Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS RIFAMPICIN ISONIAZID-PIRAZINAMID DALAM FIXED DOSE COMBINATION DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS-DENSITOMETRI 1
2
M. Hatta Prabowo *, Ari Wibowo , Laily Fauziyah 1,2,3
3
Program Studi Farmasi Universitas Islam Indonesia
*e-mail:
[email protected]
ABSTRAK Rifampicin, isoniazid (INH) dan pirazinamid merupakan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) yang tersedia dalam bentuk Fixed Dose Combination (FDC). Sediaan FDC ini lebih praktis dalam penggunaannya sehingga dapat meningkatkan kepatuhan pasien Tuberkulosis (TB) dalam mengkonsumsi obat. Namun pada beberapa penelitian masih ditemukan FDC yang subdosis yang dapat mengakibatkan pengobatan TB menjadi kurang optimal dan meningkatnya risiko resistensi OAT. Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan metode analisis baru yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT)Densitometri yang memiliki validitas baik sehingga dapat menjadi alternatif metode analisis yang lebih mudah, cepat, murah dan praktis. Validasi metode yang dilakukan meliputi pengukuran linieritas, presisi, akurasi, batas deteksi dan batas kuantitasi. Parameter hasil validasi metode dibandingkan dengan persyaratan yang ada di Association of Official Analytical Chemist (AOAC) dan United States Pharmacopeia (USP) untuk penetapan kadar FDC. Sampel FDC yang mengandung rifampicin, INH dan pirazinamid dapat dipisahkan dengan fase gerak berupa n-heksan: 2-propanol: aseton: amonia: asam format dengan perbandingan 3:3,6:3:0,3:0,1 (v/v/v/v) dan nilai Rf yang diperoleh untuk rifampicin adalah 0,85, INH 0,6 dan pirazinamid 0,7. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode KLTDensitometri dapat dikembangkan dan semua parameter validasinya memenuhi persyaratan AOAC. Hasil koefisien korelasi (r) rifampicin 0,999, INH 0,999 dan pirazinamida 0,999, perolehan kembali rifampicin 101,00 %, INH 94,36 % dan pirazinamid 95,69 %; nilai % RSD presisi rifampicin 0,55 %, INH 0,96 %, dan pirazinamid 0,98 %; nilai batas deteksi rifampicin 10,91 ppm, INH 10,38 ppm dan pirazinamid 42,14 ppm; nilai batas kuantitasi
rifampicin 33,07 ppm, INH 31,45 ppm dan pirazinamid 127,7 ppm. Kadar terukur (mg) rifampicin, INH, dan pirazinamid per tablet adalah 157,37 mg, 75,26 mg dan 400,79 mg yang berarti sesuai dengan standar yang ditetapkan oleh USP. Kata kunci: KLT-Densitometri, rifampicinINH-pirazinamid, validasi
ABSTRACT
Rifampicin, isoniazid (INH) and pyrazinamide are anti tuberculosis drugs (ATD) available in fixed dose combination (FDC) form. The FDC is more practical in usage so can improve tuberculosis patient obedience in consuming the drug. However, in some researches, there are still found subdose of FDC. Subdose of FDC that effected in less optimal TB medication and increase risk of ATD resistance. The high TB case in developing countries such as Indonesia require test of FDC drug dose evaluation. Objective of this research was to develop new analytical method, Thin Layer Chromatography (TLC)-densitometry having good validity so it may be easier, faster, cheaper and more practical analytical method alternative. Validation parameters consist of linearity, precision, accuracy, Limit Of Detection (LOD), and Limit Of Quantitation (LOQ). Parameter of method validation results was compared with requirement in Association of Official Analytical Chemist (AOAC) and United States pharmacopeia (USP) for determine active ingredient in sample. FDC sample containing rifampicin, INH and pyrazinamide can be separated with n-hexane: 2-propanol: acetone: ammonia: formic acid with proportion of 3:3.6:3:0.3:0.1 (v/vv/v) as mobile phase and Rf value for rifampicin, INH, and pyrazinamide were 0.85, 0.6, and 0.7, respectively. The results indicated that TLC-densitometry can be developed and all
M. Hatta Prabowo
validation parameters complied with AOAC requirements. The correlation coefficient (r) of rifampicin 0.999, INH 0.999 and pyrazinamide 0.999; recovery of rifampicin, INH and pyrazinamide were 101.00 %, 94.36 % and 95.69 %, respectively. In addition, precision, % RSD for rifampicin, INH and pyrazinamide were 0.55 %, 0.96 %, and 0.98 % respectively; LOD for rifampicin, INH and pyrazinamide were 10.91 ppm, 10.38 ppm and 42.14 ppm, respectively; LOQ for rifampicin, INH and pyrazinamide were 33.07 ppm, 31.45 ppm and 127.7 ppm, respectively. Concentration of rifampicin, INH and pyrazinamide in a tablet were 157.37 mg, 75.26 mg and 400.79 mg that comply with USP standard.
Rifampicin, isoniazid (INH) dan pirazinamid
Keywords: rifampicin-isoniazid-pyrazinamide, TLC-densitometry, validation
macam obat dalam waktu yang cukup lama
merupakan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) lini pertama yang digunakan untuk pengatasan penyakit TB. Ketiga obat ini tersedia dalam bentuk kombinasi satu sediaan obat dengan dosis sesuai standar yang disebut sediaan Fixed Dose Combination (FDC). Bentuk sediaan
ini
didesain
untuk
mencegah
terjadinya resistensi OAT pada pasien TB, khususnya pasien dengan tingkat kepatuhan minum obat rendah yang disebabkan akibat pasien harus mengkonsumsi bermacam-
sehingga banyak pasien TB yang tidak dapat menyelesaikan pengobatan hingga tahap akhir (Peloquin, 2007).
PENDAHULUAN
Namun Hasil
menjadi
masalah
World
Health
adalah banyak sediaan FDC yang beredar di
mengenai
angka
masyarakat memiliki dosis dibawah standar.
kejadian TB di 22 negara, diketahui India,
Fenomena ini tidak hanya terjadi di dalam
Cina dan Indonesia berkontribusi lebih dari
negeri
50 % dari seluruh kasus TB. Indonesia
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan
menempati urutan ke-3 setelah India dan
oleh
Cina (Anonim, 2008). Tingginya kasus TB di
diketahui bahwa 31 % FDC OAT yang telah
Indonesia membuat Departemen Kesehatan
beredar
RI mencanangkan program bebas TB 2050.
subdosis (Kenyon, et al.,1999).
Organization
survei
yang
(WHO)
namun
Food
di
juga
Drug
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 8 No. 2 Tahun 2011
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
luar
Administration
pasaran
(a)
di
Amerika
negeri.
(FDA)
ternyata
Pengembangan dan Validasi
(b)
(c)
Gambar 1. (a) Struktur kimia rifampicin , (b) Struktur kimia INH, (c) Strutur kimia pirazinamid
Metode analisis sediaan FDC yang
pengobatan TB dan menurunkan angka
umum digunakan saat ini mengunakan
resistensi OAT pada pasien TB (Kelesidis,et
metode yang mengacu ke United State
al., 2007).
Pharmacopeia (USP) 30 untuk menganalisis rifampicin,
INH
dan
pirazinamid
dalam
WHO merekomendasikan metode analisa yang memiliki keunggulan seperti
sediaan FDC OAT adalah metode High
HPLC
Performance Liquid Chromatography (HPLC)
pemisahan senyawa dengan sensitivitas dan
(Khuhawar, et al.,1998 dan Anonim, 2006).
selektivitas
Namun,
beberapa
preparasi yang mudah, waktu pengerjaan
keterbatasan antara lain preparasi sampel
yang singkat, perawatan alat yang mudah
yang cukup sulit, membutuhkan waktu yang
serta biaya yang lebih rendah yaitu metode
lama, peralatan yang rumit dan perawatan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri
alat
(Anonim, 2002 ). Metode ini merupakan
HPLC
yang
sulit
memiliki
sehingga
biaya
yang
terkait
keakuratan
yang
tinggi,
dalam
memiliki
hal
cara
b
dibutuhkan dalam penggunaan alat ini cukup
metode
tinggi (Kenyon et al, 1999), identifikasi
dikembangkan dalam rangka melakukan
senyawa
dan
hasil
analisa campuran obat dalam FDC. Metode
resolusi
yang
yang
yang dikembangkan harus divalidasi terlebih
sulitnya baik
didapatkan
jika
sampel
dianalisis sangat kompleks (Rohman, 2007). Penelitian
dengan
metode
KLT
alternatif
yang
perlu
untuk
dahulu untuk menjamin bahwa metode analisa
tersebut
akurat,
spesifik,
untuk menganalisis campuran rifampicin,
reprodusibel dan tahan pada kisaran analit
INH dan pirazinamid dalam sediaan FDC
yang
OAT
dan
Densitometri diharapkan menjadi solusi dari
antibiotik
anjuran WHO akan perlunya metode yang
meliputi
analisis
kuantitatif.
Analisa
rifampicin,
INH
kualitatif
campuran
dan
pirazinamid
dalam
akan
dianalisa.
Metode
KLT-
baik, valid, mudah preparasinya, namun
sediaan FDC OAT ini dinilai penting untuk
hasil
memastikan kandungan obat tersebut sesuai
dipertanggungjawabkan
atau tidak dengan ketentuan yang telah
digunakan disetiap negara baik yang maju
ditetapkan
ataupun berkembang.
dalam
Pharmacopeia menghindari
(USP) adanya
United sehingga FDC
OAT
States
yang
didapatkan sehingga
dapat dapat
dapat yang
METODE PENELITIAN
subdosis. FDC OAT yang tidak subdosis dan sesuai
dengan
ketentuan
yang
telah
Bahan
yang
digunakan
dalam
ditetapkan terkait kandungan zat aktifnya
penelitian ini adalah asam asetat glasial, n-
diharapkan
heksan, 2-propanol, aseton, ammonia, asam
dapat
mengoptimalkan
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
M. Hatta Prabowo
format (kualitas analisis, E. Merck), toluen,
corong gelas, chamber (ukuran 20 x 20 cm,
metanol (kualitas kromatografi, E. Merck),
Camag), Linomat 5 (tipe 130140, Camag),
rifampicin,
TLC scanner 3 (tipe 100914, Camag),
isoniazid
(INH),
pirazinamid,
sampel FDC yang mengandung 150 mg
Ultrasonicator (tipe B-2510, Bransonic).
rifampicin 75 mg isoniazid dan 400 mg pirazinamid, plat silika gel 60 F254 (E. Merck),
Optimasi eluen untuk pemisahan
kertas saring (Whatman, diameter 12,5 cm,
Optimasi
eluen
pemisahan
dalam
timbangan
cobakan beberapa eluen untuk pemisahan
analitik (Mettler Toledo, kepekaan 0,0001 g),
senyawa rifampicin, INH dan pirazinamid
pipet tetes, pipet volume (Pyrex), propipet,
dalam sediaan FDC OAT. Eluen yang
labu ukur (Pyrex), gelas ukur (Pyrex),
digunakan dalam optimasi eluen dapat dilihat
Erlenmeyer (Pyrex), mortir dan stamper,
pada Tabel 1.
ini
adalah
dengan
proses
ukuran pori 0,42 µm). Alat yang digunakan penelitian
dilakukan
untuk
menguji
Tabel 1. Kombinasi eluen yang digunakan dalam optimasi eluen untuk pemisahan senyawa rifampicin, INH dan pirazinamid dalam sediaan FDC OAT No
Kombinasi eluen
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Metanol: aseton: amonia Aseton: asam asetat glasial Metanol: toluen: amonia n- heksan: 2-propanol n- heksan: 2-propanol: aseton n- heksan: 2-propanol: aseton n-heksan: 2-propanol: aseton: amonia n-heksan: 2-propanol: aseton: amonia: asam format n-heksan: 2-propanol: aseton: amonia: asam format n-heksan: 2-propanol: aseton: amonia: asam format
Preparasi larutan standar campuran Larutan campuran
stok
rifampicin
detektor
standar/baku
dan
INH
Perbandingan konsentrasi (% v/v) 4,2: 5,5: 0,3 9,9: 0,1 5,3: 4,4: 0,3 5:5 4:4:2 3:3:4 3:3:3:1 3: 3,8: 2,8: 0,3: 0,1 3: 3,6: 3: 0,3: 0,1 3: 4: 2,6: 0,3: 0,1
dengan
UV
densitometer. campuran
yang Larutan
rifampicin
Indeks polaritas 4,95 5,2 3,76 2 2,62 3,24 2,73 2,94 2,96 2,92
terdapat stok dan
dalam
kurva INH
baku
dengan
konsentrasi 2500 ppm serta pirazinamid
konsentrasi 2500 ppm serta pirazinamid
5000 ppm, dibuat dengan cara melarutkan
5000 ppm diencerkan dengan metanol untuk
standar pro analisa rifampicin dan INH
membuat seri kadar dengan konsentrasi 50,
masing-masing
mg
100, 200, 300 dan 400 ppm untuk rifampicin
pirazinamid dalam 25 mL metanol, kemudian
dan INH serta 100, 200, 400, 600 dan 800
di-ultrasonic selama 5 menit, ditambahkan
ppm pirazinamid.
metanol hingga 50,0 mL lalu di-ultrasonic
baku di buat dengan menotolkan sebanyak 5
kembali selama 5 menit.
µL seri kadar kurva baku campuran pada
125
mg
dan
250
Untuk pembuatan kurva
plat silika gel 60 F254, kemudian dielusi Penentuan panjang gelombang maksimal
dengan eluen terbaik sampai tanda batas
(λ max ) dan linieritas kurva baku
atas dan dikeringkan dengan cara diangin-
Optimasi λ max dilakukan dengan
anginkan di suhu kamar. Spot yang telah
cara scanning λ max dari spot kurva baku
terpisah
campuran rifampicin, INH dan pirazinamid di
sehingga akan didapat data Retardation
permukaan plat silika dengan menggunakan
factor (Rf) dan Area Under Curve (AUC).
dianalisa
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
dengan
densitometer,
Pengembangan dan Validasi
Linieritas kurva baku ditentukan dengan cara
Pengujian akurasi
mengolah data konsentrasi seri kadar (x) dan AUC (y) yang diperoleh menggunakan
persamaan
dengan
regresi
linier.
Akurasi
ditentukan
dengan
menggunakan metode standar adisi. Sampel yang
dianalisis
mengandung
150
ppm
Linieritas kurva baku baik jika nilai koefisien
rifampicin, 75 ppm INH dan 400 ppm
korelasinya (r) ≥ 0,999 dan koefisien variasi
pirazinamid. Sampel ditambahkan dengan 3
regresi (Vx0)
seri kadar standar yang berbeda yaitu 50,
≤ 5 % bila nilai r belum a
mencapai 0,999 (Anonim, 2002 ).
200 dan 400 ppm untuk rifampicin dan INH serta
Pengujian presisi
100,
400
pirazinamid.
dan
800
Kadar
ppm
untuk
standar
yang
Pengujian presisi yang dilakukan
ditambahkan ke dalam sampel diharapkan
adalah keterulangan (repeatability) sebagai
dapat mewakili kadar terendah sampai kadar
variasi dalam sehari. Kadar yang digunakan
paling
dalam pengujian presisi adalah 200 ppm
digunakan. Ditotolkan pada plat silika gel 60
untuk rifampicin dan INH serta 400 ppm
F254, masing-masing kadar 3 kali penotolan
untuk pirazinamid . Ditotolkan pada plat silika
dengan volume penotolan masing-masing 2
gel 60 F254 dengan volume 2 µL sebanyak 6
µL dan dielusi dengan eluen terbaik. Spot
spot ripitasi dengan menggunakan linomat,
pada plat silika kemudian dianalisis dengan
dielusi
densitometer
dan
dikeringkan, spot dalam plat silika kemudian
berupa
AUC
dianalisis dengan densitometer. Data yang
ditambahkan standar kemudian dihitung %
akan
diperoleh adalah nilai Rf dan AUC
perolehan kembali dari masing-masing kadar
kemudian dihitung nilai rata-rata ( ),standar
standar yang ditambahkan dalam sampel
deviasi (SD) dan standar deviasi relatif
dengan menentukan persen analit yang
(RSD). Berdasarkan AOAC, nilai presisi
ditambahkan
yang
senyawa dengan konsentrasi 100-1000 ppm
Berdasarkan
AOAC,
dengan
eluen
terbaik
dan
a
baik jika % RSD-nya ≤ 4 % (Anonim, 2002 ).
tinggi
nilai
dari
kurva
akan
baku
yang
diperoleh
sampel
yang
dapat nilai
%
data telah
terukur. perolehan
kembali senyawa dengan konsentrasi 10100 ppm baik jika nilainya 80-115 % dan
Penentuan
batas
deteksi
dan
batas
kuantitasi
konsentrasi 100-1000 ppm nilainya antara a
85-110 % (Anonim, 2002 ).
Batas deteksi dan batas kuantitasi ditentukan dari regersi kurva baku yang
Preparasi larutan sampel
diperoleh. Nilai LOD = 3,3 × (SD/S) dan
Ditimbang 3 tablet sampel X yang
LOQ = 10 × (SD/S), standar deviasi (SD)
mengandung 150 mg rifampicin 75 mg INH
respon
dan 400 mg pirazinamid, digerus hingga
ditentukan
berdasarkan
standar
deviasi residual (simpangan baku residual)
halus.
dari garis regresi yang dinyatakan sebagai
konsentrasi 750 ppm rifampicin, 375 ppm
Sy/x dan S merupakan nilai kemiringan
INH dan 2000 ppm pirazinamid, dengan cara
(slope atau b) pada persamaan garis atau
menimbang 0,04025 g sampel, dilarutkan
Dibuat
stok
sampel
dengan
a
regresi linier y = bx + a (Anonim, 2002 ).
dalam metanol 5 mL, di-ultrasonic selama 5 menit, disaring dengan kertas Whatman dan dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL,
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
M. Hatta Prabowo
ditambah dengan metanol hingga 10,0 mL
HASIL DAN PEMBAHASAN
dan di-ultrasonic kembali selama 5 menit. Pengembangan dan validasi metode KLTAnalisis kadar obat dalam sampel
Densitometri untuk menganalisis senyawa
Sampel ditotolkan pada plat silika
rifampicin, isoniazid (INH) dan pirazinamid
gel 60 F254 sebanyak 3 totolan dengan
diawali dengan tahapan optimasi eluen atau
volume 2 µL, kemudian dimasukkan dalam
fase gerak untuk menentukan eluen terbaik
chamber untuk dielusi dengan eluen terbaik
yang dapat memisahkan ketiga senyawa
sampai batas yang ditentukan yaitu 1 cm
tersebut. Optimasi terkait kondisi awal dalam
dari atas plat. Setelah dikeringkan, spot
pengembangan metode dilakukan supaya
dalam
diperoleh kondisi awal yang optimal. Hasil
plat
densitometer
silika dan
dianalisis
data
optimasi eluen menunjukkan eluen 9 yang
berupa nilai AUC dari sampel. Perhitungan
terdiri dari campuran n-heksan: 2-propanol:
kadar
aseton: amonia: asam format
dengan
perbandingan
(v/v/v/v)
sampel
memasukkan
nilai
akan
dengan
diperoleh
dilakukan AUC
dengan
sampel
ke
3:3,6:3:0,3:0,1
persamaan regresi linier dari kurva baku, y =
merupakan
bx + a. Nilai y merupakan AUC sampel, x
memisahkan ketiga senyawa yang dianalisis
adalah
dengan
konsentrasi/kadar,
b
merupakan
eluen
sempurna
terbaik
dan
yang
nilai
dapat
Rf
yang
slope/kemiringan dan a adalah intersep (Ali,
dihasilkan relatif konstan saat dilakukan elusi
et al., 2007).
ulang dengan eluen tersebut sesuai dengan Tabel 2.
Tabel 2. Keterangan hasil pemisahan senyawa rifampicin, INH dan pirazinamid dalam sediaan FDC OAT menggunakan eluen nomor 1- 10 Eluen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Pemisahan spot rifampicin-INHpirazinamid Tidak terpisah Tidak terpisah Tidak terpisah Terpisah 2 analit Terpisah 2 analit Terpisah 2 analit Terpisah 2 analit Terpisah tidak sempurna Terpisah sempurna Terpisah sempurna
Rifampicin 0,1 0,3 0,6 0,75 0,75 0,9 0,8
Rf INH 0,6 0,7 0,7 0,85 0,7 0,6 0,6
Pirazinamid 0,8 0,75 0,7
Pengembangan dan Validasi
Spot 1 Spot 2 Spot 3 Keterangan : A: standar pirazinamid; B: standar INH; C: standar rifampicin; D: sampel
A B C (a)
D
(b)
Fase diam Fase gerak Pengembangan Penotolan Deteksi
: silika gel 60 F254 : eluen no. 9 : menaik : 2 µL : UV 254 nm
Gambar 2. Hasil kromatogram sampel FDC dibandingkan dengan standar tunggal rifampicin, INH dan pirazinamid yang dilihat di bawah sinar UV 254 nm (a) dan sinar tampak (b).
Berdasarkan
keterangan
hasil
uji
disimpulkan bahwa sampel yang dianalisis
kualitatif sampel yang dianalisis pada Tabel
diduga mengandung rifampicin, INH dan
3, dapat dinyatakan bahwa spot 1 identik
pirazinamid dengan adanya persamaan nilai
dengan standar rifampicn, spot 2 identik
Rf dan warna spot yang dilihat dibawah sinar
dengan standar pirazinamid dan spot 3
UV 254 nm dengan masing-masing standar
identik dengan standar INH, sehingga dapat
dari senyawa tersebut.
Tabel 3. Keterangan hasil uji kualitatif sampel FDC OAT dibandingkan dengan standar tunggal rifampicin, INH dan pirazinamid
No. 1. 2.
Spot yang teridentifikasi
Parameter identifikasi Nilai Rf Warna bercak pada UV 254 nm
Keterangan Rf UV
: : :
Spot 1 0,85 Kuning kemerahan
Sampel Spot 2 0,7 Ungu
Spot 3 0,6
Rifampicin 0,85
Ungu
Kuning kemerahan
Standar INH Pirazinamid 0,6 0,7 Ungu
Ungu
Retardation factor Ultra violet
Tahap penelitian selanjutnya adalah validasi
Analytical Chemist (AOAC). Kurva baku
metode
dengan linieritas yang baik dapat digunakan
analisis
meliputi
pengukuran
linieritas kurva baku, presisi, batas deteksi,
untuk
batas kuantitasi dan akurasi yang hasilnya
kadarnya diperkirakan masuk dalam range
akan dibandingkan dengan persyaratan yang
kurva baku yang digunakan.
tertera
dalam
Association
of
menetapkan
Official
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
kadar
sampel
yang
M. Hatta Prabowo
(a)
(b)
(c)
Gambar 3. Hasil optimasi panjang gelombang senyawa (a) rifampicin , (b) INH , (c) Pirazinamid pada densitometer Optimasi panjang gelombang maksimal (λ
gelombang 269 sampai 271 nm, sedangkan
max)
pirazinamid dapat berpendar dengan optimal Optimasi
panjang
maksimal
(λ
max)
senyawa
bertujuan
dari
gelombang
pada panjang gelombang 272 nm.
masing-masing
untuk
mendapatkan
Linieritas kurva baku
senyawa yang spesifik dengan absorbansi
Linieritas suatu metode analisis
yang maksimal sehingga pengukuran kadar
dinilai
yang diperoleh juga maksimal. Spesifisitas
respon terhadap kadar, koefisien korelasi (r)
suatu
merupakan
dari persamaan garis regresi, dan standar
kemampuan suatu metode analisis untuk
deviasi residual (Sy/x) dari garis regresi
mengukur analit yang dituju secara tepat dan
(Ermer,
spesifik
residual
metode
analisis
dengan
adanya
komponen-
dengan
et
al.,
ini
cara
menentukan
2005). akan
grafik
Standar
deviasi
digunakan
untuk
komponen matriks sampel seperti adanya
menghitung koefisien variasi regresi (Vx0).
pengganggu. Tujuan penentuan spesifisitas
Nilai Vx0 yang direkomendasikan adalah ≤ 5
dalam
uji
%, jika koefisien korelasi yang diperoleh dari
identifikasi. Sebagai uji identifikasi karena
persamaan regresi linier belum mencapai
dapat membedakan antar senyawa yang
0,999 supaya suatu metode analisis tetap
mempunyai struktur molekul hampir sama
dapat dikatakan memiliki linieritas yang baik.
terutama INH dan pirazinamid.
ICH
penelitian
ini
dapat sebagai
merekomendasikan
minimal
Hasil optimasi λ max yang dapat
menggunakan 5 konsentrasi kadar dalam
dilihat pada Gambar 3 menunjukkan bahwa
kurva baku untuk pengujian linieritas kurva
rifampicin, INH dan pirazinamid memiliki λ
baku suatu metode analisis (Kenkel, 2000).
max
dapat
Hasil pengukuran kurva baku rifampicin, INH
berpendar dengan optimal pada panjang
dan pirazinamid menggunakan larutan stok
gelombang 336 nm, untuk INH pada panjang
baku campuran dapat dilihat pada Tabel 4.
yang
berbeda.
Rifampicin
Tabel 4. Persamaan regresi linier kurva baku Rifampicin, INH dan Pirazinamid No 1. 2. 3.
Nama senyawa Rifampicin INH Pirazinamid
Seri kadar (ppm)
Nilai r
50, 100, 200, 300, 400 50, 100, 200, 300, 400 100, 200, 400, 600, 800
0,999 0,999 0,999
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
Persamaan regresi linier y = 0,994x + 9,672 y = 0,996x + 1,942 y = 1,005x + 140,7
Pengembangan dan Validasi
Berdasarkan hasil pada Tabel 4,
Batas deteksi didefinisikan sebagai
dapat disimpulkan bahwa linieritas kurva
konsentrasi analit terendah dalam sampel
baku
pirazinamid
yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak
memenuhi persyaratan yang baik sehingga
selalu dapat dikuantitasi. Batas kuantitasi
dijamin
merupakan
rifampicin,
INH
validitasnya.
dan
Pengukuran
kadar
konsentrasi
analit
terendah
sampel yang mengandung rifampicin, INH
dalam sampel yang dapat ditentukan dengan
dan
menggunakan
presisi dan akurasi yang dapat diterima pada
persamaan regresi dari kurva baku di atas
kondisi operasional metode yang digunakan.
dapat
Batas
pirazinamid
dijamin
dengan
validitasnya ketika
kadar
deteksi
dan
batas
kuantitasi
sampel masuk dalam range kurva baku,
merupakan
apabila kadarnya melebihi atau di bawah
metode analisis, semakin kecil nilai batas
range kurva baku maka hasil pengukuran
deteksi dan kuantitasi menandakan semakin
dengan menggunakan persamaan regresi di
sensitif suatu metode dalam menganalisis
atas tidak dijamin validitasnya.
dan
parameter sensitivitas suatu
mengukur
kadar
suatu
analit.
Batas deteksi (Limit of Detection, LOD) dan
batas
kuantitasi
(Limit
of
Quantitation, LOQ)
Tabel 5. Nilai batas deteksi dan kuantitasi rifampicin, INH dan pirazinamid No. 1. 2. 3.
Nama senyawa Rifampicin INH Pirazinamid
Nilai batas deteksi (ppm) 10,91 10,38 42,14
Presisi (keseksamaan) Presisi
Nilai batas kuantitasi (ppm) 33,07 31,45 127,7
Dokumentasi presisi seharusnya mencakup
merupakan
ukuran
simpangan baku, simpangan baku relatif
kedekatan antara serangkaian hasil analisis
(RSD) atau koefisien variasi (CV). Merujuk
yang
pada
diperoleh
dari
beberapa
kali
Association
pengukuran pada sampel homogen yang
Chemist
sama.
merupakan
Presisi
sebagai
biasanya
Guidelines
yang
acuan dalam validasi metode
analisis, nilai RSD presisi keterulangan yang diterima untuk senyawa dengan kadar 100
secara statistik. Keterulangan merupakan
sampai 1000 ppm adalah tidak lebih dari 4 %
ketepatan pada kondisi percobaan yang
(Anonim, 2002 ).
baik
relatif
Analytical
dari
(berulang)
baku
Official
sejumlah sampel yang berbeda sigifikan
sama
simpangan
diekspresikan
(AOAC)
of
a
analisnya,
Hasil
pengukuran
semua
sedangkan
merupakan
persyaratan dari AOAC sehingga dapat
ketepatan pada kondisi percobaan yang
dikatakan metode yang dikembangkan telah
salah
memenuhu kriteria yang ditentukan dan hasil
satunya
antara
berbeda
baik
analisnya,
peralatannya, tempatnya maupun waktunya.
telah
untuk
peralatannya, tempatnya, maupun waktunya, presisi
komponen
presisi
memenuhi
pengukuran presisi disajikan dalam Tabel 6.
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
M. Hatta Prabowo
Tabel 6. Hasil pengukuran presisi keterulangan (repeatibility atau intraday precision) rifampicin dan INH dengan konsentrasi 200 ppm serta pirazinamid 400 ppm dalam larutan baku campuran Rifampicin Rf AUC 0,91 4189,20 0,95 4412,20 0,95 4454,30 0,94 4437,90 0,93 4420,20 0,92 4475,00 0,93 4398,13 0,02 104,86 1,72 2,38
No.* 1. 2. 3. 4. 5. 6. SD RSD (%)
INH Rf 0,61 0,61 0,61 0,60 0,60 0,60 0,61 0,01 0,83
AUC 7166,60 7105,00 7110,80 7016,70 7076,10 7138,30 7120,25 52,01 0,73
Akurasi
dengan jumlah yang telah diketahui ke Akurasi
antara
Pirazinamid AUC 13195,60 13084,10 13087,00 13082,80 13055,00 13113,70 13103,03 49,02 0,37
Rf 0,80 0,80 0,80 0,80 0,79 0,79 0,80 0,01 0,63
nilai
merupakan
terukur dengan
kedekatan nilai
dalam sampel. Persen perolehan kembali
yang
ditentukan
dengan
menentukan
berapa
diterima sebagai nilai sebenarnya. Akurasi
persen analit yang ditambahkan tadi dapat
dinyatakan
ditemukan. Suatu pendekatan praktik dalam
sebagai
persen
perolehan
kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
metode
Pengukuran akurasi dalam penelitian ini
membagi sampel ke dalam beberapa bagian
menggunakan metode standar adisi, karena
yang sama lalu menambahkan ke dalamnya
sampel yang dianalisis merupakan obat
standar dengan
paten
matriks
meningkat. Merujuk persyaratan nilai akurasi
didalamnya sehingga tidak memungkinkan
yang tertera dalam AOAC, nilai akurasi yang
untuk membuat sampel plasebonya. Metode
diterima untuk konsentrasi 10 sampai 100
adisi merupakan teknik analisis kuantitatif
ppm adalah 80-115 % dan untuk konsentrasi
dengan
100 sampai 1000 ppm adalah 85-110 %.
yang
tidak
diketahui
menambahkan sejumlah analit
standar
adisi
adalah
dengan
level konsentrasi
yang
Tabel 7. Nilai akurasi (% perolehan kembali) Rifampicin, INH, Pirazinamid yang diukur pada 3 konsentrasi yang berbeda No.
Senyawa
1.
Rifampicin
2.
INH
3.
Pirazinamid
Berdasarkan
Level 80% 100% 120% 80% 100% 120% 80% 100% 120%
hasil akurasi dari
Recovery (%) 97,44 101,00 106,71 105,45 94,36 100,18 95,48 85,94 95,91 digunakan
untuk
menganalisis
senyawa
rifampicin, INH dan pirazinamid yang tertera
tersebut memiliki tingkat ketelitian yang baik
pada Tabel 7 diketahui persen perolehan
karena dapat menghasilkan nilai pengukuran
kembali
tersebut
kadar analit yang sangat dekat dengan nilai
memenuhi persyaratan yang tertera dalam
sebenarnya. Ketelitian metode analisis yang
AOAC, sehingga dapat ditarik kesimpulan
baik akan memberikan hasil yang akurat
bahwa
saat
dari
ketiga
metode
senyawa
KLT-Densitometri
yang
metode
tersebut
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
digunakan
untuk
Pengembangan dan Validasi
mengukur kadar sampel yang sehingga
hasilnya
dianalisis, dijamin
Penetapan kadar sampel merupakan
dapat
tahap akhir yang dilakukan dalam penelitian
KLT-
setelah metode baru yang dikembangkan
Densitometri ini memiliki validitas yang baik
memiliki validitas yang baik sehingga hasil
berdasarkan hasil pengukuran akurasi yang
pengukurannya dapat dipertanggungjawab
nilainya yang memenuhi persyaratan dalam
kan kebenarannya.
kebenarannya. disimpulkan
Oleh
dapat
Penetapan Kadar Sampel
karena
bahwa
itu,
metode
AOAC.
Tabel 8. Hasil pengukuran kadar rifampicin, INH dan pirazinamid dalam sampel FDC OAT dengan metode KLT-Densitometri No.
Nama sampel
1. 2. 3.
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata Kadar terukur (ppm) Kadar terukur (mg)
Nilai AUC INH 1838,40 1854,70 1843,20 1845,43 75,26 75,26
Rifampicin 1987,30 1996,10 2242,80 2075,40 157,37 157,37
USP mensyaratkan kadar sampel
risiko
Pirazinamid 11797,40 11696,50 11558,10 11684,00 400,79 400,79
resistensi
dalam sediaan yang mengandung rifampicin,
mengakibatkan
INH dan pirazinamid adalah antara 90
kurang optimal.
antibiotik
pengobatan
TB
yang menjadi
sampai 110 % (Kenyon, et al., 1999). Hasil
Hasil pengukuran kadar sampel yang
pengukuran kadar sampel yang dapat dilihat
mengandung rifampicin, INH dan pirazinamid
pada Tabel 8 menunjukkan bahwa sampel
pada sediaan FDC OAT menunjukkan hasil
yang dianalisis memilki kadar yang sesuai
bahwa
dengan nilai sebenarnya yang tertera dalam
tersebut memenuhi persyaratan kadar dalam
kemasan produk dan persyaratan yang
USP dan sesuai dengan kadar yang tertera
ditetapkan dalam USP, sehingga dapat
pada kemasan produk, sehingga diharapkan
disimpulkan sampel FDC yang mengandung
dengan sesuainya dosis sediaan FDC OAT
150 mg rifampicin, 75 mg INH dan 400 mg
ini dapat memberikan hasil pengobatan
pirazinamid tidak subdosis ataupun melebihi
penyakit TB yang optimal dan menurunnya
dari dosis yang ditetapkan.
angka resistensi OAT pada pasien TB.
masing-masing
kadar
senyawa
Bila sediaan FDC OAT subdosis akan menyebabkan pengobatan TB menjadi tidak
KESIMPULAN
optimal karena dosis yang dibutuhkan untuk Pengembangan
dapat mengobati penyakit ini tidak cukup
metode
analisis
sehingga tidak dapat membunuh bakteri
dengan KLT-Densitometri telah dilakukan
penyebab penyakit TB dan apabila dosis
untuk
sediaan FDC OAT ini melebihi dari dosis
isoniazid (INH)-pirazinamid dalam sediaan
yang ditentukan dapat menyebabkan risiko
Fix Dose Combination (FDC) Obat Anti
toksisitas
Tuberkulosis
dari
OAT
tersebut.
Subdosis
menganalisis
senyawa
(OAT).
rifampicin-
Metode
hasil
ataupun melebihi dari dosis pada sediaan
pengembangan dapat memisahkan senyawa
FDC OAT ini keduanya dapat meningkatkan
yang
dianalisis
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
dengan
sempurna
dan
M. Hatta Prabowo
memiliki validitas yang baik karena semua hasil penilaian parameter validasi memenuhi persyaratan
yang
ditetapkan
oleh
Association of Official Analytical Chemist (AOAC). Kadar sampel FDC OAT yang mengandung rifampicin, INH dan pirazinamid yang terukur sesuai dengan kadar yang tertera
dalam
kemasan
sampel
dan
persyaratan yang ditetapkan oleh United State Pharmacopoeia (USP).
DAFTAR PUSTAKA a
Anonim, 2002 , AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals, available at http://www. AOAC.org (diakses 12 Desember 2009). b
Anonim, 2002 , Informal consultationon 4drug Fixed-Dose Combinations (4FDCs) compliant with the WHO Model List of Essential Drugs, World Health Organization, Geneva Switzerland. Anonim, 2006, United State Pharmacopoeia 30-National Formulary 25, USA, available at http://www.usp.org (Diakses 10 April 2007). Anonim, 2008, Lembar Fakta Tuberkulosis, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Kenyon, A.S., 1999, Rapid sreening of TB Pharmaceutical by Thin-Layer Chromatography, Food and Drug Administration, Division of Testing and Applied Analytical Development, St. Louis. Kenyon, T.A., Kenyon, A.S., Kgarebe, B.V., Mothibedi, D., Binkin, N.J., Layloff, T.P., 1999, Detection of Substandard Fixed-Dose Combination Tuberculosis Drugs Using Thin Layer Chromatogtaphy, Int. J. Tuberc. Lung. Dis, 11: S347S350. Khuhawar, M.Y., and Rind, F., 1998, High Performance Liquid Chromatographic Determination of Isoniazid, Pyrazinamide and Rifampicin in Pharmaceutical Preparation, P. J. Pharm. Sci., II: 49-54. Ermer, J., and Miller, J., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis A Guide to Best Practice, Wiley-VCH Gmbh & Co. KgaA, Weinheim, 3, 248-249. Peloquin, C.A., 2007, Tuberculosis; in Dipiro, et al (Eds): Pharmacotherapy A pathophysiological approach, McGraw-Hill, New York, 2020-2024. Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Belajar, Yogyakarta, 353366, 460-469.
Ali, J, N. Ali., Y. Sultana., S.Baboota., and S. Faiyas., 2007, Development and Validation of A Stability-Indicating HPTLC Method for Analysis of Antitubercular Drugs, Acta Chromatographica, 18: 168-179. Kelesidis, K., Kelesidis, L., Rafailidis, P., Falagas, M., 2007, Counterfeit or substandard antimicrobial drugs: a review of the scientific evidence, J. Antimicrob. Chem, 60: 214–236. Kenkel, J., 2000, A Primer on Quality in the Analytical Laboratory, Lewis Publishers, Boca Raton Florida, 9.
Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 9 No. 2 Tahun 2012
