním kyslíkem v základním tripletovém stavu 3O2 jsou proto spinově zakázané podle pravidla o zachování spinu. 1 Tyto reakce mají proto vysokou aktivační energii a jsou silně exotermické, na rozdíl od spinově povolených reakcí se singletovým kyslíkem 1O2 , což je vysoce reaktivní a energeticky bohatší forma molekulárního kyslíku v excitovaném stavu. V molekule singletového kyslíku mají jeho dva elektrony v nejvyšším antivazebném orbitalu antiparalelní spin, takže má multiplicitu spinu jedna tj. singlet. Existují dvě formy singletového kyslíku: stabilnější O2(1g) a energeticky bohatší O2(1g)

forma. Při fotosensitizované produkci 1O2 závisí podíl vznikajících forem na

povaze fotosensitizeru i rozpouštědla. Méně stabilní O2(1g) přechází na O2(1g) spinově povoleným přechodem na rozdíl od přechodů O2(1g) a O2(1g) do základního stavu O2(3g), které jsou spinově zakázané. Proto má O2(1g) mnohem kratší dobu života než O2(1g).2 Při fotooxidačních reakcích 1O2 má O2(1g) vzhledem ke své krátké době života význam pouze jako prekurzor O2(1g). Singletový kyslík vzniká chemickými reakcemi jako například reakcí chlornanů s peroxidem vodíku3 a nebo tepelným rozkladem endoperoxidů4. Příkladem fyzikálního procesu vzniku 1O2 je mikrovlnný výboj v kyslíkové atmosféře. 1O2 vzniká též fotolýzou ozonu5 a je také produktem některých peroxidas6. V porovnání s kyslíkem vykazují vyšší reaktivitu i ostatní reaktivní kyslíkové častice (ROS; „reactive oxygen species“). Další ROS jsou například OH˙, O2– a H2O2. Hydroxylový radikál (OH˙) je neutrální forma hydroxidového iontu (OH-). Vzniká například Fentonovou reakcí7. Ta spočívá v rozkladu peroxidu vodíku za katalýzy dvojmocným železem: Fe 2  H 2 O2  OH   OH   Fe 3

( 1)

--9--

Fe2+ se může regenerovat jednou ze dvou následujících reakcí: Fe 3  H 2 O2  Fe 2  OOH   H 

( 2)

Fe 3  OOH   Fe 2  O2  H 

( 3)

Fentonova reakce je pro svou energetickou nenáročnost a silné oxidační vlastnosti vznikajícího hydroxylového radikálu využívána například při čištění odpadních vod.8 Další ROS, superoxidový anion radikál (O2–) je molekulární kyslík obohacený o další elektron. Kromě fotosensitizované reakce I.typu vzniká také při metabolických pochodech u aerobních organismů9, kde se také účastní fagocytózy10 a buněčné signalizace11. Ve vodných roztocích dochází k protonizaci O2–

na OOH˙ a následné

disproporcionaci za vzniku H2O2.12 O2  H   OOH 

( 4)

2 OOH   H 2O2  O2

( 5)

1.2. FOTOSENSITIZOVANÉ REAKCE Fotosensitizované reakce mají patrně největší význam pro tvorbu Grotthusova-Draperova

teorému

vyvolá

fotochemickou

změnu

pouze

1

O2. Podle

molekulou

absorbované světelné kvantum. Kyslík nemá v UV/VIS oblasti výraznější absorpci, je ale možné ho excitovat prostřednictvím jiné látky, tzv. fotosensitizeru. Fotosensitizer v základním singletovém stavu stavu S0 absorbuje světelné kvantum a přechází do vyšších excitovaných stavů Sn. Vyšší excitované stavy rychle přecházejí na nejnižší excitovaný singletový stav S1. Ten se spontánně deaktivuje vyzářením energie ve formě fluorescence, vnitřní konverzí

(„internal conversion“,

ic)

na základní

singletový stav

nebo

mezisystémovým přechodem („intersystem crossing“, isc) do tripletového stavu T1. h isc S 0  S n  S1  T1

Tento stav má relativně dlouhou dobu života, jelikož jeho deaktivace fosforescencí nebo dalším isc jsou spinově zakázané přechody. Proto může dojít ke zhášení tripletových stavů fotosensitizeru kyslíkem. Následovat mohou dva typy bimolekulárních reakcí13. Při reakci I. typu dojde k přenosu elektronu na substrát. V případě kyslíku tak vznikne

- - 10 - -

superoxidový anion radikál. U reakce II. typu dojde k přenosu energie za vzniku singletního kyslíku. 1.3. FOTOSENSITIZERY Mezi fotosensitizery patří široká skupina látek s rozdílnou strukturou, obsahující konjugovaný systém s násobnými vazbami. Patří sem například porfyriny a jejich metalokomplexy, flouresceinová barviva, thiazinová barviva a další.1 Fotosensitizery se také dají dělit podle mechanismu účinku. Fotosensitizery, jejichž excitovaný elektron pochází z nevazebného orbitalu n, se označují jako (n,π*) a upřednostňující mechanismus I. typu. Fotosensitizery upřednostňující mechanismu II. typu se označují jako (π,π*) a excitovaný elektron u nich pochází z π orbitalu. H3C

N

A)

+

CH3

N+

N

H3C

NH

CH3

+

HN

N

+

N B)

N N +

N

+

N

CH3

H3C

N

M

N

N

C)

N+ H3C

NH

N

N

N Cl

+

CH3

M = Sn(IV) Cl

NH

Obr. 1: Strukturní vzorce použitých fotosensitizerů: 4-yl) porfyrin (TMPyP) tetratosylát

A) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-

B) Sn(IV) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-

4-yl) porfyrin (TMPyP(Sn)) tetrachlorid C) 5,10,15,20-meso-tetrafenylporfyrin (TPP)

- - 11 - -

Mezi (π,π*) fotosensitizery patří i porfyriny a jejich metalokomplexy. Porfyriny mají v UV/VIS oblasti charakteristické spektrum. Skládající se ze Soretova pásu (okolo 400 nm) a z několika menších Q-pásů v oblasti 500-700 nm.14 Velký vliv na vlastnosti porfyrinových fotosensitizerů mají centrální atomy v případě metalokomplexů.15,16 Při řešení této práce byly použity dva

kationtové porfyrinové vodorozpustné

fotosensitizery TMPyP a TMPyP(Sn) a nepolární porfyrinový fotosensitizer TPP. TMPyP (5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl) porfyrin) (strukturní vzorec na Obr. 1) je tetrakation s vysokou účinností fotoprodukce 1O2.17 TMPyP(Sn) (Sn(IV) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)

porfyrin)

je

jeho

metalokomplex

s čtyřmocným cínem jehož axiální ligandy zabraňují agregaci ve vodném prostředí18. U posledního

použitého

porfyrinového

(π,π*)

fotosensitizeru

5,10,15,20-meso-

tetrafenylporfyrinu (TPP) bylo zjištěno, že v přítomnosti elektronového donoru může dojít k fotosensitizované reakci I. typu.19 Také byla u některých porfyrinových fotosensitizérů (například u hematoporfirinu, protoporfirinu a TMPyP) detekována fotogenerace H2O2, která byla silně závislá na stupni agregace těchto porfyrinů.20,21 Navržený mechanismus je elektron transfer z excitovaného tripletového stavu fotosensitizeru na molekulu kyslíku za vzniku O2-, který je následně přeměněn na H2O2 (viz. rovnice (4) a (5)).21 Fotosensitizery spektroskopie22.

jsou

Principem

často časově

charakterizovány rozlišených

pomocí

metod

časově

vhodných

rozlišené ke

studiu

fotosensitizovaných reakcí je sledování změn nebo jevů, vyvolaných absorpcí krátkého pulsu elektromagnetického záření. Například lze sledovat změnu absorbance nebo emise. Tyto metody lze s výhodou využít k detekci fotogenerovaného 1O2. Singletový kyslík vznikající ve vzorku po ozáření laserovým pulsem je možno přímo monitorovat na základě jeho fosforescence při vlnové délce 1270 nm. Jelikož je to spinově zakázaný přechod, signál je velmi slabý s kvantovými výtěžky fosforescence nižšími než 10-4. Aby signál singletového kyslíku

nebyl překryt

například

intenzivní

červenou emisí

fotosensitizeru, používá se většinou jako rozpouštědlo D2O, ve které má singletový kyslík cca 16× delší dobu života než v H2O (v D2O 44-68 s)23,24. Vzhledem k problémům spojeným s měřením fosforescence 1O2 byla poprvé detekována až Krasnovskym (1976)25. Další možnou metodou detekce 1O2 pomocí časově rozlišené spektroskopie je využití tzv. zpožděná fluorescence fotosensitizeru (SODF, singlet oxygen delayed fluorescence). Fotosensitizovanou reakcí vznikne singletový kyslík (přenosem energie z T1 stavu - - 12 - -

fotosensitizeru), který reaguje s jiným fotosensitizerem v T1 stavu, čímž dojde k repopulaci S1 stavu fotosensitizeru a následnému návratu do základního stavu za vyzáření energie SODF (viz. (6)).

3

T 1 O 2  S1  3 O 2  SODF S0

( 6)

Zpožděná fluorescence byla již pozorována u PUR nanovlákených vrstev s enkapsulovaným TPP26 a také v mezifází plyn/pevná lárka na površích zeolitů s naneseným TPP.27 1.4. NANOVLÁKENNÉ VRSTVY Jako nanovlákenné vrtstvy je označován materiál, tvořený polymerními nanovlákny, (průměr vláken je obvykle v řádu stovek nm) připravený metodou „electrospinning“. Nanovlákna mohou být tvořeny různými polymery (např. polyuretanem, polyethylenem, polytetrafluorethylenem, želatinou, chitosanem atd.) Díky svým výjimečným vlastnostem, jako je velký specifický povrch, nízká hmotnost, mechanická flexibilita a také nízká pořizovací cena, jsou nanovlákenné vrstvy využívány jako materiály pro ochranné oblečení28, filtraci29, nosiče léčiv30 atd. V této práci byly použity polystyrenové nanovlákenné vrstvy dodávané firmou Elmarco, s.r.o., využívající patentově chráněnou technologii elektrozvlákňování Nanospider (viz. Obr. 2). Ty byly poté sulfonovány, aby získaly iontově výměnné vlastnosti. Sulfonované

polystyrenové nanovlákna podobným způsobem poprvé připravil Chase31.

- - 13 - -

Obr. 2: Schéma technologie výroby nanovlákenných vrstev pomocí elektrozvlákňování Nanospider: 1)

roztok polymeru 2) rotující válcová elektroda 3) nanovlákna 4) uzemněná

elektroda 5) podkladový materiál

1.5. DOSAVADNÍ POZNATKY V naší laboratoři byly studovány nanovlákenné vrstvy s enkapsulovanými fotosensitizery26,32,33, které jsou během ozařování viditelným světlem efektivními producenty vysoce oxidativního, cytotoxického singletového kyslíku (1O2). Schopnost dopovaných

nanotkanin 34

spektroskopií

fotoprodukovat

1

O2,

byla

potvrzena

časově

rozlišenou

i fotooxidací řady substrátů. Baktericidní efekt nanotkanin byl prokázán na

bakteriálním kmenu Escherichia coli DH5alfa a prokázal tak autodesinfikující účinek na povrchu

nanovlákenných

vrstev

ozařovaných

umělým

nebo

denním

světlem.26

Nanovlákenné vrstvy jsou vzhledem k malé velikosti pórů mezi nanovlákny schopny zachytávat bakterie a větší viry. Nanovlákenné materiály dopované fotosensitizerem tak představují nové autodezinfikující, sterilní, krycí materiály, které mohou být využity např. pro medicínské aplikace, neboť kombinují vlastnosti cytotoxického 1O2 s velmi krátkým dosahem působení, s velkým měrným povrchem, dobrou difůzí a permeabilitou pro 1O2 a bakteriálním záchytem. Další výhodou oproti jiným desinfekčním činidlům je, že enkapsulovaný fotosensitizer v nízké koncentraci uvnitř nanovláken nepředstavuje zdravotní - - 14 - -

riziko, neovlivňuje tedy např. hojení ran. Výhodou je dále fakt, že bakterie či jiné mikroorganismy nevykazují resistenci vůči 1O2 (oproti např. antibiotikům) a jsou touto formou kyslíku účinně inaktivovány. Nanovlákenné vrstvy produkující 1O2 mohou mít řadu dalších praktických aplikací. Lze je například využít k syntéze produktů reakcí 1O2 s příslušným substrátem s možností jejich snadné separace od vázaného fotosensitizeru.

- - 15 - -

2. CÍL PRÁCE Hlavním cílem této práce byla příprava a studium tří nových typů fotoaktivních nanovlákenných materiálu: i) sulfonované polystyrénové (PS) nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným fotosensitizerem 5,10,15,20-meso-tetrafenylporfyrínem (TPP). ii) dvou sulfonovaných PS nanovlákenných vrstev s povrchově vázanými kationtovými fotosensitizery 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4- yl) porfyrinem (TMPyP) a Sn(IV) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl) porfyrinu TMPyP(Sn). Vedle základních, především spektrálních charakteristik zjistit především případnou fotoprodukci

1

O2 či dalších reaktivních kyslíkových častic (ROS) a případně i

fotobaktericidní vlastnosti těchto nanomateriálů.

- - 16 - -

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE, BAKTERIE A NANOVLÁKENNÉ VRSTVY 3.1.1. Chemikálie HSO3Cl (Sigma-Aldrich) H2SO4 (Sigma-Aldrich) D2O 99% (Sigma-Aldrich) FeSO4.7H2O (Sigma-Aldrich) NH2OH.HCl (Sigma-Aldrich) Octan amonný (Sigma-Aldrich) 1,10-fenanthrolin monohydrát (Sigma-Aldrich) H2O2 30% p.a. (Sigma-Aldrich) Scopoletin (Sigma-Aldrich) Křenová peroxidáza 25KU (Sigma-Aldrich) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4- yl) porfyrin (TMPyP, Sigma-Aldrich) Sn(IV) 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl) porfyrin (TMPyP(Sn), Porphyrin Systems) kyselina močová (Sigma-Aldrich) LB Agar (Sigma-Aldrich) 5-bromo4-chloro-3indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal, Invitrogen, USA) Ampicilin, sodná sůl (Sigma-Aldrich) Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG, Invitrogen,USA) 3.1.2. Nanovlákenné vrstvy PS nanovlákenná vrstva (Elmarco s.r.o.) PS nanovlákenná vrstva s enkapsulovaným 1% TPP (Elmarco s.r.o.) PUR (Larithan) nanovlákenná vrstva s enkapsulovaným 1% TPP (Elmarco s.r.o.)

- - 17 - -

3.1.3. Bakterie Bakteriální kultura kmene Escherichia coli: Bakterie DH5α (Invitrogen, USA) s plazmidem pGEM11Z (Promega, USA). 3.1.4. Agarová půda Pro přípravu agarové půdy bylo rozpuštěno 9 g agaru v 250 ml vody. Poté byla kádinka s roztokem uzavřena alobalem a 30 minut autoklávována. Po zchladnutí agaru na 60 °C bylo přidáno 50 mg ampicilinu rozpuštěného v 0,5 ml deionizované vody. Po důkladném promíchání byl agar rozlit do sterilních Petriho misek. 3.2. PŘÍSTROJE A METODY 3.2.1. Sulfonace PS nanovlákenných vrstev Aby PS nanovlákenné vrstvy získaly schopnost iontové výměny byly chemicky upraveny sulfonací. Jako sulfonační činidlo byla zvolena kyselina chlorosírová. Vlastní sulfonace byla prováděna ve vyvíjecím tanku pro TLC, který měl vhodné rozměry pro vkládání podložních sklíček s namotanou PS nanovlákennou vrstvou (65 cm). Tank s HSO3Cl byl před sulfonací vytemperován na 14 °C . Po vyjmutí z reakčního roztoku bylo sklíčko s nanovlákennou vrstvou ponořeno do kádinky s deionizovanou vodou. Nanovlákenná vrstva byla pak dále promývána deionizovanou vodou až do neutrální reakce. Poté byl vzorek aktivován ponořením do deionizované vody na 20 hodin. Takto připravené sulfonované polystryrenové vrstvy byly použity pro další experimenty. 3.2.2. Snímky ze skenovacího elektronového mikroskopu SEM snímky sulfonovaných a referenčních vzorků PS nanovlákenných vrstev byly pořízeny na přístroji FEI Quanta 200 s Everhart-Thornley sekundárním elektronovým detektorem. Distribuce průměrů jednotlivých vláken byla vyhodnocena na 5000 zvětšeném snímku. V použité části snímku (3030 mm) byly změřeny průměry všech dobře rozlišitelných vláken.

- - 18 - -

3.2.3. Stanovení adsorbovaného Fe2+ Množství adsorbovaných Fe2+ iontů na sulfonované PS nanovlákenné vrstvy bylo zjištěno

nepřímo

spektrofotometricky

stanovením

obsahu

barevného

komplexu

fenanthrolinu s ionty Fe2+ (cit.35), které se nenasorbovaly ze zásobního roztoku na vzorek sulfonované nanovlákenné vrstvy.

N Fe

2+

+

N Fe

3 N

2+

N 3

Obr. 3: Reakce iontů Fe2+ s 1,10-fenanathrolinem za vzniku barevného komplexu

Do odměrných baněk o objemu 10 ml byly napipetovány různé objemy zásobního 135 μM roztoku FeSO4 odpovídající výsledným koncentracím použitým pro sestrojení kalibrační závislosti (viz. Tab. 2). Následně bylo postupně do každé baňky přidáno 600 l 10% NH2OH.HCl a 1 ml 0,1% roztoku 1,10-fenanthrolinu. Poté byla odměrná baňka doplněna po rysku 20% CH3COONH4 a důkladně promíchána. Po 15 minutách stání bylo změřeno absorpční spektrum (350 – 700 nm) vzniklého komplexu. Ze závislosti absorbance komplexu při λ = 511 nm na koncentraci Fe2+ iontů byl sestrojen kalibrační graf. Do plastových kultivačních lahviček bylo odpipetováno po 40 ml ze zásobního roztoku 135 M FeSO4. Za stálého míchání na třepačce bylo do každé z lahviček vloženo 6 kusů definovanou dobu sulfonované PS nanotkaniny s nebo bez enkapsulovaného TPP (viz. Tab. 3) o rozměrech cca 65 cm. Po 3, 5, 20, 40 a 60 minutách bylo z každé lahvičky

odebráno 700 l do 10 ml odměrných baněk. Následně bylo postupováno jako v případě kalibračních roztoků. Po odebrání vzorků byly z kultivačních lahviček vyjmuty sulfonované nanotkaniny. Ty byly regenerovány propláchnutím 0,1M HCl a následně deionizovanou vodou. Poté byly sušeny v exsikátoru do konstantní hmotnosti. - - 19 - -

Odečtením hodnoty koncentrace odpovídající absorbanci při λ = 511 nm z kalibračního grafu a jejím vynásobením zředěvacím faktorem (10/0.7) byla získána hodnota koncentrace Fe2+ iontů v kultivační lahvičce. Pomocí vzorce: n Fe 2   c0  V0  ct  Vt   ct  n  Vt  n

(7)

bylo vypočítáno látkové množství adsorbovaných Fe2+ iontů pro jednotlivé odběry zásobního roztoku. Výraz c0V0 odpovídá látkovému množství před vložením sulfonovaných nanovlákenných vrstev a výraz ctVt látkovému množství v čase t, poslední člen rovnice představuje součet látkových množství vzorků odebraných z kultivační lahvičky před časem t. Iontová výměnná kapacita byla získána jako podíl látkového množství Fe2+ v čase t = 60 minut a hmotnosti vysušené regenerované sulfonované nanovlákenné vrstvy. Látkové množství neadsorbovaných iontů Fe2+ použité pro grafické znázornění kinetiky adsorpce bylo vypočítáno pomocí zkrácené verze předchozího vzorce:

n Fe 2   ct  Vt   ct n  Vt  n

(8)

vzniklý časový průběh úbytku iontů železa adsorpcí na sulfonované nanovlákenné vrstvy byl proložen funkcí exponenciálního úbytku reakce prvního řádu. Měření iontových kapacit jednotlivých dob sulfonace bylo provedeno v serii po třech a následně statisticky vyhodnoceno. (viz kap. 3.2.11 ) 3.2.4. Příprava sulfonovaných PS nanovlákenných vrstev s externě vázanými porfyriny Sulfonované PS nanovlákenné materiály s externě vázaným TMPyP nebo TMPyP(Sn) byly připraveny ponořením 10 minut sulfonované PS nanovlákenné vrstvy (sulfonace viz. kap. 3.2.1) do roztoku fotosensitizeru po definovanou dobu. Po vyjmutí z roztoku byl nanomateriál důkladně opláchnut deionizovanou vodou. Pro spektrální charakteristiku těchto materiálů byly připraveny tři rozdílné koncentrace adsorbovaného fotosensitizerů. A to adsorbcí 5 a 30 minut z 5.10-5 M roztoku a 30 minutovou adsorpcí z 1.10-3 M roztoku fotosensitizeru. Ostatní experimenty byly

- - 20 - -

prováděny s materiálem o největší koncentraci vázaného fotosensitizeru, tj. po 30 minutové adsorpci z 1.10-3 M roztoku fotosensitizeru. 3.2.5. UV-VIS absorpční spektra UV-VIS absorpční spektra byla měřena na přístroji UV-VIS Spektrofotometr UV 300 Unicam (UK). Nanovlákenné vrstvy byly uchycené parafilmem na křemenném sklíčku (11401 mm), kolmo ke zdroji záření. Roztoky byly měřeny v křemenných kyvetách. 3.2.6. Fluorescenční a excitační spektra Fluorescenční a excitační spektra byla měřena na spektrofluorimetru Aminco Bowman AB2. Roztoky byly měřeny v křemenných kyvetách. Vzorky nanovlákenných vrstev byly připevněny parafilmem na křemenném sklíčku a diagonálně vloženy do křemenné kyvety. Pro odstranění artefaktů způsobených rozptylem a odrazem od sklíčka se vzorkem byl použit 600 nm cut-on filtr. 3.2.7. Stanovení fotoprodukovaného H2O2 Ke stanovení fotoprodukovaného peroxidu vodíku byla použita metoda založená na zhášení fluorescence scopoletinu. Fluoreskujicí scopoletin je oxidován H2O2 za katalýzy křenovou peroxidázou na nefluoreskující formu.36,37 Scopoletin byl excitován při λ = 350 nm a jeho emise byla měřena v maximu při λ = 460 nm. Při všech měřeních bylo konstantní napětí na detektoru 600 V.

Obr. 4: Strukturní vzorec scopoletinu. 38

Pro sestrojení kalibrační závislosti bylo vždy do křemenné kyvety se 3 ml vzorku o známé koncentraci H2O2 dopipetováno 10l 7,7.10-4 M scopoletinu a po protřepání a

- - 21 - -

změření emise i 10l roztoku křenové peroxidázy o koncentraci 0,4 mg/ml. Následně byla po 15 minutách po přidání peroxidázy zaznamenána intenzita emise zbylé fluoreskující formy scopoletinu. Fotoprodukovaný peroxid vodíku byly stanovován ve 3 ml deionizované vody v kyvetě, ozařované s nanovlákennou vrstvou jednostraně připevněnou parafilmem na křemenném sklíčku. 3.2.8. Ozařovací aparatůra K ozařovacím experimentům byla použita optická sestava firmy Newport (USA) s 500 W xenonovou lampou, kyvetovým prostorem a automatickou clonou s nastavitelným časovačem. Pro odstranění nežádoucího záření v UV oblasti byl použit 400 nm cut-on filtr (Newport). 3.2.9. Detekce singletního kyslíku 3.2.9.1. Fosforescence 1O2 Změna fosforescence 1O2 byla měřena pomocí časově rozlišené spektroskopie při 1270 nm. Vzorky nanovlákenných vrstev byly vždy jednostraně připevněny na křemenném sklíčku, které bylo diagonálně umístěno v křemenné kyvetě s 3 ml D2O. Následně byla do kyvety umístěna skleněná kapilára pomocí níž byl roztok probubláván nejdřív argonem a poté kyslíkem. Zdrojem excitačního záření byl excimerový XeCl laserer Lambda physik LPX 205. Excitační puls při 308 nm měl energii 0,42 mJ. Detekční jednotka se skládala z germaniové detekční diody (Judson, USA) a filtru pro 1270 nm (Laser Components, Germany). Signál byl zaznamenán a zpracován na osciloskopu Agilent infiniium 54830B DSO, který průměroval 500 měření. 3.2.9.2. Zpožděná fluorescence K měření SODF fotosensitizeru enkapsulovaného nebo externě vázaného na sulfonovaných nanovlákenných vrstvách byly použity stejné vzorky jako pro fosforescenci 1

O2 (kap. 3.2.9.1). Jednostraně připevněné nanovlákenné vrstvy na křemenném sklíčku byly - - 22 - -

probublávány v D2O nejdříve argonem a poté kyslíkem. Vlastní měření bylo prováděno pomocí laserového kinetického spektrometru (Applied Photophysics), kde byl zdrojem excitačního záření excimerový XeCl laserem Lambda physik LPX 205 (excitační puls při 308 nm měl energii 0,42 mJ) a detektorem fotonásobič R928 (Hamamatsu). Signál byl zaznamenán na osciloskopu Agilent infiniium 54830B DSO a zpracován počítačem Acorn Archimedes 410/I. Zaznamenán byl průměr 10 měření luminiscence při 660 nm a napětí na fotonásobiči 729 V. 3.2.9.3. Kyselina močová Jako další metoda detekce singletního kyslíku byla použita metoda založená na oxidaci substrátu konkrétně kyseliny močové, která je specifická pro 1O2(cit39). Tato metoda byla použita protože kromě samotného důkazu vzniku 1O2 fotosensitizovanou reakcí demonstruje i schopnost nanovlákenné vrstvy oxidovat externí substrát. Vzorky nanovlákenných vrstev jednostraně připevněných na křemeném sklíčku (11401 mm) byly definovanou dobu ozařovány v kyvetě se 3 ml 2.10-4 M roztoku kyseliny močové. Poté bylo proměřeno absorpční spektrum roztoku. Pokles absorbance kyseliny močové s dobou ozařování byl sledován v absorpčním maximu kyseliny močové při λ = 292 nm. 3.2.10. Fotocytotoxicita K testům fotocytotoxicity byl použit kmen bakterie Escherichia coli DH5 s plazmidem pGEM11Z způsobujícím rezistenci na betalaktamová antibiotika. Kmen má dále gen pro produkci -galaktosidasy, která štěpí použitý substrát X-Gal za uvolnění indolového barviva. Živé rostoucí kolonie jsou tímto způsobem modro-zeleně zabarveny a dobře viditelné. Na Petriho misky s čerstvě připravenou agarovou půdou byly umístěny vzorky nanovlákenných vrstev. Na ně bylo poté napipetováno 10l 100mM IPTG, 10l X-Galu o koncentraci 20 mg/ml a 10l vodné bakteriální suspenze. Kontrolní vzorek byl ponechán ve tmě a zbytek agarových půd byl na třepačce ozařován po definovanou dobu 150 W lampou Kruss (Německo). Nakonec byly všechny agarové půdy inkubovány 18 hodin ve tmě při 37 °C a poté vizuálně hodnoceny.

- - 23 - -

3.2.11. Statistické vyhodnocení dat Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno následujícím způsobem.40 K vyloučení odlehlých výsledků byl použit Deanův-Dixonův test odlehlosti (viz. rovnice ( 9 )). Kritérium Q je v něm porovnáno s tabelovanou hodnotou Qk (Tab. 1) přičemž odlehlý je výsledek pokud je Q  Qk:

Q1 

x 2  x1 R

Q2 

x n  x n1 R

(9)

kde x jsou jednotlivé výsledky měření a R je rozpětí souboru dané vztahem

R  x max  x min  x n  x1

( 10 )

Jako střední hodnota souboru byl použit medián. Odhad směrodatné odchylky s souboru výsledků byl vypočten z rozpětí jeho vynásobením tabelovaným koeficientem kn pro daný počet měření n (Tab. 1).

s  kn  R

( 11 )

Relativní směrodatnou odchylku sr byla vypočtena jako podíl odhadu směrodatné odchylky a mediánu daného souboru výsledků a vyjádřena v procentech jejím vynásobením 100.

s s r  ~  100 x

( 12 )

- - 24 - -

Tab. 1: Hodnoty kn a Kn koeficientů pro daný soubor měření o počtu n a pro koeficient spolehlivosti 0,95 neboli hladinu významnosti 0,05.

3.2.12. Použitý software Pokud není uvedeno jinak byl pro zpracování naměřených dat použit program OriginPro 7.5 (OriginLab).

- - 25 - -

4. VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1. STANOVENÍ ADSORBOVANÉHO Fe2+ NA SULFONOVANÉ NANOVLÁKENNÉ VRSTVY Jedním z cílů této práce bylo připravit nanovlákennou vrstvu obsahující TPP s iontově výměnnou schopností, která by si zachovala svou strukturu a své fotooxidační schopnosti. Z toho důvodu byla zjišťována vhodná doba sulfonace PS nanovlákenné vrstvy. Jako kriterium pro určení vhodné doby sulfonace PS nanovlákenných vrstev byla zvolena iontová výměnná kapacita (IEC, Iont Exchange Kapacity) s přihlédnutím k zachování nanovlákenné struktury. Ionty Fe2+ byly zvoleny s ohledem k předpokládanému vlivu vzájemného poměru koncentrací peroxidu vodíku s železnatými ionty na efektivitu Fentonovy reakce41 (viz. dále). Pro stanovení Fe2+ byl použit jejich komplex s 1,10-fenanthrolinem (viz. kapitola 3.2.3). Na Obr. 5 je vidět kalibrační graf závislosti absorbance fenanthrolinového komplexu na koncentraci železnatých iontů. Ten byl sestrojen z naměřených dat uvedených v Tab. 2.

Tab. 2: Hodnoty absorbancí komplexu fenanthrolinu pro standardní roztoky Fe2+

Koncentrace Fe2+ mol/l

A511

0

0

22

0,2503

45

0,5099

55

0,6369

67

0,7689

90

1,0247

- - 26 - -

1,2

1,0

A511

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 0

20

40

60

80

100

2+

c Fe (M)

Obr. 5: Závislost absorbance fenanthrolinového komplexu na koncentraci železnatých iontů.

Iontové výměnné kapacity pro různé doby sulfonace kyselinou chlorosírovou (1-20 minut) jsou uvedeny v Tab. 3. Z jejich hodnot je zřejmé, že 1 minuta sulfonace není dostatečná. Doby sulfonace v rozmezí 5 až 20 minut poskytují téměř shodnou IEC a nedochází patrně k významnému narušování vláken a rozpouštění polymeru, což by se projevilo poklesem IEC. S ohledem na SEM snímek 20 minut sulfonované nanovlákenné vrstvy se dá předpokládat, že při delší době sulfonace by již k významnému poškození vláken a rozpouštění polystyrenu došlo. Z výsledků je dále patrné, že enkapsulovaný TPP v PS nanovlákenné vrstvě nemá vliv na IEC. Vzhledem k těmto výsledkům byla jako optimální doba sulfonace zvoleno 10 minut. K dále uváděným experimentům vyjma kinetiky adsorbce byla tedy použita v HSO3Cl 10 minut sulfonovaná PS nanovlákenná vrstva.

- - 27 - -

Tab. 3: Kapacity iontové výměny (IEC) pro PS nanovlákenné vrstvy sulfonované různou dobu v HSO3Cl.

Doba sulfonace min

IEC

Průměr IEC

SD

mmol/g

mmol/g

mmol/g

0,63

0,03

4,7

0,79

0,04

5,2

0,80

0,04

5,9

0,80

0,05

4,4

0,79

0,04

4,5

0,79

0,02

3,0

Srel %

0,63 1

0,61 0,66 0,75

5

0,8 0,82 0,8

10

0,84 0,76 0,83

10*

0,81 0,77 0,78

15

0,76 0,82 0,81

20

0,78 0,77

*

označuje dobu sulfonace PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným 1% TPP

Graf na Obr. 6 demonstruje kinetiku úbytku iontů Fe2+ ze zásobního roztoku FeSO4 na PS nanovlákenné vrstvy sulfonované 10 minut. Pokles koncentrace Fe2+ byl dle předpokladů ve všech případech exponenciální. K ustálení koncentrace došlo vždy zhruba po 10 minutách adsorpce. Jak vyplývá z Tab. 3 enkapsulovaný TPP nemá vliv na kinetiku adsorpce Fe2+.

- - 28 - -

60

2+

nFe [mol]

50 40 30 20 10

0

10

20

30

40

50

60

t [min]

Obr. 6: Demonstrace kinetiky úbytku iontů Fe2+ ze zásobního roztoku FeSO4 na PS nanovlákenné vrstvy.

4.2. SNÍMKY NANOVLÁKENNÝCH VRSTEV ZE SKENOVACÍHO ELEKTRONOVÉHO MIKROSKOPU K potvrzení zachování nanovlákenné struktury PS nanovlákenných vrstev po sulfonaci byly pořízeny jejich SEM snímky (Obr. 7). Ze snímků byl zjištěn průměr nanovláken, který se pohyboval u PS nanovlákenných vrstev v rozmezí 200 – 400 nm a u vzorků po různých definovaných dobách sulfonace v rozmezí 300-500 nm. Na snímcích A a B je vidět, že přítomnost enkapsulovaného TPP nemá vliv na nanovlákennou

strukturu.

Malé

defekty,

tzv.

uzlíky

vznikají

při

vlastním

elektrozvlákňování. Z porovnání snímků sulfonovaných a nesulfonovaných nanovlákenných vrstev je patrné, že při sulfonaci HSO3Cl nedochází k narušení nanovlákenné struktury. Ze snímků C a D je zřejmé, že ani přítomnost enkapsulovaného TPP během sulfonace nemá vliv na strukturu. Déle nebyl pozorován žádný vliv různé doby sulfonace, v rozmezí 1-20 minut na strukturu sulfonované nanovlákenné vrstvy.

- - 29 - -

Obr. 7: Snímky ze skenovacího elektronového mikroskopu: Polystyrenová nanovlákna (A) po 10 minutách sulfonace v HSO3Cl (C). Polystyrenová nanovlákna s enkapsulovaným TPP (B) po 10 minutách sulfonace v HSO3Cl (D).

4.3. ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRA NANOVLÁKENNÝCH VRSTEV Absorpční a emisní spektra nanovlákenných vrstev byla změřena aby potvrdila jednak přítomnost enkapsulovaného TPP v PS nanovlákenné vrstvě po její sulfonaci a také úspěšnou adsorpci kationtových porfyrinových fotosensitizerů (TMPyP a TMPyP(Sn)). Dále byla pro tuto práci důležitá případná přítomnost agregované formy (viz. kap. 1.3) fotosensitizerů. Absorpční spektra (Obr. 8) potvrdila přítomnost TPP v PS nanovlákenné vrstvě po sulfonaci. V absorpčním pásu PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným TPP je vidět poměrně široký Soretův pás (425 nm) což naznačuje přítomnost i agregované formy TPP42. - - 30 - -

Dále spektrum obsahuje čtyři Q-pásy (514, 550, 590 a 650 nm) odpovídající TPP v nepolárním prostředí43. Spektrum vzorku po sulfonaci vykazuje Soretův pás který je posunut o 15 nm na λ = 440 nm což ukazuje na protonizovanou formu. Během sulfonace bylo pozorováno vymývání TPP do sulfonačního činidla, což vysvětluje snížení absorbance TPP po sulfonaci. Dále bylo zjištěno, že zbylý TPP se po sulfonaci dále nevymývá do vody a je tedy stále enkapsulovaný.

1.0

A

0.8

0.6

0.4

0.2 400

500

600

700

 [n m ]

Obr. 8: Absorpční spektra PS nanovlákenné vrstvy s 1% enkapsulovaným TPP před sulfonací (černá) a po 10 minutách sulfonace (červená)

Tento předpoklad byl potvrzen i emisními a excitačními spektry. Na Obr. 9 jsou vidět u vzorku před sulfonací dva emisní pásy TPP při 652 a 717 nm a také excitační spektrum odpovídající neprotonizované formě. Oproti tomu na Obr. 10 je ve spektrech po sulfonaci pouze jeden široký emisní pás s vrcholem při 670 nm, jehož excitační spektrum odpovídá protonizované formě TPP.

- - 31 - -

8

A

7

7

6

6

intenzita fluorescence [a.u.]

intenzita fluorescence [a.u.]

8

5

4 3 2

5 4 3 2 1

1 0 600

B

650

700

750

0

800

400

 [nm]

450

500

550

600

 [nm]

Obr. 9: Emisní (A) a excitační (B) spektrum PS nanovlákenné vrstvy s 1% enkapsulovaným TPP před sulfonací. Emisní spektrum bylo měřeno po excitaci v absorpčním maximu fotosensitizeru při λ = 420 nm a excitační spektrum při λ = 650 nm.

8

A

6 5 4 3 2

B

7

intenzita fluorescence [a.u.]

7

intenzita fluorescence [a.u.]

8

6 5 4 3 2 1

1

0

0 600

650

700

750

800

 [nm]

400

450

500

550

600

 [nm]

Obr. 10: Emisní (A) a excitační (B) spektrum PS nanovlákenné vrstvy s 1% enkapsulovaným TPP po 10 minutách sulfonace v HSO3Cl. Emisní spektrum bylo měřeno po excitaci v absorpčním maximu fotosensitizeru při λ = 440 nm a excitační spektrum při λ = 670 nm .

Pomocí UV-VIS a fluorescenční spektroskopie byla také potvrzena úspěšná adsorpce TMPyP a TMPyP(Sn), který se již poté ani při dlouhodobém stání nevymývaly do deionizované vody . - - 32 - -

Při dlouhodobém stání v deionizované vodě bylo pozorovány změny v absorpčních spektrech (Obr. 11) externě vázaného TMPyP, kdy narůstá Soretův pás při 430 nm, odpovídající protonizované formě

TMPyP za současného poklesu druhé, patrně

agregované formy při 460 nm44. Tímto fenoménem jsem se podrobněji zabýval v bakalářské práci45. Dále je na spektrech patrné různé množství agregované formy způsobené rozdílnou dobou adsorpce a koncentrací roztoku, ze kterého byla prováděna. To je pro tuto práci důležité s ohledem na předpoklad20,21, že za fotoprodukci H2O2 je zodpovědná agregovaná forma porfyrinu.

2.6

1.8

A

1.6

2.2

1.4

2.0

1.2

1.8

A A

B

2.4

1.0

1.6 1.4

0.8

1.2

0.6

1.0

0.4

0.8 0.6

0.2 400

500

600

700

[nm]

400

500

600

700

[nm]

Obr. 11: Absorpční spektra sulfonovaných nanovlákenných vrstev s různou koncentrací externě vázaného TMPyP. Měřeno ihned po adsorpci (A) a po 10 dnech stání v deionizované vodě (B). Po 5 (černá) a 30 (červená) minutách adsorpce z roztoku 5.10-5 M TMPyP a po 30 minutách adsorpce z roztoku 1.10-3 M TMPyP (modrá).

U komplexu TMPyP(Sn) s axiálními ligandy bránícími agregaci ve vodném prostředí18 externě vázaného na sulfonovanou PS nanovlákennou vrstvu nebyly pozorovány změny v absorpčních spektrech po dlouhodobém stání v deionizované vodě ani přítomnost agregované formy (Obr. 12). Na spektru nanovlákenné vrstvy s nižší koncentrací TMPyP(Sn) je dobře vidět jeho Soretův pás při 420 nm a nejintenzivnější Q-pás při 551 nm. U větší koncentrace jsou Q-pásy dobře rozlišitelné.

- - 33 - -

2.6

1.2

A

1.0

2.2

A

A

0.8 0.6

2.0 1.8

0.4

1.6

0.2 0.0 400

B

2.4

1.4 500

600

700

 [nm]

500

600

700

 [nm]

Obr. 12: Absorpční spektra sulfonovaných nanovlákenných vrstev s různou koncentrací externě vázaného TMPyP(Sn). Po 30 minutách adsorpce z roztoku 5.10-5 M TMPyP(Sn) (A) a po 30 minutách adsorpce z 1.10-3 M roztoku TMPyP(Sn) (B).

Na emisním spektru (Obr. 13) externě vázaného TMPyP jsou dobře vidět dva emisní pásy při 655 a 714 nm. Nízká kvalita excitačního spektra je způsobena nižším zastoupením fluoreskující formy TMPyP oproti nefluoreskující agregované formě. Také u emisních spekter byly pozorovány změny v intenzitě emise TMPyP odpovídající změnám v rovnováze agregát-monomer. Na emisním spektru (Obr. 14) externě vázaného TMPyP(Sn) je patrný široký emisní pás při 650 nm jehož excitační spektrum odpovídá absorpčním pásů vázaného TMPyP(Sn). Stejně jako u absorpčních i u emisních spekter tohoto vzorku nebyly pozorovány změny způsobované přítomností agregovaných forem.

- - 34 - -

8

7

A intenzita fluorescence [a.u.]

intenzita fluorescence [a.u.]

7 6 5 4 3 2

B

6 5 4 3 2 1

1 0 600

650

700

750

800

0 300

350

400

450

500

550

600

[nm]

 [nm]

Obr. 13: Emisní (A) a excitační (B) spektrum sulfonované PS nanovlákenné vrstvy s externě vázaným TMPyP. Emisní spektrum bylo měřeno po excitaci v absorpčním maximu fotosensitizeru při λ = 440 nm a excitační spektrum při λ = 660 nm.

5

5

B 4

intenzita fluorescence [a.u.]

intenzita flourescence [a.u.]

A 4

3

2

1

3

2

1

0 600

650

700

750

0 300

350

 [nm]

400

450

500

550

 [nm]

Obr. 14: Emisní (A) a excitační (B) spektrum sulfonované PS nanovlákenné vrstvy externě vázaným TMPyP(Sn). Emisní spektrum bylo měřeno po excitaci v absorpčním maximu fotosensitizeru při λ = 425 nm a excitační spektrum při λ = 660 nm.

- - 35 - -

4.4. DETEKCE SINGLETOVÉHO KYSLÍKU 4.4.1. Fosforescence 1O2 Jedním z důležitých cílů této práce bylo zjistit, zda jsou připravené nanomateriály fotoaktivní ve smyslu fotogenerace 1O2. Pro detekci fotogenerovaného 1O2 byla použita přímá metoda detekce pomocí časově rozlišené spektroskopie, měřením fosforescence 1O2 při 1270 nm. Signál fosforescence 1O2 u fotosensitizerem dopované nanovlákenné vrstvy v D2O probublávané argonem byl odečten od signálu naměřeného při probublávání kyslíkem. Singletový kyslík byl detekován u PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným TPP před i po sulfonaci a u obou povrchově vázaných porfyrinových fotosensitizerů. Na Obr. 15 je jako příklad uveden signál 1O2 pro povrchově vázaný TMPyP(Sn) na sulfonovanou nanovlákennou vrstvu. Naměřené fosforescence 1 O2 jsou poměrně slabé (okolo 3 mV), proto se nepodařilo spolehlivě určit doby života 1O2.

3,0 150

2,5 2,0

A

140

signál [mV]

signál [mV]

145

1,5

B

1,0 0,5

135

0,0 130

-0,5 0

50

100

0

20

40

60

80

100

čas [ s]

čas [s]

Obr. 15: Signál luminiscence (A) nanovlákenné vrstvy s externě vázaným TMPyP(Sn) v D2O probublávané argonem (černá) a kyslíkem (červená). A odečtený signál fosforescence 1O2 (B). Experimentální podmínky- viz kap. 3.2.9.1.

- - 36 - -

4.4.2. Zpožděná flourescence Protože naměřené hodnoty fosforescence singletového kyslíku se pohybovaly na hranici meze detekce, byla fotogenerace 1O2 potvrzena další fotofyzikální metodou, měřením tzv. zpožděné fluorescence fotosensitizeru (SODF, viz. 3.2.9.2). U studovaných nanovlákenných vrstev s enkapsulovaným TPP ale i s externě vázanými porfyrinovými fotosensitizery byla zjištěna SODF. To jednoznačně potvrdilo fotoprodukci 1O2 ve všech studovaných vzorcích. Na Obr. 16 je demonstrován signál SODF odečtením signálu fluorescence vzorku v kyslíku a argonu.

0,40

0,10

0,35

A

0,30

B

0,08

signál [V]

signál [V]

0,25 0,20 0,15

0,06

0,04

0,10

0,02

0,05 0,00 -0,05

0,00 0

10

20

čas [s]

30

0

10

20

30

čas [s]

Obr. 16: Signál fluorescence fotosensitizeru detekovaný při  = 660 nm (A) změřený u nanovlákenné vrstvy s povrchově vázaným TMPyP(Sn) probublávané v D2O argonem (červená) a kyslíkem (černá). Odečtený signál SODF fotosensitizeru (B). Další experimentální podmínky- viz kap. 3.2.9.2.

4.4.3. Kyselina močová U všech studovaných vzorků byla fotofyzikálními metodami potvrzena fotogenerace 1

O2 (viz. kap. 4.4.1 a 4.4.2). Pro potvrzení schopnosti fotoprodukovaného 1O2 efektivně

oxidovat chemický substrát byla použita metoda detekce 1O2 založená na degradaci kyseliny močové (viz. kap. 3.2.9.3). Singletový kyslík byl touto metodou detekován u PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným TPP před i po sulfonaci a u obou povrchově vázaných porfyrinových - - 37 - -

fotosensitizerů. Na Obr. 17 je jako příklad uvedena kinetika degradace kyseliny močové pro povrchově vázaný TMPyP(Sn) na sulfonovanou nanovlákennou vrstvu. Při ponechání studovaných materiálů v kyvetě s kyselinou močovou bez ozařování a při ozařování sulfonované a nesulfonované PS nanovlákenné vrstvy bez obsahu fotosensitizerů nebyl zaznamenán pokles absorbance kyseliny močové.

2,5 2,2

A

292 nm 2,0

B

2,0 1,8

1,5

A292

A

1,6

1,0

1,4 1,2 1,0

0,5

0,8

0,0 250

300

350

400

450

500

0

10

 [nm]

20

30

40

50

60

čas [min]

Obr. 17: Fotodegradace kyseliny močové: Pokles absorpčního pásu kys. močové při 292 nm (A) a kinetika její fotodegradace (B). Ozařována byla sulfonovaná PS nanovlákenná vrstva s povrchově vázaným TMPyP(Sn). Experimentální podmínky viz. kap. 3.2.9.3.

4.5. DETEKCE A STANOVENÍ FOTOPRODUKOVANÉHO H2O2 Jak již bylo uvedeno, některé vzorky obsahují i agregovanou formu adsorbovaného porfyrinového fotosensitizeru. Je známo, že agregované formy porfyrinů mohou upřednostňovat fotosensitizovanou reakci I. typu a fotogenerovat O2-.20,21 Byla proto věnována pozornost H2O2, který by v takovém případě vznikl dismutací primárně vzniklého O2- (viz. kap. 1.1). K detekci a stanovení fotoprodukovaného H2O2 byla zvolena metoda založená na zhášení fluorescence scopoletinu (viz. kap. 3.2.7). Byl sestaven kalibrační graf závislosti poklesu intenzity fluorescence scopoletinu při λ = 460 nm na známé koncentraci H2O2 (Obr. 18). Ten byl použit k orientačnímu stanovení množství fotoprodukovaného H2O2.

- - 38 - -

pokles intenzity fluorescence scopoletinu po přidání HRP [a.u.]

5

4

3

2

1

0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

c H O (nM) 2

2

Obr. 18: : Kalibrační graf závislosti poklesu intenzity fluorescence scopoletinu při = 460 nm na koncentraci H2O2. Experimentální podmínky - viz kap. 3.2.7.

Sledována byla fotogenerace H2O2 u všech studovaných vzorků. Sulfonované i nesulfonované PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným fotosensitizerem a vrstev s externě vázanými porfyrinovými fotosensitizery. Jak vyplývá z Obr. 19 u sulfonované PS nanovlákenné vrstvy s externě vázaným TMPyP dochází vlivem dlouhodobého stání k poklesu fotogenerace H2O2. To může odpovídat změnám v rovnováze monomer – agregát, které byly u externě vázaného TMPyP pozorovány na rozdíl od TMPyP(Sn) (viz. kap. 4.3). Větší zastoupení agregovaných forem odpovídá vyšší fotogeneraci H2O2. Největší fotogenerace

H2O2 byla ale překvapivě zjištěna (Obr. 19) u externě

vázaného TMPyP(Sn). TMPyP(Sn) díky přítomnosti axiálních ligandů netvoří ve vodném prostředí agregované formy18. Absorpční i emisní spektra adsorbovaného TMPyP(Sn) na povrch sulfonovaných nanovlákenných vrstev rovněž neukazují větší zastoupení agregovaných forem (obr. 12 a 14, kap. 4.3). Není proto možné vysvětlit fotogeneraci H2O2 na základě stejného předpokladu jako u TMPyP. Vysoká koncentrace i monomerní formy TMPyP(Sn) však může usnadnit elektronový přenos mezi blízko sebe navázanými molekulami.

- - 39 - -

c fotoprodukovaného H2O2 [nmol/l]

5

4

3

2

1

0 0

2

4

6

8

10

čas [min]

Obr. 19: Závislost produkce H2O2 na době ozařování nanovlákenných vrstev s externě vázaným TMPyP(Sn) (červená), TMPyP (zelená) a TMPyP po 10 dnech v deionizované vodě (černá). Sulfonované i nesulfonované PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným 1% TPP vykazují jen velmi nepatrnou fotogeneraci H2O2 (modrá). Experimentální podmínky - viz kap. 3.2.7.

U sulfonované i nesulfonované PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným 1% TPP, nebyl takřka detekován fotogenerovaný peroxid H2O2 (Obr. 19). To může být vysvětleno malým zastoupením agregované formy. Je však pravděpodobné že roli hraje vlastní materiál nanovlákenné matrice. U nanovlákenných vrstev s enkapsulovaným fotosensitizerem z polymeru obsahující funkční skupiny fungující jako elektronové donory byl zjištěna vysoká produkce H2O2.46 Příkladem může být polyuretanová nanovlákenná vrstva (Larithan) s enkapsulovaným 1% TPP s velmi vysokou fotogenerací H2O2 (Obr. 20). Jedním z dílčích cílů práce bylo připravit sulfonovanou PS nanovlákennou vrstvu s enkapsulovaným TPP produkujícím H2O2 s na povrchu vázanými ionty Fe2+. Na takto připraveném nanomateriálu by mohla probíhat během ozářování Fentonova reakce za vzniku OH˙ radikálů (viz. kap. 1.1). Sulfonovaná PS nanovlákenná vrstva s enkapsulovaným TPP ale nevykazovala produkci H2O2, nebylo tedy možné připravit jedinou nanovlákennou vrstvu, na které by probíhala Fentonova reakce. Bylo nutné použít vrstvy dvě, jednu produkující H2O2 a na ni

- - 40 - -

druhou s vázanými ionty Fe2+. Při ozařování tohoto dvouvrstevnatého materiálu nebyl detekován žádný H2O2 (Obr. 20). To je v souladu s předpokládanou Fentonovou reakcí rozkládající vznikající H2O2 za

vzniku OH˙. Dle očekávání byl pozorován mírný pokles produkce H2O2 vlivem „stínění“ druhou nanovlákennou vrstvou (bez efektu navázaného Fe2+). K demonstraci těchto jevů byly použita PUR (Larithan) nanovlákenná vrstva s 1% TPP, protože má ze všech studovaných vzorku největší produkci H2O2. Druhou vrstvu tvořil sulfonovaný PS nanomaterial s navázaným ionty Fe2+ (Obr. 20). Jev byl pozorován i u externě vázaných fotosensitizerů.

c fotoprodukovaného H2O2 [nmol/l]

6

4

2

0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

čas [min]

Obr. 20: Závislost koncentrace fotoprodukovaného H2O2 na době ozařování PUR nanovlákenné vrstvy (Larithan) s 1% enkapsulovaným TPP před (modrá) a po překrytí sulfonovanou PS nanovlákennou vrstvou (černá) na kterou byly poté navázanými ionty Fe2+ (červená). Experimentální podmínky - viz kap. 3.2.7.

- - 41 - -

4.6. TESTY FOTOCYTOTOXICITY NANOVLÁKENNÝCH VRSTEV Pro studium baktericidních účinků PS nanovlákenných vrstev byla použita bakteriální suspenze popsaná v kap. 3.2.10. Po skončení inkubace byly plotny vizuálně hodnoceny. Na Obr. 21 a Obr. 23 je vidět, že PS nanovlákenná vrstva s enkapsulovaným TPP vykazuje při ozařování baktericidní vlastnosti, které si zachovává i po sulfonaci. Oproti tomu při ponechání ve tmě poroste nanovlákenná vrstva s TPP podobným množstvím kolonií jako kontrola bez TPP. To ukazuje, že za baktericidní vlastnosti je odpovědný fotoprodukovaný 1O2, a že sulfonovaný povrch nanovlákenné vrstvy není pro bakterie toxický. Pravděpodobným důvodem většího nárůstu drobnějších kolonií na sulfonovaných vzorcích je jejich větší hydrofilnost.

Obr. 21: Ozařovaná (B) a neozařovaná (A) Obr. 22: Ozařovaná (D) a neozařovaná (C) plotna plotna s nesulfonovanou PS nanovlákennou s nesulfonovanou PS nanovlákennou vrstvou s (2) vrstvou s (2) a bez enkapsulovaného TPP (1).

a bez enkapsulovaného TPP (1).

Na fotografické dokumentaci (Obr. 23 a Obr. 24) nejsou kvůli tmavému pozadí dobře vidět narostlé kolonie u vzorků sulfonovaných PS nanovlákenných vrstev s externě vázaným TMPyP a TMPyP(Sn), ponechaných ve tmě (E2,H2). Nicméně i u externě vázaných fotosensitizerů byly pozorovány baktericidní účinky pouze po jejich ozáření.

- - 42 - -

Obr. 23: Ozařovaná (F) a neozařovaná (E) plotna Obr. 24: Ozařovaná (G) a neozařovaná (H) plotna se sulfonovanou PS nanovlákennou vrstvou s (2) a se sulfonovanou PS nanovlákennou vrstvou s (2) a bez (1) externě vázaného TMPyP

bez (1) externě vázaného TMPyP(Sn)

Na základě shora uvedených testů lze konstatovat, že jednoduchou chemickou úpravou – sulfonací, lze dosáhnout vyšší hydrofilnosti nanomateriálu bez podstatnější změny v produkci singletového kyslíku či toxicity ve tmě. Sulfonované hydrofilní nanomateriály, ale mohou být podstatně účinnější (ve smyslu fototoxicity) v boji s pathogeny s vyšší adhezí na polární povrchy.

- - 43 - -

5. ZÁVĚR V rámci této práce bylo zjištěno následující: 1) Byly nalezeny vhodné podmínky sulfonace PS nanovlákenné vrstvy připravené metodou „electrospinning“ a podařilo se tak úspěšně připravit materiál s vlastnostmi katexového nanomateriálu. 2) Analýzou SEM snímků byl odhadnut průměr PS nanovláken před a po sulfonaci. Vlivem sulfonace nedochází k podstatnějšímu narušení struktury nanovláken. 3) Byla zjištěna iontová výměnná kapacita (IEC) a kinetika adsorpce iontů Fe2+ pro připravené katexové materiály. 4) Pomocí UV-VIS a fluorescenční spektroskopie bylo zjištěno, že v případě PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným nepolárním porfyrinem TPP proces sulfonace sice částečně vymývá TPP, za vhodných experimentálních podmínek však podstatná část TPP zůstává stabilně zakotvena v PS matrici a po sulfonaci se dále nevymývá do vodného prostředí. 5) Záporně nabitý povrch připravených sulfonovaných nanovlákenných vrstev umožňuje externě elektrostaticky vázat kationtové porfyriny z vodného prostředí. Tato schopnost byla demonstrována na modelových porfyrinových fotosensitizerech TMPyP a TMPyP(Sn). V případě TMPyP bylo zjištěno, že porfyrin se na povrch matrice váže v podobě monomerní i agregované formy. Rovnováha monomeragregát se přitom posouvá směrem k monomerní formě dlouhodobým stáním v H2O. TMPyP(Sn) se váže jen monomerní formou, agregaci brání přítomnost axiálních ligandů. 6) Sulfonovaná i nesulfonovaná PS nanovlákenná vrstva s enkapsulovaným TPP efektivně generuje singletový kyslík po ozáření viditelným světlem. Fotogenerace singletového kyslíku byla zjištěna i u nanovlákenných vrstev s externě vázanými fotosensitizery TMPyP a TMPyP(Sn). K detekci singletového kyslíku byly použity fotofyzikální metody, detekce fosforescence - - 44 - -

1

O2 a zpožděné fluorescence

fotosensitizeru. Použita byla i chemická metoda detekce

1

O2 založená na

fotodegradaci kyseliny močové. 7) Sulfonované PS

nanovlákenné vrstvy s externě

vázanými porfyrinovými 1

fotosensitizery TMPyP a TMPyP(Sn) vykazují vedle O2 i fotogeneraci H2O2. Mechanismus této fotogenerace se zatím nepodařilo určit. 8) V případě PS nanovlákenné vrstvy s externě vázaným TMPyP(Sn) či PUR nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným TPP, kde byla již silná fotogenerace H2O2 zjištěna, bylo demonstrováno, že po v přítomnosti další, sulfonované PS vrstvy s navázaným Fe2+ nebyl H2O2 po ozáření detekován. To naznačuje možnost fotofentonové reakce a fotogeneraci OH. radikálů v těchto hybridních systémech. 9) Silné fotobaktericidní vlastnosti vůči E. Coli byly zjištěny u sulfonované i nesulfonovaná PS nanovlákenné vrstvy s enkapsulovaným TPP a u sulfonovaných PS nanovlákenných vrstev s externě vázanými fotosensitizery TMPyP a TMPyP(Sn). Ani v jednom případě nebyla zaznamenána „temná“ toxicita. To naznačuje, že baktericidní vlastnosti nanovlákenných nanomateriálů způsobuje fotogenerovaný 1

O2, případně H2O2.

- - 45 - -

6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1

Lang, K.; Mosinger, J.; Wagnerová, DM.; Pokroky ve fotochemii singletového kyslíku. Chemické Listy 99, 211-221 (2005).

2

Weldon, D.; Poulsen, TD; Mikkelsen, KV; et al.: Singlet sigma: The "other" singlet oxygen in solution. Photochemistry and photobiology 70:4, 369-379 (1999).

3

Foote, CS.; Wexler, S.; Ando, W.; Higgins, R.; Chemistry of singlet oxygen .4.oxygenations with hypochlorite-hydrogen peroxide. Journal of the American Chemical Society 90, 975-& (1968).

4

Aubry, JM.; Pierlot, C.; Rigaudy, J.; et al.; Reversible binding of oxygen to aromatic compounds. Accounts of chemical research 36:9, 668-675 (2003).

5

Slanger, TG.; Copeland, RA.; Energetic oxygen in the upper atmosphere and the laboratory. Chemical reviews 103:12, 4731-4765 (2003).

6

Tarr, M.; Valenzeno, DP.; Singlet oxygen: the relevance of extracellular production mechanisms to oxidative stress in vivo. Photochemical & Photobiological Scencesi 2, 355-361 (2003).

7

Freinbichler, W.; Colivicchi, MA.; Stefanini, Ch.; et al.; Highly reactive oxygen species : detection, formation, and possible functions. Cellular and molecular life sciences 68:12, 2067-2079 (2011).

8

Deng, Y.; Englehardt, JD.; Treatment of landfill leachate by the Fenton process. Water research 40:20, 3683-3694 (2006).

9

Cadenas, E.; Packej, L.; Understanding the Process of Aging – The Roles of Mitochondria, Free Radicals, and Antioxidants. CRC Press (1999).

10

Dahlgren, C.; Karlsson, A.; Respiratory burst in human neutrophils. Journal of Immunological Methods 232, 3-14 (1999).

11

Thannickal, VJ.; Fanburg BL.; Reactive oxygen species in cell signaling. American Journal of Physiology - Lung Cell Molecular Physiology 279, 1005-1028 (2000).

12

Gerischer, H.; Heller, A.; The role of oxygen in photooxidation of organic-molecules on semiconductor particles. Journal of physical chemistry 95:13, 5261-5267 (1991).

13

Foote, CS. ; Definition of type-I and type-II photosensitized oxidation. Photochemistry and Photobiology 54:5, 659-659 (1991).

14

Mosinger, J.; Demié, M.; Lang, K.; Kubát, P.; Wagnerová DM.; Supramolecular sensitizer:

complexation

of

meso-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin

- - 46 - -

with

2-

hydroxypropyl-cyclodextrins. Journal of Photochemistry and Photobiology 130, 13-20 (2000). 15

Kalyanasundaram, K.; Neumann-Spallart, M.; Photophysical and redox properties of water-soluble porphyrins in aqueous-media. Journal of Physical Chemistry 86:26, 51635169 (1982).

16

Kadish, KM.; Maiya, BG.; Araullo-McAdams, C.; Spectroscopic characterization of meso-tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrins, [(TMpyP)H2]4+ and [(TMpyP)M]4+, in aqueous micellar media, where M = VO2+, Cu(II), and Zn(II). The Journal of Physical Chemistry 95:1, 427-431 (1991).

17

Usui, Y.: Determination of quantum yield of singlet oxygen formation by photosensitization. Chemistry Letters 7, 743-744 (1973).

18

Mosinger, J.; Janoskova, M.; Lang, K.; Kubat, P.; Light-induced aggregation of cationic porphyrins. Journal of Photochemistry and Photobiology 181, 283-289 (2006).

19

Hadjur, C.; Wagnieres, G.; Monnier, PH.; EPR and spectrophotometric studies of free radicals (O2•−, √OH, BPD-MA•−) and singlet oxygen (1O2) generated by irradiation of benzoporphyrin derivative monoacid ring A. Photochemistry and Photobiology 65, 818– 827 (1997).

20

Komagoe, K.; Katsu, T.; Porphyrin-Induced Photogeneration of Hydrogen Peroxide Determined Using the Luminol Chemiluminiscence Method in Aqueous Solution: A Structure-Activity Relationship Study Related to the Aggregation of Porphyrin. Analytical Sciences 22, 255-258 (2006).

21

Komagoe, K.; Tamagake, K.; Katsu, T.; The Influence of Aggregation of Porphyrins on the Efficiency of Photogeneration of Hydrogen Peroxide in Aqueous Solution. Chemical & Pharmaceutical Bulletin 54, 1004-1009 (2006).

22

Kubat, P.; Utilization of time-resolved spectroscopy in the study of photosensitized reactions. Chemicke listy 90:8, 515-522 (1996).

23

Wilkinson, F.; Helman, WP.; Ross, AB,: Rate constants for the decay and reactions of the lowest electronically excited singlet-state of molecular-oxygen in solution – an expanded and revised compilation. Journal of Physical and Chemical Reference Data 24:2, 6631021 (1995).

24

Scurlock, RD.; Wang, BJ.; Ogilby, PR.: Chemical reactivity of singlet sigma oxygen (b(1)Sigma(+)(g)) in solution. Journal of the American Chemical Society 118:2, 388-392 (1996). - - 47 - -

25

Krasnovskii, AA.: Photosensitized luminescence of singlet oxygen in solution. Biofizika 21:4, 748-749 (1976).

26

Mosinger, J.; Jirsak, O.; Kubat, P.; et al.; Bactericidal nanofabrics based on photoproduction of singlet oxygen. Journal of Materials Chemistry 17:2, 164-166 (2007).

27

Levin, P.; Costa, SM.; Photokinetics in tetraphenylporphyrin – molecular oxygen system at gas/solid interfaces: effect of singlet oxygen quenchers on oxygen-induced delayed fluorescence. Chemical Physics 263, 423-436 (2001).

28

Schreuder-Gibson, H.; Gibson, P.; Senecal, K.; et al.; Protective textile materials based on electrospun nanofibers. Journal of Advanced Materials 34:3, 44-55 (2002).

29

Ma, ZW.; Kotaki, M.; Ramarkrishna, S.; Surface modified nonwoven polysulphone (PSU) fiber mesh by electrospinning: A novel affinity membrane. Journal of Membrane Science 272, 179-187 (2006).

30

Kenawy, ER.; Bowlin, GL.; Mansfield, K.; et al.; Release of tetracycline hydrochloride from electrospun poly(ethylene-co-vinylacetate), poly(lactic acid), and a blend. Journal of Controlled Release 81, 57-64 (2002).

31

An, H.; Shin, C.; Chase, GG.; Ion exchanger using electrospun polystyrene nanofibers. Journal of Membrane Science 283, 84-87 (2006).

32

Jesenská, S.; Plíštil, L.; Kubát, P.; Lang, K.; et al.; Antibacterial nanofiber materials actived by light. Journal of Biomedical Materials Research:Part A (2011).

33

Mosinger, J.; Lang, K.; Kubat, P.; et al.; Photofunctional Polyurethane Nanofabrics Doped by Zinc Tetraphenylporphyrin and Zinc Phthalocyanine Photosensitizers. Journal of Fluorescence 19:4, 705-713 (2009).

34

Mosinger, J.; Lang, K.; Plíštil, L.; Jesenská, S.; Hostomský, J.; Zelinger, Z.; Kubát, P.; Fluorescent polyurethane nanofabrics : a source of singlet oxygen and oxygen sensing. Langmuir : The ACS Journal of Surface and Colloids 26, 10050-10056 (2010).

35

Fortune, WB.; Mellon, MG.; Determination of iron with o-phenanthroline - A spectrophotometric study. Industrial & engineering chemistry. Analytical edition. 10:2, 60-64 (1938).

36

Corbett, JT.; The scopoletin assay for hydrogen peroxide A review and better method. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 18, 297-307 (1989).

37

Rice-Evans, CA.; Diplock, AT.; Symons, MC.; Techniques in free radical research. Elsevier, 92-96 (1991).

38

Gomes, A.; Fernandes E.; Lima JF.; Fluorescence probes used for detection of reactive - - 48 - -

oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 65, 45-80 (2005). 39

Fischer, F; Graschew, G; Sinn, HJ; et al.: A chemical dosimeter for the determination of the photodynamic activity of photosensitizers. Clinica Chimica Acta 274:1, 89-104 (1998).

40

Základní praktikum z analytické chemie. Skriptum Univerzity Karlovy v Praze, (2004). Dostupné na URL: http://web.natur.cuni.cz/analchem/zprakt/navody.pdf [cit. 24.7.2011].

41

Eyens, E.; Baeyens, J.; A review of classic Fenton. Journal of hazardous materials 98, 33-50 (2003).

42

Khairutdinov, RF.; Sermone, N.; Photoluminiscence and Transient Spectroscopy of Free Base Porphyrin Aggregates. The Journal of Physical Chemistry B 103, 761-769 (1999).

43

Korínek, M.; Dědic, R.; Molnár, A.; Svoboda, A.; Hála, J.; A comparison of photosensitizing properties of meso-tetraphenylporphin in acetone and in dimethyl sulfoxide. Journal of Molecular Structure 744, 728 – 731 (2005).

44

Kadish, KM.; Maiya, BG.; Araullomcadams, C.: Spectroscopic characterization of mesotetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrins, [(TMPYP)H2]4+ and [(TMPYP)M]4+, in aqueous micellar media, where M = VO2+, CU(II), and ZN(II). Journal of Physical Chemistry 95:1, 427-431 (1991).

45

Henke, P.; Fotosensitizers externally bound to polymer nanofabrics. Bakalářská práce, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze (2009).

46

Perlík, M.; Study of photogeneration of hydrogen peroxide by polymeric nanofibers with encapsulated photosensitizer. Diplomová práce, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze (2011).

- - 49 - -