VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN Staphylococcus aureus PADA PUPUK HAYATI
LESTARI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ABSTRAK LESTARI. Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati. Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Pupuk hayati komersial harus bebas kontaminan sebelum dipasarkan, sehingga pupuk hayati harus diuji mikrobiologi cemarannya. Metode analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati yang tervalidasi belum tersedia, oleh sebab itu metode uji yang terstandard harus dibuat. Penelitian ini bertujuan untuk menyediakan metode standard pengujian cemaran S. aureus pada pupuk hayati melalui validasi metode berdasarkan presisi dan akurasi. Presisi ditetapkan berdasarkan nilai Horwitz sedangkan akurasi ditetapkan berdasarkan persen perolehan kembali dan uji T. Metode acuannya adalah SNI 2332.9:2011 untuk menguji keberadaan S. aureus. Dalam pengujian ini mikrob rujukan yang digunakan ialah mikrob yang tersertifikasi (S. aureus IPBCC 5.11.666). Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode SNI 2332.9:2011 yang diterapkan untuk pupuk hayati memiliki presisi cukup baik. Simpangan baku relatif (SBR) untuk sampel yang membawa cemaran S. aureus (berturut-turut sebesar 0,20 dan 0,19) kurang dari 2/3 nilai Horwitz (0,84 dan 0,78). Persen perolehan kembali cemaran S. aureus ialah sebesar 172,34 %. Nilai perolehan kembali masuk dalam kisaran (48-291%) yang ditetapkan oleh Environmental Protection Agency. Uji T pada akurasi dan presisi jumlah sel S. aureus memperlihatkan hasil yang berbeda nyata pada α = 0,05. Berdasarkan nilai presisi dan akurasi (persen perolehan kembali), metode SNI 2332.9:2011 dapat diaplikasikan sebagai metode uji cemaran mikrob pupuk hayati. Kata kunci : validasi, metode analisis mikrobiologi, presisi, akurasi. ABSTRACT LESTARI. Validation Method of Staphylococcus aureus Contamination Analysis in Biological Fertilizer. Supervised by GAYUH RAHAYU and NISA RACHMANIA MUBARIK. Commercial bio-fertilizers must be free from contaminants. Yet, microbial testing methodology which validated for bio-fertilizers is not available. Therefore, such a method should be made available by validation procedure of certain reference method. This study aims to provide a standard method of testing microbial contamination S. aureus on bio-fertilizer. This method should fulfill the validation parameters, such as precision and accuracy. Precision is estimated by the Horwitz’s value and that of accuracy from the percent recovery. Precision is estimated by comparing the relative standard deviation (RSD) to the Horwitz’s value and accuracy is estimated by percentage of recovery and T test. The reference methods used is SNI 2332.9:2011 for the presence of S. aureus. In this research the contaminatS. aureus IPBCC 5.11.666)is used as a reference mataerial. he result indicated that SNI 2332.9:2011 have a high precision, since the relative standard deviation for sample and contaminant (0.20 and 0.19) of less than 2/3 value Horwitz (0.84 and 0.78). Percent recovery of contaminant S. aureus is 172.34%. The value of S. aureus were in the range limit (48-291%) of the Environmental Protection Agency. T-test of the accuracy and precision S. aureus test showed significantly different at α = 0.05. Based on the value of precision and accuracy (% recovery), SNI 2332.9:2011 can be applied as microbial contamination test method bio-fertilizer. Key word: validation, testing method for microbiology, precision, accuracy.
VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN Staphylococcus aureus PADA PUPUK HAYATI
LESTARI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Judul : Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati Nama : Lestari NIM : G34070090
Disetujui : Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Gayuh Rahayu NIP. 195801051983032002
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. NIP. 19671127 199302 2 001
Diketahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
RAWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 10 Januari 1989 dari Bapak Timan dan Ibu Warti. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SD Negeri 025 Delik, Kabupaten Kampar, Riau. Tahun 2004 penulis lulus dari SLTP Negeri 4 Bulukerto, Kabupaten Wonogiri, Jawa Tengah. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Kerinci Kanan, Kabupaten Siak Sri Indrapura, Riau. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Bibit Unggul Daerah (BUD). Pada tahun 2008 penulis diterima di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar TPA di desa Balumbang Jaya tahun 2009. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Serambi Ruhiyah Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (SERUM-G) pada tahun 2008-2009 serta menjadi panitia diberbagai kegiatan antara lain Ekspresi Muslimah (Eksmus), dan Masa Perkenalan Mahasiswa Baru (MPKMB) IPB angkatan 45. Pada tahun 2010/2011 penulis pernah menjadi Senior Resident (SR) di Asrama TPB IPB.
PRAKATA Segala puji bagi Tuhan Yang Mahaesa atas segala limpahan rizki dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah dengan judul “Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati” Ini disusun berdasarkan hasil penelitian dari bulan Maret sampai September 2011. Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penyusunan karya ilmiah ini, terutama kepada Ibu Dr. Ir. Gayuh Rahayu dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan saran selama penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga disampaiakan kepada Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan koreksi dan saran-saran dalam perbaikan skripsi ini. Terima kasih kepada Bapak, Ibu, Sugeng Widodo, Mulyani, Arief Nur Din Syah, Yunus Budiawan serta Pemerintah Daerah (Pemda) Kabupaten Siak atas segala dukungan baik moril, materil, serta doa selama penulis menempuh pendidikan hingga karya ilmiah ini terselesaikan. Terima kasih kepada laboran Laboratorium Mikologi, IPBCC dan Laboratorium Mikrobiologi: Bu Emi, Bu Riana, Pak Kus, Bu Heni, Pak Jaka, Pak Aldian atas bantuannya, dan teman-teman dari Sekolah Pascasarjana: Ibu Yuyun, Ibu Dini, Ibu Ade, Pak Yosi serta temanteman seperjuangan di laboratorium mikologi (IPBCC): Rahmah, Sepri, dan teman-teman Biologi 44, terima kasih atas kerjasamanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2011
Lestari
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .......................................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii PENDAHULUAN Latar Belakang ....................................................................................................................... 1 Tujuan .................................................................................................................................... 2 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................................................ 2 Bahan dan Alat....................................................................................................................... 2 Metode ................................................................................................................................... 2 Persiapan Kultur Kerja .................................................................................................. 2 Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ........................................................................ 2 Pembuatan Cemaran (spike) dari CRM ......................................................................... 2 Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ...................................................................... 2 Pengolahan Data ............................................................................................................ 3 HASIL Kultur Kerja... ........................................................................................................................ 3 Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ................................................................................ 3 Cemaran (spike) dari CRM .................................................................................................... 4 Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ............................................................................... 4 PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4 SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 5 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6 LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 7
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Pertumbuhan Certified Reference Material (CRM) S. aureus pada media BPA... ........................ 3 2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat pada pupuk hayati di media BPA... ....................................... 3 3 Hasil uji kontrol positif S. aureus pada pupuk hayati di media BPA ............................................ 4
PENDAHULUAN Latar Belakang Di dalam sebuah pengujian diperlukan metode dan peralatan yang absah. Hal ini dilakukan agar metode dapat dijamin dan sesuai untuk penggunaan yang dimaksud dengan hasil uji cukup handal (reliable). Evaluasi metode ini dikenal dengan istilah validasi. Validasi adalah konfirmasi dengan pengujian dan penyediaan bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi (ISO 2008). Metode yang harus divalidasi yaitu metode yang tidak baku, metode yang dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan di luar lingkup dan metode baku yang dimodifikasi untuk mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksud (ISO 2008). Validasi metode bermanfaat untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis yang akurat, menekan sekecil-kecilnya resiko penyimpangan yang timbul, dan menjamin kedapatulangan yang tepat. Suatu metode analisis dikatakan absah jika telah memenuhi syarat keberterimaan parameter validasi. Parameter yang dimaksud yaitu presisi dan akurasi. Metode yang telah divalidasi eksternal seperti Association Official of Analytical Chemistry (AOAC) harus memenuhi persyaratan presisi dan akurasi. Presisi (keseksamaan) didefinisikan sebagai ukuran derajat kesesuaian antara hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita 2004). Presisi dapat dilihat dari simpangan baku (SB) dan simpangan baku relatif (SBR) yang diperoleh dari pengukuran. Presisi yang baik akan memberikan nilai median dari ulangan di antara selang rata-rata ± SB (Saefuddin et al. 2009) dan SBR kurang dari 2/3 nilai Horwitz (AOAC 2005). Menurut ISO, akurasi (kecermatan) didefinisikan sebagai kesesuaian antara hasil analisis dengan nilai benar atau nilai acuan yang dapat diterima. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) dari mikrob cemaran yang ditambahkan. Persen perolehan kembali adalah angka yang menunjukkan besarnya penambahan standar yang mampu diidentifikasi kembali dengan suatu metode. Nilai perolehan kembali bergantung pada matriks sampel, prosedur proses sampel, dan konsentrasi cemaran.
Batas penerimaan perolehan kembali menurut EPA (2005) ialah 48-291%. Laboratorium IPB Culture Collection (IPBCC) saat ini sedang dalam proses persiapan diri untuk akreditasi ISO/IEC 17025:2005. Salah satu persyaratan akreditasi ialah implementasi metode uji yang sudah divalidasi sesuai dengan ketentuan pada ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4 (BSN 2008a). Metode analisis yang akan divalidasi diadopsi dari metode standard yang valid. Untuk akreditasi IPBCC perlu melakukan validasi metode uji pada ruang lingkup parameter yang akan diakreditasi. Ruang lingkup IPBCC yang akan diakreditasi ialah pupuk hayati dengan parameter cemaran mikrob nonsimbiotik. Metode standard sebagai rujukannya ialah metode Standard Nasional Indonesia (SNI). Metode SNI banyak merujuk pada buku AOAC. Metode ini akan digunakan untuk menguji mikrob pada pupuk hayati karena pupuk tersebut mengandung berbagai organisme hidup. Pupuk hayati didefinisikan sebagai inokulan berbahan aktif organisme hidup yang berfungsi untuk menambat hara tertentu atau memfasilitasi tersedianya hara dalam tanah bagi tanaman, misal pupuk hayati Rhiphosan mengandung bakteri Bradyrhizobium japonicum perangsang bintil akar dan Aeromonas punctata untuk pelarutan fosfat. Ketersediaan hara ini dapat berlangsung melalui peningkatan akses tanaman terhadap hara misalnya oleh cendawan mikoriza arbuskuler, pelarutan oleh mikrob pelarut fosfat, maupun perombakan oleh aktinomiset (Simanungkalit et al. 2006). Pupuk hayati semacam itu harus diuji bebas cemaran yaitu mikrob lain selain mikrob komposisi pada pupuk. Mikrob lain yang tumbuh dapat mengganggu pertumbuhan mikrob komposisi. Hal ini dapat menurunkan efektivitas pupuk hayati. Dalam pengujian cemaran mikrob digunakan mikrob indikator, karena selain mudah dideteksi juga dapat memberikan gambaran tentang kondisi higienis dari produk yang diuji (BPOM RI 2008). Mikrob indikator adalah golongan atau spesies bakteri yang kehadirannya dalam jumlah di atas batas (limit) tertentu, merupakan pertanda bahwa bahan telah terpapar dengan kondisi-kondisi yang memungkinkan berkembangbiaknya mikrob patogen (BPOM RI 2008). Mikrob indikator digunakan untuk menilai keamanan dan mutu mikrobiologi bahan (BPOM RI 2008).
2 Pada saat ini metode standard uji analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati belum tersedia. Oleh sebab itu, metode standard untuk keperluan ini harus divalidasi. Metode yang divalidasi ialah metode yang telah valid akan tetapi diterapkan pada sampel yang berbeda. Metode yang akan divalidasi pada penelitian ini termasuk ke dalam kategori metode baku yang digunakan di luar lingkup yang dimaksud. Metode analisis mikrobiologi dihitung secara kuantitatif dengan metode angka lempeng total (ALT). Angka lempeng total dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah mikrob yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung koloni bakteri yang ditumbuhkan pada media agar (BSN 2008b). Validasi metode uji cemaran mikrob sedikit berbeda dengan validasi metode uji kimia. Dalam cemaran mikrob sebagai CRMnya digunakan makhluk hidup yang dikenal sebagai kultur murni bakteri. Metode rujukan yang digunakan dalam penelitian ini ialah metode SNI 2332.9:2011 untuk menguji keberadaan S. aureus (BSN 2011). Produk makanan diganti dengan sampel pupuk hayati. Tujuan Penelitian ini bertujuan memvalidasi metode standard pengujian dengan mengevaluasi kinerja metode, meliputi presisi dan akurasi sebagai pembuktian kinerja metode uji cemaran mikrob Staphylococcus aureus pada pupuk hayati. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2011 sampai bulan September 2011 di Laboratorium Analis Uji IPBCC, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah pupuk hayati (Rhiphosant), dan mikrob rujukan Staphylococcus aureus IPBCC 5.11.666 (ATCC 6538) yang merupakan Certified Reference Material (CRM). Baird Parker Agar (BPA) dan Butterields Phosphate Buffered (BPB) (Lampiran 1). Alat-alat laboratorium yang digunakan ialah laminar,
autoklaf, inkubator, neraca analitik, pipet mikro, cawan petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, serta peralatan umum yang digunakan di laboratorium. Metode Persiapan Kultur Kerja. Kultur stok dari CRM dibiakkan kembali dan dijadikan kultur kerja. Kultur kerja S. aureus dibuat dengan cara menggoreskan satu lup biakan pada media NA cawan dan biakan diinkubasi pada kondisi ruang selama 48 jam. S. aureus yang telah tumbuh pada media NA digores ke media selektif BPA untuk pembanding. Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati. Sebanyak 10 gram pupuk hayati tanpa sterilisasi dicampur dalam 90 mL BPB dan dihomogenkan di atas mesin penggoyang. Sebanyak 0,1 mL disebarkan pada media BPA. Pembuatan Cemaran (Spike) dari CRM. Suspensi cemaran S. aureus dibuat dengan cara sebanyak 2 lup biakan dimasukkan ke dalam 100 mL BPB dalam Erlenmeyer ukuran 1L. Bakteri yang berada dalam media cair tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 35 ˚C. Setelah masa inkubasi berakhir, sebanyak 0,1 mL suspensi biakan disebar pada media BPA dan diinkubasi pada suhu ± 35 ˚C. konsentrasi bakteri dihitung dengan metode ALT. Setelah dianalisis, spike tersebut disimpan di lemari pendingin 10 ˚C untuk dipergunakan sebagai sumber cemaran. Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati. Sampel yang dianalisis terbagi dalam 2 kelompok perlakuan yaitu pupuk hayati yang diberi cemaran (sampel positif) dan pupuk hayati tanpa cemaran (sampel negatif). Sampel positif merupakan matriks yang membawa cemaran pada konsentrasi yang diketahui. Sebanyak 10 mL spike S. aureus (dengan konsentrasi terstandard) ditambahkan ke dalam masing-masing 10 g sampel pupuk hayati. Kemudian ke dalam campuran tadi ditambahkan media BPB sehingga volume campuran mencapai 100 mL. Kemudian campuran didiamkan selama 2 menit dan dihomogenkan di atas mesin penggoyang. Konsentrasi cemaran yang ada pada sampel dihitung secara kuantitatif dengan metode ALT cawan sebar pada media BPA. Sebelum dianalisis, suspensi sampel
3 dihomogenkan kemudian dicawankan. Sebanyak 0,1 mL disebarkan pada media BPA. Biakan S. aureus diinkubasi pada suhu ± 35˚C selama 2-3 hari. Jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dihitung dan dinyatakan dalam colony formy unit (cfu) mL-1. Pengenceran dengan kerapatan koloni 25-250 koloni/cawan (BSN 2008b) digunakan dalam perhitungan presisi dan akurasi. Prosedur yang sama dilakukan untuk sampel negatif yaitu sampel tanpa cemaran. Sampel tanpa cemaran adalah pupuk hayati yang disterilisasi. Sterilisasi dilakukan untuk lebih meyakinkan bahwa pupuk tersebut bebas dari cemaran yang akan diujikan. Sterilisasi pupuk juga dilakukan agar tidak ada mikrob lain yang tumbuh sehingga menghambat pertumbuhan cemaran di dalam pupuk. Masing-masing perlakuan minimal diulang sebanyak tujuh kali. Pengolahan Data. Data diolah untuk mendapatkan nilai presisi dan akurasi. Presisi ditetapkan berdasarkan simpangan baku (SB) dan simpangan baku relatif (SBR) (Saefuddin et al. 2009) dari ulangan. SB dan SBR dihitung dengan rumus berikut :
C: cemaran tanpa sampel (kontrol positif) Tingkat akurasi metode ditetapkan berdasarkan perbandingannya terhadap nilai perolehan kembali yang ditetapkan oleh EPA (2005). Uji komparatif dilakukan untuk membuktikan kekuatan dari metode uji melalui uji beda nyata antara sampel positif dan kontrol positif. Uji komparatif dilakukan dengan uji T dengan menghitung nilai P menggunakan software Minitab 14. HASIL Kultur Kerja Kultur CRM S. aureus tumbuh pada media BPA dengan ciri koloni berwarna abuabu hingga kehitaman dan sekeliling tepi koloni bening (terbentuk halo). Koloni berbentuk bundar, cembung, licin/halus dengan tepian rata, tumbuh setelah 48 jam inkubasi di media BPA (Gambar 1). a
b
SB = SBR = SB/χ SB SBR
: simpangan baku : simpangan baku relatif (koefisien keragaman) x : rata-rata dari ulangan n : ulangan x1, x2,....xn : nilai konsentrasi ke-1.... n Jika SBR kurang dari 2/3 nilai Horwitz (AOAC 2005) maka metode dapat diterima. Nilai Horwitz dihitung dengan persamaan berikut: Nilai Horwitz = 2(1-0,5log Y) Y: rata-rata konsentrasi cemaran (kontrol positif) Akurasi diukur dengan persentase perolehan kembali melalui uji komparatif. Persentase perolehan kembali adalah banyaknya cemaran yang dapat diisolasi kembali dari sejumlah cemaran yang dimasukkan ke dalam sampel. Persen perolehan kembali (recovery) dihitung dengan rumus berikut: % recovery (R) = [(A-B)/C] × 100 A: sampel dengan cemaran (sampel positif) B: sampel tanpa cemaran (sampel negatif)
Gambar 1 Pertumbuhan Certified Reference Material (CRM) S. aureus pada media BPA (a) S. aureus dari media NA (b) koloni tunggal S. aureus setelah diencerkan. Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati Hasil analisis awal pupuk hayati mengandung bakteri pada media selektif BPA (Gambar 2). Bakteri yang tumbuh berwarna hitam akan tetapi tidak memiliki zona bening setelah diinkubasi selama 2-3 hari. Analisis ini dibandingkan terhadap CRM-nya yang menunjukkan bahwa pupuk hayati yang digunakan dinyatakan bebas dari S. aureus.
Gambar 2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat pada pupuk hayati di media BPA.
4 ulangan ke-3 (385) dan ke-4 (400). Pada Cemaran (Spike) dari CRM sampel positif terdapat dua data yang berbeda Konsentrasi sumber inokulum S. nyata dengan uji T yaitu pada ulangan ke-2 aureus sebagai spike kontrol positif yang dan ke-3 (650). tumbuh pada media BPA sebesar 315 cfu.mL-1 (Gambar 3) (Tabel 1). Tabel 1 Presisi uji cemaran S. aureus Ulangan 1 2 3 4 5 6 7 Rata-rata SB Median Batas atas Batas bawah SBR 2/3 nilai Horwitz
Jumlah sel S. aureus (cfu mL-1) KPa SPb 260 600 355 650 d 650 d 385d d 400 400 265 450 285 600 255 450 315,00 542,86 62,92 105,79 285,00 600,00 377,92 648,64 252,08 437,07 0,20 0,19 0,84 0,78
SNc 0 0 0 0 0 0 0 0 -
Keterangan: a: Jumlah sel yang tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 10x ; b: Jumlah sel yang tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 100x; c: Jumlah sel yang tumbuh dari pupuk hayati yang disterilisasi; d: berbeda nyata dengan uji T pada taraf α= 0,05.
PEMBAHASAN
Gambar 3 Hasil uji kontrol positif S. aureus pada pupuk hayati di media BPA. Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati Konsentrasi S. aureus dari spike yang ditambahkan ke dalam pupuk hayati sebagai sampel positif yang tumbuh pada media BPA sebesar 543 cfu.mL-1 (Tabel 1). Nilai SB dan SBR metode uji berturut-turut sebesar 62,92 dan 0,20 pada kontrol positif serta 105,79 dan 0,19 pada sampel positif (Tabel 1). Data perolehan kembali cemaran S. aureus dan nilai P (software Minitab 14) berturut-turut yaitu sebesar 172,34 % dan P= 0,002. Nilai persen perolehan kembali menunjukkan bahwa metode S. aureus memiliki akurasi tinggi karena memenuhi batas penerimaan EPA (2005) yaitu 48291%. Nilai P yang diperoleh menggambarkan penyimpangan kesalahan data (standard eror) yang fungsinya sama dengan α. Dari ketujuh data kontrol positif pada S. aureus yang diperoleh terdapat dua data yang berbeda nyata dengan uji T yaitu pada
Pupuk hayati yang beredar di pasaran sangat beragam diantaranya yaitu Rhiphosant. Pupuk Rhiphosant mengandung bakteri Bradyrhizobium japonicum perangsang pembentukan bintil akar dan Aeromonas punctata untuk pelarutan fosfat. Sebelum dipasarkan pupuk hayati harus melewati uji efektivitas dan uji mikrobiologi cemaran. Bakteri adalah jenisjenis kontaminan biologi. akteri S. aureus merupakan salah satu jenis bakteri yang umum ditemukan di tanah. Pupuk hayati yang dianalisis tidak mengandung S. aureus sehingga bakteri ini digunakan sebagai pencemar (spike). Menteri Pertanian RI (2009) menetapkan persyaratan teknis cemaran pupuk hayati untuk kontaminan Escherichia coli dan Salmonella sp. minimal nol pada pengenceran 10-3. Pada penelitian ini cemaran S. aureus pada pupuk hayati sebesar kurang dari 10 pada pengenceran 10-2. Dengan demikian pada pengenceran 10-3 diduga tidak dijumpai lagi cemaran S. aureus. Spike adalah cemaran sebagai kontrol positif yang telah diketahui dengan pasti jumlah koloni/ml. Cemaran S. aureus dipilih menjadi bakteri pencemar karena bakteri ini dapat diisolasi dari tanah rhizospher pada gandum. Bakteri ini dapat dimanfaatkan
5 sebagai mikrob pendegradasi anilin di tanah (Ahmed 2010). Dari kontrol positif diketahui bahwa mikrob cemaran yang ditambahkan ke dalam pupuk sebesar 315 cfu/mL. Konsentrasi ini tidak menunjukkan jumlah yang sama dengan konsentrasi sumber cemaran yang ditambahkan pada sampel positif. Hal ini mengindikasikan bahwa spike konsentrasi cemaran pada saat diuji sukar dijaga untuk tetap konstan jumlah selnya. Meskipun spike yang sudah ditetapkan konsentrasinya disimpan dalam lemari pendingin 10˚C. Pada penelitian ini, dilakukan 7 kali ulangan dan lebih besar dari jumlah ulangan yang dianjurkan oleh Harmita (2004) yaitu paling sedikit 6 kali. Keterulangan digunakan untuk meningkatkan ketelitian percobaan dan mengendalikan ragam galat. Untuk bahan yang sudah terdeskripsi secara jelas seperti pupuk buatan maka diperlukan ulangan yang kecil. Metode analisis cemaran S. aureus pada pupuk hayati memperlihatkan nilai simpangan baku relatif yang telah memenuhi kriteria yang ditetapkan oleh AOAC (2005) untuk dapat disebut sebagai metode yang menghasilkan ketelitian cukup baik, yaitu dengan nilai SBR (0,20 dan 0,19) < 2/3 Horwitz (0,84 dan 0,78) (Tabel 1). Presisi merupakan kedekatan di antara beberapa individu hasil pengujian oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek (intraday) (Harmita 2004). Presisi untuk uji cemaran mikrob diukur dengan melihat kandungan cemaran yang ada dalam sampel, membuat cemaran dan memberi cemaran pada sampel. Setelah uji presisi maka dapat dilanjutkan dengan uji akurasi. Metode analisis S. aureus memberikan persen perolehan kembali sebesar 172,34 %. Artinya, metode ALT yang digunakan untuk menghitung jumlah sel S. aureus dalam kontrol positif dan sampel positif dapat menunjukkan jumlah sel S. aureus dengan ketepatan rata-rata sebesar 172,34 % dari jumlah sel terhitung pada kultur awal. Berdasarkan nilai perolehan kembali ketetapan EPA (2005) yaitu 48-291% maka metode analisis S. aureus telah memenuhi batas penerimaan EPA. Hal ini dapat dikatakan bahwa metode analisis cemaran S. aureus pada pupuk hayati dapat diterapkan di laboratorium IPBCC berdasarkan keakuratannya. Menurut Harmita (2004) akurasi sangat tergantung pada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahap
analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur. Pada penelitian ini metode pengambilan homogenasi dengan pipet mikro terganggu oleh partikel pupuk yang menggunakan bahan pembawa gambut yang tidak larut, sehingga mengganggu kecermatan. Berdasarkan uji T diketahui bahwa dari ketujuh data sampel positif S. aureus yang diperoleh, terdapat dua data yang berbeda nyata dengan uji T pada taraf α = 0,05, yaitu pada ulangan ke-2 dan ke-3 yaitu 650 cfu mL-1. Hasil yang berbeda nyata ini menunjukkan bahwa metode ALT yang digunakan untuk menghitung sel S. aureus pada pupuk hayati memiliki keragaman data pada taraf α = 0,05. Analisis beda nyata yang dilakukan menunjukkan bahwa nilai P pada data hasil analisis S. aureus sebesar 0,002. Nilai P yang diperoleh menunjukkan bahwa ketujuh data analisis yang didapat berbeda nyata pada taraf α sebesar 0,05. Keragaman data yang dimaksud adalah selisih jumlah sel pada ulangan yang satu dengan ulangan yang lainnya. Nilai simpangan baku (SB) yang diperoleh akan menunjukkan keragaman data yang diperoleh. Nilai SB juga akan membentuk selang data. Selang data yang terdiri atas batas bawah dan batas atas akan menentukan data-data yang berbeda nyata pada taraf α = 0,05. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Validasi metode analisis Staphylococcus aureus pada pupuk hayati dengan menggunakan SNI 2332.9:2011 yaitu Cara Uji Mikrobiologi-Bagian 9: Penentuan Staphylococcus aureus pada produk perikanan dapat memenuhi kriteria presisi dan akurasi yang memenuhi kriteria sebagai metode uji sampel pupuk hayati. Metode ini dapat diterapkan sebagai metode standard uji di laboratorium IPB Culture Collection. Saran Penyimpanan spike pada kondisi lingkunngan yang baik perlu dicari agar jumlah mikrob dalam spike relatif konstan. Uji ketertiruan untuk parameter ketelitian
6 perlu dilakukan agar dapat diketahui pengaruh dari kerja analis, kondisi instrumen dan waktu analisis yang berbeda dalam laboratorium yang sama maupun berbeda terhadap hasil akhir. Perlu juga dilakukan pembuatan formulasi pupuk dengan cemaran terlebih dahulu sebelum dianalisis. DAFTAR PUSTAKA Ahmed S et al. 2010. Isolation and characterization of a bacteria strain for aniline degradation. Afr J Biotechnol 9:1173-1179. [AOAC] Association Official of Analytical Chemistry. 2005. Official Method of Analysis. Washington DC: AOAC. [BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2008. Pengujian mikrobiologi pangan. Jakarta: Badan POM RI. [BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008a. Pelatihan Audit Internal Sistim Manajemen Mutu Laboratorium. Jakarta: BSN. [BSN] Badan Standar Nasional. 2008b. Metode pengujian cemaran mikrob dalam daging, telur dan susu, serta hasil olahannya. Jakarta: BSN; (Standard Nasional Indonesia 2897:2008). [BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2011. Cara uji mikrobiologi - bagian 9: penentuan Staphylococcus aureus pada produk perikanan. Jakarta: BSN; (Standard Nasional Indonesia 2332.9:2011).
[EPA] Environmental Protection Agency. 2005. Manual for the Certification of Laboratories Analyzing Drinking Water: Criteria and Procedurer Quality Assurance. Edke-5. Ohio: US International Protection Agency Office of Water. Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majal Ilm Kefarm 1:117-135. [ISO]
International Organization for Standardization. 2008. Persyaratan umum kompetensi laboratorium pengujian dan laboratorium kalibrasi. Jakarta: ISO; (SNI ISO/IEC 17025:2008 (klausul 5.4.5.1 dan 5.4.5.2).
Menteri Pertanian Republik Indonesia. 2009. Peraturan Menteri Pertanian 28/Permentan/SR.130/5:2009 Tentang Pupuk Organik, Pupuk Hayati dan Pembenah Tanah. Jakarta: Menteri Pertanian RI. Saefuddin A, Notodiputro KH, Alamudi A, Sadik K. 2009. Statistika Dasar. Jakarta: PT Grasindo. Simanungkalit RDM, Suriadikarta DA, Saraswati R, Setyorini D, Hartatik W. 2006. Pupuk Organik dan Pupuk Bogor: Balai Besar Hayati. Penelitian dan Pengembangan.
LAMPIRAN
8 Lampiran 1 Pembuatan Pereaksi Media BPA dan BPB 1. Larutan media baird parker agar (BPA) menurut SNI 2332.9:2011 BPA sintetik 60 g Aquades 1L Egg Yolk 50 mL Larutan BPA dan aquades tersebut dididihkan. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15 menit. Media didinginkan hingga suhu 45 ˚C kemudian ditambahkan egg yolk. 2. Larutan butterfield’s phosphate buffered (BPB) menurut SNI 2332.9:2011 Larutan stok 34 g KH2PO4 Aquades 500 mL pH larutan diatur 7,2 dengan menggunakan 1 N NaOH. Volume larutan ditepatkan hingga 1000 mL dengan penambahan aquades. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15 menit. Larutan stok disimpan dalam refrigerator. Cara membuat larutan kerja yaitu sebanyak 10 mL larutan stok diambil dan ditepatkan hingga 1000 mL dengan penambahan aqudes. Kemudia larutan disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15 menit.
