PAKOMÁŘI JAKO MODEL HODNOCENÍ TOXICITY

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

VÝZKUMNÉ CENTRUM PRO CHEMII ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGII

PAKOMÁŘI JAKO MODEL HODNOCENÍ TOXICITY SEDIMENTŮ

Zuzana Rábová

Bakalářská práce

Brno, Česká republika, 2008

vedoucí práce: Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D.

konzultant: Bc. Zuzana Ruferová ...za velkou pomoc bych chtěla poděkovat vedoucí práce Mgr. Kláře Hilscherové, Ph.D. a konzultantce Bc. Zuzaně Ruferové, která mi trpělivě demonstrovala laboratorní úkony v rámci chovu a testů s pakomáry, obohatila mě o mnoho praktických dovedností a poskytla mi cenné studijní materiály.

V Brně, 11. května 2008

2

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod odborným vedením Mgr. Kláry Hilscherové, Ph.D. a Bc. Zuzany Ruferové. Práce vychází z informací ve vědeckých článcích a odborné literatuře.

V Brně, 20.5.2008

….…………………………….

Zuzana Rábová

3

Obsah

1. 2. 3.

4. 5.

6. 7.

8.

9. 10. 11. 12. 13.

Anotace ……………………………………………………………………………… Abstract …………………………………………………………………………… Úvod………………………………………………………………………………….. Využití pakomárovitých (Chironomidae) jako modelových organismů v ekotoxikologii……………………………………………………………………… Charakteristika vývojového cyklu a jednotlivých vývojových stupňů pakomárovitých (Chironomidae) …………………………..……………………… 3.1 Charakteristika jednotlivých vývojových stádií…………………………………. 3.1.1 Vajíčko…………………………………………………………………….. 3.1.2 Larva………………………………………………………………………. 3.1.3 Kukla………………………………………………………………………. 3.1.4 Imago……………………………………………………………………… 3.2 Ekologie…………………………………………………………………………. Laboratorní chov pakomárů (Chironomidae)……………………………………... 4.1 Návod k laboratornímu chovu pakomárů dle OECD a US EPA………………… Provedení testů na základě standardizovaných i nestandardizovaných mezinárodních metodik…………………………..………………………………… 5.1 Standardní 48h/96h test akutní toxicity na larvách……………………………… 5.2 Standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev………………………….. 5.3 Standardní 28-d test líhnutí a vývoje…………………………………………….. 5.4 Standardní 65-d celoživotní studie ……………………………………………… 5.5 Dosud nestandardizované metodiky testování toxicity sedimentu s užitím pakomárovitých Chironomidae………………………………………………………. Využití modelového sedimentu nebo různě zatížených přírodních sedimentů …. 6.1 Kontaminace sedimentu a vody nad sedimentem……………………………….. Testování jednotlivých modelových látek a jejich směsí………………………….. 7.1 Kovy…………………………..…………………………..……………………... 7.2 Pesticidy – organofosfáty, pyrethroidy…………………………..………………. 7.3 Azaareny (NPAHs) …………………………..…………………………………... 7.4 Léčiva …………………………..………………………………………………... 7.5 Radioaktivní látky…………………………..…………………………..………… Přehled využití pakomárů (Chironomidae) jako indikátorů zatížení v reálném prostředí…………………………..…………………………..……………………… 8.1 Bioindikace znečištění vyššími alifáty (HMWHs) ……………………………… 8.2 Hodnocení vlivu herbicidu MagnacideR H pomocí bioindikace na makroskopických vodních bezobratlých……………………………………………... Praktické aspekty metodik akutních, semichronických a chronických testů s pakomáry (Chironomidae) …………………………..……………………………. Praktické seznámení s chovem a testy s pakomáry (Chironomidae)……………... Závěr………………………………………………………………………………….. Použitá literatura …………………………………………………………………… 12.1 Databáze chemických látek……………………………………………………… Přílohy ………………………………………………………………………………..

5 5 6 7 8 8 8 8 9 10 11 11 12 14 17 17 18 18 20 21 22 22 23 26 30 31 32 32 32 34 35 38 40 41 43 44

4

Anotace Bakalářská práce se zabývá problematikou využití pakomárů jako modelových organismů v ekotoxikologii. Práce shrnuje informace týkající se laboratorního chovu pakomárů čeledi Chironomidae a ekotoxikologického testování s využitím těchto organismů. Text také uvádí příklady využití pakomárů v biotestech či bioindikačních studiích při stanovování toxicity modelových látek v přírodním nebo artificiálním sedimentu. Použité informace pocházejí z odborných článků a standardních metodik k provedení biotestů vydávaných organizacemi jako OECD a US-EPA. Součástí práce je také praktické seznámení s laboratorním chovem a testováním na pakomárech v podobě jednoduchého protokolu o provedení 18ti denního testu, jehož cílem bylo posoudit vliv krmného režimu v průběhu testu na procento přežití.

Abstract The Bachelor Thesis deals with the possible use of chironomids (non-biting midges) in ecotoxicology. It comprises data on laboratory culturing and testing with chironomids as model organisms. The text provides important examples of bioassays and bioindication studies using chironomids as a menas of ecotoxicological assessment of model substances in natural or artificial sediment. The Bachelor Thesis was written on the basis of numerous scholarly articles and guidelines for standardized tests issued by OECD and US-EPA. The work includes a section on the practical aspects of culturing and using chironomids in bioasays and presents a minor protocol of an 18-d test designed to compare the effects of two different feeding regimes on survival.

5

1. Úvod Pakomárovití (Chironomidae) jsou jako zástupci bentických bezobratlých významným modelovým organismem v ekotoxikologii. Pakomárovití jsou velmi důležitou skupinou v rámci přírodních akvatických ekosystémů, protože zde bývají dominantním článkem na úrovni konzumentů prvního řádu (Lindegaard 1997). Zásadní roli v ekotoxikologických biotestech hrají především druhy Chironomus riparius a Chironomus tentans, kteří jsou dnes již běžně užíváni ve specializovaných laboratořích k posuzování toxicity sedimentu. Chov pakomárů v laboratoři je poměrně snadný, jejich životní cyklus je krátký a přiměřená senzitivita ke znečištění umožňuje využití těchto organismů při sledování subletálních parametrů v testech (Janssens de Bisthoven 1998). Testy s pakomáry se nejčastěji provádí dle metodik standardizačních organizací jako OECD, ISO, US-EPA, ASTM a dalších, které přesně stanovují veškeré podmínky, za účelem minimalizace variability výsledků. Při provádění testu je možné se odkázat na velké množství odborné literatury, která uvádí důležité informace získané v již provedených testech, čímž se zjednodušuje práce např. při hledání rozsahu testovaných koncentrací, navíc je tak možné ušetřit zbytečnou práci a náklady. Pakomáry lze také využít v bioindikačních studiích, protože zastoupení určitých druhů odpovídá míře znečištění a svou citlivostí jsou pakomáři mnohdy výhodnějším modelem než zástupci producentů (Albarino et al. 2006). Laboratorní práce s pakomáry vyžaduje zkušenost a existuje mnoho praktických aspektů, které je třeba mít při provádění testů a péči o chov neustále na vědomí. Bakalářská práce si klade za cíl přehledně zpracovat informace týkající se všeobecného využití

pakomárů

v ekotoxikologii,

jejich

životního

cyklu,

laboratorního

chovu

a

standardizovaných testů na tomto modelu. Dalším bodem je náhled do problematiky testování toxicity jednotlivých modelových látek na příkladech akutních či chronických testů z odborné literatury. Práce má přinést stručný příklad bioindikačního potenciálu pakomárovitých, dále výpis praktických aspektů spojených s chovem a testováním na pakomárech a v závěrečné části také praktické seznámení s chovem a testy v laboratoři – v podobě cvičného biotestu.

6

2. Využití pakomárovitých (Chironomidae) jako modelových organismů v ekotoxikologii Pakomárovití (Chironomidae) se stali modelovými organismy již před více než sto lety a dnes bývají zástupci této čeledi rutinně užíváni v laboratorních testech (bioassays) k posouzení toxicity sedimentů (Grosell et al. 2006). Důvodů, proč jsou právě pakomáři, a to především zástupci rodu Chironomus, vhodným modelovým organismem pro laboratorní testování, je hned několik: Prvním může být fakt, že populace pakomárů hrají v přírodě zcela zásadní roli, protože často bývají dominantními konzumenty 1. řádu v rámci sladkovodních akvatických ekosystémů. Díky značné abundanci jsou tedy významným článkem potravního řetězce, neboť představují zdroj potravy pro dravé bezobratlé a ryby. Toto nám umožňuje pozorovat důsledky kontaminace na úrovni populací, potravních řetězců až celého ekosystému. Druhým z důvodů je relativně krátký životní cyklus pakomárů chovaných v laboratorních podmínkách, přičemž jednotlivá životní stádia lze snadno rozlišit a pozorovat. Dalším důležitým důvodem k častému využití pakomárů v ekotoxikologii je skutečnost, že larvy pakomárů vykazují citlivost vůči znečištění (Lopes 2005). Zároveň je výhodou, že zástupci rodu Chironomus dokážou do jisté míry stres způsobený chemickou kontaminací překonávat, proto můžeme provádět řadu subletálních testů a sledovat různé parametry jako například: délku a váhu těla larev, suchou váhu a energetický obsah, podíl vylíhnutých dospělců, četnost deformací, eluční píky proteinů vážících kovy apod. (Janssens de Bisthoven 1998). Velikost pakomárů nám dovoluje snadno měřit biomarkery, dostupná je i epiteliální buněčná linie s lokalizovaným ekdysteroidním receptorem (Lammerding-Koppel et al. 1998; Grebe et al. 2000). Dalším faktem, který hovoří pro použití pakomárů, je znalost struktury G chromozomu, čehož se vyžívá pro stanovení vlivu kontaminace na úrovni genů (Ruferová 2005). Navíc jsou dostupné modely populačního růstu pakomárovitých (Lopes 2005; Péry et al. 2006), což výrazně přispívá k efektivní analýze dat z celoživotních testů a hodnocení vlivů na úrovni populací. V neposlední řadě je třeba také zmínit to, že užití pakomárů v testech toxicity má dnes již určitou tradici, na tomto modelovém organismu bylo zpracováno mnoho studií, máme tedy možnost porovnávat výsledky v celosvětovém měřítku (OECD 2006), případně moderními metodami meta-analýzy prohlubovat výpovědní hodnotu již získaných dat (Hose et al. 2006). Laboratorní testy založené na pakomárech mají i určité nevýhody, ty však nejsou v převaze, proto můžeme bezpochyby tvrdit, že se jedná o výhodný nástroj k posouzení toxicity sedimentu.

7

3. Charakteristika vývojového cyklu a jednotlivých vývojových stupňů pakomárovitých (Chironomidae) Pakomáři

zastupují

v ekotoxikologických

testech

skupinu

makroskopických

bezobratlých žijících na rozhraní sedimentu a volného vodního prostředí. Konkrétně jsou pakomárovití (Chironomidae) čeledí z řádu dvoukřídlého hmyzu (Diptera) a to v rámci jednoho z fylogeneticky původnějších podřádů (Nematocera) (Epler 2001), jde tedy o zástupce hmyzu s proměnou dokonalou (kohorta Holometabola) s 4 morfologicky i funkčně oddělenými vývojovými stadii – vajíčko, larva, kukla, imago (viz obr. 1) (Sedlák 2006).

Obrázek 1: Životní cyklus pakomára

3.1 Charakteristika vývojových stádií: 3.1.1 Vajíčko Vajíčka pakomárovitých jsou podlouhlá, měří v rozsahu od 0,15 do 0,6 mm. Barva chorionu se v průběhu vývoje vajíčka pozoruhodně mění (Lindegaard 1997). Uspořádání vajíček je u různých taxonů různé, časté však bývá seskupení vajíček do řad ve dvou vrstvách. Samičky kladou shluky vajíček na hladinu, vajíčka v těchto shlucích jsou spojena želatinózní hmotou a mohou čítat až 600 kusů (Lopes 2005).

3.1.2 Larva V larválním stadiu vývoje prochází jedinec 4 instary, přičemž první instar bývá převážně planktonický, kdežto larvy v následujících instarech žijí zavrtané v sedimentu (Lopes 8

2005). Larvální stadium trvá od 2 týdnů až po několik let (arktické druhy), délka trvání tedy závisí na teplotě (Mandaville 1999). Tělo larev je rozlišené na hlavu, hruď a zadeček a jeho délka se pohybuje v rozmezí od 2 do 30 mm. Barva těla může být od bílé, přes žlutou, zelenou, červenou, fialovou a růžovou až po hnědou, zatímco lidově bývají larvy pakomárů označovány jako „krvaví červi“ (Mandaville 1999). Hlava larev nese 3 oční jamky umístěné po stranách, dále tykadla složená ze 4-8 článků, čelisti s několika zoubky a dobře vyvinuté mentum se sklerotizovanými zoubky (viz obr. 2). Hruď se skládá ze 3 článků, první z nich nese pár panožek. Zadeček je tvořen 9 články, poslední nese pár panožek a 4 nebo 6 análních tubulů. U některých rodů např. Chironomus nalézáme ještě 2 páry ventrálních tubulů na 8. zadečkovém článku a pár postranních tubulů na 7. zadečkovém článku. Larvy mohou být volné nebo žijí trvale ve schránkách (eutrofní vody), které si vytvářejí z detritu, řas a částic sedimentu (Lopes 2005). Odtud prohledávají okolí za účelem získávání potravy nebo filtrují vodu přímo ve schránce samotné (Lindegaard 1997). Larvy pakomárů mají uzavřený tracheální systém, a tudíž jejich dýchání závisí na příjmu kyslíku z okolního prostředí přes povrch těla do hemolymfy. Většina pakomárovitých má v hemolymfě obsažen hemoglobin, což jim zajišťuje příjem stále stejného množství kyslíku do těla, i když jeho koncentrace v okolním prostředí klesá. Tato vlastnost umožňuje některým pakomárovitým především rodu Chironomus přežívat v podmínkách se sníženým obsahem rozpuštěného kyslíku, jako jsou organicky znečištěné toky nebo profundál eutrofních jezer (Lindegaard 1997). Schopnosti rodu Chironomus přežívat značné znečištění a nepodléhat stresu z nedostatku kyslíku využíváme v laboratorních testech.

Obrázek 2: Larva pakomára, vpravo detail larvy

3.1.3 Kukla Vývoj v kukle trvá zpravidla jen několik dnů. Délka kukly je v rozsahu 1,5 – 25 mm. Stejně jako u larvy i zde můžeme rozlišit hlavu, hruď a zadeček (viz obr. 3). V hrudní části jsou uschovány nohy, křídla a haltery (kyvadélka). V zadní části hrudi se nachází pár tzv. hrudních trubiček, které mohou být větvené – jde o respiratorní orgán (Lindegaard 1997). Kukly aktivně 9

putují k hladině, kde následuje ekdyze a líhnutí dospělců, kteří jsou hned vzápětí schopni letu (Lopes 2005).

Obrázek 3: Kukla pakomára

3.1.4 Imago Dospělci pakomárů dosahují velikosti 25 mm, podobají se komárům, ale na rozdíl od nich nesají krev, mají zakrnělé ústní ústrojí (vůbec nepřijímají potravu) a tykadla hustě ochmýřená, a to především u samců (viz obr. 4). Jsou velmi krátkověcí – imago přežívá jen několik dnů. Na hlavě jsou po stranách výrazné oči, hruď nese nohy, křídla a haltery. Křídla jsou obvykle pokryta chloupky tzv. makrotrichiemi. Pohlavní orgány pakomárů nazýváme hypopygium – jde o modifikovaný 9. zadečkový článek s přívěsky = gonocoxit a gonostylus (Lindegaard 1997). Dospělci se často líhnou synchronizovaně ve velkých množstvích a tvoří hejna nad vodní hladinou. U pakomárů často pozorujeme proterandrii – samečci se líhnou o 4-7 dnů dříve než samičky (US-EPA 2000), tento jev zvyšuje reprodukční úspěch a hraje roli při páření nepříbuzných jedinců - outbreedingu (Servia et al. 2005). V hejnech dochází k páření, samičky následně nesou oplodněná vajíčka v rosolovitém shluku na konci zadečku a kladou jej nahodile do vody.

Obrázek 4: Vlevo – kopulující dospělci, uprostřed a vpravo – dospělý sameček 10

Ekologie Pakomárovití jsou kosmopolitně rozšířeni, nepochybně je můžeme považovat za nejúspěšnější skupinu vodního hmyzu, která obývá všechny typy sladkovodních habitatů a úspěšně se rozšiřuje i v brakických a pobřežních mořských vodách (Lindegaard 1997). Pakomárovití jsou nejčetnější skupinou makroskopických vodních bezobratlých a to jak v počtu druhů, tak v četnosti jedinců (Epler 2001). Četnost larev v sladkovodním sedimentu běžně dosahuje až 50 000 jedinců na m2, což činí v průměru 60 % veškeré bentické produkce. Pakomáři jsou oportunisté, rychlost růstu závisí na teplotě a dostupnosti potravy, proto se v laboratorních podmínkách jedinci obvykle vyvíjí rychleji a životní cyklus se tak zkracuje. V přírodě mírného pásma je většina druhů uni- nebo bivoltinních, tzn. že za jednu vegetační sezónu vytvoří 1-2 generace (Lindegaard 1997). Trofické vztahy pakomárovitých jsou velmi rozmanité – většina larev je všežravá – spásají řasy, živí se rozsivkami, detritem apod. (Mandaville 1999). Dospělci zpravidla potravu již nepřijímají. Dle Lindegaarda můžeme pakomárovité rozdělit na základě ekologických předpokladů na lotické (tekoucí voda) a lentické (stojatá voda). Zastoupení jednotlivých druhů nebo celých podčeledí má pak důležitou vypovídací hodnotu o charakteru prostředí, případně o kvalitě vody (Williams 1992).

4. Laboratorní chov pakomárů (Chironomidae) Chov pakomárů v ekotoxikologické laboratoři je výhodné udržovat v případě, že se taková laboratoř opakovaně (nejednorázově) zabývá testy na hodnocení toxicity sedimentu užitím těchto organismů, protože laboratorní chovy jsou stálým a homogenním zdrojem pokusných zvířat. V případě jednorázového testování je možné zakoupit organismy přímo ve specializovaných laboratořích1. Chov pakomárů v laboratoři je poměrně jednoduchý, ale i přesto vyžaduje pravidelný dohled, obsluhu a stabilní podmínky – teplota, osvětlení, provzdušňování apod. Pokyny pro nastavení těchto podmínek a všeobecný postup při chovu a testování poskytují různé organizace, zdarma je lze získat na webových stránkách americké Agentury pro ochranu životního prostředí (US-EPA) a Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD).

_____________________________________________________________________________ 1.

Kontakt na specializované laboratoře, které se zabývají chovem pakomárů a poskytují tyto organismy, jak pro zakládání nových kultur, tak k jednorázovému použití, lze získat buď na serveru Chironomid Home Page: nebo v metodických pokynech pro stanovování toxicity sedimentu pomocí vodních bezobratlých vydaných americkou agenturou na ochranu životního prostředí US EPA:

11

Neexistuje žádná zcela jednotná metodika a postup pro laboratorní chov pakomárů, ale známe všeobecné principy, které by měly být dodržovány ve všech chovatelských laboratořích. Organismy v laboratorním chovu musí být jasně taxonomicky definované a zdokumentované. V laboratorních chovech se využívají především dva druhy pakomárů: Chironomus tentans a Chironomus riparius.

4.1 Návod k laboratornímu chovu pakomárů dle OECD a US EPA (US-EPA 2000; OECD 2004) Pro založení nové kultury umísťujeme vajíčka pakomárů do nádoby - zpravidla skleněného akvária (velikost závisí na velikosti chovu, běžně 19 l / 6-8 l vody) – s 8-10 mm silnou vrstvou křemenného písku nebo křemeliny a několika centimetrovou vrstvou měkké vody. Nad hladinou musí být zachováno dostatečné místo pro líhnoucí se pakomáry, přičemž strop akvária je přikryt síťovinou (viz obr. 5). Pakomáry chováme při teplotě 23±1°C, fotoperiodě 16:8 (16 hodin světlo, 8 hodin tma), osvětlení 1000 lux a relativní vzdušné vlhkosti vyšší než 60%. Voda může být buď studniční, vodovodní (nechlorovaná) nebo uměle připravená dle metodických pokynů z deionizované vody a iontů (makroelementů a stopových prvků). Při chovu je třeba pravidelně měřit jednotlivé parametry, které popisují chovné vodní prostředí: teplota (denně nebo kontinuálně), rozpuštěný kyslík (týdně), tvrdost vody, bazicita, amoniak a pH by se měly měřit aspoň jednou za čtvrt roku. Chovné nádoby mohou být buď průtokové nebo statické. Technické řešení průtokových systémů bývá složitější a uspořádání může být různé, vždy však platí, že voda v chovných nádobách je kontinuálně obměňována, čímž se přirozeně snižují ztráty na kultuře způsobené poklesem kyslíku nebo hromaděním metabolitů. Průtokové nebo cirkulující systémy šetří obsluhu a jsou důležitým krokem k postupné automatizaci celého procesu. Statické uspořádání je technicky jednodušší, avšak vyžaduje častější a náročnější obsluhu. Podmínky v chovných nádobách se u statických systému mohou značně měnit mezi dvěma výměnami vody, proto je třeba obzvlášť pozorně sledovat všechny výše uvedené parametry – především hladinu rozpuštěného kyslíku, která nikdy nesmí klesnout pod 2,5 mg/l. V případě, že kyslík klesne pod kritickou hodnotu, chov je třeba provzdušňovat (cca 1 bublina/s). Pravidelně musíme také pozorovat celkový stav organizmů – důležitá je například barva larev, která by měla být sytě červená – jeví-li se totiž organismy nezdravě a ve stresu, nemohou být použity pro ekotoxikologické testování. Vodu při statickém uspořádání měníme jednou za měsíc nebo jednou za dva měsíce. Při výměně vody jak ve statickém tak v průtokovém systému dbáme na to, aby proud vody zbytečně nerozrušoval sediment a schránky pakomářích larev. 12

Nezbytnou součástí chovu pakomárů je krmení. Larvy pakomárů krmíme vločkovým krmením pro akvarijní ryby (TetrafinR), do chovné nádoby přidáváme 0,25 – 0,5 mg rozemletých vloček na larvu a den. Potravu aplikujeme v podobě suspenze (1,25 g sušených vloček na 100ml vody). Krmivo by také mělo obsahovat přídavek vápenného prášku, čímž zabráníme poklesu pH. Dodáváme-li krmiva příliš mnoho, mohou se v nádobě rozvinout bakteriální a plísňové nárosty, což vede k poklesu rozpuštěného kyslíku. Přidáváme-li nedostatečné množství krmiva, larvy mají tendenci opouštět sediment a vznášet se ve vodním sloupci. Jako krmivo mohou být také přidávány buňky zelených řas (Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus). Líhnutí dospělců nastává při chovu ve 23°C asi po třech týdnech od vykulení z vajíčka. Dospělci vylétají nad hladinu a usedají na stěny síťové klícky, odkud je musíme opatrně odsát a přemístit do snubní komůrky (= reprodukční nádoba). Snubní komůrka (viz obr. 5 a 7) může mít nejrůznější podoby, lze ji například jednoduše vyrobit z Erlenmayerovy baňky, kam na svislo umístíme pevnou síťku – ta slouží samičkám jako podklad pro kladení vajíček. Do baňky nalijeme 50-75 ml vody a hrdlo uzavřeme síťovinou jako u chovné nádoby pro larvy. U dospělců si všímáme poměru zastoupení pohlaví, ideálem pro efektivní oplodnění je poměr 3:1 ve prospěch samiček. Samičky kladou shluky vajíček na připravenou síťku, dospělci pak brzy umírají. Shluky vajíček poslouží k založení nové kultury nebo k testování kontaminovaných sedimentů. Pro založení nové laboratorní kultury postačí 5 shluků vajíček, které vysadíme do chovné nádoby. Potravu nepřidáváme, dokud se z vajíček nevylíhne první larvální instar, což obvykle trvá 2-4 dny. Životní cyklus druhu Chironomus riparus (21-28 dnů) je v laboratorních podmínkách zpravidla o několik dnů kratší než u druhu Chironomus tentans (25-30 dnů).

13

Obrázek 5: Realizace chovu pakomárů v laboratořích Recetox; vlevo nahoře – chovné nádoby v záchytné klícce, vlevo dole – snubní akvárium, vpravo detail chovné nádoby – vzdušnění Pasteurovou pipetou

5. Provedení testů na základě standardizovaných i nestandardizovaných mezinárodních metodik (US-EPA 2000; OECD 2004) Testy na stanovování toxicity sedimentu s užitím pakomárů jsou dnes již velmi rozšířené, a proto byly standardizovány několika světovými organizacemi za účelem možnosti srovnání a lepší interpretace výsledků testů prováděných v různých laboratořích. U standardizovaných testů jsou přesně definovány veškeré podmínky, kroky postupu i způsob vyhodnocování, aby se u sledovaných parametrů minimalizoval nebo aspoň sjednotil vliv pozadí a statistického zpracování na výsledky. Jednotlivé organizace poskytují tyto velmi detailně vypracované postupy buď zdarma anebo za úplatu2. Bezplatným zdrojem směrnic k testům je americká Agentura pro ochranu životního prostředí (US-EPA) a Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD). _____________________________________________________________________________ 2. Organizace poskytující standardní postupy k provádění testů s užitím pakomárů zdarma: Organizace Web US EPA http://www.etc-cte.ec.gc.ca/organization/bmd/pubs/pubs_en/1RM32EnglishFinal.pdf Environment Canada

14

Tabulka 1: Přehled doporučených metodik k testům s pakomáry Vydávající organizace OECD

Identifikační číslo 218

Rok

Název dokumentu

2004 OECD Guidelines for testing of chemicals, Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment OECD 219 2004 OECD Guidelines for testing of chemicals, Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Water US-EPA 600/R-99/064 2000 Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sedimentassociated Contaminants with Freshwater Invertebrates. - Test Method 100.2: Chironomus tentans 10-d Survival and Growth Test for Sediments - Test Method 100.5: Life-cycle Test for Measuring the Effects of Sediment-associated Contaminants on Chironomus tentans BBA U1-95-14697 1995 Long-term toxicity test with Chironomus riparius: development and validation of a new test system Environment EPS 1/RM/32 1997 Biological Test Method: Test for Canada Growth and Survival in Sediment Using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius) ASTM E1706-05 2005 Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates

Délka testu 10 - d 28 - d

10 - d 28 - d

10 - d

celoživotní

28 -d

10 - d

10 - d

Existují 4 základní typy testů: 1. Standardní 48 hod / 96 hod test akutní toxicity na larvách 2. Standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev 3. Standardní 28-d test líhnutí a vývoje 4. Standardní 65-d celoživotní studie Postupy a podmínky pro provedení jednotlivých testů jsou velmi podobné, testy se liší dobou expozice a především sledovanými parametry, na základě kterých testy vyhodnocujeme. Všeobecně platí, že při testování musíme průběžně sledovat všechny zadané veličiny a důsledně dbát na dodržení podmínek – obzvlášť na množství rozpuštěného kyslíku. Při přemisťování 15

dospělců nebo vajíček je třeba postupovat co nejopatrněji, abychom je nezranili. Při stanovování váhy organismů určujeme vždy váhu sušiny prosté popelovin (AFDW- ash free dry weight), neboť se ukázalo, že vnitřní obsah střev larev často vykazuje značné množství nestravitelných částic sedimentu – toto množství je však variabilní a při započtení váhy těchto zrníček sedimentu do váhy organismu bychom se dopouštěli chyby (US-EPA 2000). Praktickou alternativou k náročnému stanovování AFDW je měření délky těla larev, neboť bylo prokázáno, že AFDW a délka těla spolu těsně korelují (US-EPA 2000) (viz Graf 1).

Graf 1: Závislost AFDW na délce těla larev (US-EPA 2000)

Počet opakování, rozsah a faktor ředění mezi testovanými koncentracemi závisí na cíli experimentu. US-EPA doporučuje 8 opakování/koncentraci v 10-d testu a 12 opakování/ koncentraci v celoživotním testu, kdežto OECD v celoživotním testu doporučuje testování 5 různých koncentrací aspoň po 3 opakováních/koncentraci (f<2) při stanovování ECx a po 4 opakováních/ koncentraci při stanovování LOEC a NOEC. Test můžeme považovat za validní v případě, že v kontrole přežívá více než 70 % jedinců (u 10-d testu) nebo se vylíhne více než 50% jedinců (celoživotní test). Splněny musí být i další parametry uvedené v tabulkách 1 a 3 v příloze. Při stanovování procenta přežití za mrtvé považujeme larvy, které se nepohybují ani nereagují na podráždění, a zároveň larvy které se nepodaří v sedimentu při přesívání objevit (rozdíl počtu celkově vysazených a na konci objevených larev). Při zpracování výsledků se užívá statistických metod (viz tab. 2) uvedených ve směrnicích OECD a US-EPA (US-EPA 2000; OECD 2004).

16

Tabulka 2: Statistika pro zpracování dat (OECD 2004) ECx NOEC, LOEC Závislost citlivosti na pohlaví Procento vylíhnutých jedinců

Regresní analýza ANOVA Chi-square test Cochran-Armitage test, Fisher’s exact test, MantelHaentzal test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin transformace)

Jako referenční chemikálie lze použít např. lindan, trifluralin, pentachlorfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (OECD 2004). Výstupem testu je tzv. testová zpráva (viz tabulka 7 v příloze)

5.1 48 hod / 96 hod test akutní toxicity na larvách V akutních testech vystavujeme organismy vyšším koncentracím testovaných látek a sledovaným cílovým parametrem je mortalita. Tento test je normován pouze pro provedení ve vodě, nikoli v sedimentu (OECD 2006).

5.2 Standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev (US-EPA 2000) Tato testová metoda je používána ke stanovování toxicity sedimentu od konce 70.let 20. století a byla ověřena mnoha mezilaboratorními studiemi i v testech se skutečnou přírodní bentickou populací. Test se začíná s 10 dní starými larvami (třetí instar) a expozice kontaminaci v sedimentu trvá 10 dnů. Je velmi důležité, aby testované organismy byly ve věku uniformní, protože jednotlivé fáze larválního vývoje (instary) jsou ke kontaminantům různě citlivé - třetí a čtvrtý instar je obdobím nejnižší citlivosti. Sledovanými parametry na konci pokusu jsou procento přežití a AFDW – jako parametr růstu. Imobilní jedince izolované ze sedimentu považujeme za mrtvé a do stanovování AFDW je nezahrnujeme. Navíc můžeme měřit také délku larev – v tomto případě je potřeba larvy zakonzervovat v 8% cukerném roztoku formalínu. Vliv ostatních organismů, žijících přirozeně v sedimentu, nebyl na výsledcích testu prokázán. Při interpretaci výsledků je však třeba brát v úvahu toxicitu způsobenou amoniakem. Všeobecné podmínky a časový harmonogram 10-d testu dle US-EPA jsou uvedeny v příloze v tabulkách 1 a 2. Uspořádání testu znázorňuje obr. 6.

17

Obrázek 6: Uspořádání 10-d testu, vlevo detail testových kádinek s přívodem vzdušnění

5.3 Standardní 28-d test líhnutí a vývoje (OECD 2004) 28-d test s pakomáry se provádí za stejných podmínek jako 10-d varianta, do testu se však nasazují 1-4 dny staré larvy a celý test trvá, jak vyplývá z názvu, 28 dní – toto platí pro druh C. riparius, u druhu C. tentans může trvat až 65 dnů. Dle OECD se kádinky se sedimentem a testovou vodou (viz tabulka 8, 9, a 10 v příloze) nasazují po 20 jedincích. Testové kádinky jsou svrchu opatřeny síťkou k záchytu vylíhlých dospělců. Sledovanými parametry 28-d testu jsou: procento líhnutí dospělců, střední čas vývoje a střední rychlost vývoje – postup výpočtu naznačuje tabulka 6 v příloze. Postup při nasazení a pozorování líhnutí je podrobněji popsán u následujícího testu (viz 5.4); detailní popis podmínek i jednotlivých kroků testu udává tabulka 5 v příloze.

5.4 Standardní 65-d celoživotní studie (US-EPA 2000) Test se začíná s nově vylíhlými larvami v testových nádobách s důkladně homogenizovaným sedimentem zalitým testovou vodou. Larvičky získáváme ze shluků vajíček sesbíraných na Petriho misku ze snubní komůrky, kde dochází k páření. Larvy se obvykle líhnou po 48 hodinách a po dalších 24 hodin zpravidla zůstávají v želatinózním shluku, který slouží jako zdroj potravy, poté larvy shluk opouštějí. Proto přemísťujeme celý shluk po 24 hodinách od propuknutí líhnutí do testové kádinky s čistou vodou, čímž zajistíme homogenní stáří larev, neboť larvy které by opustily shluk a tím i zdroj potravy dříve by musely být považovány za starší. Následně jsou larvy nasávány Pasteurovou pipetou a vypouštěny do vody v testových kádinkách (viz obr. 8). Poté larvy denně krmíme, doplňujeme odpařené médium destilovanou vodou a sledujeme důležité parametry testového prostředí – především pH a rozpuštěný kyslík. Asi po 23 dnech se dospělci začínají líhnout a létat. Samce a samice z jednotlivých kádinek pak 18

odchytáváme a přemísťujeme do snubních komůrek (Erlenmayerova baňka, viz obr. 7), kde dochází k rozmnožování. Oplodněné samice kladou shluky vajíček, které odebíráme a umísťujeme do Petriho misek. Samičky mohou naklást i více než jeden shluk vajíček – pro výsledky testu jsou však směrodatná pouze vajíčka z prvního nakladeného shluku. Abychom zajistili dostatečný počet samečků na páření, který kvůli jejich dřívějšímu líhnutí (proterandrii) o 4-7 dnů nemusí být vždy zaručen, chováme pomocnou testovou kulturu s časovým posunem 7 dnů. V den 20 stanovujeme růst (AFDW), což odpovídá cílovému parametru 10-d testu. Pro toto měření použijeme 4 z celkových 12 doporučených opakování, 8 opakování nám tedy zůstává pro hodnocení reprodukčních parametrů a růstu na konci pokusu. Ode dne 23 denně monitorujeme líhnutí a reprodukci. Test se končí tehdy, pokud se v dané kádince už 7 dnů nevylíhl žádný dospělec. Soubor sledovaných parametrů udává tabulka 3.

Obrázek 7: Snubní komůrka: A – víčko ze síťoviny, B – pevná oporná síťka, C – voda (US-EPA 2000) Tabulka 3: Sledované parametry u celoživotního testu (US-EPA 2000) Letální Přežití: Larvy (20-d) Larvy na konci Kukly Dospělci

Růst: Larvy

Subletální Líhnutí: Reprodukce: Celkem/procentuálně Poměr pohlaví Kumulativní četnost Čas do kladení vajíček vylíhnutých jedinců Čas do prvního líhnutí Střední počet vajíček na samici Čas do smrti Počet shluků vajíček na kádinku Poměr vajíček vylíhlých ku nevylíhlým

Parametry spojené s reprodukcí bývají variabilnější, proto v některých případech musíme volit větší počet opakování. Při hodnocení líhnutí je třeba rozlišovat tzv. úplné a částečné líhnutí. Při úplném líhnutí jedinec zcela odhodí exuvii stadia kukly a překonává 19

povrchové napětí vody. Při částečném líhnutí si jedinec nechává část exuvie připojenou k tělu a do 24 hodin hyne, stejně tak jako vylíhlý jedinec, kterému se nepodaří překonat povrchové napětí hladiny. Nakladené shluky vajíček přemísťujeme do Petriho misky a zaznamenáváme líhnutí. Odhad počtu vajíček ve shlucích které tvarem připomínají písmeno C provádíme tzv. prstencovou metodou: shluk rozdělíme podélně na 5 prstenců stejné délky, počet vajíček ve shluku pak odpovídá počtu vajíček v 1 prstenci vynásobený 5ti. Vznikne-li v sedimentu velký gradient kontaminace, je velmi pravděpodobné, že líhnutí v jednotlivých koncentracích bude značně asynchronní. Všeobecné podmínky a časový harmonogram celoživotního testu dle US EPA jsou uvedeny v příloze v tabulkách 3 a 4.

Obrázek 8: Testová nádoba k provedení celoživotního testu (A - nylonová síťka, B - plastový kryt, C - kádinka bez zobáčku, D - otvory na výměnu vody, E – sediment) (US-EPA 2000) 5.5 Dosud nestandardizované metodiky testování toxicity sedimentu s užitím pakomárovitých Chironomidae Vedle standardizovaných testů existuje mnoho dalších alternativ, lišících se buď v celém experimentálním navržení nebo jen v samotných cílových parametrech. V poslední době se jako cílového parametru často využívá stanovování subletálních biomarkerů jako jsou aktivita acetylcholinesterázy (Moreira-Santos et al. 2005), hladina sacharidů a lipidů (Servia et al. 2005), vitellogeneze (OECD 2006) a aktivita glutathion-S-transferázy (Printes et al. 2007). Některé studie využívající pakomáry jsou prováděny in-situ a přinášejí tedy relevantnější informace o reálném ekosystému oproti laboratorním testům (Moreira-Santos et al. 2005). Pakomárovité je možno využít i pro monitoring, protože zastoupení jednotlivých druhů často koreluje se znečištěním (Albarino et al. 2006).

20

OECD se v současné době snaží vyvinout a standardizovat metodiky testů, které by poskytovaly data o vlivu endokrinních disruptorů, a pomocí nichž by bylo možné hodnotit potenciální poškození populace. Takové testy by měly být dlouhodobější a zahrnovat aspoň dvě generace, aby se mohly projevit mnohdy latentní vlivy endokrinních disruptorů například na fertilitu, páření, embryonální vývoj atp. Pakomárovití jsou jako zástupci hmyzu dobrými kandidáty na toto testování, protože právě hmyz je skupinou bezobratlých, u níž jsou růst, vývoj a reprodukce řízeny hormonálně a jejíž endokrinní systém je nejlépe prostudován, hlavně díky hedvábnictví a vývoji pesticidů třetí generace. Například Watts et al. (2001) provedli dvougenerační studie posuzující vliv 17-ethinylestradiolu a bisfenolu A na životní cyklus pakomárů Chironomus riparius. Došlo k opoždění líhnutí a změně poměru pohlaví v druhé generaci u opakování s nejvyššími koncentracemi látek (1 mg/l), ty jsou však naštěstí absolutně environmentálně nerelevantní. Testování některých látek přineslo velmi překvapivé a mnohdy i protichůdné výsledky, což je zatím společně s nedostatečnou odpovědí na xenoestrogeny slabým místem tohoto typu testování (OECD 2006).

6. Využití modelového sedimentu nebo různě zatížených přírodních sedimentů V testech s pakomáry můžeme jako substrát využít buď přírodní a nebo uměle připravený sediment. Ve standardizovaných testech se doporučuje užívat artificiálního sedimentu, protože jeho fyzikálně-chemické vlastnosti jsou mnohem lépe definovatelné než v případě přírodního sedimentu. Další výhodou artificiálního sedimentu je, že nepodléhá sezónním variacím, neobsahuje žádnou další faunu a nemusí se tedy dále předpřipravovat. Všechny tyto aspekty snižují náklady testování. Navíc je možné porovnávat výsledky jednotlivých studií. Přesné složení artificiálního sedimentu udává tabulka 4.

Tabulka 4: Složení artificiálního sedimentu pro testování toxicity chemických látek (OECD 2004) Složka

Vlastnosti

Rašelina

Rašelina mechu Sphagnum (rašeliník) o pH 5,5-6 s nezřetelnými rostlinnými zbytky, jemně namletá (velikost zrn<1mm), vysušená Velikost zrn: více než 50% zrn by mělo být v rozsahu velikostí 50-200 µm Obsah kaolinitu > 30 % Upraveno přidáním písku a rašeliny Rozemletý, chemicky čistý Vodivost < 10 µS/cm

Křemenný písek Kaolin Organický uhlík Uhličitan vápenatý Voda

Procentuální obsah suché váhy sedimentu 4-5

75-76 20 2 ± 0,5 0,05-0,1 30-50

21

Užíváme-li v testu přírodní sediment, je potřeba charakterizovat jeho pH, obsah organického uhlíku, poměr C/N a zrnitost (OECD 2004). Bylo však prokázáno, že v případě 10-d testů obsah organické hmoty jak v přírodním tak artificiálním sedimentu nemá vliv na přežití organismů, avšak hraje důležitou roli pro růst (US-EPA 2000).

6.1 Kontaminace sedimentu a vody nad sedimentem Existují 2 hlavní přístupy v přípravě koncentračních řad kontaminace v testových nádobách: prvním přístupem je kontaminace sedimentu a následné zalití čistým médiem. Druhá varianta pracuje s čistým sedimentem a naopak kontaminovanou vodou nad sedimentem. V obou případech je nutné dodržet potřebnou dobu na dosažení rozdělovací rovnováhy (48 hodin až několik dnů). Na začátku a konci testu by měla být provedena analýza sedimentu, vody nad sedimentem a pórové vody aspoň v nádobách s 2 nejvyššími koncentracemi. Kontaminace sedimentu se provádí tak, že ve fázi přípravy sedimentu přidáváme patřičné množství zásobního roztoku kontaminantu ředěného v deionizované vodě. Směs se musí důkladně promíchat. Je-li testovaná látka špatně rozpustná ve vodě, můžeme ji rozpustit v co nejmenším možném množství organického rozpouštědla (hexanu, acetonu, chloroformu). Poté doplníme 10 g jemného křemenného písku (množství odpovídající jedné testové nádobě), promícháme, veškeré rozpouštědlo necháme několik minut odpařit (použitá rozpouštědla musí být volatilní a tudíž se odpařovat okamžitě), poté smícháme se zbývajícími složkami sedimentu (OECD 2004). Kontaminace vody se provádí přímým ředěním zásobního roztoku kontaminantu médiem. Koncentrace je uvažovaná pouze na objem vody nad sedimentem – objem samotného sedimentu se při výpočtu koncentrace k objemu vody nepřičítá. Použijeme-li organické rozpouštědlo nebo dispergovadlo, je potom nutné založit další kontrolu s ekvivalentním přídavkem tohoto rozpouštědla, abychom byli schopni identifikovat jeho případný vliv na testové organismy.

7. Testování jednotlivých modelových látek a jejich směsí V ekotoxikologické praxi byla provedena už řada biotestů na pakomárech za účelem stanovení toxicity modelových látek v sedimentu. V popředí zájmu ekotoxikologických výzkumů stojí bezesporu těžké kovy, syntetické organické látky a pesticidy, a to především kvůli jejich množství, distribuci a škodlivým či necílovým účinkům v životním prostředí. V této oblasti je možné získat množství informací z odborných článků, které uvádějí účinné koncentrace látek, citlivost organismů vůči nim či jiná 22

zajímavá fakta týkající se testového uspořádání. Toxicita významných těžkých kovů, organických látek a pesticidů je dnes již dle standardních metodik dobře charakterizována a výsledky hodnocení toxicity ve standardizovaných testech s pakomáry jsou pro řadu látek shrnuty v mezinárodních ekotoxikologických databázích (např. IRIS, ITER TERA a další, viz 12.1). Není možné se v rámci bakalářské práce zabývat všemi těmito daty, proto byly do dalšího textu vybrány jen příklady podrobnějších studií, které kromě standardních výstupů hodnotí i další specifické parametry. Studie ekotoxicity s užitím pakomárů je možné dohledat například v databázi SETAC (Společnost pro environmentální toxikologii a chemii) nebo pomocí vyhledávačů BioOne a ScienceDirect. Na pakomárech byly testovány i další modelové látky jako například azaareny, radioaktivní látky nebo léčiva. Existuje jen omezené množství studií zabývajících se takovými toxikanty a do budoucna tedy představují prostor pro další výzkum. V následujícím textu jsou zmíněny příklady prací popisujících toxicitu těchto tří skupin skupin.

7.1 Těžké kovy Těžké kovy jsou perzistentními polutanty, které se dostávají ve zvýšené míře do prostředí díky lidské činnosti. Těžké kovy mají k sedimentu obzvláště vysokou afinitu, a protože většina kovů je pro biotu neesenciální a v určitém množství toxická, je potřeba v legislativě zakotvit vhodné limity pro jejich obsah (Dias et al. 2005; Grosell et al. 2006). Při hledání této hodnoty můžeme využít mimo jiné biotesty s pakomáry. Studií, které se zabývají toxicitou kovů pro pakomáry, existuje celá řada (Fargašová 2001). Na tomto místě však není možné zmínit všechny tyto experimenty, proto jsou níže uvedeny 3 zajímavé příklady konkrétních testů. Jako první příklad poslouží studie provedená vědci z univerzity v Miami (USA) (Grosell et al. 2006), kteří testovali chronickou toxicitu olova paralelně na třech zástupcích sladkovodních bezobratlých – Brachionus calyciflorus (vířníci - Rotifera), Chironomus tentans (hmyz – Insecta) a Lymnea stagnalis (měkkýši – Mollusca) a porovnali citlivost jednotlivých druhů. V případě pakomárů zvolili celoživotní test, avšak oproti standardnímu postupu byl test započat s 8-d larvami. Substrátem byl plážový písek (15 ml) zalitý testovou vodou (130 ml) – z jedné třetiny tvořenou běžnou vodovodní vodou z oblasti Florida Key a ze dvou třetin deionizovanou vodou obohacenou vápenatými ionty. Takto upravená voda umožňuje udržet vysoké

koncentrace

rozpuštěného

olova,

tím

že

koncentrace

uhličitanových

a

hydrogenuhličitanových iontů jsou nízké, a zároveň slouží jako vhodné medium pro vývoj larev. Testované koncentrace olova byly v rozsahu 0 – 800 µg/l (5 členů řady, vždy 3 opakování po 5 jedincích, v průtočném systému 20 ml/min). Sledováno bylo procento přežití, líhnutí a čas do 23

líhnutí. Procento přežití bylo výrazně nižší ve dvou nejvyšších koncentracích. Čas do líhnutí se v žádném případě významně nelišil od kontroly, a všechny larvy, co přežily se také vylíhly. Hodnoty NOEC a LOEC byly stanoveny na NOEC = 109 µg/l a LOEC = 497 µg/l. Ukázalo se, že Chironomus riparius je ze tří výše uvedených druhů nejtolerantnější vůči olovu. Dobrou zprávou je, že dle zjištěných hodnot NOEC a LOEC by olovo pro přírodní populace pakomárů nemělo představovat žádné reálné riziko, neboť běžné koncentrace olova v prostředí se pohybují v rozsahu 0,6 – 120 µg/l. Potenciální nebezpečí pro pakomáry představují olovem zamořené vody s nízkým obsahem Ca2+, neboť mezi larválním příjmem iontů vápníku a olova existuje antagonistický vztah (Grosell et al. 2006). Dále je třeba mít na paměti, že citlivost je dána nejen druhem (viz graf 2), ale také životní fází, ve které se organismus nachází. Je známo, že u pakomárů je nejcitlivějším obdobím první larvální instar, kdy jedinci mohou být vůči působení kovů až 1000krát citlivější oproti čtvrtému instaru (Bleeker et al. 1998).

Graf 2: Rozložení druhové citlivosti k Pb podle hodnoty NOEC u různých sladkovodních organismů. Běžné koncentrace Pb ve vodách se pohybují v rozsahu 0,6 - 120µg/l (Grosell et al. 2006) Dalším zajímavým příkladem využití pakomárů při studiu ekotoxicity kovů může být studie provedená společně vědci z Francie a Španělska (Servia et al. 2005), zabývající se vlivem mědi na energetický metabolismus a vývoj larev. Cílovými parametry této studie byly tedy 1) vývojové biomarkery: vývoj imaginárních disků a mokrá váha těla larev; 2) energetické biomarkery: hladina sacharidů a lipidů v hemolymfě a těle zbaveném obsahu střeva. Aby bylo 24

možné získat dostatek biologického materiálu pro biochemická měření, musely být provedeny 2 nezávislé experimenty. Test se začínal se 4-d larvami - po 20 jedincích ve 3 opakování každé koncentrace - a trval 7 (experiment 1) a 9 dnů (experiment 2). Doba testu byla vybrána tak, aby zachycovala období larválního somatického růstu, který za daných podmínek trvá asi 10 dnů. Poté totiž následuje období, kdy larvy začínají investovat energii do produkce gamet – zvyšuje se jejich hmotnost a akumulace rezerv, ale tělo se neprodlužuje (Dias et al. 2005). Expozice tedy byla ukončena po 7 a 9 dnech – rozdílné hodnoty byly zvoleny z důvodu rozdílné vývojové rychlosti samců a samic. Nominální koncentrace mědi v experimentu sahaly od 0 do 50 mg/kg suché váhy sedimentu. Ukázalo se, že v 7-d testu má statisticky významný vliv na rychlost vývoje pouze pohlaví. Naopak u 9-d testu už to byla i koncentrace mědi – 25 a 50 mg/kg. Některé larvy utrpěly značné zpomalení vývoje a zaostaly ve fázi třetího instaru. Hladiny sacharidů (konkrétně glukózy, trehalózy a glykogenu) se mezi jednotlivými koncentracemi významně nelišily, kdežto hladiny lipidů (konkrétně glycerolu a trigliceridu) byly variabilnější – vysoké hladiny glycerolu byly zaznamenány především u larev v koncentraci 50 mg/kg. Se zvyšující se koncentrací mědi se snižovala hladina triglyceridu u samic, což koresponduje se sníženou fekunditou (počet vajíček ve shluku) zjištěnou v dřívějších studiích popisujících ekotoxicitu mědi. Výsledky studie je možné interpretovat tak, že k výraznému snížení hladiny cirkulujících sacharidů nedošlo, neboť ta je variabilní podle intenzity stresu. Dalším důležitým faktem je to, že larvy mohly zvýšený energetický výdej kompenzovat příjmem potravy, protože byly krmeny dostatečně. Celkově se samice projevily jako citlivější v uvedených sledovaných parametrech než samci (Servia et al. 2005). Za zmínku jistě stojí také studie provedená pod záštitou Environment Canada (Hruska and Dubé 2004), jejímž cílem bylo porovnat výsledky biotestu prováděného standardně (beaker bioassay – BB) a v artificiálním toku (artificial stream bioassay – ASB). 11-d larvy byly v obou případech vystaveny 45% odpadní vodě po úpravě v ČOV (Copper Cliff Wastewater Treatment Plant v Sudbury, ON, Canada) a pozorovány až do skončení jejich životního cyklu. Testová voda byla oproti referenční vodě významně zatížena zvýšeným obsahem 13 různých kovů (As, B, Cd, Co, Cu, Fe, Li, Mn, Ni, Rb, Sr, Se, Tl) pocházejících z přilehlých dolů, ale pouze u 4 kovů (Cu, Cd, Ni a Se) byly překročeny koncentrační limity dané kanadskou legislativou. Umělý tok (ASB) byl vytvořen v 10-ti litrové válcové nádobě, umístěné v 85-ti litrovém zásobním bazénu, odkud voda proudila do válcových nádob (celkem 6) rychlostí 2 l za minutu, což simuluje přirozené říční podmínky. Do každého umělého toku bylo umístěno 250 larev, kdežto do každé standardní kádinky 12 larev (celkem 8 opakování). Oba systémy byly udržovány v laboratoři za stejných podmínek a byly u nich stejným způsobem hodnoceny stejné cílové parametry: procento přežití 25

(10-d a na konci) růst (délka, 10-d a na konci), čas do líhnutí dospělců, procento líhnutí dospělců, poměr pohlaví, počet shluků vajíček na samici, počet vajíček ve shluku, procento líhnutí vajíček. Pouze růst (délka) byl stanovována rozdílně – v ASB variantě byla délka změřena celkem 3krát po začátku expozice, což se později projevilo jako velmi efektivní řešení, které přináší relativně důležité informace pro statistické hodnocení. V závěru se ukázalo, že odpověď organismů se u dvou různě uspořádaných biotestů shoduje pouze ve dvou sledovaných cílových parametrech. U obou uspořádání se čas do líhnutí dospělců celkově zvýšil (jak pro samce tak pro samice), a procento líhnutí vajíček se snížilo. Ve variantě s užitím umělého vodního toku (ASB) došlo také k významným negativním změnám v dalších 4 parametrech (% přežití, % líhnutí dospělců, počet shluků vajíček/samici a délka), kdežto v případě standardní kádinkové metody (BB) se změny v těchto parametrech neprojevily jako statisticky významné. Nejednotnost výsledků má příčinu především v zásadně rozdílné velikosti vzorků v jednotlivých uspořádáních (250 v ASB a 12 v BB), ačkoli hustota larev byla v ASB i BB obdobná (0,36 jedince/cm2). Protože z varianty ASB bylo k určení střední hodnoty parametru/opakování vybráno více subvzorků, variabilita výsledků z ASB byla nižší a proto bylo možné prokázat statisticky významné rozdíly, které se v BB nemohly kvůli malému počtu jedinců na opakování projevit. Výstupem z této studie bohužel nemůže být informace o tom, do jaké míry se která složka podílí na celkové toxicitě odpadní vody. Práce Fargašové (2001) uvádí, že směsi kovů, jakou je například právě odpadní voda ze zmíněné ČOV, vykazují zpravidla vyšší toxicitu než jaká byla zjištěna u jednotlivých prvků. Míra synergismu ovšem závisí na koncentraci přítomných kovů ve směsi (Fargašová 2001). Zajímavým zjištěním studie s užitím ASB je bezpochyby to, že citlivost standardních kádinkových biotestů může být oproti jiným variantám značně omezená a snadno tedy můžeme podcenit toxicitu kovů testovanou v tomto uspořádání. Avšak velkou výhodou standardního testu zůstává relativně nízká cena oproti složitým technickým a logistickým řešením v případě ASB (Hruska and Dubé 2004). Důležitým aspektem, který je třeba zmínit v souvislosti s pakomáry a posuzováním toxicity sedimentů znečištěných kovy, je ochranná povaha schránky, kterou si larvy kolem sebe budují z částeček substrátu. Bylo totiž prokázáno, že u larev vystavených kontaminaci sulfidem měďnatým, schránka sehrála důležitou roli v omezení průniku kontaminantů do tkání. U larev bez schránek se vliv kontaminantu projevil zvýšenou propustností membrán mnohem více než u larev žijících v ochranných schránkách (Halpern et al. 2002).

26

7.2 Pesticidy – organofosfáty, pyrethroidy Pesticidy aplikované na zemědělsky využívané plochy se běžně s nevelkým zpožděním a ve velkých dávkách dostávají do vodního prostředí, kde mohou ohrožovat necílové druhy. Pesticidy jsou centrem zájmu ekotoxikologického testování, a proto bylo provedeno mnoho experimentů i s pakomáry. Dnes již víme spoustu základních údajů o jednotlivých látkách, posoudit skutečná rizika pesticidů v reálném prostředí je však stále velmi obtížné: důležitou roli hraje aplikační režim, fyzikálně-chemické vlastnosti (hlavně hydrofobicita a degradabilita), vzájemné spolupůsobení (Forbes and Cold. 2005; Belden and Lydy 2006) nebo také specifický charakter zasaženého prostředí. Těmto problémům se věnují následující vybrané příklady pokročilejších ekotoxikologických studií: Dosavadních prací, které by braly v úvahu například expoziční scénář není mnoho. Jedním takovým příkladem může být experiment, využívající pakomáry Chironomus riparius, provedený na dánské univerzitě v Roskilde (Forbes and Cold. 2005). V tomto pokusu šlo o pozorování vlivu pyrethroidu esfenvaleratu na přežití, vývoj a reprodukci ve 3 různých uspořádáních. V prvním experimentu byl posuzován vliv environmentálně realistické koncentrace pesticidu (0,2 µg/l) na týdenní larvy v kontaminovaném vodním sloupci po dobu 1 hodiny (simulace jednorázové aplikace pesticidu). Test probíhal v 0,5 l nádobách s 30 jedinci po 4 opakováních; vedle kontroly zde byly 2 varianty s kontaminovaným vodním sloupcem, z první byli po 1 hodině jedinci přemístěni do čisté vody a sedimentu; z druhé byli jedinci přemístěni do čisté vody avšak kontaminovaného sedimentu, který prošel stejnou expozicí. V druhém experimentu byl sediment vystaven 24-h expozici stejné koncentrace esfenvaleratu (0,2 µg/l), poté zalit čistou vodou a nasazen testovými organismy. Cílem třetího experimentu bylo zjistit, jakou roli v otázce toxicity esfenvaleratu hraje hustota populace: týdenní larvy byly den po nasazení vystaveny 1-h expozici pesticidu ve vodné fázi a přemístěny do sedimentu při dvou různých populačních hustotách – 0,2 a 0,4 larvy/cm2 (při stejném množství potravy na larvu – 0,25 mg/d). Výsledky jednotlivých experimentů lze v krátkosti interpretovat tak, že i velmi krátké expozice užitými realistickými koncentracemi esfenvaleratu působí měřitelné efekty na vývoj a přežití mladých larev, které jsou nejcitlivější. Největší vliv byl zaznamenán ve variantě s kontaminovaným vodním sloupcem. Avšak ti jedinci, co přežili pak již nejevili známky postižení esfenvaleratem v ostatních znacích. U varianty s 24-h kontaminovaným sedimentem nedošlo k významným změnám oproti kontrole. Vyšší populační hustota snížila rychlost růstu populace (PGR), přičemž vliv esfenvaleratu tento efekt zmírňoval – byl tedy menší než aditivní, což je v souladu s výsledky Hoopera et al. (2005). Hustota populace i pesticid měly tendenci prohlubovat rozdíl mezi dobou do líhnutí samců a samic. Studie tedy dospěla k podobným 27

výsledkům jako předešlý experiment využívající modelového korýše Gammarus pulex, který reagoval na koncentrace esfenvaleratu v rozmezí 0,1 – 0,6 µg/l s tím, že reprodukční parametry byly obzvláště citlivé (Forbes and Cold. 2005). Conrad et al. (1999) provedli experiment, v němž podobně

jednorázově

kontaminovali

testové

systémy

pyrethroidem

permethrinem

v koncentracích od 0 do 100 µg/l. Ve své studii se kromě realistického expozičního scénáře snažili porovnat výsledky testů v laboratoři a in situ, k čemuž využili soustavu umělých rybníků. V laboratoři provedli celkem tři testy s 8-d starými larvami: akutní 96-h test ve vodním sloupci, 10-d test s přírodním sedimentem kontaminovaným v laboratoři a 10-d test se sedimentem pocházejícím z kontaminovaných umělých rybníků, odebíraný v různých časových intervalech po nástřiku pesticidu. V laboratorních testech bylo sledováno procento přežití, u populace v přírodních podmínkách hustota larev a počet líhnoucích se dospělců. Výsledky experimentu přinesly následující informace: permethrin způsobil významný pokles hustoty larev a líhnutí dospělců při koncentraci 10 µg/l a vyšších; tento výsledek se shoduje s hodnotami (EC50 = 9,72 µg/l) z 48-h laboratorního testu ve vodním sloupci; oba 10-d testy se sedimentem výrazně podcenily toxicitu permethrinu oproti in situ variantám, protože v nich není vůbec zahrnuta akutní letalita způsobená vysokou koncentrací látky ve vodním sloupci v zápětí po aplikaci (Conrad et al. 1999). Podobně tomu bylo ve výše uvedeném experimentu provedeném Forbesovou a Coldem (2005). Populace v kontaminovaných rybnících se brzy dostaly do normálu, díky krátkému životnímu cyklu pakomárů a snadné rekolonizaci z přilehlé kontrolní lokality (Conrad et al. 1999). Dalším příkladem může být studie Beldena a Lydyho (2006), která sledovala vliv spolupůsobení 2 pesticidů: organofosfátu chlorpyrifosu a pyrethroidu esfenvaleratu. Je známo, že pyrethroidy narušují sodíkové kanály a organofosfáty inhibují acetylcholinesterázu, oba pesticidy jsou tedy neurotoxické, otázkou však zůstává, jakou roli hraje jejich současné působení. K řešení takových otázek byly na základě mechanismů působení látek vytvořeny matematické modely, předpovídající toxicitu komplexní směsi. Cílem zmíněné studie bylo porovnat skutečnou toxicitu ekvipotentní směsi 2 výše uvedených pesticidů v experimentu s výstupy ze dvou prediktivních modelů s užitím pakomárů (Chironomus tentans) a ryb (Pimephales promelas – střevle). První z prediktivních modelů počítá s nezávislým působením látek (IA – independent action) a druhý s aditivitou koncentrací toxikantů (CA - concentration addition). S pakomáry byl proveden akutní 96-h test, přičemž cílovým parametrem byla mobilita: pokud se larvy nebyly schopné po jemném podráždění esovitě pohybovat, byly považovány za postižené. Přestože šlo o akutní test, larvy byly umístěny do testových nádob se sedimentem – šlo totiž o 14-16-d staré larvy (3.-4. instar). Ukázalo se, že oba modely podcenily 28

toxicitu směsi u obou organismů, nicméně CA model vykazoval nižší odchylku od reality. Výsledky tedy hovoří pro synergickou interakci testovaných pesticidů. Zvýšení toxicity esfenvaleratu u střevlí se předpokládalo na základě výsledků předešlých studií o spolupůsobení esfenvaleratu a diazinonu - tento organofosfát totiž inhibuje karboxylesterázu, enzym důležitý při detoxikaci pyrethroidu. Podobný mechanismus tedy pravděpodobně funguje i při interakci s chlorpyrifosem. Překvapivé je však to, že u střevlí byla dávka chlorpyrifosu potřebná k zablokování biotransformačního enzymu o více než 2 řády vyšší – celková směs byla tedy pro pakomáry téměř 400krát toxičtější. Hodnota EC50 směsi pro pakomáry činila 0,18 µg/l (u střevlí to bylo 67 µg/l). Studie tedy ukázala, že dosavadní modely (IA a CA) užívané k odhadu toxicity směsí pesticidů nejsou vždy adekvátní, a to hlavně v případě jednoduchých směsí; u vícesložkových systémů tyto modely fungují lépe. Binární směsi jsou ale nejlepším nástrojem ke zjištění a studiu vzájemných interakcí jednotlivých látek (Belden and Lydy 2006). Zajímavou metodou studia toxicity pesticidů, která stojí za pozornost, je 48-h biotest s tropickými pakomáry Chironomus xanthus, který zohledňuje expozici jak tradičně v sedimentu, tak ve vodních kořenech emerzních makrofyt (Moreira-Santos et al. 2005). Biotest byl vyvinut z důvodu potřeby přizpůsobit klasické biotesty s pakomáry podmínkám subtropického a tropického klimatu, neboť kvalita životního prostředí v tropech se rychle zhoršuje, aniž by existovaly možnosti tyto změny efektivně hodnotit. Tropický biotest se provádí s larvami 4. instaru (9-d po líhnutí) a sledovanými parametry jsou aktivita acetylcholinesterázy (AChE) a postexpoziční příjem potravy, který se jeví jako vhodný akutní cíl, protože jej lze rychle a snadno kvantifikovat, je citlivý a má velký fyziologický význam. Hodnotí se tak, že přežívající larvy se nechají po dobu 90 minut ve vialce v přítomnosti rozmražených nauplií Arthemia franciscana a výsledkem je potom počet zkonzumovaných nauplií na larvu. Kořeny a stonky vodních rostlin byly vedle sedimentu začleněny do testu jako substrát proto, že v tropických oblastech vodní makrofyta tvoří značnou biomasu, pokrývají velký povrch vodní hladiny a představují habitat a potravu pro bentické organismy. Zároveň mají velkou bioakumulační schopnost a představují tedy významný zdroj toxikantů pro vodní bezobratlé. Biotest s pakomárem C. xanthus byl proveden v zemědělské oblasti brazilského státu Bahía jak laboratorně tak in situ v mikrokosmech. Sledován byl vliv pyrethroidu detlamethrinu v doporučené (10 g/ha) a 20krát vyšší dávce. Výsledky variant se sedimentem a makrofyty byly velmi podobné a oba cílové parametry projevily stejnou citlivost vůči deltamethrinu (už při nižší použité koncentraci toxikantu), přičemž mikrokosmové varianty in situ byly o něco citlivější oproti laboratorním. Tento typ biotestu tedy vypadá jako vhodná alternativa ke standardním testům (Moreira-Santos et al. 2005). 29

7.3 Azaareny (NPAHs) Ve snaze zjistit a porovnat toxicitu osmi azaarenů (diaromát – chinolin; triaromáty akridin, fenanthridin, benzo[f]chinolin, benzo[h]chinolin; tetraaromáty - benzo[a]akridin, benzo[c]akridin; a pentaaromát - dibenzo[a,i]akridin) užili holandští ekotoxikologové z University of Amsterdam akutního 96-h testu s pakomáry (Bleeker et al. 1998). Azaareny (NPAHs) jsou odvozené od polyaromatických uhlovodíků (PAHs), v jejich aromatické struktuře jsou však substituovány některé atomy uhlíku dusíkem. Tyto látky se v přírodě vyskytují přirozeně např. jako alkaloidy, nebo vlivem antropogenní činnosti vstupují do prostředí při nedokonalém spalování fosilních paliv, při haváriích a vypouštění průmyslových odpadních vod, těžbě a zpracování ropy, úpravě dřeva a výrobě pesticidů. Předešlé studie se zabývaly pouze toxicitou akridinu a chinolinu, což se zdá být pro spolehlivou analýzu rizik nedostatečné. 96-h test byl proveden za statických podmínek, při teplotě 20±2ºC, fotoperiodě 16:8, v 180 ml nádobách s obsahem 100 ml vody, ve 3 opakování každé koncentrace. Do každé testové nádoby bylo vysazeno 50 čerstvě vylíhlých larev (aspoň u 20 byla vždy změřena délka těla). Po 96 hodinách bylo určeno procento přežití a délka těla larev, stejně jako skutečná koncentrace azaarenů. U cílového parametru procenta přežití (bráno oproti kontrole, kde přežilo vždy více než 80% jedinců) získali Bleeker et al. (1998) zřetelné křivky dávka-odpověď u všech testovaných azaarenů kromě dibenz[a,i]akridinu. S rostoucím počtem aromatických kruhů v molekule se azaareny stávají lipofilnějšími, což se projevilo při analýze po 96 hodinách, kdy návratnost analytické metody klesala právě s rostoucím počtem aromatických jader. Lze tedy předpokládat, že lipofilní azaareny sorbovaly na skle, potravě přidané do testové vody nebo na tělech larev. V případě takto špatně ve vodě rozpustných sloučenin je třeba uvažovat potravu jako hlavní cestu expozice toxikantem, a proto hodnoty LC50 založené na konečné koncentraci ve vodě mohou významně podceňovat jejich skutečnou toxicitu. Alternativou by mohlo být například určení hodnoty LC50 na základě obsahu toxikantu v těle larvy (LBB – lethal body burden). Ve výsledcích se zároveň ukázalo, že s rostoucím počtem aromatických jader roste také toxicita, která koresponduje s již zmíněnou vyšší lipofilitou a tím vyšší schopností bioakumulace a průchodu biomembránami. Zjištěnou zajímavostí je také rozdíl v toxicitě akridinu (LC50 = 0,0714 mg/l) a ostatních triaromátů (LC50 = 0,6131 – 0,8312mg/l), který pravděpodobně naznačuje transformaci akridinu, neboť jeho návratnost byla při analýze velmi nízká. Akridon, jenž vzniká při metabolické transformaci akridinu u slávičky mnohotvárné - Dreissena polymorpha (zebra mussel), nebyl při analýze nalezen. Je tedy možné, že existují i jiné transformační cesty. Fotoindukovaná toxicita hraje důležitou roli, při posuzování nebezpečnosti NPAHs, neboť může zapříčinit až o několik řádů vyšší celkovou toxicitu (Bleeker et al. 1998). 30

7.4 Léčiva Ojedinělým příkladem experimentu, který testuje toxicitu léčiv, je studie zkoumající vliv lufenuronu (Hooper et al. 2005). Lufenuron je účinnou látkou léčiv proti blechám, dále některých anihelmintik a fungicidních přípravků (Novartis Animal Health US 2005), kromě veterinární medicíny se také užívá jako pesticid na bázi syntetické benzoylfenylmočoviny (Hooper et al. 2005). Lufenuron inhibuje tvorbu, polymerizaci a ukládání chitinu (Novartis Animal Health US 2005), čímž zabraňuje vývoji hmyzích larev či rozvoji houbové infekce. Tým vědců z Velké Británie se ve své studii zabýval vlivem této látky na populaci pakomára C. riparius v souvislosti s populační hustotou (Hooper et al. 2005). Je známo, že vyšší hustota populace často mírní vliv stresorů, které způsobují mortalitu, neboť těla odumřelých jedinců znamenají živiny navíc pro jedince přežívající; proto mají tyto stresory menší než aditivní účinek k vysoké hustotě populace (Forbes and Cold. 2005). U stresorů, které nepůsobí přímo smrt, ale pouze inhibují růst, jako je tomu u lufenuronu, je však úvaha opačná; měly by tedy mít více než aditivní účinek, což se pokusila prokázat Hooper et. al. (2005) ve 2 laboratorních experimentech, prováděných v akváriích s artificiálním sedimentem a vodou. V prvním 10-d experimentu se testoval vliv lufenuronu v 6 nominálních koncentracích (15 -150 µg/kg sedimentu) na populaci o nízké hustotě (0,5 larvy/cm2); sledovanými parametry bylo přežití, váha larev a rezidua lufenuronu (14C). V druhém 67-d experimentu byly larvy celkem ve 4 různých hustotách (0,5; 1; 2; a 4 larvy/cm2) vystaveny tříčlenné koncentrační řadě lufenuronu (88; 113; a 138 µg/kg sedimentu); hodnotil se počet a pohlaví vylíhnutých jedinců, počet shluků vajíček, počet vajíček na shluk, a procento líhnutí vajíček; dále byla určena rychlost růstu populace (PGR- population growth rate3). Výsledky studie nepotvrdily zcela jednoznačně dřívější předpoklad: s rostoucí hustotou populace se sice zvyšovaly projevy negativních vlivů na všechny sledované parametry, avšak vliv lufenuronu se nelogicky lišil u jednotlivých populačních hustot. PGR se v kontrolách snižoval s rostoucí hustotou larev, zatímco vliv lufenuronu na PGR byl větší při nízké hustotě. U koncentrací vyšších než 60 µg/kg docházelo k úhynu jedinců v mnohem větší míře než se předpokládalo. Převážil tak vliv lufenuronu jako stresoru působícího mortalitu než jako růstového stresoru. Tento překvapivý výsledek mohl nastat z důvodu neznámého specifického působení lufenuronu na pakomáry nebo vlivem rostoucí tolerance vůči této látce s každým svlékáním (tento jev byl prokázán u některých cílových druhů). _________________________________________________________________________ 3.

Rychlost růstu populace (PGR) byla spočítána dle vzorce: 1/t = log (N2/N1) kde N1 je počáteční hustota larev, N2 je počet potomků a t je čas v týdnech kdy se vylíhlo nejvíce potomstva.

31

Hustota populace se tedy jeví jako silnější stresor než lufenuron. Jediný dobře prokazatelný efekt lufenuronu v této studii se projevil na počtu vylíhnutých vajíček (50 % snížení při koncentraci 88 µg/kg) (Hooper et al. 2005).

7.5 Radioaktivní látky Sediment je mimo jiné významným rezervoárem radioaktivních látek, které se zde mohou vyskytovat jak přirozeně, tak ve zvýšených koncentracích vlivem lidské činnosti. Jedním příkladem vědecké práce, která zkoumala vliv různých koncentraci uranu v sedimentu na mortalitu, dobu vývoje a růst pakomárů, je studie provedená skupinou francouzských odborníků (Dias et al. 2005). 10-d test byl proveden za standardních podmínek s užitím artificiálního sedimentu kontaminovaného uranyl nitrátem (UO2(NO3). 6H2O) v koncentracích 0; 2,97; 6,07; 11,44; 23,84 µg U/g suché váhy sedimentu. Na konci testu byl stanoven růst (délka), vývoj (jednotlivé instary byly určeny podle šířky hlavy u všech larev, co přežily), a procento přežití. Ve všech sledovaných parametrech se projevil negativní vliv uranu, přičemž procento přežití a vývojový stupeň se významně snížily u koncentrací 6,07 µg U/g a vyšších, délka larev čtvrtého instaru byla významně snížená už od koncentrace 2,97 µg U/g, u larev třetího instaru k významnému poklesu délky těla nedošlo. V předešlých studiích se ukázalo, že prostá mortalita není nejlepším a nejcitlivějším nástrojem v posuzování toxicity sedimentu, což se potvrdilo i v této práci. Subletální parametry jako růst a vývoj umožňují i v případě kontaminace uranem odhalit účinky nižších koncentrací. Příkladem toho je již zmíněné zpomalení vývoje s rostoucí koncentrací uranu. Tento výsledek je nepochybně dán zvyšující se relativní abundancí larev třetího instaru oproti larvám instaru čtvrtého, uran tedy zpomaluje vývoj larev, což může hrát roli na úrovni populací. Toto souvisí i s délkou – larvy musí během prvních tří instarů, kdy převažuje somatický růst, dosáhnout určité kritické velikosti těla a potom začít investovat do vývoje gamet – vlivem toxikantu se doba dosažení této kritické velikosti těla prodlužuje (Dias et al. 2005; Servia et al. 2005). Koncentrace uranu použité v citované studii odpovídají situaci v reálném prostředí, v sedimentech francouzských toků se totiž běžně pohybují v rozmezí 0,24 až 6,29 µg U/g suché váhy sedimentu, nehledě na extrémní hodnoty v oblasti uranových dolů, které mohou dosahovat hodnot až 450 µg U/g (Španělsko) (Servia et al. 2005).

8. Přehled využití pakomárů (Chironomidae) jako indikátorů zatížení v reálném prostředí Protože

pakomárovití

tvoří

ekologicky

velmi

významnou

skupinu

vodních

bezobratlých, stávají se často součástí nejrůznějších bioindikačních studií. Vedle jiných skupin 32

makroskopických vodních bezobratlých mají pakomárovití výhodu v tom, že čeleď zahrnuje velký počet druhů s odlišnou citlivostí k enviromentálnímu stresu, nepohybují se na velké vzdálenosti jako třeba ryby, čímž umožňují prostorově definovat rozsah znečištění. Pakomárovití mají v přírodě také relativně dlouhý životní cyklus oproti klasickému testovému druhu vodního korýše Daphnia magna, což je v tomto případě výhodou, neboť lze pozorovat změny v čase na parametrech jako je abundance. Citlivost makroskopických bezobratlých například vůči herbicidům je navíc často vyšší než v případě primárních producentů (Albarino et al. 2006).

8.1 Bioindikace znečištění vyššími alifáty (HMWHs) Vyšší alifatické uhlovodíky (high molecular weight hydrocarbons, HMWHs) běžně znečišťují vody a sedimenty v příměstských oblastech, kam se dostávají atmosférickou depozicí dopravních a průmyslových emisí, průsaky, a odpadní vodou. Vyšší alifáty jsou téměř nerozpustné ve vodě a zpravidla se sorbují na pevné částice sedimentu. Samy o sobě nejsou tyto látky toxické, nijak biochemicky neovlivňují buněčnou aktivitu, avšak v jejich přítomnosti se mění fyzikálně-chemické vlastnosti sedimentu, výrazně obohacují sediment organickým uhlíkem, pokrývají těla organismů a dusí je (Pettigrove and Hoffmann 2005). Experiment, který hodnotí výše uvedené vlivy vyšších alifátů, provedli australští vědci (Pettigrove and Hoffmann 2005) metodou in situ mikrokosmu. Jejich cílem bylo posoudit změny v zastoupení druhů a četnosti jedinců makroskopických vodních bezobratlých v mikrokosmech kontaminovaných rostoucí koncentrací syntetického motorového oleje oproti nekontaminované kontrole. Uspořádání experimentu bylo následující: čistý sediment byl odebrán v oblasti Glynns Wetland 30 km východně od Melbourne a zároveň využit jako referenční sediment (celkem 10 opakování) i jako sediment ke kontaminaci syntetickým motorovým olejem (hlavní složku tvořily polyalfaolefiny) ve 4 koncentracích (5 opakování/koncentraci). Konečné koncentrace TPH (total petroleum hydrocarbon) v sedimentu činily: 125 – 14 266 mg/kg; celkem bylo požito 30 mikrokosmů. Prvních 50 dnů byl mikrokosmos otevřen, s tím že sem vylíhlý hmyz z okolí náhodně naklade vajíčka, poté byly nádoby překryty síťkou, aby se zabránilo další kolonizaci a zachování druhů, které mikrokosmos již obsadily. Test byl ukončen po 88 dnech a následně byly taxonomicky určeny všechny druhy, počty jejich zástupců a celkový počet jedinců i druhů. Pro vyhodnocení velkého množství dat bylo použito několika pokročilých statistických metod a jejich složitá interpretace by se jednoduše dala shrnout tím, že očekávané výsledky se potvrdily snížením počtu druhů i jejich abundancí v případě vyšších koncentrací HMWHs za různé citlivosti různých druhů. Tyto nikterak překvapivé výsledky však nesou hlubší ekologický význam, neboť koncentrace použité v experimentu jsou v prostředí městských aglomerací zcela 33

reálné – například 19,6% ze 112 odvodňovacích kanálů v oblasti Melbourne vykázalo koncentraci HMWHs vyšší než 1 858 mg/kg. Studie ukázala, že koncentrace alifátů (TPH) vyšší než 860 mg/kg již mohou narušovat složení ekosystému - dochází k zvýšenému výskytu oportunních druhů zatímco citlivější druhy mizí. V koncentracích nad 1 870 mg/kg pak může dojít k zásadnímu poškození ekosystému, kdy nedostatek vodních bezobratlých znamená katastrofu pro jejich konzumenty – ryby a vyšší obratlovce (Pettigrove and Hoffmann 2005). 8.2 Hodnocení vlivu herbicidu MagnacideR H pomocí bioindikace na makroskopických vodních bezobratlých Herbicid s obchodním názvem MagnacideR H, jehož účinnou látkou je akrolein, se užívá k vymýcení plevelných makrofyt, které brzdí tok v zavlažovacích kanálech zemědělské oblasti v údolí řeky Colorado ve východní Argentině. Byla zde provedena studie, posuzující vliv akroleinu na společenstvo makroskopických bezobratlých porovnáním 4 ošetřených a 4 neošetřených lokalit během dvou let (1999 a 2000) (Albarino et al. 2006). Ošetřené lokality byly kontaminovány jednorázově každý měsíc během jižního jara a léta (říjen-únor) v míře 10-15 mg/l při rychlosti toku 0,11-0,78 m3/s. Na každé lokalitě byly odebrány vzorky 3krát za rok – jednou v průběhu aplikace herbicidu, poté 2 měsíce po poslední aplikaci herbicidu (duben), a následně po obnovení zavlažovacího systému a před novou aplikací látky (září). Odběr i uchování vzorků byly provedeny standardně (4 vzorky z každé lokality) a následně se stanovovala abundance bentických bezobratlých na vzorkovnici, počet druhů a Simpsonův index diverzity4. Nebylo překvapením, že v době průběhu aplikace pesticidu byl rozdíl v parametrech společenstev kontrolních a ošetřovaných lokalit největší, avšak lišil se v jednotlivých letech. V roce 1999 došlo v době aplikace k snížení počtu taxonů na 58%, abundance na 57% a diverzity společenstva na 67%. Nicméně příznivé bylo zjištění, že v obou následujících letech se vždy do 2 měsíců po poslední aplikaci herbicidu osídlení faunou makroskopických bezobratlých vrátilo do normálu. Pakomárovití v této studii vykázali obzvláště rychlou schopnost rekolonizace ošetřovaných lokalit. Přesto je třeba uvažovat, že schopnost takové rekolonizace závisí na persistenci a biodostupnosti toxikantu nebo na vzdálenosti lokalit se zdrojem rekolonizujících organismů (Conrad et al. 1999). _____________________________________________________________________________ Simpsonův index diverzity - podíl, kterým biomasa nebo jedinci každého druhu přispívají do celku zjištěného pro daný vzorek, znamená to, že druh i přispívá podílem Pi, S je celkový počet druhů:

D− =

1

∑

S

i =1

Pi 2

34

Závěrečným výstupem této bioindikační studie v hodnocení rizik herbicidu MagnacideR H je tedy fakt, že z hlediska společenstev makroskopických bezobratlých je užití této látky za přísné kontroly dosavadního aplikačního režimu bezpečné. Pro celkové hodnocení je však důležité vzít v potaz i obratlovce s pomalejším růstem a schopností obnovy populací na zasažených lokalitách (Albarino et al. 2006).

9. Praktické aspekty metodik akutních, semichronických a chronických testů s pakomáry (Chironomidae) Kvalitní provedení biotestů s pakomáry vyžaduje nejen určitou zkušenost, ale také řešení problémů, které standardizované postupy většinou neuvádějí. Následující odstavce odhalují některé z těchto problémů: Při dlouhodobějších testech s artificiálními sedimenty připravenými z přírodní rašeliny se mohou někdy vyskytnout nepříjemné bakteriální či plísňové nárosty, které mohou působit zákal a spotřebovávat rozpuštěný kyslík. V tomto případě je vhodné předem sterilizovat rašelinnou složku. Částečnou sterilizaci lze provést například v mikrovlnné troubě. Při zalévání sedimentu médiem v přípravné fázi testu, je potřeba dbát na to, aby se jemné částice sedimentu nevyplavily a následně neusadily na povrchu. Proto je vhodné při zalévání položit na povrch sedimentu podložku z inertního materiálu, která se následně odstraní pinzetou. Larvy 1.instaru jsou velmi malé, proto s nimi manipulujeme pod preparačním mikroskopem. Při nasazování testu i nové generace chovu nasáváme larvy Pasteurovou pipetou a přemísťujeme do cílové nádoby tak, aby tyto larvy neulpěly buď v nejužším místě pipety nebo na vodní blance hladiny v nádobě. Dodržení počtu je totiž u většiny testů podstatné. Dalším důležitým aspektem provedení všech biotestů s pakomáry je krmení. Množství přidávané potravy je třeba optimalizovat tak, aby se nekazila kvalita vody a aby se neobjevovaly bakteriální nárosty. Standardní metodiky doporučují přidávat více krmiva starším larvám. Problémem však zůstává samotný krmný režim, neboť některé studie poukazují na to, že právě režim přidávání potravy může ovlivnit výsledky testu (De Haas et al. 2006) a často vede k podcenění toxicity testované látky (Forbes and Cold. 2005). Problematickým místem reprodukčních testů s pakomáry je předpoklad, že při náhodném výběru larev do testových nádob vkládáme stejný počet samců a samic. Počty jedinců v kádinkách bývají malé (12 nebo 20), což znamená, že pravděpodobnost, že předpoklad nemusí odpovídat realitě je poměrně vysoká. Toto potom může ovlivnit poměr vylíhlých samců a samic či reprodukční parametry, které sledujeme (Hruska and Dubé 2004). 35

Testové nádoby by měly být svrchu opatřeny skleněnými nebo plastovými kryty, čímž se minimalizuje odpar testové vody. V případě poklesu hladiny doléváme do nádob deionizovanou vodu, aby se přídavkem média nezvyšovala koncentrace solí. V testových nádobách je potřeba denně sledovat hladinu vody a vzdušnění, neboť pokles hladiny může způsobit, že vzdušnící kapilára rozstřikuje médium a další úbytek vody je tak velmi urychlen. Jedním z velkých problémů chovu a následného testování látek na pakomárech je snížená genetická diverzita laboratorních oproti přírodním populacím a tedy zvýšená citlivost vůči stresu. Výsledky testů tak ztrácejí na ekologické relevanci a jsou poněkud zkreslené. Snížení genetické diverzity je důsledkem imbreedingu, tzv. founder efektu (kultura je započata s několika málo jedinci), úplné reprodukční izolace, zabraňující přílivu nových genů z jiných populací, které by vyvážily vliv genetického driftu. Vědci z frankfurtské univerzity (Nowak et al. 2007) provedli studii porovnávající genetickou diverzitu 10 laboratorních kultur po 23 generací, 2 populací z terénu (jižní Německo) a jedné populace vzniklé křížením jedinců z 11 laboratorních kultur metodou analýzy mikrosatelitové DNA. Testováno bylo vždy 21-25 jedinců na 5 různých lokusech mikrosatelitové DNA. Sledovány byly tyto parametry: heterozygotnost, počet alel na lokus, výskyt vzácných alel a Shannonův index5. Diverzita všech laboratorních kultur byla významně nižší, než diverzita prokřížené kultury a než u obou terénních vzorků, které byly vzájemně srovnatelné a vykazovaly největší počet alel, heterozygotnost i Shannonův index. U poloviny laboratorních kultur nebyla nalezena žádná vzácná alela. Ukázalo se, že ani prokřížená kultura nedosahuje svými hodnotami diverzity populace z přírody (viz tabulka 5). Tato populace byla také sledována po dobu 23 generací, aby se projevil vliv laboratorního chovu na genetické ochuzení populace (viz graf 3). Během 23 generací klesla heterozygotnost z hodnoty 0,481 na 0,334 a počet alel na lokus z 4,0 na 2,4. Výsledky studie tedy ukázaly, že laboratorní kultury pakomárů jsou značně geneticky ochuzené oproti přírodním populacím a ani metoda genetického obohacení křížením jedinců z různých laboratorních kultur se nejeví jako dostatečné řešení. Možné by tedy bylo vnášet nové geny přímo z přírodních populací, tomu by však muselo předcházet důsledné taxonomické stanovení všech jedinců, což je u pakomárovitých dosti problematické (Nowak et al. 2007) _____________________________________________________________________________________________ 5. Shannonův index diverzity: S – celkový počet druhů; Pi – relativní zastoupení i-té populace S

H ´ = − ∑ Pi . ln Pi i =1

36

Tabulka 5 : Průměrná genetická variabilita křížené populace, laboratorních (n = 10) a přírodních populací (n = 2) Chironomus riparius (Nowak et al. 2007) Průměrná genetická variabilita prokřížené populace, laboratorních kultur a přírodních populací A (počet HO (pozorovaná HE (očekávaná SI (Shannonův index) alel) heterozygotnost) heterozygotnost) Křížená p. 3,6 0,47 0,60 1,05 Laboratorní p. 1,7 0,23 0,23 0,34 Přírodní p. 5,3 0,62 0,62 1,28

Graf 3: Křivka udává očekávanou heterozygotnost (HE) prokřížené populace pakomára Chironomus riparius na 5 lokusech mikrosatelitové DNA během 23 generací laboratorního chovu (Nowak et al. 2007)

37

10. Praktické seznámení s chovem a testy s pakomáry (Chironomidae) V rámci zpracování bakalářské práce byl proveden zkušební 18-d test s larvami 1. instaru, jehož cílem bylo porovnat vliv rozdílných krmných režimů v průběhu testu na procento přežití ve 4 různých variantách. Uspořádání testu: Do testu byly nasazeny mladé larvy, 2-3 dny po líhnutí. Experiment probíhal standardně v 600 ml kádinkách s 40 g sedimentu (jemný křemenný písek) a mediem (Duch Standard Water) doplněným na 200 ml. Do každé kádinky bylo nasazeno 20 larev. V rámci testu byly připraveny 4 různé expoziční varianty - K: kontrola se standardním každodenním krmením (10 opakování), Cd: 0,1 µg/g sedimentu se standardním každodenním krmením (15 opakování), K+P: kontrola s přídavkem veškerého obsahu krmiva na začátku pokusu (10 opakování), Cd + P: 0,1 µg/g s přídavkem veškerého obsahu krmiva na začátku pokusu (15 opakování). Ve variantách K a Cd byly larvy krmeny suspenzí vloček Tetramin – 0,5 mg/larva/den, ve variantách K+P a Cd+P nebyly larvy dokrmovány vůbec. Ve všech variantách bylo instalováno vzdušnění, změřeno pH, vodivost a rozpuštěný kyslík (v průběhu a na konci testu). Během testu bylo odpařené médium pravidelně doplňováno destilovanou vodou, případně upraveno vzdušnění. Test byl proveden ve zvýšeném množství opakování z důvodu potřeby získat velké množství biologického materiálu na další biochemickou analýzu (metalothioneiny). Pozorování a vyhodnocení: Během testu došlo v několika případech k poklesu hladiny rozpuštěného kyslíku pod předepsanou hodnotu 60% ASW, tento problém byl vždy co nejdříve napraven. Ke konci testu došlo k nepředpokládanému předčasnému zakuklení a v některých případech i vylíhnutí dospělců. Při vyhodnocování procenta přežití byli všichni tito jedinci považováni za přeživší. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 6 a 7; a grafech 4 a 5. U procenta přežití pozorujeme trend k poklesu u variant krmených na začátku pokusu oproti pravidelně krmené kontrole, avšak tento rozdíl mezi skupinami není statisticky významný; ve všech případech bylo procento přežití vyšší než 70%. Zajímavé je však pozorování procenta zakuklených, případně vylíhlých jedinců, kde je již možné mezi krmenými a nekrmenými variantami pozorovat statisticky významné rozdíly. Kontaminace kadmiem neměla na tento parametr žádný významný vliv. Zdá se, že u nekrmených variant došlo k dřívějšímu rozkladu nebo spotřebě krmiva, larvy tedy později trpěly hladem a to se projevilo na rychlosti vývoje, která byla oproti pravidelně krmeným variantám zjevně zpomalena. Všechny hodnoty a úsudky jsou však pouze orientační, neboť test byl prováděn především ze cvičných důvodů a další informace přinese plánovaná analýza na metalothioneiny.

38

Tabulka 6: Průměrné procento přežití (SE – standardní chyba, n – počet opakování) % přežití x (prumer) SE n

K

Cd 0,90 0,039 10

0,87 0,063 15

Cd

K+P

K+P Cd+P 0,78 0,76 0,115 0,026 10 15

1,0

% přežití

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 K

Cd+P

Graf 4: Průměrné procento přežití (žlutá – pravidelně krmená skupina, modrá – skupina nakrmená na začátku experimentu) Tabulka 7: Průměrné procento zakuklených nebo vylíhlých jedinců (SE – standardní chyba, n – počet opakování) Cd K+P Cd+P %zakuklení K x (prumer) 0,29 0,40 0,03 0,06 SE 0,083 0,050 0,009 0,018 n 10 15 10 15

% zakuklení / líhnutí

0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10

* *

0,05 0,00 K

Cd

K+P

Cd+P

Graf 5: Průměrné procento zakuklených nebo vylíhlých jedinců (žlutá – pravidelně krmená skupina, modrá – skupina nakrmená na začátku experimentu (* statisticky významný rozdíl od pravidelně krmené skupiny, Kruskal-Wallis ANOVA, Statistica for Windows 7.0)

39

11. Závěr Pakomárovití (Chironomidae) jsou jako představitelé bentické bezobratlé fauny vhodným modelovým organismem pro stanovování toxicity sedimentu. Laboratorní chov pakomárů je poměrně snadný a bez problémů poskytuje v pravidelném intervalu cca 30ti denního životního cyklu dostatečné množství organismů pro testování. Ekotoxikologické biotesty s pakomáry se nejčastěji provádí dle standardizovaných metodik poskytovaných organizacemi jako například OECD a US EPA. Existují 4 hlavní typy testů: standardní 48 hod / 96 hod test akutní toxicity na larvách, standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev, standardní 28-d test líhnutí a vývoje a standardní 65-d celoživotní studie. Kromě těchto standardizovaných testů se setkáváme i s nejrůznějšími alternativami lišícími se buď celým uspořádáním pokusu nebo sledovanými parametry – časté je dnes stanovování biomarkerů. Biotestů s užitím pakomárů na jednotlivých modelových látkách byla provedena již celá řada, proto je možné se opřít o velké množství zdrojů, které poskytují informace o účinných koncentracích, jejich rozsahu, citlivosti pakomárů v porovnání s jinými organismy a o nejrůznějších praktických aspektech testování. Ústředním zájmem experimentů s pakomáry jsou pesticidy a těžké kovy, studie s hodnocením vlivu například léčiv nebo radioaktivních látek jsou výjimečné. Pakomárovité lze také využít jako bioindikační skupiny, neboť zastoupení určitých taxonů koreluje s mírou znečištění dané lokality. V rámci bakalářské práce byl proveden cvičný 18-d test s čerstvě vylíhlými larvami pakomárů, který měl posoudit vliv krmného režimu na procento přežití. Ve dvou variantách (K, Cd) byly pakomáři krmeni standardně každý den, v dalších dvou (K+P, Cd+P) bylo veškeré krmení na dobu celého pokusu přidáno na začátku. Během testu došlo k nepředpokládanému dřívějšímu zakuklení a líhnutí dospělců, a to hlavně ve variantách krmených každý den dle standardního postupu. U nekrmených variant se vývoj patrně zpomalil. Rozdíly v přežití se nejeví jako příliš výrazné. Při chovu pakomárů a provádění ekotoxikologických testů na tomto modelu je dobré brát na vědomí několik důležitých praktických aspektů, které mohou ovlivnit vitalitu a diverzitu chovné populace, charakter testového prostředí, distribuci toxikantu v testové nádobě, či výsledné parametry testu. Práce s pakomáry v ekotoxikologii tedy zůstává oblastí, která se nadále rozvíjí, a nové vědecké poznatky přispívají ke zdokonalování a optimalizaci laboratorního chovu i testů.

40

12. Použitá literatura Albarino, R., A. Venturino, et al. (2006). "Environmental effect assessment of Magnacide H herbicide at Rio Colorado irrigation channels (Argentina). Tier 4: In situ survey on benthic invertebrates." Environmental Toxicology and Chemistry 26(1): 183-189. Belden, J. B. and M. J. Lydy (2006). "Joint toxicity of chlorpyrifos and esfenvalerate to fathead minnow and midge larvae." Environmental Toxicology and Chemistry 25(2): 623-629. Bleeker, E., H. Van der Geest, et al. (1998). "Comparative ecotoxicity of NPAHs to larvae of the midge Chironomus riparius." Aquatic Toxicology 41: 51-62. Conrad, A. U., R. J. Fleming, et al. (1999). "Laboratory and field response of Chironomus riparius to a pyrethroid insecticide." Water Resources 33(7): 1603-1610. De Haas, E. M., C. Wagner, et al. (2006). "Habitat selection by chironomid larvae: fast growth requires fast food." Journal of Animal Ecology 75(1): 148-155. Dias, V., B. Ksas, et al. (2005). "Sublethal effects of sediment associated uranium on Chironomus riparius (Diptera: Chironomidae) larvae." Radioprotection 40: S191-S197. Epler, J. H. (2001). Identification Manual for Larval Chironomidae (Diptera) of North and South Carolina., North Carolina Department of Environment and Natural Resources, Division of Watetr Duality. Fargašová, A. (2001). "Winter Third- to Fourth-Instar Larvae of Chironomus plumosus as Bioassay Tools for Assessment of Acute Toxicity of Metals and Their Binary Combinations." Ecotoxicology and Environmental Safety 48: 1-5. Forbes, V. E. and A. Cold. (2005). "Effects of the pyrethroid esfenvalerate on life-cycle traits and population dynamics of Chironomus riparius - importance of exposure scenario." Environmental Toxicology and Chemistry 24(1): 78-86. Grebe, M., P. Rauch, et al. (2000). "Characterization of subclones of the epithelial cell line from Chironomus tentans resistant to the insecticide RH 5992, a non-steroidal moulting hormone agonist." Insect Biochemistry and Molecular Biology 30(7): 591-600. Grosell, M., R. M. Gerdes, et al. (2006). "Chronic toxicity of lead to three freshwater invertebrates - Brachionus calyciflorus, Chironomus tentans, and Lymnea stagnalis." Environmental Toxicology and Chemistry 25(1): 97-104. Halpern, M., A. Gasith, et al. (2002). "The protective nature of Chironomus luridus larval tubes against copper sulfate." Journal of Insect Science 2(8): 5pp. Hooper, H. L., R. M. Sibly, et al. (2005). "Joint effects of density and a growth inhibitor on the life history and population growth rate of the midge Chironomus riparius." Environmental Toxicology and Chemistry 24(5): 1140-1145. Hose, G. C., M. B.R., et al. (2006). "A meta-analysis comparing the toxicity of sediments in the laboratory and in situ." Environmental Toxicology and Chemistry 25(4): 1148-1152.

41

Hruska, K. A. and M. G. Dubé (2004). "Comaparison of a partial life-cycle bioassay in artificial streams to a standard beaker bioassay to asssess effects of metal effects of metal mine effluent on Chironomus riparius." Environmental Toxicology and Chemistry 24(9): 2325-2335. Janssens de Bisthoven, L., Nuyts, P., Goddeeris, B., and Ollevier, F. (1998). "Sublethal parameters in morphologically deformed Chironomus larvae: clues to understanding their bioindicator value." Freshwater Biology 39: 179-191. Lammerding-Koppel, M., E. Spindler - Barth, et al. (1998). "Immunohistochemical localization of ecdysosteroid receptor and ultraspiracle in the epithelial cell line from Chironomus tentans (Insecta, Diptera)." Tissue and Cell 30(2): 187-194. Lindegaard, C. (1997). Diptera Chironomidae, Non-biting Midges. Aquatic Insects of Northern Europe - A taxonomic Handbook, Uni. of Copenhagen: 265-283. Lopes, C., Péry, A.R.R., Chaumot, A., Charles, S. (2005). "Ecotoxicology and population dynamics: Using DEBtox models in a Leslie modelling approach." Ecological Modelling(188): 30-40. Mandaville, S. M. (1999). Bioassessment of freshwaters using benthic macroinvertebrates, Soil and Water Conservation Society of Metro Halifax. 25 Oct 2007. Moreira-Santos, M., A. Fonesca, et al. (2005). "Short-term sublethal (Sediment and Aquatic Roots of Floating Macrophytes) assays with a tropical chironomid based on postexposure feeding and biomarkers." Environmental Toxicology and Chemistry 24(9): 2234-2242. Novartis Animal Health US, I. (2005). Sentinel® Flavor Tabs® for Dogs Product Information. Greensboro, NC, USA, Novartis Animal Health US, Inc. 4 Apr 2008. Nowak, C., C. Vogt, et al. (2007). "Genetic impoverishment in laboratory cultures of the test organism Chironomus riparius." Environmental Toxicology and Chemistry 26(5): 10181022. OECD (2004). "Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment." OECD Test Guideline 218. OECD (2006). "Detailed review paper on aquatic arthropods in life-cycle toxicity tests with an emphasis on developmental reproductive and endocrine disruptive effects." OECD Series ontesting and Assessment 50. Péry, A., M. P. Babut, et al. (2006). "Deriving effects on Chironomus riparius population carrying capacity from standard toxicity tests." Environmental Toxicology and Chemistry 25(1): 144-148. Pettigrove, V. and A. Hoffmann (2005). "Effects of long-chain hydrocarbon-polluted sediment on freshwater macroinvertebrates." Environmental Toxicology and Chemistry 24(10): 2500-2508.

42

Printes, L. B., E. L. G. Espindola, et al. (2007). "Biochemical Biomarkers in Individual Larvae of Chironomus xanthus (Rempel, 1939) (Diptera, Chironomidae)." J. Braz. Soc. Ecotoxicol. Ruferová, Z. (2005). Bioindikace toxického znečištění drobných toků na základě analýzy deformit ústního ústrojí larev pakomárovitých (příp. dalších bezobratlých). Brno, Masaryk Uni. Sedlák, E. (2006). Zoologie bezobratlých. Brno, Masaryk Uni. Servia, M. L., A. Péry, et al. (2005). "Effects of copper on energy metabolism and larval development in the midge Chironomus riparius." Ecotoxicology 15: 229-240. US-EPA (2000). "Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sedimentassociated Contaminants with Freshwater Invertebrates." US-EPA EPA 600/R-99/064. Williams, D. D. a. F., B.W. (1992). Aquatic Insects, CAB International.

12.1 Databáze chemických látek IRIS – databáze U.S. EPA ITER - TERA - Toxicology Excellence for Risk Assessment ECDIN - Environmental Chemicals Data and Information Network ASTDR - Agency for Toxic Substances and Disease Registry

43

13.

Přílohy

Tab. 1 Doporučené podmínky pro provedení desetidenního (10-d) testu toxicity sedimentu s Chironomus tentans (US-EPA 2000) 1.

Parametr Typ testu

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Teplota Kvalita světla Osvětlení Fotoperioda Nádoba Objem sedimentu Objem vody Výměna vody Věk organismů

11. 12. 13.

Počet organismů v testové nádobě Počet opakování (testových nádob) Krmení

14. 15. 16. 17.

Provzdušňování Voda Čištění testové nádoby Kvalita vody

18. 19. 20.

Délka testu Sledované parametry Přijatelnost testu

Podmínky Test celkové toxicity sedimentu s obnovováním vody, jež sediment omývá 23 ±1°C Širokospektré fluorescenční světlo 100 – 1000 lux 16L : 8D 300 ml kádinka bez zobáčku 100 ml 175 ml 2 výměny objemu/den– kontinuální nebo jednorázové Larvy druhého nebo třetího instaru (asi 10 dnů staré larvy, organismy musí být ve stadiu třetího instaru aspoň z 50% 10 Běžně 8, záleží na cíli pokusu Krmení pro rybičky – tetrafinR, 1,5ml denně (1ml obsahuje 4,0 mg suchých vloček) Žádné – pokud hladina rozpuštěného kyslíku neklesne pod 2,5 mg/l Studniční, povrchová, provozní, uměle připravená Pokud se zanáší stěny testové komůrky – jemně otřít kartáčkem Tvrdost, bazicita, vodivost, pH, amoniak – na začátku a na konci testu Teplota a rozpuštěný kyslík - denně 10 dní Přežití a růst (AFDW – popelovin prostá suchá váha) Minimální střední přežití v kontrole 70%, minimální střední váha (AFDW) kontrolního organismu 0,48 mg

Tab. 2 Všeobecný pracovní plán pro provedení desetidenního testu (10-d) testu toxicity sedimentu s Chironomus tentans (US-EPA 2000) den -14 -13 -12 -11 -10 -9 až -2 -1 0

1 až 8 9 10

Úkol Odizoluj dospělce od vajíček Ulož nakladené shluky vajíček do misky určené pro líheň Připrav nádobu s novým substrátem pro chov larev Prozkoumej shluky vajíček a stav líhnutí, jestli se některé larvy už vylíhly, přemísti je i s zbylými vajíčky do chovné nádoby a začni krmit Proveď stejný úkol jak dne -11 Krm a pozoruj larvy. Kontroluj kvalitu vody – teplotu a rozpuštěný kyslík Krm a pozoruj larvy. Kontroluj kvalitu vody – teplotu a rozpuštěný kyslík, přidej sediment do všech testových nádob, umísti testové nádoby do expozičního systému a začni vyměňovat vodu Změř kvalitu vody (pH, bazicitu, rozpuštěný kyslík, vodivost a amoniak), vyjmi larvy třetího instaru v chovné nádobě ze substrátu, přidej 1,5ml TetrafinuR do každé testové nádoby, vlož 10 jedinců do každé testové nádoby – pod hladinu, uchovej 20 testových organismů na determinaci instaru, váhy a délky, pozoruj chování organismů Přidávej 1,5ml krmení do každé testové nádoby, měř teplotu a rozpuštěný kyslík, pozoruj chování organismů Změř celkovou kvalitu vody Změř teplotu a rozpuštěný kyslík, ukonči test sebráním larev sítkem. Změř váhu a délku larev, co přežily.

44

Tab. 3 Doporučené podmínky pro provedení celoživotního testu toxicity sedimentu s Chironomus tentans (US-EPA 2000) 1.

Parametr Typ testu

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Teplota Kvalita světla Osvětlení Fotoperioda Nádoba Objem sedimentu Objem vody Výměna vody Věk organismů Počet organismů v testové nádobě Počet opakování (testových nádob) Krmení

14. 15. 16. 17.

Provzdušňování Voda Čištění testové nádoby Kvalita vody

18.

Délka testu

19.

Sledované parametry

20.

Přijatelnost testu

Podmínky Test celkové toxicity sedimentu s obnovováním vody, jež sediment omývá 23 ±1°C Širokospektré fluorescenční světlo 100 – 1000 lux 16L : 8D 300 ml kádinka bez zobáčku 100 ml 175 ml 2 výměny objemu/den– kontinuální nebo jednorázové 24-hodin staré larvy 12 16 (12 z nich zakládáme v den -1 a 4 pomocné v den 10) Krmení pro rybičky – tetrafinR, 1,5ml denně (1ml obsahuje 4,0 mg suchých vloček) Žádné – pokud hladina rozpuštěného kyslíku neklesne pod 2,5 mg/l Studniční, povrchová, provozní, uměle připravená Pokud se zanáší stěny testové komůrky – jemně otřít kartáčkem Tvrdost, bazicita, pH, amoniak – na začátku, v den 20 a na konci testu Teplota a rozpuštěný kyslík - 3krát týdně Vodivost – denně Měření rozpuštěného kyslíku by měla být prováděna častěji v případě, že koncentrace poklesla pod 1mg/l při předcházejícím měření Okolo 50 až 65 dnů, každé opakování je ukončeno zvlášť – nepozorujeme-li již žádné líhnutí dospělců po 7 dnů; jestliže u opakování nedošlo k žádnému líhnutí, pak test ukončujeme podle kontroly (ta se také řídí sedmidenním kritériem) Přežití a váha ve den 20, vylíhnutí samiček a samečků, mortalita dospělců, počet nakladených shluků vajíček, počet vylíhlých vajíček, a některé další možné subletální parametry Průměrná velikost přeživších organismů v kontrole v den 20 musí být aspoň 0,6 mg suché váhy nebo 0,48 mg AFDW, líhnutí dospělců musí přesahovat 50%, ukázalo se, že v kontrole kukly obvykle přežívají ve více než 83% a dospělci ve více než 96%, doba než dojde k smrti dospělců musí přesahovat 6,5 dne pro samce a 5,1 dne pro samice. Střední počet vajíček v kontrole musí přesahovat 800 a procento líhnutí by mělo být větší než 80%

45

Tab. 4 Všeobecný pracovní plán pro provedení celoživotního testu toxicity sedimentu s Chironomus tentans (US-EPA 2000) den Úkol Před testem -4 Začni reprodukcí dospělců ve snubní komůrce (poměr samice : samci 3:1), z komůrky bychom měli na závěr sesbírat například 30 samic a 10 samců, 15 až 25 shluků vajíček, které čítají 600-1500 vajíček -3 Sesbírej 6-8 shluků vajíček a inkubuj při 23 °C -2 Zkontroluj shluky vajíček – jejich vývoj a životaschopnost -1 1. Zkontroluj líhnutí a vývoj vajíček 2. Do každé testové kádinky přidej 100 ml homogenizovaného testového sedimentu, poté co se sediment usadí (nejméně za hodinu) do každé kádinky přidej 1,5 ml krmné suspenze TetrafinuR , začni měnit vodu Test sedimentu 0 1. Přemísti všechny shluky vajíček do skleněné nádoby s kontrolní vodou, vyřaď larvy, které se vylíhly již v inkubační nádobce, přidej 1,5 ml krmení do každé kádinky, ještě pře vysazením larev, přidej 12 larev do každé kádinky, po hodině zabuduj kádinky s larvami do systému (uchycení, výměna vody) 2. Změř teplotu, pH, tvrdost, bazicitu, kyslík, vodivost a amoniak 1-ke konci Denně přidávej 1,5 ml krmné suspenze,měř teplotu, třikrát za týden měř pH a kyslík, týdně měř vodivost, poklesne-li kyslík pod 1mg/l od předchozího měřen – kyslík měř častěji a provzdušňuj pokud se v kádince udržuje hladina kyslíku pod 2,5mg/l 6 Začni reprodukci pro získání pomocných samečků (poměr samice : samci = 3:1) 7-10 Při zakládání kádinek pro kulturu pomocných samečků postupuj stejně jako u ostatních testových organizmů, založ 4 opakování 19 Připrav se na vážení, tím že vyžíháš lodičky na vážení při 550°C po dobu 2 hodin – lodičky musí být vyžíhané, abychom se vyhnuli chybám spojeným s oxidací materiálu lodičky při žíháni se vzorkem 20 1. Náhodně vyber 4 kádinky a vyber z nich larvy přesíváním sedimentu k určení růstu a váhy, dej všechny larvy z jednotlivých kádinek dohromady a vysuš takový vzorek do konstantní váhy 2. Nainstaluj záchytnou síťovinu k záchytu líhnoucích se dospělců na strop zbývajících kádinek 3. Změř teplotu, pH, tvrdost, bazicitu, rozpuštěný kyslík, vodivost a amoniak 21 Vzorek sušených larev umísti do exsikátoru při pokojové teplotě a zvaž co s přesností na 0,01 mg, sušené larvy potom vyžíhej při 550°C po dobu 2 hodin a znovu zvaž, výslednou AFDW pak získáš odečtením váhy vyžíhaného vzorku s lodičkou od váhy suchého vzorku s vyžíhanou lodičkou Chronická měření 23-ke Denně zaznamenávej líhnutí samců a samic, mortalitu kukel a dospělců, čas od vylíhnutí po smrt konci dospělců Denně přemísťuj dospělce z chovné kádinky do snubní komůrky a postupně přemísťuj primární shluky vajíček do Petriho misek, kde monitorujeme inkubaci a líhnutí Zaznamenej každý shluk vajíček, počet vajíček ve shluku (užitím prstencové metody nebo metody přímého počtu), počet vylíhnutých vajíček Je-li obtížné odhadnout počet vajíček ve shlucích, použij metodu přímého výpočtu – přestože pak nelze získat data popisující úspěšnost líhnutí 28 Umísti záchytnou síťovinu na kádinky s kulturami pomocných samečků 33-ke Přemísti líhnoucí se samečky z pomocné kultury do jednotlivých převrácených Petriho misek – konci pomocní samečci slouží k páření se samicemi z opakování založených na začátku, kde se většina samců vylíhla již dříve, nebo pro případ, že by se samci nevylíhli vůbec 40-ke Po 7 dnech, kdy již v dané kádince nepozorujeme žádné další líhnutí dospělců, ukonči test přesíváním konci sedimentu k získání nevylíhlých larev nebo svléknuté pokožky kukel, jestliže v kádince nedojde k žádnému líhnutí, pak ukonči test podle kontroly – s použitím sedmidenního kritéria

46

Tab. 5 Postup testování toxicity sedimentu na druhu Chironomus riparius dle OECD (OECD 2004) s užitím kontaminovaného sedimentu a kontaminované vody nad sedimentem Parametr Typ testu Testové organismy Teplota Kvalita světla Osvětlení Fotoperioda Nádoba Výška sedimentu v nádobě Poměr výšky sediment voda Věk organismů Počet organismů v testové nádobě 12. Počet opakování (testových nádob) 13. Krmení 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

14. 15. 16. 17.

Provzdušňování Voda Sediment Kvalita vody

18. Délka testu

19. Sledované parametry

20. Přijatelnost testu

Podmínky Test celkové toxicity sedimentu 10d/ 28d/ 65d Chironomus riparius, Chironomus tentans, Chironomus yohimatsui 20 ±2°C Širokospektré fluorescenční světlo 500 – 1000 lux 16L : 8D 600 ml kádinka bez zobáčku, 8 cm v průměru (2-3 cm2/larva) 1,5-3 cm 1:4 1-4 dny staré larvy 20 3 (ECx), 4 (NOEC, LOEC) Krmení pro rybičky – TetrafinR, 0,25-0,5mg/larva/den pokud možno denně, nebo aspoň 3krát týdně Mírné vzdušnění Paseurovou pipetou Studniční, povrchová, provozní, uměle připravená Přírodní nebo artificiální pH 6-9, rozpuštěný kyslík – aspoň 60% ASV (air sturatian value) – musí se změřit na konci testu tvrdost a koncentrace amoniaku se změří na začátku testu v kontrole a v jednom opakování nejvyšší koncentrace testované látky Pro Chironomus riparius max. 28 dnů, pro Chironomus tentans 65 dnů (pokud dojde k líhnutí dříve test je možno ukončit po pěti dnech od vylíhnutí posledního dospělce) Po 10 dnech – procento přežití a růst (hodnoceno v opakováních založených navíc) Na konci testu (28d, 65d) – procento vylíhnutých jedinců, střední čas vývoje, střední rychlost vývoje Procento vylíhnutých jedinců na konci testu musí být větší nebo rovno 70%

47

Tab. 6 Cílové parametry standardního 28-d testu a jejich výpočet (OECD 2004) Cílový parametr Procento líhnutí dospělců

Střední čas vývoje Střední rychlost vývoje

Výpočet

ne na

ER =

ER: procento líhnutí dospělců (emergence ratio) na: počet jedinců vysazených do kádinky ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu) Přijatelnost testu: ER kontroly >0,7 čas od vysazení do líhnutí m

x=∑ i =0

f i xi ne

xi =

1 deni − li / 2

x: střední rychlost vývoje v kádince i: index intervalu mezi pozorováními m: počet všech intervalů mezi pozorováními fi: počet vylíhnutých jedinců během daného intervalu ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu) xi: rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i deni: den pozorování (od začátku) li: délka intervalu mezi pozorováními (obvykle 1 den)

Tab. 7 Testová zpráva (OECD 2004) Testovaná látka

-

Testový druh:

-

Testové podmínky:

-

Výsledky:

-

fyzikálně-chemické vlastnosti (rozpustnost ve vodě, tlak nasycené páry, rozdělovací koef. v půdě, stabilita ve vodě) chemická identifikace (CAS, běžný název, čistota, analytická metoda stanovení) název, zdroj, chovné podmínky organismů, věk organismů vložených do testových kádinek vlastnosti a původ sedimentu, vlastnosti a původ vody nad sedimentem, metoda umělé kontaminace sedimentu, koncentrace, inkubační podmínky, informace o krmení, informace o užitém nádobí a technice nominální a naměřené koncentrace, výsledky všech analýz kvalita vody (pH, teplota, rozpuštěný kyslík, tvrdost, amoniak) výměna vody počet vylíhlých samců a samic/kádinka/den počet nevylíhlých larev/kádinka AFDW/kádinka procento vylíhlých/kádinka /koncentrace střední rychlost růstu/ kádinka/koncentrace odhady cílových parametrů ECx a užitá statistika diskuze výsledků

48

Tab.8 Složení zásobních roztoků stopových prvků a příprava média M7 k chovu a testům s pakomáry Chironomus riparius a C. tentans (OECD 2004) Zásobní roztok I

Obsah v mg v l litru deionizované vody

K přípravě kombinovaného zásobního roztoku II se smísí dané množství (ml) zásobního roztoku I a doplní se na 1 litr neionizovanou vodou H3BO3 57190 0,25 MnCl2 . 4 H2O 7210 0,25 LiCl 6120 0,25 RbCl 1420 0,25 SrCl2 . 6 H2O 3040 0,25 NaBr 320 0,25 Na2MoO4 . 2 H2O 1260 0,25 CuCl2 335 0,25 ZnCl2 260 1,0 CoCl2 200 1,0 KI 65 1,0 Na2SeO2 43,8 1,0 NH2VO2 11,5 1,0 Na2EDTA . 2 H2O (1) 5000 5,0 FeSO4 . 7 H2O (1) 1991 5,0 (1) Tyto roztoky se připravují odděleně, pak se smísí a okamžitě autoklávují

Výsledná koncentrace v testových roztocích (mg/l) 0,715 0,090 0,077 0,018 0,038 0,004 0,016 0,004 0,013 0,010 0,0033 0,0022 0,00058 0,625 0,249

Tab. 9 Zásobní roztoky makronutrientů pro přípravu M7 média (OECD 2004) Obsah v mg v l litru deionizované vody CaCl2 . 2 H2O MgSO4 . 7 H2O KCl NaHCO3 NaSiO3 . 9 H2O NaNO3 KH2PO4 K2HPO4

293800 246600 58000 64800 50000 2740 1430 1840

Množství zásobního roztoku makronutrientů na přípravu 1 litru média M7 (ml) 1,0 0,5 0,1 1,0 0,2 0,1 0,1 0,1

Výsledná koncentrace v testových roztocích (mg/l) 293,8 123,3 5,8 64,8 10,0 0,274 0,143 0,184

Tab. 10 Zásobní roztoky vitaminů pro přípravu média M7 (OECD 2004)

Thiamin hydrochlorid Cyanokobalamin(B12) Biotin

Obsah v mg v l litru deionizované vody

Množství zásobního roztoku vitaminů na přípravu 1 litru média M7 (ml)

750 10 7,5

0,1 0,1 0,1

Výsledná koncentrace v testových roztocích (mg/l) 0,075 0,0010 0,00075

49